Ibig sabihin ang analysis ifa. Ano ang ibig sabihin ng positibong resulta ng ELISA (enzymatic immunoassay)? Kabilang sa mga benepisyo ng ELISA ng dugo

Ang diagnostic method (ELISA) ay nagbibigay-kaalaman at hindi masyadong mahal, kaya maraming mga laboratoryo ang nag-aalok sa kanilang mga kliyente ng ganitong paraan (enzyme-linked immunosorbent assay). Ang pag-aaral ay isinasagawa sa isang walang laman na tiyan, ang dugo para sa pagsusuri ay kinuha mula sa cubital vein ng pasyente. Bago ang ELISA, ipinapayong huwag manigarilyo o uminom ng alak.

Ano ang ELISA blood test?

Kabilang sa mga pamamaraan ng pagsusuri ng dugo na nagbibigay-daan upang masuri ang kakayahan ng katawan na lumaban Nakakahawang sakit at pagpapakita ng yugto ng sakit, mahalagang lugar tumatagal naka-link na immunosorbent assay(KUNG ANG). Ang pagsasagawa ng pag-aaral na ito ay nagpapahintulot sa iyo na komprehensibong masuri ang aktibidad ng proteksiyon na function ng dugo at tukuyin ang estado ng immunodeficiency sa mga nakakahawang patolohiya pati na rin ang mga sakit sa dugo, mga proseso ng autoimmune, mga problema sa hormonal.

Ito pananaliksik sa laboratoryo, na nagpapahintulot sa iyo na matukoy ang pagkakaroon ng mga tiyak na antibodies ( proteksiyon na mga kadahilanan dugo na may likas na protina) sa ilang antigens (pathogenic agent). Kabilang sa mga antibodies na pinakamahalaga ay ang mga immunoglobulin, na maaaring umiral sa anyo ng mga immunocomplex.

Ang mga immunoglobulin ay ginawa bilang resulta ng mga kumplikadong neurohumoral na reaksyon ng kaligtasan sa tao na nangyayari bilang kakayahang tumugon sa pagpapakilala ng mga dayuhang antigens. Ang bawat uri ng pathogen ay gumagawa ng sarili nitong mga tiyak na antibodies. Ang mga ito ay kumikilos sa pamamagitan ng "pagbibigkis" ng isang antigen o isang pathological microorganism, na bumubuo ng isang "antigen-antibody" complex compound, na sinusundan ng neutralization, enzymatic lysis, mga reaksyon ng phagocytosis at paglabas mula sa katawan. Ito ay sa pamamagitan ng pagkakaroon ng ilang mga complexes na tinutukoy ng ELISA method ang uri ng pathogen o nakakapinsalang substance na nasa pasyente.

Ito ay nagkakahalaga ng pag-alala na pagkatapos ng kurso ng paggamot, ang mga antibodies ay maaaring manatili sa ating katawan sa napakatagal na panahon, kahit na ang impeksyon ay umalis sa ating katawan, i.e. ang tinatawag na "serological scar" ay nananatili. Upang magbigay ng isang halimbawa: mayroong libu-libong bituin sa kalangitan sa gabi. Marami sa mga bituin na ito ay matagal nang namatay, ngunit ang kanilang liwanag ay sumisikat pa rin sa atin sa loob ng maraming siglo. Kung tutuusin, bakas lang ng bituin ang nakikita natin. May liwanag, ngunit ang mga bituin ay matagal nang nawala.

Ngunit kung walang ilaw, hindi ito nangangahulugan na wala ang bituin. Totoo rin ito sa mga antibodies. Ang kanilang presensya ay hindi ginagarantiyahan ang pagkakaroon ng ninanais na nakakahawang ahente sa katawan. Ang kawalan ng antibodies ay hindi nangangahulugan na walang impeksyon. Kung ang resulta ng pagsusuri ng ELISA ay positibo, nangangahulugan ito na kailangan mong hanapin ang impeksyon na may mas tiyak at mamahaling pamamaraan - PCR, mga kulturang bacteriological. Posibleng hindi totoo positibong resulta kung ilang microbes ay may katulad antigenic na istraktura, pagkatapos ay ang "katulad" na mga antibodies ay gagawin sa iba't ibang microbes.

Ano ang mga immunoglobulin

5 pangunahing klase ng immunoglobulins ang natuklasan at pinag-aralan - IgA, IgM, IgG, IgD, IgE. ang papel ng iba ay hindi pa ganap na naipaliwanag at sila ay nasa yugto ng siyentipikong pananaliksik.

Ang pangunahing gawain ng immunoglobulin A (IgA) ay ang mga proteksiyon na pag-andar ng mga mucous membrane respiratory tract, gastrointestinal tract at sistema ng ihi. Sa isang talamak na pagsisimula ng sakit, imposibleng makilala ang mga ito. Ang mga proteksiyon na complex na ito ay lilitaw lamang mula sa ika-2 linggo ng pagsisimula ng sakit, minsan mamaya. Ang bulk ng immunoglobulin A ay puro sa mga mucous tissue. Humigit-kumulang 80%. Ang natitirang mga antibodies ay umiikot sa dugo.

Ang pangunahing pag-andar ay ang neutralisasyon at pagkasira ng mga microorganism. Pagkatapos ng paghupa talamak na pagpapakita sakit, ang bilang ng mga immunoglobulin na ito ay nagsisimulang bumaba at ganap na nawawala hanggang 8 linggo pagkatapos ng pagsisimula ng sakit. Kung ang IgA ay matatagpuan sa higit sa late na mga petsa, pagkatapos ay nagsasaad ito ng chronization ng proseso.

Pangunahin at unang mga marker talamak na yugto pagbuo ng patolohiya ay class M immunoglobulins (IgM). Ang mga ito ay matatagpuan sa ika-5 araw ng simula ng karamdaman. Maaari mong matukoy ang kanilang presensya sa dugo para sa mga 6 na linggo. Pagkatapos ay nagsisimula silang mawala nang mabilis.

Ang natitirang immune response ay nagpapakilala sa pagkakaroon ng class G immunoglobulins (IgG) sa dugo. Ang hitsura ng mga salik na ito sa dugo ay napansin humigit-kumulang isang buwan pagkatapos ng pagsisimula ng sakit. Sa hinaharap, maaari silang matukoy para sa maraming buwan, taon, at kahit na habang-buhay, gumaganap proteksiyon na function mula sa pagbabalik (pagbabalik) ng sakit, at sa ilang mga kaso na ginagawang imposible para sa pangalawang pag-unlad ng patolohiya.

Kung ang halaga ng immunoglobulin G ay nagsimulang tumaas muli, kung gayon ang muling impeksyon ay maaaring pinaghihinalaan. Ang isang katulad na konklusyon ay maaaring iguguhit sa pamamagitan ng pagsasagawa ng dalawa o tatlong sample na kinuha na may pagitan ng 2 linggo.

Paano isinasagawa ang ELISA ng dugo?

Para sa enzyme-linked immunosorbent assay, sa karamihan ng mga kaso, ang dugo ng mga pasyente ay ginagamit, kung minsan ay kinukuha ang tissue vitreous na katawan, likido spinal canal, amniotic fluid.

Ang dugo ay iginuhit sa pamamagitan ng isang injection needle sa isang syringe mula sa cubital vein. Ang pag-aaral ay isinasagawa sa walang laman na tiyan. Dapat tandaan na ang pagkuha ng ilan medikal na paghahanda maaaring makaapekto sa resulta ng pagsusuri. Bago mag-donate ng dugo, dapat mong pigilin ang paninigarilyo, pag-inom ng alak. Ang paggamit ng mga narcotic substance ay maaaring masira ang mga resulta.

Sa kaso ng mga negatibong halaga ng immunoglobulins IgM, IgG, IgA, maaari nating pag-usapan ang kawalan ng isang sakit o ang unang bahagi, posible rin ang isang resulta na may mga minus para sa magaling na pagkatapos ng isang makabuluhang tagal ng panahon.

Kung ang IgA at IgM ay hindi nakita, at ang IgG ay positibo, kung gayon sa lahat ng posibilidad nag-uusap kami tungkol sa nabuong kaligtasan sa sakit pagkatapos ng isang nakakahawang sakit, o pagkatapos ng pagbabakuna.

