Metoda dijagnostike (ELISA) je informativna i nije preskupa, zbog čega mnoge laboratorije svojim klijentima nude ovu metodu (enzimski imunotest krvi). Studija se provodi na prazan želudac, krv za analizu se uzima iz ulnarne vene pacijenta. Pre ELISA testa, preporučljivo je ne pušiti i ne piti alkohol.
Šta je test krvi koji se radi ELISA metodom?
Među metodama analize krvi za procjenu sposobnosti tijela da se odupre zarazne bolesti i pokazuje fazu bolesti, važno mjesto uzima vezani imunosorbentni test(ELISA). Provođenje ove studije omogućava vam da sveobuhvatno procijenite aktivnost zaštitne funkcije krvi i identificirate stanje imunodeficijencije u zarazne patologije, takođe bolesti krvi, autoimunih procesa, hormonalni problemi.
Ovo laboratorijski test, što vam omogućava da utvrdite prisustvo specifičnih antitijela ( zaštitni faktori krv proteinske prirode) na određene antigene (patogeni agensi). Među antitijelima primarni značaj imaju imunoglobulini koji mogu postojati u obliku imunokompleksa.
Imunoglobulini nastaju kao rezultat složenih neurohumoralnih reakcija ljudskog imunog sistema, koje nastaju kao responzivnost na uvođenje stranih antigena. Svaka vrsta patogena proizvodi svoja specifična antitijela. Djeluju tako što „vezuju“ antigen ili patološki mikroorganizam, formirajući kompleksno jedinjenje „antigen-antitijelo“, nakon čega slijedi neutralizacija, enzimska liza, reakcije fagocitoze i uklanjanje iz organizma. Upravo prisustvom određenih kompleksa utvrđuje se ELISA metoda. vrsta patogena ili štetne supstance prisutne u pacijentu.
Vrijedi zapamtiti da nakon tretmana, antitijela mogu ostati u našem tijelu jako dugo, čak i nakon što infekcija napusti naše tijelo, tj. ostaje takozvani "serološki ožiljak". Uzmimo primjer: na noćnom nebu postoje hiljade zvijezda. Mnoge od ovih zvijezda su odavno umrle, ali njihova svjetlost i dalje dopire do nas, vekovima. U suštini, vidimo samo trag zvezde. Svetlo je, ali zvezda je odavno nestala.
Ali ako nema svjetlosti, to ne znači da zvijezde nije bilo. Isto je i sa antitelima. Njihovo prisustvo ne garantuje prisustvo željenog infektivnog agensa u telu. Odsustvo antitijela ne znači da nema infekcije. Ako je rezultat ELISA testa pozitivan, to znači da trebate tražiti infekciju specifičnijim i skupljim metodama - PCR, bakteriološke kulture. Moguće lažno pozitivan rezultat u slučaju da nekoliko mikroba ima slično antigena struktura, tada će se proizvoditi “slična” antitijela na različite mikrobe.
Šta su imunoglobulini?
Otkriveno je i proučavano 5 glavnih klasa imunoglobulina - IgA, IgM, IgG, IgD, IgE. uloga ostatka još nije u potpunosti razjašnjena i pod naučnim je istraživanjem.
Glavni zadatak imunoglobulina A (IgA) je zaštitna funkcija sluzokože respiratornog trakta, gastrointestinalnog trakta i urinarnog sistema. U akutnom početku bolesti nemoguće ih je identificirati. Ovi zaštitni kompleksi se pojavljuju tek od 2. sedmice od početka bolesti, ponekad i kasnije. Najveći dio imunoglobulina A koncentriran je u mukoznim tkivima. Otprilike oko 80%. Preostala antitijela cirkuliraju u krvi.
Glavna funkcija je neutralizacija i uništavanje mikroorganizama. Nakon smirivanja akutne manifestacije bolesti, količina ovih imunoglobulina počinje da se smanjuje i potpuno nestaje do 8 sedmica od početka bolesti. Ako se IgA otkrije u više kasni datumi, onda to ukazuje na hronični proces.
Glavni i prvi markeri akutna faza razvoj patologije su imunoglobulini klase M (IgM). Otkrivaju se do 5. dana od početka bolesti. Njihovo prisustvo u krvi može se utvrditi u roku od oko 6 sedmica. Tada počinju brzo nestajati.
Rezidualni imuni odgovor karakterizira prisustvo imunoglobulina G (IgG) u krvi. Pojava ovih faktora u krvi otkriva se otprilike mjesec dana nakon pojave bolesti. U budućnosti, oni se mogu odrediti za mnogo mjeseci, godina, pa čak i cijeli život, ispunjavajući zaštitna funkcija od povratka (relapsa) bolesti, au nekim slučajevima i onemogućavanja sekundarnog razvoja patologije.
Ako količina imunoglobulina G ponovo počne da raste, onda se može posumnjati na ponovnu infekciju. Sličan zaključak se može izvući vođenjem dva ili tri uzorka uzeta u razmaku od 2 sedmice.
Kako se izvodi ELISA krvi?
Za enzimski imunološki test, u većini slučajeva, koristi se krv pacijenta, ponekad se prikuplja tkivo staklasto tijelo, tečnosti kičmeni kanal, amnionska tečnost.
Krv se vuče kroz injekcijsku iglu u špric iz kubitalne vene. Studija se provodi na prazan želudac. Treba imati na umu da uzimanje nekih medicinski materijal može uticati na rezultat analize. Prije davanja krvi morate se suzdržati od pušenja i pijenja alkohola. Upotreba droga može iskriviti rezultate.
U slučaju negativnih vrijednosti imunoglobulina IgM, IgG, IgA, možemo govoriti o odsustvu bolesti ili njenom početna faza, moguć je i rezultat sa minusima kada potpuni oporavak nakon što je prošlo značajno vreme.
Ako IgA i IgM nisu otkriveni, a IgG je pozitivan, onda je vrlo vjerojatno mi pričamo o tome o formiranom imunitetu nakon zarazne bolesti ili nakon vakcinacije.
Ako IgA i IgM nisu otkriveni, a IgG je pozitivan, onda je po svoj prilici riječ o formiranom imunitetu nakon zarazne bolesti, ili nakon vakcinacije
U slučaju visokog titra IgM sa negativnim vrijednostima IgG i IgA, može se zaključiti da je riječ o akutnoj zaraznoj bolesti.