Kung ang IgA at IgM ay hindi nakita, at ang IgG ay positibo, kung gayon sa lahat ng posibilidad ay pinag-uusapan natin ang nabuong kaligtasan sa sakit pagkatapos ng isang nakakahawang sakit, o pagkatapos ng pagbabakuna.

Sa kaso ng isang mataas na titer ng IgM na may negatibong mga halaga ng IgG, IgA, maaari itong tapusin na mayroong isang talamak na nakakahawang sakit.

Sabay-sabay mga positibong halaga ang mga resulta ng immunoglobulins - IgA, IgM, IgG ay katangian ng talamak na yugto ng pagbabalik sa dati ng isang umiiral na malalang sakit.

Ano ang ibinibigay ng ipinakita na teknolohiya: pagpapasiya ng pagkakaroon ng mga helminth sa dugo; naghahanap ng iba pang mga pathogens sa katawan; maaari mong malaman ang mga dahilan para sa pagkasira ng iyong kalusugan; ang paggamot ay batay din sa mga pagsusuri na nakuha sa ganitong paraan; maaari mong subaybayan ang estado ng iyong immune system.

Isa pa magandang katangian- ang kakayahang subaybayan ang mga oncological marker, anuman ang kanilang pinagmulan, ngunit napapailalim sa kanilang presensya sa katawan, siyempre. Ang pagsubok na ito angkop para sa paglalarawan ng estado reproductive system tao. Ang pagkakaroon ng ilang mga protina, hormones at peptides ay ginagawang posible upang hatulan ang potensyal ng isang kapareha sa mga tuntunin ng paglilihi ng isang bata, pati na rin ang inaasahang kalidad ng hinaharap na fetus.

Ang pagsusuri ng dugo para sa Giardia ay isang medyo popular na kasanayan sa mga modernong doktor. Bilang karagdagan, ang paraan ng pananaliksik na ito ay isang mahusay na tool para sa biomedical analytics at quantitative statistics sa mga tuntunin ng mga partikular na antigens.

Paano ginagamit ang ELISA?

Totoo, ito ay higit pa mahirap na mga kaso, kaya ang kalidad ng naturang pagsusuri ay lubos na nakasalalay sa mga manggagawa ng laboratoryo na nagsasagawa ng pagsubok. Mga tampok ng teknolohiya at pagkakaiba nito mula sa lumang pananaliksik sa laboratoryo:

ngayon, sa halip na isang sample ng dumi, ang dugo ay ginagamit upang matukoy ang pagkakaroon ng helminths;
ang pag-aaral ng sample ay isinasagawa sa laboratoryo nang napakabilis, sa susunod na araw makakakuha ka ng kumpletong impormasyon;
ang halaga ng pananaliksik sa laboratoryo ay mura, dahil ang teolohiya ay napakasimple;
pagsusuri ng dugo para sa mga helminth mataas na pagganap katumpakan.

Pagsusuri sa immunological analysis ng dugo sa pamamagitan ng ELISA

Ilang tao ang nakakaalam tungkol sa kung ano ang mga pagsusuri sa dugo mula sa pananaw ng sistema ng immunological ng tao, dahil ang mga pagsusuring ito ay hindi pangkaraniwan. Bilang isang patakaran, ang naturang pagsusuri sa dugo ay nagbibigay ng impormasyon tungkol sa immunodeficiency virus sa katawan ng tao at hindi nagpapakilala, dahil ito ay isinasagawa sa kahilingan ng pasyente.

Para sa sampling, ang dugo na kinuha sa isang walang laman na tiyan mula sa isang ugat ay ginagamit, kung saan ang serum ay nakuha para sa pagsusuri sa pamamagitan ng centrifugation. Bilang karagdagan, ang pag-aaral ng serum ng dugo ay maaaring magbunyag ng isang bilang ng mga sakit na nakukuha sa pakikipagtalik(syphilis, herpes, chlamydia), pati na rin ang lahat ng uri ng hepatitis, tigdas, rubella, beke at toxoplasmosis.

Talaga, para sa pagsusuri ng ELISA, ang pinag-aralan biyolohikal na materyal ay dugo, gayunpaman, ang pag-aaral ay maaaring cerebrospinal fluid, mga nilalaman ng vitreous body, amniotic fluid at iba pa.

Ang mga immunoglobulin ay mga immune molecule na maaaring magbigkis at mag-neutralize sa karamihan ng mga nakakahawang ahente at lason sa katawan. Sa kasong ito, ang pinakamahalagang katangian ng mga immunoglobulin ay ang kanilang pagtitiyak, iyon ay, ang kakayahang magbigkis sa isang tiyak na antigen. Ito ang ari-arian na ginagamit upang magsagawa ng pagsusuri ng dugo para sa immunoglobulin.

Mayroong limang uri ng immunoglobulins, ngunit ang pinaka-pinag-aralan ay immunoglobulins A, M, at G. Immunoglobulins M at G ay aktibo sa dugo. Ang mga immunoglobulin A ay isang uri ng hadlang sa ibabaw ng mga mucous membrane, dahil naroroon sila sa maraming dami.

Ang isang immunological na pagsusuri sa dugo ay nagbibigay-daan sa iyo upang matukoy ang uri ng mga immunoglobulin, salamat dito, pinapayagan ka ng ELISA hindi lamang upang masuri ang sakit, kundi pati na rin upang matukoy ang yugto ng sakit na ito at subaybayan ang dinamika ng sakit:

sa unang 2 linggo ng sakit, ang mga immunoglobulin A lamang ang nakita;
mula sa ika-2 hanggang ika-3 linggo ng sakit, ang mga immunoglobulin A at M ay napansin sa dugo;
Cc3 sa loob ng 4 na linggo, tinutukoy ng pagsusuri sa dugo para sa immunoglobulin ang lahat ng tatlong uri;
kapag bumabawi, ang mga immunoglobulin M ay nawawala sa dugo, at ang halaga ng A at G ay bumababa ng 2-4 na beses;
sa pagkakaroon ng isang malalang proseso, ang mga immunoglobulin G ay kinakailangang naroroon sa dugo, ang mga immunoglobulin M ay wala, ang mga immunoglobulin A ay maaaring naroroon o maaaring wala.

Saklaw ng immunological blood test ng ELISA

Mga diagnostic mga sakit na viral: hepatitis, herpes, Epstein Barr virus, cytomegalovirus, atbp.;
mga impeksiyon na nakukuha sa pakikipagtalik: chlamydia, gonorrhea, trichomonas, mycoplasma, ureaplasma;
syphilis; endocrinology (pagpapasiya ng mga antas ng hormone);
mga marker ng tumor (diagnosis mga sakit sa oncological); immunology (pag-diagnose ng immunodeficiency);
allergology (diagnosis at paggamot ng mga allergy).

Serological blood test - pamamaraan ng laboratoryo mga pagsusuri sa dugo na ginagamit upang masuri Nakakahawang sakit at mga kahulugan ng yugto nakakahawang proseso. Serological reaksyon batay sa pakikipag-ugnayan ng mga antibodies at antigens.

Ang pagtukoy ng mga antigen ay ginagamit upang matukoy ang genus at species ng mga microorganism. Ang paraan ng pananaliksik na ito ay ginagamit sa urology at venereology. dugo para sa pagsusuri ng serological ang dugo ay kinuha sa umaga sa isang walang laman na tiyan mula sa isang ugat.

Mga indikasyon para sa reseta at mga sakit na nakita ng ELISA

Ang pangunahing biomaterial para sa ELISA ay serum ng dugo: sa laboratoryo, ang isang sample ng dugo ay kinuha mula sa isang pasyente mula sa isang ugat, kung saan ito ay kasunod na tinanggal. hugis elemento humahadlang sa pagsusuri. Sa ilang iba pang mga kaso, ang cerebrospinal fluid, amniotic fluid, mucosal swabs, atbp ay ginagamit para sa pagsusuri.

Upang maiwasan ang mga pagbaluktot sa mga resulta, inirerekumenda na mag-abuloy ng dugo nang walang laman ang tiyan, at dalawang linggo bago ang pag-aaral (kung ang layunin ay mag-diagnose ng talamak, nakatagong mga nakakahawang sakit), kinakailangan na huminto sa pag-inom ng mga antibiotic at antiviral na gamot. Imposibleng masakop buong listahan mga indikasyon para sa ELISA.

Ang hindi mapag-aalinlanganang mga bentahe ng ELISA ay ang mataas na sensitivity at pagtitiyak ng pamamaraan. Ang pagiging sensitibo ay ang kakayahang makilala ang nais na sangkap, kahit na ang konsentrasyon nito sa sample ay mababa. Ang katumpakan, sa kabilang banda, ay nagpapahiwatig ng katumpakan ng diagnosis: kung ang resulta ay positibo, nangangahulugan ito na eksakto ang antibody o antigen na dapat na matagpuan, at hindi ang iba.

Ang ELISA ay higit na pinalitan ang "gold standard" ng microbiology - pamamaraang bacteriological mga diagnostic, kung saan, upang makilala ang pathogen, kinakailangan na ihiwalay ito mula sa katawan, at pagkatapos ay palaguin ang kultura sa isang nutrient medium sa isang test tube sa loob ng ilang araw.

Sa lahat ng oras habang isinasagawa ang pagsusuri, ang mga doktor ay pinilit na tratuhin ang pasyente nang "bulag", paghula tungkol sa pinagmulan ng mikroorganismo sa pamamagitan ng mga sintomas ng sakit. Ang pagpapasiya ng IgM gamit ang ELISA ay nagpapahintulot sa iyo na gumawa ng tumpak na diagnosis na sa mga unang araw ng sakit.

Mataas na antas ang paggawa ng enzyme immunoassay ay nagpapaliit sa impluwensya ng kadahilanan ng tao, na binabawasan ang posibilidad ng pagkakamali. Karamihan ginagamit sa modernong laboratoryo Ang mga sistema ng pagsubok at reagents para sa ELISA ay ginawa sa kapaligirang pang-industriya na ginagarantiyahan ang mga tumpak na resulta.

Mga disadvantages ng ELISA method

Sa kasamaang palad, upang magsagawa ng ELISA, kailangan mong malaman kung ano ang hahanapin: ang pamamaraan ng pagsusuri ay nagpapahiwatig na ang doktor ay may palagay tungkol sa likas na katangian ng sakit nang maaga. Samakatuwid, walang saysay na magreseta ng gayong pagsubok sa pag-asa na hindi sinasadyang "hulaan" ang diagnosis.

Sa kaso ng pag-diagnose ng mga nakakahawang sakit, hindi mahanap ng enzyme immunoassay ang pathogen at matukoy ang mga partikular na katangian nito: ipinapahiwatig lamang nito ang pagkakaroon ng mga antibodies sa dugo ng pasyente, na hindi direktang nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng isang dayuhang microorganism sa katawan ng tao. Ang ELISA ay isang napakatumpak, ngunit hindi murang paraan, kaya kailangan mong gamitin ito nang matalino, at dapat bigyang-kahulugan ng isang kwalipikadong doktor ang mga resulta.

Mga posibleng resulta ng ELISA

Depende sa nilalaman ng pagsusuri sa form, ang data ay maaaring ipakita sa anyo ng isang talahanayan na naglilista ng lahat ng antibodies o antigens na may marka para sa negatibo o positibong reaksyon, o ang quantitative value ng resulta (negatibo, mahinang positibo, positibo o malakas na positibo) ay ipahiwatig.

Huling pagpipilian tinutukoy kung gaano karaming mga antibodies ang nakapaloob sa nasuri na sample. Ang isa pang quantitative indicator ay ang antibody avidity index, na ipinahayag bilang isang porsyento. Ipinapahiwatig nito kung gaano karaming oras ang lumipas mula noong simula ng nakakahawang proseso (mas mataas ang index, mas marami).

Ngayon, libu-libong uri ng mga sistema ng pagsubok sa ELISA ang ginawa, na ginagawang posible na makakita ng mga partikular na antibodies at antigens sa pinakamaraming iba't ibang mga patolohiya. Samakatuwid, ang pagsusuri na ito ay ginagamit sa halos lahat ng mga medikal na sangay. Ang diagnosis na ginawa sa tulong ng ELISA ay isang garantiya ng appointment ng sapat na therapy at mabisang paggamot mga sakit.

Sa presensya ng mga kinakailangang reagents at magandang organisasyon ng laboratoryo, matatanggap mo ang resulta ng pagsusuri sa loob ng 1-2 araw pagkatapos ng sampling ng dugo. Sa ilang mga kaso, kung kailangan mo ng agarang tugon, ang panahong ito ay maaaring bawasan sa 2-3 oras.

Kinakatawan modernong hitsura Ang pananaliksik sa laboratoryo, ELISA, o enzyme immunoassay ay nagbibigay-daan sa iyo na makahanap ng mga partikular na antibodies o antigens sa dugo para sa ilang mga sakit. Pinapayagan ka nitong makita ang parehong etiology ng sakit at matukoy ang yugto nito. Kasabay nito, ang mga resulta ng ganitong uri ng pananaliksik ay maaaring mailabas sa quantitatively at qualitatively. Kaya, isaalang-alang natin nang detalyado ang prinsipyo ng paraan ng immunoassay ng enzyme, ang pamamaraan at kakanyahan nito.

Ano ang enzyme immunoassay

Itinalaga para sa pinakakumpleto pinagsamang pagtatasa katayuan sa kalusugan, pinapayagan ng enzyme immunoassay ang pagtatasa pangkalahatang estado kalusugan at suriin ang proteksiyon na mga tungkulin nito. Ang pag-aaral sa laboratoryo na ito ay nagpapahintulot sa iyo na mag-diagnose ng mga nakakahawang, autoimmune, hematological pathologies sa isang pagsusuri sa dugo.

Ang kakanyahan ng enzyme immunoassay ay tinalakay sa video sa ibaba:

Kanino ito nakatalaga

Ang pag-aaral na ito ay maaaring italaga sa mga pasyenteng may mga sumusunod na sakit:

sakit viral na pinagmulan, na kinabibilangan ng hepatitis,;
mga sakit na nakukuha sa pakikipagtalik - chlamydia, trichomonas, syphilis, ureaplasma, mycoplasma;
immunodeficiency;
komprehensibong pagsusuri bago ang operasyon.

Ang pagsusuri sa dugo ng ELISA ay inireseta din upang matukoy ang antas ng mga hormone at masuri ang kalidad ng uri ng therapy na isinasagawa.

Maaaring humirang ang doktor pagsusuring ito upang itakda ang yugto ng isang umiiral na sakit, na nagbibigay-daan sa napapanahong pagsasaayos sa ginamit na paggamot. At ang mataas na katumpakan ng data na nakuha ay nagpapahintulot sa iyo na magkaroon ng pinakadetalyadong larawan ng kalusugan. Kasabay nito, ang data ay nakuha pagkatapos isagawa ang pag-aaral sa isang napakaikling panahon, na nagbibigay-daan sa iyo upang subaybayan ang dinamika ng pag-unlad. proseso ng pathological.

Bakit kunin ang mga pagsusulit na ito?

Dahil salamat sa pagsusuri sa dugo ng ELISA, maaari kang makakuha ng isang malaking halaga ng impormasyon tungkol sa estado ng kalusugan at mga proseso ng pathological na nagaganap sa katawan, ito ay ginagawang posible na ganap na isaalang-alang ang paunang data (pangkalahatang kalusugan, yugto ng sakit, dinamika ng pag-unlad ng proseso ng pathological, tagapagpahiwatig ng pagiging epektibo ng therapy na ginamit) kapag bumubuo ng isang regimen ng paggamot.

Para sa kadahilanang ito, upang makuha ang pinaka-binibigkas na resulta ng paggamot at ang pinakamabilis na pagwawakas ng proseso ng pathological sa katawan, isang pagsusuri sa dugo ng ELISA ay inireseta. Mga malubhang sakit ng immune system, ang pagkakaroon ng antigens sa dugo, at ang mga sanhi ng allergy, batay sa data na nakuha, ay maaaring gumaling nang mas mabilis, gamit ang mga pinaka-epektibong pamamaraan.