Simultaneous pozitivne vrijednosti Rezultati imunoglobulina - IgA, IgM, IgG su karakteristični za akutnu fazu relapsa postojeće hronične bolesti.
Šta predstavljena tehnologija pruža: određivanje prisustva helminta u krvi; traženje drugih patogena u tijelu; možete saznati razloge pogoršanja vašeg zdravlja; liječenje se također zasniva na testovima dobijenim na ovaj način; možete pratiti stanje vašeg imunološkog sistema.
Drugi dobra osobina– mogućnost praćenja markera raka bez obzira na njihovo porijeklo, ali naravno uz njihovu prisutnost u tijelu. Ovaj test takođe pogodan za opisivanje stanja reproduktivni sistem osoba. Prisustvo određenih proteina, hormona i peptida omogućava procjenu potencijala partnera u pogledu začeća djeteta, kao i očekivanog kvaliteta budućeg fetusa.
Test krvi na Giardia je prilično popularna praksa među modernim doktorima. Osim toga, ova metoda istraživanja je odličan alat za biomedicinsku analitiku i kvantitativnu statistiku u pogledu specifičnih antigena.
Kako se koristi enzimski imunosorbentni test?
Istina, to je više složeni slučajevi, stoga će kvalitet takve analize u velikoj mjeri zavisiti od laboratorijskog osoblja koje vrši ispitivanje. Karakteristike tehnologije i njena razlika od starih laboratorijskih studija:
- sada se umjesto uzorka stolice koristi krv za određivanje prisutnosti helminta;
- Uzorak se vrlo brzo proučava u laboratoriji, a potpune informacije se mogu dobiti već sljedeći dan;
- trošak laboratorijskog istraživanja je jeftin, budući da je teologija vrlo jednostavna;
- test krvi na helminte daje Visoke performanse tačnost.
Testovi za imunološku analizu krvi pomoću ELISA
Malo ljudi zna koje krvne pretrage postoje sa stanovišta ljudskog imunološkog sistema, jer ovi testovi nisu toliko česti. Takav test krvi u pravilu daje informacije o virusu imunodeficijencije u ljudskom tijelu i anoniman je, jer se provodi na zahtjev pacijenta.
Za uzorkovanje se koristi krv uzeta iz vene na prazan želudac, iz koje se dobija serum za ispitivanje centrifugiranjem. Osim toga, istraživanje krvnog seruma može otkriti brojne venerične bolesti(sifilis, herpes, klamidija), kao i sve vrste hepatitisa, malih boginja, rubeole, zaušnjaka i toksoplazmoze.
Uglavnom, za provođenje ELISA analize, ispitanici biološki materijal je krv, međutim, može se ispitati cerebrospinalnu tečnost, sadržaj staklastog tijela, amnionska tečnost i sl.
Imunoglobulini su imunološki molekuli koji se mogu vezati i neutralizirati većinu infektivnih patogena i toksina u tijelu. U ovom slučaju, najvažnija karakteristika imunoglobulina je njihova specifičnost, odnosno sposobnost vezivanja za određeni antigen. Upravo se ovo svojstvo koristi za provođenje krvnog testa na imunoglobulin.
Postoji pet vrsta imunoglobulina, ali su najviše proučavani imunoglobulini A, M i G. Imunoglobulini M i G pokazuju svoju aktivnost u krvi. Imunoglobulini A su svojevrsna barijera na površini sluzokože, jer su tamo prisutni u velikim količinama.
Imunološki test krvi vam omogućava da odredite vrstu imunoglobulina, zahvaljujući čemu ELISA omogućava ne samo dijagnosticiranje bolesti, već i određivanje stadija bolesti i praćenje dinamike bolesti:
- u prve 2 sedmice bolesti otkrivaju se samo imunoglobulini A;
- od 2. do 3. sedmice bolesti u krvi se otkrivaju imunoglobulini A i M;
- CC3 do 4. sedmice, test krvi na imunoglobulin otkriva sva tri tipa;
- nakon oporavka, imunoglobulini M nestaju iz krvi, a količina A i G se smanjuje za 2-4 puta;
- u prisustvu hroničnog procesa, imunoglobulini G su nužno prisutni u krvi, imunoglobulini M su odsutni, imunoglobulini A mogu ili ne moraju biti prisutni.
Opseg primjene imunološke analize krvi pomoću ELISA
- Dijagnostika virusne bolesti: hepatitis, herpes, Epstein-Barr virus, citomegalovirus, itd.;
- spolno prenosive infekcije: klamidija, gonoreja, trihomonas, mikoplazma, ureaplazma;
- sifilis; endokrinologija (određivanje nivoa hormona);
- tumor markeri (dijagnoza onkološke bolesti); imunologija (dijagnoza imunodeficijencije);
- alergologija (dijagnostika i liječenje alergija).
Serološki test krvi - laboratorijska metoda krvne pretrage koje se koriste u dijagnostičke svrhe zarazne bolesti i inscenacija infektivnog procesa. Serološka reakcija zasnovano na interakciji antitela i antigena.
Određivanje antigena se koristi za određivanje roda i vrste mikroorganizama. Ova metoda istraživanja koristi se u urologiji i venerologiji. Krv za serološka analiza krv se uzima ujutro na prazan želudac iz vene.
Indikacije za upotrebu i bolesti otkrivene ELISA testom
Glavni biomaterijal za ELISA je krvni serum: u laboratoriji se pacijentu uzima uzorak krvi iz vene, iz koje se potom vadi. oblikovani elementi, što komplikuje analizu. U nekim drugim slučajevima za analizu se koristi likvor, amnionska tečnost, razmaz sluzokože itd.
Kako bi se izbjegla izobličenja u rezultatima, preporučuje se davanje krvi na prazan želudac, a dvije sedmice prije testa (ako je cilj dijagnosticiranje kroničnih, latentnih zaraznih bolesti) potrebno je prestati uzimati antibiotike i antivirusne lijekove. Nemoguće pokriti puna lista indikacije za ELISA.
Neosporne prednosti ELISA-e su visoka osjetljivost i specifičnost metode. Osjetljivost je sposobnost prepoznavanja željene supstance, čak i ako je njena koncentracija u uzorku niska. Specifičnost podrazumijeva dijagnozu bez greške: ako je rezultat pozitivan, to znači da je pronađeno upravo ono antitijelo ili antigen koji se očekivao, a ne neki drugi.