Ang appointment ng isang pagsusuri sa ELISA ay isinasagawa para sa iba't ibang mga pathologies, at dapat itong gawin lamang ayon sa direksyon ng isang doktor. Ang dalas ng pagsusuri ay itinakda din ng doktor, at kapag nag-donate ng dugo para sa pagsusuri ng ELISA, ang larawan ng sakit ay ang pinakakumpleto. Dahil posible na makuha ang dynamics ng kurso ng sakit sa pamamagitan ng pagkuha ng pagsusuri na ito nang higit sa isang beses, ang mga donasyon ng dugo mula tatlo hanggang limang beses ay maaaring madalas na inireseta. Ginagawa nitong posible na ihambing ang dami ng antibodies sa dugo sa iba't ibang agwat ng oras.

Mga uri ng naturang pamamaraan

Mayroong ilang mga uri ng enzyme immunoassay. Nag-iiba sila sa uri ng likido na kinuha mula sa katawan ng tao, batay sa kung saan pinag-aralan ang komposisyon nito at ang pagkakaroon ng ilang antigens.

Kasabay nito, hindi lamang dugo ng tao, kundi pati na rin ang iba pang mga likido ay maaaring kunin para sa pagsusuri:

amniotic fluid,
cerebrospinal fluid,
nilalaman ng vitreous
mga pahid,
mucus mula sa urethra at cervical canal.

Ang operasyon mismo upang kumuha ng isang partikular na uri ng likido ay pamantayan at isinasagawa sa isang araw na ospital.

Mga indikasyon para sa paghawak

Karaniwan, ang isang pagsusuri sa ELISA ay inireseta ng isang doktor kung kinakailangan upang makakuha ng isang detalyadong larawan ng kasalukuyang sakit, na nagaganap sa anumang anyo: talamak, tamad o talamak. At ang mga sumusunod na kondisyon at therapeutic na layunin ay maaaring ituring na mga indikasyon para sa ganitong uri ng pagsusuri:

paghahanap para sa mga antigens ng ilang mga sakit;
pagpapasiya ng katayuan sa hormonal;
pagtuklas ng hepatitis virus sa katawan;
pananaliksik sa;
maghanap ng mga antibodies sa anumang uri ng nakakahawang sakit;
pagsusuri para sa pagkakaroon ng mga autoimmune lesyon ng katawan.

Para sa enzyme immunoassay, tingnan ang video sa ibaba:

Contraindications para sa paghawak

Ang mga kontraindikasyon para sa immunoassay ng enzyme ay hindi pa natukoy hanggang ngayon.

Sa panahon ng pagbubuntis, kapag may patuloy na pagbabago sa nilalaman ng mga hormone sa dugo, kinakailangan na paulit-ulit na isagawa ang pagsusuri na ito upang kumpirmahin ang resulta. Mga bagong silang at mga bata kamusmusan maaari ding magkaroon ng maling data ng pagsusuri: sa panahon ng pagbuo ng fetus, ang ilang uri ng antibodies ay maaaring makapasok sa dugo ng fetus sa pamamagitan ng inunan ng ina. Samakatuwid, ang kanilang presensya sa kinuhang pagsusuri ay hindi dapat ituring na tanda ng isang umiiral na impeksiyon.

Subukan ang kaligtasan

Ang pagsasagawa ng pamamaraan para sa pagkuha ng anumang uri ng likido mula sa katawan ng tao ay hindi nagdudulot ng anumang negatibong epekto sa katawan. Ang kumpletong sterility sa panahon ng mga manipulasyon ay nag-iwas sa posibilidad ng impeksyon sa anumang uri ng sakit.

Paghahanda para sa kaganapan

Para makuha ang maximum maaasahang resulta ang pananaliksik ay dapat umiwas sa paggamit mga inuming nakalalasing at mga narkotikong gamot bago kumuha ng dugo (o iba pang likido) para sa pagsusuri.

Paano ang pamamaraan, mga sensasyon sa panahon nito

Upang magsagawa ng pagsusuri sa ELISA, ang dugo ng pasyente ay mahigpit na kinukuha sa isang walang laman na tiyan: hindi ka dapat kumain ng pagkain sa anumang anyo ng hindi bababa sa isang oras bago ang pamamaraan. Ang pagsusuri ay kinuha mula sa cubital vein.

Ang pagkakaroon ng anumang mga sakit at ang mga gamot na iniinom ay iniuulat nang maaga sa doktor, kadalasan ang mga gamot sa oras ng donasyon ng dugo ay kakanselahin. Ang mga damdamin sa panahon ng pamamaraan ay katulad ng pagkuha ng dugo para sa biochemical analysis.

Pag-decipher ng mga resulta

Ang mga diagnostic ng ELISA ay nagpapahintulot sa iyo na matukoy ang pagkakaroon ng impeksiyon sa katawan, ang aktibidad ng proseso ng pathological at ang etiology ng umiiral na impeksiyon. Ang mabilis na pagtanggap ng resulta ng pagsusuri (sa loob ng isang araw) ay isa sa mga pakinabang ng ganitong uri ng pag-aaral.

Ang proseso ng pag-decode ng impormasyong natanggap ay isinasagawa ng doktor. Kasabay nito, dapat itong isaalang-alang na ang kawastuhan ng mga resulta na nakuha para sa dinamika ng anumang mga proseso ay ginagarantiyahan kapag pumasa sa mga pagsusuri sa isang laboratoryo.

Average na gastos ng pamamaraan

Ang average na presyo ng isang pag-aaral ng ELISA ay nakasalalay sa direksyon ng pagsusuri at ang pagpapasiya ng mga partikular na halaga. Kaya, ang pagpapasiya ng mga serological marker ng mga nakakahawang sakit iba't ibang uri(anti-HAV IgG, anti-HAV IgM, HBsAg) ay nagkakahalaga mula 200 hanggang 320 rubles at isasagawa sa loob ng 2 araw ng trabaho. Ang tagapagpahiwatig ng gastos ng pamamaraang ito ay isinasaalang-alang din ang kalamangan nito: ang pagkakaroon ng mga presyo para sa anumang uri ng pananaliksik ay nagbibigay-daan sa pananaliksik na maisagawa sa anumang badyet.

Ang halaga ng isang pag-aaral ng ELISA ay depende sa patakaran institusyong medikal, gayunpaman, dapat itong ituring na isang pampublikong pamamaraan na nagbibigay-daan sa iyo upang makakuha ng isang detalyadong larawan ng umiiral na sakit at magbigay ng pinaka kumpletong paggamot.

Tungkol sa mga pamantayan at tampok ng pag-aaral ng ELISA, tingnan ang video sa ibaba:

(link sa ika-3 artikulo sa file na ito), na nagbibigay-daan upang masuri ang kakayahan ng katawan na labanan ang mga nakakahawang sakit at ipakita ang yugto ng sakit, isang mahalagang lugar ang inookupahan ng enzyme immunoassay (ELISA). Ang pagsasagawa ng pag-aaral na ito ay nagbibigay-daan sa iyo upang komprehensibong masuri ang aktibidad ng proteksiyon na pag-andar ng dugo at kilalanin ang estado ng immunodeficiency sa mga nakakahawang pathologies, pati na rin ang mga sakit sa dugo, mga proseso ng autoimmune, at mga problema sa hormonal.

Paano posible na masakop ang napakaraming target sa isang pagsusuri, at ano ang mga indikasyon para sa pagpapatupad nito? Subukan nating malaman ito.

Ano ang ELISA blood test?

Ito ay isang pagsubok sa laboratoryo na nagbibigay-daan sa iyo upang matukoy ang pagkakaroon ng mga tiyak na antibodies (proteksiyon na mga kadahilanan ng dugo ng isang likas na protina) sa ilang mga antigens (mga ahente ng pathogen). Kabilang sa mga antibodies na pinakamahalaga ay ang mga immunoglobulin, na maaaring umiral sa anyo ng mga immunocomplex.

Ang mga immunoglobulin ay ginawa bilang isang resulta ng mga kumplikadong reaksyon ng neurohumoral ng tao na nangyayari bilang isang tugon sa pagpapakilala ng mga dayuhang antigens. Ang bawat uri ng pathogen ay gumagawa ng sarili nitong mga tiyak na antibodies. Ang mga ito ay kumikilos sa pamamagitan ng "pagbubuklod" ng isang antigen o isang pathological microorganism, na bumubuo ng isang "antigen-antibody" complex compound, na sinusundan ng neutralization, enzymatic lysis, phagocytosis reactions at excretion mula sa katawan.