ELISA je u velikoj mjeri zamijenila "zlatni standard" mikrobiologije - bakteriološka metoda dijagnostiku, tokom koje je za identifikaciju patogena bilo potrebno izolovati ga iz organizma, a zatim uzgajati kulturu na hranljivoj podlozi u epruveti nekoliko dana.
Sve vreme dok je analiza vršena, lekari su bili primorani da leče pacijenta „na slepo“, nagađajući poreklo mikroorganizma po simptomima bolesti. Određivanje IgM pomoću ELISA-e omogućava postavljanje tačne dijagnoze već u prvim danima bolesti.
Visok stepen Proizvodnost enzimskog imunotesta minimizira utjecaj ljudskog faktora, što smanjuje vjerovatnoću greške. Najviše se koristi u moderne laboratorije sistemi za testiranje i reagensi za ELISA se proizvode u industrijskim uslovima, što garantuje tačan rezultat.
Nedostaci ELISA metode
Nažalost, da biste proveli ELISA, morate znati šta tačno tražiti: tehnika analize podrazumijeva da liječnik unaprijed ima pretpostavku o prirodi bolesti. Stoga, nema smisla propisivati takav test u nadi da ćemo slučajno "pogoditi" dijagnozu.
U slučaju dijagnosticiranja zaraznih bolesti, enzimski imunotest ne može pronaći uzročnika i odrediti njegova specifična svojstva: on samo ukazuje na prisutnost antitijela u krvi pacijenta, što indirektno ukazuje na prisutnost stranog mikroorganizma u ljudskom tijelu. ELISA je izuzetno precizna, ali ne i jeftina metoda, tako da je morate koristiti mudro, a kvalifikovani ljekar bi trebao tumačiti rezultate.
Mogući rezultati ELISA
Ovisno o sadržaju analize, obrazac može prikazati podatke u obliku tabele sa popisom svih antitijela ili antigena sa napomenama o negativnim ili pozitivna reakcija, ili će biti naznačena kvantitativna vrijednost rezultata (negativno, slabo pozitivno, pozitivno ili jako pozitivno).
Poslednja opcija određuje koliko se antitijela nalazi u analiziranom uzorku. Drugi kvantitativni indikator je indeks avidnosti antitela, izražen u procentima. Označava koliko je vremena prošlo od početka infektivnog procesa (što je indeks veći, to više).
Danas se proizvode hiljade tipova ELISA test sistema, koji omogućavaju detekciju specifičnih antitela i antigena najviše razne patologije. Stoga se ova analiza koristi u gotovo svim medicinskim industrijama. Dijagnoza postavljena pomoću ELISA je garancija za propisivanje adekvatne terapije i efikasan tretman bolesti.
U prisustvu neophodni reagensi i dobrom organizacijom laboratorije, rezultat testa ćete dobiti u roku od 1-2 dana nakon uzimanja uzorka krvi. U nekim slučajevima, ako je potrebno dobiti hitnu reakciju, ovaj period se može smanjiti na 2-3 sata.
Zastupanje moderan izgled laboratorijsko testiranje, ELISA ili enzimski imunotest omogućava vam da pronađete specifična antitijela ili antigene na određene bolesti u krvi. To omogućava otkrivanje etiologije bolesti i određivanje njenog stadija. Štaviše, rezultati ove vrste istraživanja mogu se prikazati i kvantitativno i kvalitativno. Dakle, pogledajmo detaljno princip metode enzimskog imunoeseja, njegovu metodologiju i suštinu.
Šta je enzimski imunotest
Imenovan za maksimalnu kompletnost sveobuhvatna procjena zdravstveno stanje, enzimski imunotest omogućava procjenu opšte stanje zdravlja i procijeniti njegove zaštitne funkcije. Ovaj laboratorijski test omogućuje vam dijagnosticiranje infektivnih, autoimunih, hematoloških patologija pomoću krvnog testa.
Suština enzimskog imunoeseja razmatra se u videu ispod:
Kome je propisano?
Ova studija se može propisati onim pacijentima kod kojih su dijagnosticirane sljedeće bolesti:
- bolesti virusnog porekla, koji uključuju hepatitis,;
- spolno prenosive bolesti - klamidija, trihomonas, sifilis, ureaplazma, mikoplazma;
- imunodeficijencija;
- obavljanje preoperativnog sveobuhvatnog pregleda.
Takođe se propisuje ELISA test krvi za određivanje nivoa hormona i procenu kvaliteta vrste terapije koja se sprovodi.
Lekar može propisati ovu analizu da se utvrdi stadijum postojeće bolesti, što omogućava pravovremeno prilagođavanje primenjenog lečenja. A visoka tačnost dobijenih podataka omogućava vam da imate najsveobuhvatniju sliku zdravlja. Istovremeno, podaci se dobijaju nakon studije u vrlo kratkom vremenskom periodu, što omogućava praćenje dinamike razvoja patološki proces.
Zašto raditi takve testove?
Budući da je ELISA analizom krvi moguće dobiti značajnu količinu informacija o zdravstvenom stanju i patološkim procesima koji se dešavaju u organizmu, omogućava najpotpunije uzimanje u obzir početnih podataka (opće zdravstveno stanje, stadij bolesti). bolest, dinamika razvoja patološkog procesa, pokazatelj efikasnosti primijenjene terapije) pri sastavljanju režima liječenja.
Iz tog razloga, kako bi se dobio što izraženiji rezultat liječenja i najbrži prestanak patološkog procesa u organizmu, propisuje se ELISA test krvi. Ozbiljne bolesti imunološki sistem, prisustvo antigena u krvi i uzroci alergija na osnovu dobijenih podataka mogu se brže izliječiti najefikasnijim metodama.
Imenovanje ELISA analize provodi se za različite patologije, a treba je raditi samo prema propisu liječnika. Učestalost analize također određuje ljekar, a kada se krv daruje za ELISA analizu, slika bolesti je najpotpunija. Budući da je dobivanje dinamike toka bolesti moguće uzimanjem ovog testa više puta, najčešće se davanje krvi može propisati tri do pet puta. Ovo omogućava upoređivanje količine antitijela u krvi u različitim vremenskim periodima.
Vrste takvog postupka
Postoji nekoliko vrsta enzimskih imunotestova. Razlikuju se po vrsti tečnosti koja se uzima iz ljudskog organizma, na osnovu čega se proučava njen sastav i prisustvo određenih antigena.
U ovom slučaju, za analizu se može uzeti ne samo krv osobe, već i druge tečnosti:
- amnionska tečnost,
- cerebrospinalna tečnost,
- sadržaj staklastog tijela,
- udarci,
- sluz iz uretre i cervikalnog kanala.
Sama operacija uzimanja određene vrste tečnosti je standardna i izvodi se u dnevnoj bolnici.
Indikacije za testiranje
Tipično, ELISA test propisuje liječnik ako je potrebno da se dobije detaljna slika trenutne bolesti, koja se javlja u bilo kojem obliku: kroničnom, sporom ili akutnom. A sljedeća stanja i svrhe liječenja mogu se smatrati indikacijama za ovu vrstu analize:
- traženje antigena određenih bolesti;
- određivanje hormonskog statusa;
- otkrivanje virusa hepatitisa u tijelu;
- istraživanje o ;
- traženje antitijela na bilo koju vrstu zarazne bolesti;
- pregled na prisustvo autoimunih lezija organizma.
Za informacije o enzimskom imunotesti pogledajte video ispod:
Kontraindikacije za
Do danas nisu utvrđene kontraindikacije za enzimski imunotest.
Tokom trudnoće, kada postoji stalna promjena nivoa hormona u krvi, potrebno je više puta raditi ovu analizu kako bi se potvrdio dobijeni rezultat. Novorođenčad i djeca djetinjstvo takođe mogu imati netačne podatke analize: tokom intrauterinog razvoja, određene vrste antitela mogu ući u fetalnu krv kroz placentu majke. Stoga se njihovo prisustvo u analizi ne smije smatrati znakom postojeće infekcije.
Testirajte sigurnost
Provođenje postupka uzimanja bilo koje vrste tečnosti iz ljudskog organizma ne donosi nikakve negativne efekte na organizam. Potpuna sterilnost tokom manipulacija izbjegava rizik od infekcije bilo kojom vrstom bolesti.
Priprema za događaj
Da dobijete maksimum pouzdani rezultati istraživanja treba da se uzdrže od konzumiranja alkoholna pića i narkotike prije uzimanja krvi (ili druge tečnosti) za analizu.
Kako procedura funkcioniše i kako se osećate tokom nje
Za provođenje ELISA testa, pacijentova krv se uzima strogo na prazan želudac: ne biste trebali jesti bilo kakav oblik hrane najmanje nekoliko sati prije zahvata. Analiza se uzima iz ulnarne vene.
Prisustvo bolesti i uzete lijekove unaprijed se prijavljuje ljekaru, najčešće se uzimanje lijekova ukida u trenutku davanja krvi. Osjeti tokom postupka su slični vađenju krvi za biohemijsku analizu.
Dekodiranje rezultata
ELISA dijagnostika vam omogućava da utvrdite prisutnost infekcije u tijelu, aktivnost patološkog procesa i etiologiju postojeće infekcije. Brz prijem rezultata analize (u roku od 24 sata) jedna je od prednosti ove vrste istraživanja.
Proces dekodiranja primljenih informacija provodi liječnik. Treba uzeti u obzir da je tačnost dobijenih rezultata o dinamici bilo kojeg procesa zagarantovana kada se ispitivanja izvode u jednom laboratoriju.
Prosječna cijena procedure
Prosječna cijena ELISA testa ovisi o fokusu analize i određivanju specifičnih vrijednosti. Dakle, određivanje seroloških markera zaraznih bolesti razne vrste(anti-HAV IgG, anti-HAV IgM, HBsAg) koštat će od 200 do 320 rubalja i provodi se u roku od 2 radna dana. Troškovi ovog postupka također se smatraju njegovom prednošću: pristupačnost cijena za bilo koju vrstu istraživanja omogućava vam da provodite istraživanje u bilo kojoj veličini budžeta.
Cijena ELISA testiranja ovisi o politici medicinska ustanova, međutim, treba ga smatrati opće dostupnom procedurom koja omogućava dobivanje detaljne slike postojeće bolesti i pružanje najpotpunijeg liječenja.
O normama i karakteristikama ELISA istraživanja pogledajte video u nastavku:
(link na 3. članak u ovoj datoteci), koji omogućava procjenu sposobnosti organizma da se odupre zaraznim bolestima i prikazuje fazu bolesti, enzimski imunosorbentni test (ELISA) igra važnu ulogu. Provođenje ove studije omogućuje vam da sveobuhvatno procijenite aktivnost zaštitne funkcije krvi i identificirate stanje imunodeficijencije u zaraznim patologijama, kao i bolestima krvi, autoimunim procesima i hormonalnim problemima.
Kako je moguće obuhvatiti toliko ciljeva u jednoj analizi i koje indikacije postoje za njeno sprovođenje? Pokušajmo to shvatiti.
Šta je test krvi koji se radi ELISA metodom?
Ovo je laboratorijski test koji vam omogućava da odredite prisutnost specifičnih antitijela (zaštitni faktori krvi proteinske prirode) na određene antigene (patogene agense). Među antitijelima primarni značaj imaju imunoglobulini koji mogu postojati u obliku imunokompleksa.
Imunoglobulini nastaju kao rezultat složenih ljudskih neurohumoralnih reakcija koje nastaju kao odgovor na uvođenje stranih antigena. Svaka vrsta patogena proizvodi svoja specifična antitijela. Djeluju tako što "vezuju" antigen ili patološki mikroorganizam, formirajući kompleks "antigen-antitijelo" spoj, nakon čega slijedi neutralizacija, enzimska liza, reakcije fagocitoze i uklanjanje iz tijela.
Bilješka:Upravo prisustvom određenih kompleksa ELISA metoda određuje vrstu patogena ili štetne tvari prisutne u pacijentu.
Znati osnovni principi Možete vidjeti kako ljudski imunološki sistem funkcionira ako pogledate ovaj video recenzija:
Šta su imunoglobulini?
Otkriveno je i proučavano 5 glavnih klasa imunoglobulina - IgA, IgM, IgG, IgD, IgE. uloga ostatka još nije u potpunosti razjašnjena i pod naučnim je istraživanjem.
Bilješka:U praktičnoj medicini najvažniji su imunoglobulini klasa A, M i G. Informativnost definicije zasniva se na različitim vremenskim intervalima njihovog pojavljivanja, maksimuma i nestanka.