Tandaan:ito ay sa pamamagitan ng pagkakaroon ng ilang mga complex na tinutukoy ng pamamaraang ELISA ang uri ng pathogen o nakakapinsalang sangkap na nasa pasyente.

Para malaman pangunahing mga prinsipyo paggana ng kaligtasan sa tao, maaari mong sa pamamagitan ng pagtingin ang video na ito pagsusuri:

Ano ang mga immunoglobulin

Tandaan:ang pinakamahalaga sa praktikal na gamot ay mga immunoglobulin ng mga klase - A, M at G. Ang pagiging informative ng kahulugan ay batay sa iba't ibang mga agwat ng oras ng kanilang hitsura, maximum at pagkawala.

Isaalang-alang natin ang tanong na ito nang mas detalyado.

Ang pangunahing gawain immunoglobulin A (IgA) Binubuo ito sa mga proteksiyon na function ng mauhog lamad ng respiratory tract, gastrointestinal tract at urinary system. Sa isang talamak na pagsisimula ng sakit, imposibleng makilala ang mga ito. Ang mga proteksiyon na complex na ito ay lilitaw lamang mula sa ika-2 linggo ng pagsisimula ng sakit, minsan mamaya. Ang bulk ng immunoglobulin A ay puro sa mga mucous tissue. Humigit-kumulang 80%. Ang natitirang mga antibodies ay umiikot sa dugo. Ang pangunahing pag-andar ay ang neutralisasyon at pagkasira ng mga microorganism. Matapos ang mga talamak na pagpapakita ng sakit ay humupa, ang halaga ng mga immunoglobulin na ito ay nagsisimulang bumaba at ganap na nawawala hanggang sa 8 linggo pagkatapos ng simula ng sakit. Kung ang IgA ay napansin sa ibang araw, kung gayon ito ay nagpapahiwatig ng isang talamak na proseso.

Ang pangunahing at unang mga marker ng talamak na yugto ng pagbuo ng patolohiya ay class M immunoglobulins (IgM). Ang mga ito ay matatagpuan sa ika-5 araw ng simula ng karamdaman. Maaari mong matukoy ang kanilang presensya sa dugo para sa mga 6 na linggo. Pagkatapos ay nagsisimula silang mawala nang mabilis.

Ang natitirang tugon ng immune ay nagpapakilala sa presensya sa dugo class G immunoglobulins (IgG). Ang hitsura ng mga salik na ito sa dugo ay napansin humigit-kumulang isang buwan pagkatapos ng pagsisimula ng sakit. Sa hinaharap, maaari silang matukoy sa loob ng maraming buwan, taon, at kahit isang buhay, na gumaganap ng isang proteksiyon na function laban sa pagbabalik (pagbabalik) ng sakit, at sa ilang mga kaso na ginagawang imposible para sa pangalawang pag-unlad ng patolohiya. Kung ang halaga ng immunoglobulin G ay nagsimulang tumaas muli, kung gayon ang muling impeksyon ay maaaring pinaghihinalaan. Ang isang katulad na konklusyon ay maaaring iguguhit sa pamamagitan ng pagsasagawa ng dalawa o tatlong sample na kinuha na may pagitan ng 2 linggo.

Immunoglobulin D (IgD) na matatagpuan sa B-lymphocytes, ay nasa isang maliit na konsentrasyon sa malusog na tao. Pagkatapos ng 10 taon ng buhay ay umabot sa pinakamataas na halaga nito. Ang dami ng immunoglobulin D ay tumataas sa panahon ng pagbubuntis, sa mga pasyente mga sistematikong sakit nag-uugnay na tisyu, mga sakit na dulot ng immunodeficiency.

Mga indikasyon para sa appointment ng enzyme immunoassay

Pagpapasiya ng mga antibodies sa presensya sa katawan ng mga pathogenic microbes na nagiging sanhi ng:

trichomoniasis;
ureaplasmosis at.

Mayroong pagtaas sa bilang ng mga immunoglobulin at may.

Ang mga diagnostic ay isinasagawa upang makita ang:

mga sakit na herpetic;
mga grupo ng viral hepatitis;
Epstein Barr virus;
cytomegalovirus.

Sa tulong ng ELISA, posible na matukoy ang pagkakaroon ng mga antibodies sa 600 uri ng mga allergens, upang makita ang estado ng immunodeficiency, upang isagawa komprehensibong pagsusuri bago ang operasyon ng transplant kumplikadong pagsusuri tungkol sa pagiging epektibo ng paggamot.

Si ELISA ay karagdagang pamamaraan pagtuklas ng mga selula ng kanser.

Paano isinasagawa ang ELISA ng dugo?

Para sa enzyme-linked immunosorbent assay, sa karamihan ng mga kaso, ang dugo ng mga pasyente ay ginagamit, minsan ang vitreous tissue, spinal canal fluid, at amniotic fluid ay kinukuha.

Ang dugo ay iginuhit sa pamamagitan ng isang injection needle sa isang syringe mula sa cubital vein. Ang pag-aaral ay isinasagawa sa walang laman na tiyan. Dapat tandaan na ang pagkuha ng ilang mga gamot ay maaaring makaapekto sa resulta ng pagsusuri. Bago mag-donate ng dugo, dapat mong pigilin ang paninigarilyo, pag-inom ng alak. Ang paggamit ng mga narcotic substance ay maaaring masira ang mga resulta.

Sa kaso ng mga negatibong halaga ng immunoglobulins IgM, IgG, IgA, maaari nating pag-usapan ang kawalan ng sakit o ang paunang yugto nito, at ang resulta na may mga minus ay posible rin sa kumpletong pagbawi pagkatapos ng isang makabuluhang tagal ng oras.

Sa kaso ng isang mataas na titer ng IgM na may negatibong mga halaga ng IgG, IgA, maaari itong tapusin na mayroong isang talamak na nakakahawang sakit.

Ang sabay-sabay na mga positibong halaga ng mga resulta ng immunoglobulins - IgA, IgM, IgG ay katangian ng talamak na yugto ng pag-ulit ng isang umiiral na malalang sakit.

Para sa talamak na impeksiyon Ang ELISA, na nasa yugto ng pagpapatawad ng proseso, ay nagpapakita ng mga negatibong halaga ng immunoglobulin M (IgM), habang ang resulta ng immunoglobulins G (IgG) at A (IgA) ay magiging positibo.

Mga benepisyo ng paraan ng enzyme immunoassay

Ang pangunahing bentahe ng pamamaraang ELISA ay:

mababang halaga ng pagsusuri;
pagtitiyak ng diagnostic, katumpakan;
dynamic na kontrol (ulitin ang pagsusuri upang matukoy ang pagiging epektibo ng paggamot at mga yugto ng sakit);
ang posibilidad ng pagsasagawa ng mass examinations sa foci ng impeksiyon;
ang bilis ng pagkuha ng resulta;
relatibong pagiging simple ng pagsusuri;
posibilidad ng paggamit teknolohiya ng impormasyon sa pagpoproseso;
kaligtasan at kawalan ng sakit para sa pasyente.

May mga disadvantages ba ang blood ELISA?

hepe negatibong sandali ang pananaliksik ay ang posibilidad na makakuha ng false-negative at false-positive na data. Ang sanhi ng hindi pagkakaunawaan ay maaaring teknikal na mga depekto, pagkuha ng mga gamot, na maaaring masira ang larawan.

Ang ELISA ay ginagamit upang makita ang:

(ascaris, pinworms);
matalas at talamak na anyo opisthorchiasis;
trichinosis;
ang pagkakaroon ng lamblia (bilang karagdagang pagsusuri);
mga anyo ng leishmaniasis;
amoebiasis;
ang nilalaman ng toxoplasma;

Sa konklusyon, dapat tandaan na ang modernong immunology ay patuloy na nasa yugto ng pag-unlad, na naghahanap ng mga bagong pamamaraan para sa pag-diagnose at pagpapagamot ng mga sakit.