Razmotrimo ovo pitanje detaljnije.
Glavni zadatak imunoglobulin A (IgA) sastoji se u zaštitnim funkcijama sluzokože respiratornog trakta, gastrointestinalnog trakta i mokraćnog sistema. U akutnom početku bolesti nemoguće ih je identificirati. Ovi zaštitni kompleksi se pojavljuju tek od 2. sedmice od početka bolesti, ponekad i kasnije. Najveći dio imunoglobulina A koncentriran je u mukoznim tkivima. Otprilike oko 80%. Preostala antitijela cirkuliraju u krvi. Glavna funkcija je neutralizacija i uništavanje mikroorganizama. Nakon povlačenja akutnih manifestacija bolesti, količina ovih imunoglobulina počinje opadati i potpuno nestaje do 8 sedmica od početka bolesti. Ako se IgA otkrije kasnije, to ukazuje na kronični proces.
Glavni i prvi markeri akutne faze razvoja patologije su imunoglobulini klase M (IgM). Otkrivaju se do 5. dana od početka bolesti. Njihovo prisustvo u krvi može se utvrditi u roku od oko 6 sedmica. Tada počinju brzo nestajati.
Rezidualni imunološki odgovor karakterizira prisustvo u krvi imunoglobulini klase G (IgG). Pojava ovih faktora u krvi otkriva se otprilike mjesec dana nakon pojave bolesti. U budućnosti se mogu određivati više mjeseci, godina, pa čak i cijeli život, vršeći zaštitnu funkciju od povratka (relapsa) bolesti, au nekim slučajevima onemogućujući sekundarni razvoj patologije. Ako količina imunoglobulina G ponovo počne da raste, onda se može posumnjati na ponovnu infekciju. Sličan zaključak se može izvući vođenjem dva ili tri uzorka uzeta u razmaku od 2 sedmice.
Imunoglobulin D (IgD) nalazi se na B-limfocitima, a nalazi se u niskim koncentracijama u zdravi ljudi. Nakon 10 godina života dostiže svoje maksimalne vrijednosti. Količina imunoglobulina D se povećava tokom trudnoće, kod pacijenata sistemske bolesti vezivno tkivo, bolesti uzrokovane imunodeficijencijom.
Indikacije za primjenu enzimskih imunoloških testova krvi
Određivanje antitijela na prisutnost u tijelu patogenih mikroba koji uzrokuju:
- trihomonijaza;
- ureaplazmoza i
Dolazi do povećanja količine imunoglobulina i sa.
Dijagnostika se provodi radi otkrivanja:
- herpetične bolesti;
- grupe virusnih hepatitisa;
- Epstein-Barr virus;
- citomegoalovirus.
Pomoću ELISA-e možete utvrditi prisutnost antitijela na 600 vrsta alergena, otkriti stanje imunodeficijencije, ponašati se sveobuhvatan pregled prije operacije transplantacije izvršite sveobuhvatna analiza u pogledu efikasnosti lečenja.
ELISA je dodatna metoda otkrivanje ćelija raka.
Kako se izvodi ELISA krvi?
Za enzimski imunotest se u većini slučajeva koristi krv pacijenta; ponekad se sakupljaju staklasto tkivo, tečnost kičmenog kanala i amnionska tečnost.
Krv se vuče kroz injekcijsku iglu u špric iz kubitalne vene. Studija se provodi na prazan želudac. Treba imati na umu da uzimanje određenih lijekova može utjecati na rezultat testa. Prije davanja krvi morate se suzdržati od pušenja i pijenja alkohola. Upotreba droga može iskriviti rezultate.
U slučaju negativnih vrijednosti imunoglobulina IgM, IgG, IgA, može se govoriti o odsustvu bolesti ili njenoj početnoj fazi; negativan rezultat je moguć i uz potpuni oporavak nakon značajnog vremena.
Ako se IgA i IgM ne otkriju, a IgG je pozitivan, onda je po svoj prilici riječ o formiranom imunitetu nakon zarazne bolesti, odnosno nakon vakcinacije.
U slučaju visokog titra IgM sa negativnim vrijednostima IgG i IgA, može se zaključiti da je riječ o akutnoj zaraznoj bolesti.
Simultane pozitivne vrijednosti rezultata imunoglobulina - IgA, IgM, IgG karakteristične su za akutnu fazu relapsa postojeće kronične bolesti.
Za hronična infekcija, koji je u fazi smirivanja procesa (remisija), ELISA pokazuje negativne vrijednosti imunoglobulina M (IgM), dok će rezultat imunoglobulina G (IgG) i A (IgA) biti pozitivan.
Prednosti metode enzimskog imunotestiranja krvi
Glavne prednosti ELISA metode su:
- niska cijena analize;
- dijagnostička specifičnost, tačnost;
- dinamička kontrola (ponavljanje analize radi utvrđivanja efikasnosti liječenja i stadijuma bolesti);
- mogućnost provođenja masovnih pregleda u područjima infekcije;
- brzina dobijanja rezultata;
- relativna jednostavnost analize;
- mogućnost upotrebe informacione tehnologije u preradi;
- sigurnost i bezbolnost za pacijenta.
Postoje li nedostaci ELISA-e krvi?
Main negativna tačka istraživanje je mogućnost dobijanja lažno negativnih i lažno pozitivnih podataka. Uzrok nesporazuma mogu biti tehnički nedostaci ili upotreba lijekova koji mogu iskriviti sliku.
ELISA se koristi za otkrivanje:
- (ascaris, pinworms);
- akutna i hronični oblik opisthorhijaza;
- trihineloza;
- prisustvo Giardia (kao dodatna analiza);
- oblici lajšmanijaze;
- amebijaza;
- sadržaj toksoplazme;
U zaključku, treba napomenuti da je moderna imunologija stalno u fazi razvoja, u potrazi za novim metodama za dijagnosticiranje i liječenje bolesti.
Stepanenko Vladimir, hirurg
5.1 Suština i klasifikacija ELISA.
ELISA se pojavila sredinom 60-ih i prvobitno je razvijena kao metoda za identifikaciju antigena u histološkom uzorku, kao i za vizualizaciju taložnih linija u testovima imunodifuzije i imunoelektroforeze, a zatim se počela koristiti za kvantitativno određivanje antigena i antitijela u biološke tečnosti. U razvoju metode su učestvovali E. Engvall i R. Pählman, kao i, nezavisno, W. Van Weeman i R. Schurs.
Rice. 6 Osnovni princip ELISA:
za identifikaciju antigena; 2) za otkrivanje antitela
Metoda se zasniva na specifičnom vezivanju antitela za antigen, pri čemu je jedna od komponenti konjugovana sa enzimom; kao rezultat reakcije sa odgovarajućim hromogenim supstratom nastaje obojeni proizvod čija se količina može odrediti spektrofotometrijski (slika 6).
Otkriće mogućnosti imobilizacije antigena i antitijela na različitim nosačima uz održavanje njihove aktivnosti vezivanja omogućilo je proširenje primjene ELISA-e u različitim poljima biologije i medicine.
Pojava monoklonskih antitijela doprinijela je daljem razvoju ELISA testa, što je omogućilo povećanje njegove osjetljivosti, specifičnosti i ponovljivosti rezultata.
Teoretski, ELISA se zasniva na podacima iz savremene imunohemije i hemijske enzimologije, poznavanju fizičko-hemijskih zakona reakcije antigen-antitelo, kao i na glavnim principima analitičke hemije. Osetljivost ELISA testa i vreme koje je potrebno određuju nekoliko glavnih faktora: kinetičke i termodinamičke karakteristike reakcije antigen-antitelo, odnos reagensa, aktivnost enzima i razrešenje metoda njegove detekcije. IN opšti pogled Reakcija antigen-antitijelo može se opisati jednostavnom shemom:
+[AG]↔[ATAG]
Raznolikost objekata proučavanja od niskomolekularnih spojeva do virusa i bakterija, kao i neobično širok spektar zadataka povezanih s različitim uvjetima za korištenje ELISA-e, određuju razvoj izuzetno velikog broja varijanti ove metode.
Bilo koja verzija ELISA-e sadrži 3 obavezne faze:
1. faza prepoznavanja ispitivanog jedinjenja od strane antitela koje je specifično za njega, što dovodi do stvaranja imunog kompleksa;
2. faza formiranja veze konjugata sa imunim kompleksom ili sa slobodnim mestima vezivanja;
3. faza pretvaranja enzimske oznake u snimljeni signal. Klasifikacija ELISA metoda zasniva se na nekoliko pristupa:
1. Na osnovu vrste reagensa prisutnih u prvoj fazi ELISA, razlikuju se kompetitivne i nekonkurentne metode.
A) U kompetitivnoj ELISA testu, u prvoj fazi, sistem sadrži i analizirano jedinjenje i njegov analog, obeležen enzimom i takmiči se za specifična mesta vezivanja sa njim.
B) Nekonkurentne metode karakteriše prisustvo u sistemu u prvoj fazi samo analiziranog jedinjenja i za njega specifičnih centara vezivanja.
2. Sve ELISA metode se dijele na homogene i heterogene.
Ako se sva tri etapa ELISA odvijaju u rastvoru i između glavnih faza nema dodatnih koraka za odvajanje formiranih imunih kompleksa od neizreagovanih komponenti, metoda spada u grupu homogenih.
Osnova homogene ELISA, koja se po pravilu koristi za određivanje niskomolekularnih supstanci, je inhibicija aktivnosti enzima kada se kombinuje sa antigenom ili antitijelom. Aktivnost enzima se obnavlja kao rezultat reakcije antigen-antitijelo.
Kada se antitijelo veže za antigen koji sadrži enzimsku oznaku, aktivnost enzima je inhibirana za 95% u odnosu na supstrat visoke molekularne težine, što je posljedica sterične isključenosti supstrata iz aktivnog centra enzima. Kako se koncentracija antigena povećava, veže se više antitijela i ostaje više slobodnih konjugata antigen-enzim, sposobnih za hidrolizu supstrata visoke molekularne težine. Analiza se izvodi vrlo brzo, za jedno određivanje potrebno je 1 minut. Osetljivost metode je prilično visoka. Može se koristiti za određivanje supstance na nivou pikomola.
Heterogene metode karakteriše analiza u dvofaznom sistemu uz učešće čvrste noseće faze i obavezna faza odvajanja imunih kompleksa od neizreagovanih komponenti (ispiranje), koje se nalaze u različite faze(formirani imuni kompleksi su u čvrstoj fazi, a neizreagovani kompleksi su u rastvoru). Heterogene metode u kojima se formiranje imunoloških kompleksa u prvoj fazi događa na čvrstoj fazi nazivaju se metode čvrstog stanja.
Metode se klasifikuju kao homogeno-heterogene ako se u 1. fazi - formiranje specifičnih kompleksa javlja u rastvoru, a zatim se za razdvajanje komponenti koristi čvrsta faza sa imobilisanim reagensom.
3. Prema principu određivanja ispitivane supstance:
A) Direktno određivanje koncentracije supstance (antigena ili antitijela) prema broju veznih mjesta koja s njom djeluju. U ovom slučaju, oznaka enzima će se nalaziti u formiranom specifičnom AG-AT kompleksu. Koncentracija analita će biti direktno proporcionalna snimljenom signalu.
B) Određivanje koncentracije supstance razlikom ukupan broj vezna mjesta i preostala slobodna vezna mjesta. U tom slučaju će se koncentracija analita povećati, a snimljeni signal smanjiti, pa u ovom slučaju postoji inverzna ovisnost o veličini snimljenog signala.
5.2 Karakteristike komponenti koje se koriste u ELISA testu.
Enzimi.
Enzimske oznake imaju izuzetno snažan katalitički učinak; jedna molekula enzima može reagirati s velikim brojem molekula supstrata. Stoga se enzim prisutan u malim količinama može identificirati i kvantificirati stvaranjem proizvoda i reakcijom koju katalizira. Još jedna prednost korištenja enzima kao oznaka je zbog prisutnosti u molekuli brojnih funkcionalnih grupa (sulfhidril, karboksil, tirazinski ostaci, itd.), preko kojih se molekuli liganda mogu kovalentno vezati.
Enzimski markeri koji se koriste u ELISA testu moraju imati sljedeća svojstva:
– visoka aktivnost i stabilnost enzima u analitičkim uslovima, kada je modifikovan iu konjugaciji sa antitelima ili drugim proteinima;
– prisutnost osjetljivih supstrata i jednostavnost metode za određivanje produkata ili supstrata enzimske reakcije;
– sposobnost prilagođavanja sistema supstrata daljem jačanju;
– odsustvo enzima i njegovih inhibitora u ispitivanom stanju biološka tečnost.