Stepanenko Vladimir, surgeon

5.1 Kakanyahan at pag-uuri ng ELISA.

Ang ELISA ay lumitaw noong kalagitnaan ng 60s at orihinal na binuo bilang isang paraan para sa pagtukoy ng isang antigen sa isang histological na paghahanda, pati na rin para sa pag-visualize ng mga linya ng pag-ulan sa isang immunodiffusion at immunoelectrophoresis test, at pagkatapos ay nagsimulang gamitin para sa quantitative determination ng antigens at antibodies sa biological fluids. Nakibahagi sina E. Engvall at R. Pelman sa pagbuo ng pamamaraan, gayundin, nang nakapag-iisa sa kanila, sina V. Van Veeman at R. Schurs.

kanin. 6 Pangunahing prinsipyo ng ELISA:

upang makita ang mga antigen; 2) upang makita ang mga antibodies

Ang pamamaraan ay batay sa tiyak na pagbubuklod ng isang antibody sa isang antigen, habang ang isa sa mga sangkap ay pinagsama sa isang enzyme; bilang isang resulta ng reaksyon sa kaukulang chromogenic substrate, isang may kulay na produkto ang nabuo, ang halaga nito ay maaaring matukoy nang spectrophotometrically (Larawan 6).

Ang pagtuklas ng posibilidad ng antigen at antibody immobilization sa iba't ibang mga carrier habang pinapanatili ang kanilang aktibidad na nagbubuklod ay naging posible upang mapalawak ang paggamit ng ELISA sa iba't ibang larangan ng biology at medisina.

Ang hitsura ng mga monoclonal antibodies ay nagsilbi bilang isang karagdagang pag-unlad ng ELISA, na naging posible upang madagdagan ang pagiging sensitibo, pagtitiyak at muling paggawa ng mga resulta.

Sa teorya, ang ELISA ay batay sa data ng modernong immunochemistry at chemical enzymology, kaalaman sa mga batas ng physicochemical ng reaksyon ng antigen-antibody, pati na rin sa mga pangunahing prinsipyo ng analytical chemistry. Ang sensitivity ng ELISA at ang tagal nito ay tinutukoy ng ilang pangunahing mga kadahilanan: ang kinetic at thermodynamic na mga katangian ng reaksyon ng antigen-antibody, ang ratio ng mga reagents, aktibidad ng enzyme, at ang paglutas ng mga pamamaraan ng pagtuklas nito. SA pangkalahatang pananaw Ang reaksyon ng antigen-antibody ay maaaring ilarawan sa isang simpleng paraan:

+[AG]↔[ATAG]

Ang iba't ibang mga bagay ng pag-aaral mula sa mababang molekular na timbang na mga compound hanggang sa mga virus at bakterya, pati na rin ang isang hindi karaniwang malawak na hanay ng mga gawain na nauugnay sa iba't ibang mga kondisyon para sa paggamit ng ELISA, ay tumutukoy sa pagbuo ng isang napakalaking bilang ng mga variant ng pamamaraang ito.

Ang anumang variant ng ELISA ay naglalaman ng 3 mandatoryong yugto:

1. ang yugto ng pagkilala sa test compound ng isang antibody na tiyak dito, na humahantong sa pagbuo ng isang immune complex;

2. ang yugto ng pagbuo ng koneksyon ng conjugate sa immune complex o libreng mga site na nagbubuklod;

3. ang yugto ng pag-convert ng label ng enzyme sa isang rehistradong signal. Ang pag-uuri ng mga pamamaraan ng ELISA ay batay sa ilang mga diskarte:

1. Ayon sa uri ng mga reagents na naroroon sa unang yugto ng ELISA, ang mapagkumpitensya at hindi mapagkumpitensyang mga pamamaraan ay nakikilala.

A) Sa mapagkumpitensyang ELISA, sa unang yugto, ang system ay naglalaman ng parehong nasuri na tambalan at ang analog nito, na may label na enzyme at nakikipagkumpitensya para sa mga partikular na lugar na nagbubuklod dito.

B) Para sa mga pamamaraan na hindi mapagkumpitensya, ang presensya sa system sa unang yugto lamang ng nasuri na tambalan at mga nagbubuklod na sentro na tiyak dito ay katangian.

2. Ang lahat ng pamamaraan ng ELISA ay nahahati sa homogenous at heterogenous.

Kung ang lahat ng tatlong yugto ng ELISA ay isinasagawa sa solusyon at sa pagitan ng mga pangunahing yugto ay walang karagdagang mga yugto ng paghihiwalay ng nabuo na mga immune complex mula sa hindi na-react na mga bahagi, ang pamamaraan ay kabilang sa pangkat ng mga homogenous.

Ang batayan ng homogenous na ELISA, na kadalasang ginagamit upang matukoy ang mababang molekular na timbang na mga sangkap, ay ang pagsugpo sa aktibidad ng enzyme kapag ito ay pinagsama sa isang antigen o antibody. Ang aktibidad ng enzyme ay naibalik bilang resulta ng reaksyon ng antigen-antibody.

Kapag ang isang antibody ay nagbubuklod sa isang antigen na naglalaman ng isang label ng enzyme, ang aktibidad ng enzyme ay hinahadlangan ng 95% na may paggalang sa isang mataas na molekular na timbang na substrate, na dahil sa steric na pagbubukod ng substrate mula sa aktibong sentro ng enzyme. Habang tumataas ang konsentrasyon ng antigen, mas maraming antibodies ang nagbubuklod at mas maraming libreng antigen-enzyme conjugates ang nananatili na maaaring mag-hydrolyze sa mataas na molekular na substrate. Ang pagsusuri ay isinasagawa nang napakabilis, 1 minuto ang kinakailangan para sa isang pagpapasiya. Ang sensitivity ng pamamaraan ay medyo mataas. Gamit ito, maaari mong matukoy ang sangkap sa antas ng picomoles.

Para sa mga heterogenous na pamamaraan, tipikal na magsagawa ng pagsusuri sa isang two-phase system na may partisipasyon ng isang solidong phase - isang carrier, at isang obligadong yugto ng paghihiwalay ng mga immune complex mula sa mga unreacted na bahagi (paghuhugas), na nasa iba't ibang yugto(Ang mga nabuong immune complex ay nasa solid phase, at ang mga unreacted complex ay nasa solusyon). Ang mga heterogenous na pamamaraan, kung saan ang pagbuo ng mga immune complex sa unang yugto ay nagpapatuloy sa solid phase, ay tinatawag na solid-phase na mga pamamaraan.

Ang mga pamamaraan ay inuri bilang homogenous-heterogeneous, kung ang 1st stage - ang pagbuo ng mga tiyak na complexes ay nangyayari sa solusyon, at pagkatapos ay isang solid phase na may isang immobilized reagent ay ginagamit upang paghiwalayin ang mga bahagi.

3. Ayon sa prinsipyo ng pagtukoy sa sangkap ng pagsubok:

A) Direktang pagtukoy ng konsentrasyon ng isang sangkap (antigen o antibody) sa pamamagitan ng bilang ng mga nagbubuklod na sentro na nakikipag-ugnayan dito. Sa kasong ito, ang label ng enzyme ay nasa resultang partikular na AG-AT complex. Ang konsentrasyon ng analyte ay direktang proporsyonal sa nakarehistrong signal.

B) Pagpapasiya ng konsentrasyon ng isang sangkap sa pamamagitan ng pagkakaiba kabuuang bilang umiiral na mga site at natitirang libreng umiiral na mga site. Sa kasong ito, ang konsentrasyon ng analyte ay tataas, at ang naitala na signal ay bababa, samakatuwid, sa kasong ito, mayroong isang kabaligtaran na pag-asa sa magnitude ng naitala na signal.

5.2 Mga katangian ng mga sangkap na ginamit sa ELISA.

Mga enzyme.

Ang mga label ng enzyme ay may napakalakas na catalytic effect; ang isang molekula ng enzyme ay maaaring tumugon sa isang malaking bilang ng mga molekula ng substrate. Kaya, ang isang enzyme na naroroon sa hindi gaanong halaga ay maaaring makita at ma-quantify sa pamamagitan ng pagbuo ng mga produkto, ang reaksyon na ito ay catalyzes. Ang isa pang bentahe ng paggamit ng mga enzyme bilang mga label ay dahil sa presensya sa molekula ng maraming mga functional na grupo (sulfhydryl, carboxyl, tyrazine residues, atbp.), Kung saan ang mga molekula ng ligand ay maaaring magkabit ng covalently.

Ang mga enzymatic marker na ginagamit sa ELISA ay dapat magkaroon ng mga sumusunod na katangian:

– mataas na aktibidad at katatagan ng enzyme sa ilalim ng mga kondisyon ng pagsusuri, sa panahon ng pagbabago at sa conjugate na may mga antibodies o iba pang mga protina;

- ang pagkakaroon ng mga sensitibong substrate at ang pagiging simple ng pamamaraan para sa pagtukoy ng mga produkto o substrate ng reaksyon ng enzymatic;

- posibilidad ng pagbagay ng mga sistema ng substrate sa higit pang pagpapalakas;

– ang kawalan ng enzyme at ang mga inhibitor nito sa pinag-aralan biyolohikal na likido.

Ang ELISA ay maaaring gumamit ng hindi bababa sa 15 iba't ibang mga enzyme. Ang malunggay peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP) at β-D-galactosidase ay natagpuan ang pinakamalaking paggamit, alinsunod sa mga kinakailangan sa itaas. Ang lahat ng tatlo ay matatag at pinapagana ang mga sensitibong reaksyon. Bilang karagdagan, ang mga produkto na nagreresulta mula sa mga reaksyon na na-catalyze ng mga enzyme na ito, depende sa substrate na ginamit, ay maaaring makita hindi lamang sa pamamagitan ng mga colorimetric na pamamaraan, kundi pati na rin ng mga fluorescent na pamamaraan. Ang iba pang mga enzyme ay hindi gaanong ginagamit. Ito ay ipinaliwanag ng kanilang mas mababang partikular na aktibidad kumpara sa HRP at AP.

Mga substrate.

Ang pagpili ng substrate ay pangunahing tinutukoy ng enzyme na ginamit bilang isang label, dahil ang reaksyon ng enzyme-substrate ay lubos na tiyak.

Mga pangunahing kinakailangan para sa substrate:

– tinitiyak ang mataas na sensitivity ng pamamaraan sa pagtuklas ng enzyme sa conjugate;

- pagbuo ng mahusay na tinukoy (halimbawa, may kulay) na mga produkto ng reaksyon ng enzyme-substrate;

– ang substrate ay dapat na ligtas, mura, naa-access at maginhawang gamitin.

Mas madalas, ginagamit ang mga chromogenic substrates, na, kapag nawasak, ay bumubuo ng isang kulay na sangkap. Ang promising ay ang paggamit ng mga high-energy substrates - fluorescent, chemiluminescent. Ang paggamit ng naturang mga substrate ay ginagawang posible na theoretically upang madagdagan ang sensitivity ng ELISA sa pamamagitan ng dalawang mga order ng magnitude.

pagbuo ng conjugate.

Ang conjugate ay isang antigen o antibody na may label na enzyme label. Ang pagbuo ng conjugate ay isa sa milestones pagsasagawa ng ELISA.

Kapag bumubuo ng conjugate, ang isang pinakamainam na paraan para sa pagpapakilala ng isang label ng enzyme ay pinili upang ang parehong mga bahagi ng conjugate ay mapanatili ang kanilang biological na aktibidad: ang enzyme - ang kakayahang makipag-ugnayan sa substrate, at ang antigen o antibody - antigenicity at antigen-binding na aktibidad, ayon sa pagkakabanggit. Ang pagkakaroon ng may label, mataas na purified antigen ay nagpapahintulot sa paggamit ng mga mapagkumpitensyang pamamaraan. Sa kasong ito, ang aktibidad ng conjugate na hindi nakatali sa mga immobilized antibodies ay maaaring masukat sa huling yugto, na iniiwasan ang pamamaraan ng paghuhugas at ginagawang mas maginhawa ang pagsusuri. Gayunpaman, ang mga antigen ay magkakaiba sa kanilang mga katangian ng physicochemical at istraktura, na nangangahulugan na imposibleng bumuo ng mga unibersal na pamamaraan para sa pagkuha ng isang conjugate na may isang antigen. Sa kasong ito, ang pagkuha ng antigen-enzyme conjugate ay isang hiwalay na hamon. Ang paghahanda ng mga may label na antibodies para sa ELISA ay mas naa-access sa pamamaraan.

Ang conjugation ng isang enzyme na may immunochemically active proteins ay isinasagawa sa pamamagitan ng iba't ibang pamamaraan: chemical cross-linking, covalent binding ng isang enzyme molecule sa isang AG o AT, at pagbuo ng mga compound sa pamamagitan ng non-covalent bond, halimbawa, kapag ang koneksyon sa pagitan ng enzyme at AG o AT ay isinasagawa sa immunologically, sa pamamagitan ng antigen-antibody interaction.

Ang pinakakaraniwang ginagamit na mga pamamaraan ng covalent para sa paghahanda ng mga conjugates. Ang pagpili ng nagbubuklod na reaksyon ay tinutukoy ng uri ng mga functional na grupo na magagamit sa mga molekulang protina na ito. Ang glutaraldehyde, sodium periodate, atbp. ay ginagamit bilang mga reagents na ginagamit upang ipasok ang enzyme sa mga molekula ng antigen at antibody.

Mayroong isang hakbang at dalawang hakbang na pamamaraan para sa pagkuha ng mga conjugates gamit ang glutaraldehyde. Ang mga conjugates ng iba't ibang laki na may pinababang aktibidad ng enzymatic (15 - 60% ng libreng enzyme) ay maaaring mabuo. Ang resultang conjugate malalaking sukat maaaring makahadlang sa pagtukoy ng sangkap ng pagsubok. Ang medyo mababang molecular weight conjugates ay binubuo ng isang Fab fragment at isang enzyme molecule.

Bilang resulta ng dalawang yugto na synthesis, na binubuo sa yugto-yugtong paghahanda ng isang enzyme na unang binago ng isang cross-linking agent, ang paghihiwalay nito, at pagkatapos ay ang kasunod na pakikipag-ugnayan nito sa isang antigen (antibody), ang mga molekula ng isang homogenous na komposisyon ay nabuo na naglalaman ng 1-2 mga molekula ng enzyme bawat molekula ng immunoglobulin at pinapanatili ang mataas na aktibidad ng enzymatic at immunological. Gayunpaman, ang dami ng naturang conjugates na nabuo ay maliit (para sa malunggay peroxidase ito ay 5-10%).

Ang paraan ng pagkuha ng immunoperoxidase conjugates, batay sa oksihenasyon ng carbohydrate component ng enzyme na may sodium periodate (ang pagbubuklod ng peroxidase sa conjugate ay umabot sa 70-90% ng paunang halaga ng enzyme), ay natagpuan ang pinakamalaking praktikal na aplikasyon.

Ang isang maaasahang conjugate ay dapat magkaroon ng mga sumusunod na katangian:

Mataas na antibody tigre at mataas na pagkakaugnay para sa antigen upang magamit ito sa mataas na pagbabanto at sa gayon ay mabawasan ang hindi tiyak na pagbubuklod;

Sapat na pagtitiyak sa nagtatrabaho pag-aanak;

Ang pamamayani ng mga monomeric na anyo sa mga polymeric, dahil ang mga polymeric form ay may posibilidad na sumunod sa hindi partikular sa plastic, na nagreresulta sa isang mataas na antas ng background ng reaksyon;

Ang pinakamainam na molar ratio sa pagitan ng enzyme at antibodies (ang pinakamainam na ratio ay tungkol sa 1:1);

Sapat na aktibidad ng enzymatic ng conjugate. Ang pag-aari na ito ay pangunahing tinutukoy ng mga kondisyon ng conjugation at ang ratio ng mga molekula ng enzyme at antibody sa conjugate.

5.3 Heterogenous na pamamaraan ng ELISA.

Ang mga heterogeneous na ELISA (o mga solid-phase na ELISA) ay kinabibilangan ng mga pamamaraan kung saan ang analyte ay nasa dalawang yugto. Upang paghiwalayin ang mga bahagi ng isang immunochemical reaksyon, isang solidong bahagi (isang hindi matutunaw na carrier, kadalasang plastik) na may mga antibodies o isang antigen na hindi kumikilos dito, na hinuhugasan sa bawat yugto upang maalis ang mga intermediate na produkto ng mga hindi gumagalaw na sangkap.