Najmanje 15 različitih enzima se može koristiti u ELISA testu. U skladu sa gore navedenim zahtevima najčešće se koriste peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza (ALP) i β-D-galaktozidaza. Sva tri su stabilna i katalizuju vrlo osjetljive reakcije. Osim toga, proizvodi koji nastaju reakcijama kataliziranim ovim enzimima, ovisno o korištenom supstratu, mogu se detektirati ne samo kolorimetrijskim metodama, već i fluorescentnim metodama. Drugi enzimi se koriste mnogo rjeđe. Ovo se objašnjava njihovom nižom specifičnom aktivnošću u odnosu na PC i AP.
Podloge.
Izbor supstrata prvenstveno je određen enzimom koji se koristi kao oznaka, budući da je reakcija enzim-supstrat vrlo specifična.
Osnovni zahtjevi za podlogu:
– obezbeđivanje visoke osetljivosti metode u detekciji enzima u konjugatu;
– formiranje dobro prepoznatljivih (na primjer, obojenih) proizvoda reakcije enzim-supstrat;
– podloga mora biti sigurna, jeftina, pristupačna i pogodna za upotrebu.
Češće se koriste kromogeni supstrati, koji, kada se unište, formiraju obojenu tvar. Obećavajuće je korištenje visokoenergetskih supstrata – fluorescentnih, hemiluminiscentnih. Upotreba takvih supstrata omogućava teoretski povećanje osjetljivosti ELISA-e za dva reda veličine.
Formiranje konjugata.
Konjugat je antigen ili antitijelo označeno enzimskom oznakom. Formiranje konjugata je jedan od važne faze provođenje ELISA.
Prilikom formiranja konjugata odabire se optimalna metoda za uvođenje enzimske oznake tako da obje komponente konjugata zadrže svoju biološku aktivnost: enzim - sposobnost interakcije sa supstratom, a antigen ili antitijelo - antigenost i aktivnost vezanja antigena. , odnosno. Prisustvo obilježenog, visoko pročišćenog antigena omogućava korištenje kompetitivnih metoda. U ovom slučaju, u završnoj fazi moguće je izmjeriti aktivnost konjugata koji nije povezan s imobiliziranim antitijelima, čime se izbjegava postupak ispiranja i analiza čini praktičnijom. Međutim, antigeni su različiti po svojim fizičko-hemijskim svojstvima i strukturi, što znači da je nemoguće razviti univerzalne metode za dobijanje konjugata sa antigenom. U ovom slučaju, dobijanje konjugata antigen-enzim predstavlja poseban složen zadatak. Priprema obilježenih antitijela za ELISA metodički je pristupačnija.
Konjugacija enzima sa imunohemijski aktivnim proteinima vrši se različitim metodama: hemijskim umrežavanjem, kovalentnim vezivanjem molekula enzima za Ag ili AT i stvaranjem jedinjenja preko nekovalentnih veza, na primer, kada je veza između enzima a Ag ili AT se odvija imunološki, kroz interakciju antigen-antitijelo.
Najrasprostranjenije su kovalentne metode za pripremu konjugata. Izbor reakcije vezivanja određen je tipom funkcionalnih grupa dostupnih u datim proteinskim molekulima. Glutaraldehid, natrijum perjodat, itd. se koriste kao reagensi koji se koriste za uvođenje enzima u molekule antigena i antitela.
Postoje metode u jednom i dva koraka za dobijanje konjugata pomoću glutaraldehida. Mogu se formirati konjugati različitih veličina sa smanjenom enzimskom aktivnošću (15 - 60% slobodnog enzima). Dobijeni konjugat velike veličine može sterički ometati određivanje ispitivane tvari. Konjugati s relativno malom molekulskom težinom sastoje se od Fab fragmenta i jednog molekula enzima.
Kao rezultat dvostepene sinteze, koja se sastoji od postupne proizvodnje enzima prvo modificiranog agensom za umrežavanje, njegovog izolovanja, a zatim njegove naknadne interakcije s antigenom (antitijelom), molekule formiraju se homogeni sastavi koji sadrže 1-2 molekula enzima po molekuli imunoglobulina i održavaju visoku enzimsku i imunološku aktivnost. Međutim, broj takvih konjugata je mali (za peroksidazu hrena iznosi 5-10%).
Najveća praktična primena nađena je u metodi dobijanja konjugata imunoperoksidaze, zasnovanoj na oksidaciji ugljenohidratne komponente enzima natrijum perjodatom (vezivanje peroksidaze u konjugat dostiže 70-90% početne količine enzima).
Pouzdan konjugat mora imati sljedeća svojstva:
Visoka snaga antitijela i visok afinitet za antigen tako da se može koristiti u visokom razrjeđenju i na taj način smanjiti nespecifično vezivanje;
Dovoljna specifičnost u radnom razrjeđivanju;
Prevladavanje monomernih oblika nad polimernim, jer polimerni oblici imaju tendenciju da se nespecifično prianjaju na plastiku, što rezultira visokim pozadinskim nivoom reakcije;
Optimalni molarni omjer između enzima i antitijela (optimalni omjer je oko 1:1);
Dovoljna enzimska aktivnost konjugata. Ovo svojstvo je određeno uglavnom uslovima konjugacije i omjerom molekula enzima i antitijela u konjugatu.
5.3 Heterogene ELISA metode.
Heterogene ELISA (ili ELISA čvrste faze) uključuju metode u kojima je analit prisutan u dvije faze. Za odvajanje komponenti imunokemijske reakcije koristi se čvrsta faza (nerastvorljivi nosač, obično plastika) na kojoj su imobilizirana antitijela ili antigen, koja se ispire u svakoj fazi kako bi se uklonile intermedijarne i neizreagirane komponente.
Imobilizacija se može provesti kovalentnim vezivanjem antitijela (antigena) na aktivirani nosač korištenjem kemijskih pristupa, kao i fizičkom adsorpcijom antitijela (antigena) na površini čvrstih polimera (na primjer, polistirenske ploče). U stranoj literaturi ovaj smjer se naziva ELISA test ili enzimski imunosorbentni test.
Nekonkurentna ELISA za određivanje antigena na primjeru upotrebe enzimom obilježenih specifičnih antitijela i imobiliziranih antitijela.
Rastvor koji sadrži antigen koji se analizira dodaje se u nosač sa imobilisanim antitelima. Tokom procesa inkubacije formira se specifični kompleks antigen-antitijelo. Zatim se nosač ispere od nevezanih antigena i dodaju se označena antitela – konjugat. U ovom slučaju, količina vezanog konjugata je direktno proporcionalna količini antigena u uzorku za testiranje. Nakon sekundarne inkubacije i uklanjanja viška konjugata, dodaje se hromogeni supstrat za korišćeni enzim, koji pod dejstvom enzima menja boju, odnosno dolazi do enzimske reakcije sa bojenjem rastvora u jažicama. Stepen obojenosti je direktno proporcionalan količini specifičnih antitijela označenih enzimom, enzimom i, shodno tome, antigenom koji se proučava. Mjerenja optičke gustoće otopine u jažicama na određenoj talasnoj dužini (ovisno o korištenom supstratu) vrše se pomoću posebnih spektrofotometara prilagođenih čitačima mikroploča. Kvantitativna procjena koncentracije antigena u uzorku utvrđuje se poređenjem rezultata sa kalibracionom krivuljom zavisnosti optičke gustine rastvora o koncentraciji standardnog rastvora antigena.
Slika 7.
Budući da je u fazi identifikacije specifičnog imunokompleksa antigen povezan s molekulima imobiliziranih i označenih antitijela, u literaturi se ova metoda često naziva „sendvič“ metoda (od engleskog sendvič) ili ELISA metoda na dva mjesta (od engleski test na dvije lokacije).
Ova metoda se može koristiti za analizu samo onih antigena koji na svojoj površini imaju najmanje dvije antigenske determinante. Neprihvatljivo je za analizu velikog broja monovalentnih antigena (ljekovitih jedinjenja, pesticida itd.).
Glavna prednost ovu metodu– visoka osetljivost. Granica detekcije spojeva ovom metodom trenutno dostiže vrijednost od oko 10-21 mol, što odgovara detekciji samo 600 molekula analita u uzorku. Maksimalna senzitivnost se postiže kada se svaka imunološka reakcija odvija u ravnoteži, što utiče na trajanje analize, koje u prosjeku iznosi 4-6 sati. Nekonkurentna ELISA za određivanje antitijela na primjeru korištenja sekundarnih antitijela označenih enzimima i imobiliziranih antigena.
Test serum se dodaje imobiliziranom antigenu. Nakon inkubacije i ispiranja nevezanih antitijela, dodaju se označena sekundarna antitijela koja su specifična za antitijela koja se analiziraju. Nakon sekundarne inkubacije i uklanjanja viška obilježenih sekundarnih antitijela, sadržaj enzimske oznake na nosaču je proporcionalan koncentraciji specifičnih antitijela u serumu.
Ova shema je jedna od najčešćih ELISA testova za otkrivanje antitijela, jer omogućava otkrivanje antitijela na različite antigene.
Heterogena kompetitivna ELISA za određivanje antigena na primjeru upotrebe obilježenog antigena i imobiliziranih antitijela.
Antitijelima imobiliziranim na nosaču dodaje se otopina koja sadrži antigen koji se analizira i fiksnu koncentraciju konjugata antigen-enzim. Nakon inkubacije, nosač se ispere od nevezanog slobodnog i označenog antigena i bilježi se enzimska aktivnost na nosaču, koja je obrnuto proporcionalna koncentraciji antigena koji se utvrđuje.
5.4 Homogena ELISA metoda.
Homogeni enzimski imunotest (HELISA) je metodološki najjednostavniji tip ELISA testa. Kada se izvede, jedan od učesnika u imunološkoj reakciji (obično niskomolekularni antigen) biva obeležen enzimom i prati se napredak formiranja kompleksa antigen-antitelo, beležeći promene u aktivnosti enzima.
Takvo kršenje enzimske aktivnosti može nastati ili zbog prostornog odvajanja enzima i supstrata, ili zbog konformacijskih promjena u molekuli enzima koje prate formiranje imunološkog kompleksa. HIFA ima niz značajnih prednosti u odnosu na druge imunohemijske metode. Prvo, visoka ekspresija (cijela analiza korištenjem HIFA traje nekoliko minuta, pa čak i djelića minuta).
Rice.8 Homogeni enzimski imunološki testovi(A - efekat razdvajanja enzima (F) i supstrata (C) zbog steričnih smetnji tokom interakcije antigena (Ag) i antitela (Ab); B - efekat promene konformacije) enzim tokom formiranja kompleksa antigen-antitelo).
Drugo, metoda je jednostepena i ne zahtijeva naporne i dugotrajne korake pranja. I na kraju, treće, metoda zahtijeva minimalne zapremine (8-50 μl) i količine biološkog ili kliničkog uzorka. Međutim, HIFA metoda ima jedan izuzetno značajan nedostatak - na njenoj osnovi moguće je kreirati dijagnostičke testne sisteme samo za antigene niske molekularne težine. Samo u ovom slučaju, antitelo, u interakciji sa antigenom, može efikasno zaštititi ili modifikovati molekul enzima povezan sa ovim antigenom. Upravo u tom smislu, (uprkos prividnoj jednostavnosti i očiglednim prednostima u odnosu na druge metode, stvoreni su dijagnostički alati na bazi HIFA za otkrivanje samo hormona, peptida, medicinskih i narkotičkih supstanci i nekih niskomolekularnih proteina.
5.5 “Sendvič” - ELISA varijanta za otkrivanje antigena.
Antigeni otkriveni korištenjem ove ELISA varijante moraju imati više epitopa sposobnih da vežu antitijela, ili moraju imati ponavljajuće, prostorno odvojene epitope iste specifičnosti.
Prilikom izvođenja ove verzije ELISA-e, visoko specifična poli- ili monoklonska antitijela adsorbirana na čvrstoj fazi inkubiraju se sa test uzorkom. Nakon postupka ispiranja, enzimski obilježena antitijela (konjugat) na isti antigen se dodaju u jažice i zatim se provode svi ostali stadiji reakcije. Efikasnost formiranja specifičnog kompleksa u svakoj fazi analize zavisi od konstante vezivanja reakcije antigen-antitelo.