Ang immobilization ay maaaring isagawa sa pamamagitan ng covalently binding antibodies (antigens) sa isang activated carrier gamit ang mga chemical approach, gayundin sa pamamagitan ng physical adsorption ng antibodies (antigens) sa ibabaw ng solid polymers (halimbawa, polystyrene plates). Sa banyagang panitikan, ang direksyong ito ay tinatawag na ELISA test o ang enzyme-linked immunosorbent assay.

Non-competitive ELISA para sa antigen detection gamit ang enzyme-labeled specific antibodies at immobilized antibodies bilang isang halimbawa.

Ang isang solusyon na naglalaman ng nasuri na antigen ay idinagdag sa carrier na may mga immobilized antibodies. Sa panahon ng pagpapapisa ng itlog, nabuo ang isang tiyak na antigen-antibody complex. Pagkatapos ang carrier ay hugasan mula sa hindi nakatali na mga antigen at may label na antibodies ay idinagdag - ang conjugate. Ang dami ng nakatali na conjugate ay direktang proporsyonal sa dami ng antigen sa sample ng pagsubok. Pagkatapos ng pangalawang pagpapapisa ng itlog at pag-alis ng labis na conjugate, isang chromogenic substrate para sa enzyme na ginamit ay idinagdag, na nagbabago ng kulay sa ilalim ng pagkilos ng enzyme, ibig sabihin, ang isang enzymatic reaksyon ay nangyayari sa paglamlam ng solusyon sa mga balon. Ang antas ng paglamlam ay direktang proporsyonal sa bilang ng mga partikular na antibodies na may label na enzyme, ang enzyme, at, nang naaayon, ang test antigen. Ang mga sukat ng optical density ng solusyon sa mga balon sa isang tiyak na alon (depende sa substrate na ginamit) ay isinasagawa gamit ang mga espesyal na spectrophotometer na inangkop para sa mga mambabasa ng microplate. Ang konsentrasyon ng antigen sa sample ay sinusukat sa pamamagitan ng paghahambing ng mga resulta sa isang calibration curve ng pagtitiwala ng optical density ng solusyon sa konsentrasyon ng karaniwang antigen solution.

Larawan 7

Dahil sa yugto ng pagkilala sa isang tiyak na immunocomplex, ang antigen ay nakatali sa mga molekula ng immobilized at may label na mga antibodies, sa panitikan ang pamamaraang ito ay madalas na tinatawag na "sandwich" na pamamaraan (mula sa English sandvich) o ang two-center na pamamaraan ng ELISA (mula sa English two-site assay).

Magagamit lamang ang paraang ito upang pag-aralan ang mga antigen na mayroong hindi bababa sa dalawang antigenic determinant sa ibabaw ng mga ito. Ito ay hindi katanggap-tanggap para sa pagsusuri ng isang malaking bilang ng mga monovalent antigens (mga gamot, pestisidyo, atbp.).

Pangunahing bentahe ang pamamaraang ito- mataas na sensitivity. Ang limitasyon ng pagtuklas ng mga compound sa pamamagitan ng pamamaraang ito ay kasalukuyang umaabot sa isang halaga ng pagkakasunud-sunod ng 10-21 mol, na tumutugma sa pagtuklas ng 600 molecule lamang ng analyte sa sample. Ang pinakamataas na sensitivity ay nakakamit kapag ang bawat immunological reaction ay isinasagawa sa isang equilibrium mode, na nakakaapekto sa tagal ng pagsusuri, na may average na 4-6 na oras. Non-competitive ELISA para sa pagtuklas ng mga antibodies gamit ang enzyme-labeled secondary antibodies at immobilized antigens bilang isang halimbawa.

Ang serum na susuriin ay idinagdag sa immobilized antigen. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog at paghuhugas ng mga hindi nakagapos na antibodies, idinaragdag ang may label na pangalawang antibodies na partikular sa nasuri na mga antibodies. Pagkatapos ng pangalawang pagpapapisa ng itlog at pag-alis ng labis na may label na pangalawang antibodies, ang nilalaman ng label ng enzyme sa carrier ay proporsyonal sa konsentrasyon ng mga tiyak na antibodies sa suwero.

Ang iskema na ito ay isa sa pinakakaraniwang ELISA para sa pagtuklas ng mga antibodies, dahil pinapayagan nito ang pagtuklas ng mga antibodies sa iba't ibang antigens.

Heterogenous competitive ELISA para sa antigen detection gamit ang may label na antigen at immobilized antibodies bilang isang halimbawa.

Ang isang solusyon na naglalaman ng nasuri na antigen at isang nakapirming konsentrasyon ng antigen-enzyme conjugate ay idinagdag sa mga antibodies na hindi kumikilos sa carrier. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog, ang carrier ay hinuhugasan mula sa hindi nakatali na libre at may label na antigen at ang aktibidad ng enzymatic sa carrier ay naitala, na inversely proporsyonal sa konsentrasyon ng antigen na tinutukoy.



5.4 Homogeneous na pamamaraan ng ELISA.

Ang homogenous enzyme immunoassay (HIFA) ay ang pinaka-metodo simpleng uri ng ELISA. Kapag ito ay itinakda, isa sa mga kalahok sa immune reaction (karaniwan ay isang mababang molekular na timbang antigen) ay may label na isang enzyme, at ang kurso ng pagbuo ng antigen-antibody complex ay sinusubaybayan sa pamamagitan ng pagrehistro ng pagbabago sa aktibidad ng enzyme.

Ang ganitong pagkagambala ng aktibidad ng enzymatic ay maaaring mangyari alinman dahil sa spatial uncoupling ng enzyme at substrate, o dahil sa mga pagbabago sa conformational sa molekula ng enzyme na kasama ng pagbuo ng immune complex. Ang GIFA ay may isang bilang ng mga makabuluhang pakinabang sa iba pang mga pamamaraan ng immunochemical. Una, mataas na expression (ang buong pagsusuri gamit ang GIFA ay tumatagal ng ilang minuto at kahit na mga fraction ng minuto).

kanin.8 Homogeneous ELISA Options(A - ang epekto ng uncoupling ng enzyme (F) at substrate (C) dahil sa steric hindrances sa panahon ng pakikipag-ugnayan ng antigen (Ag) at antibody (Ab); B - ang epekto ng pagbabago sa conformation ng enzyme sa panahon ng pagbuo ng antigen-antibody complex).

Pangalawa, ang pamamaraan ay may isang yugto at hindi nangangailangan ng matrabaho at matagal na mga hakbang sa paghuhugas. At panghuli, pangatlo, ang pamamaraan ay nangangailangan ng kaunting volume (8-50 µl) at dami ng isang biological o klinikal na sample. Gayunpaman, ang pamamaraan ng HIFA ay may isang lubhang makabuluhang disbentaha - maaari itong magamit upang lumikha ng mga diagnostic test system para lamang sa mga antigen na mababa ang timbang ng molekular. Sa kasong ito lamang, ang antibody, na nakikipag-ugnayan sa antigen, ay maaaring epektibong protektahan o baguhin ang molekula ng enzyme na nauugnay sa antigen na ito. Ito ay sa koneksyon na ito na (sa kabila ng tila simple at halatang bentahe sa iba pang mga pamamaraan), batay sa HIFA, ang mga diagnostic kit ay nilikha upang makita lamang ang mga hormone, peptides, panggamot at narcotic substance, at ilang mababang molekular na timbang na protina.

5.5 "Sandwich" - isang variant ng ELISA para sa pagtuklas ng mga antigens.

Ang mga antigen na na-detect gamit ang ELISA variant na ito ay dapat magkaroon ng maramihang antibody-binding epitope o may paulit-ulit, spatially separated epitope na may parehong specificity.

Kapag isinasagawa ang variant na ito ng ELISA, ang napakaspesipikong poly- o monoclonal antibodies na na-adsorb sa solid phase ay ini-incubate sa sample ng pagsubok. Pagkatapos ng pamamaraan ng paghuhugas, ang mga antibodies na may label na enzyme (conjugate) sa parehong antigen ay idinagdag sa mga balon, at pagkatapos ay isinasagawa ang lahat ng iba pang mga yugto ng reaksyon. Ang kahusayan ng pagbuo ng isang tiyak na kumplikado sa bawat yugto ng pagsusuri ay nakasalalay sa nagbubuklod na pare-pareho ng reaksyon ng antigen-antibody.