Karamihan sa mga impeksyon sa viral ay nagkakaroon ng mga immune response na ginagamit para sa diagnosis. Karaniwang sinusuri ang mga tugon sa cellular sa mga pagsusuri ng cytotoxicity ng lymphocyte laban sa mga nakakahawang ahente o mga nahawaang target na selula, o ang kakayahan ng mga lymphocyte na tumugon sa iba't ibang antigen at mitogens.
Sa gawain ng mga praktikal na laboratoryo, ang kalubhaan ng mga reaksyon ng cellular ay bihirang tinutukoy. Ang mga pamamaraan para sa pagtukoy ng mga antiviral na AT ay naging mas laganap.
RN batay sa pagsugpo ng cytopathogenic effect pagkatapos ng paghahalo ng virus sa mga tiyak na antibodies. Ang hindi kilalang virus ay nahahalo sa kilalang komersyal na antisera at, pagkatapos ng naaangkop na pagpapapisa ng itlog, ipinakilala sa cell monolayer. Ang kawalan ng pagkamatay ng cell ay nagpapahiwatig ng hindi pagkakatugma sa pagitan ng nakakahawang ahente at mga kilalang antibodies.
Pagbabawal ng hemagglutination RTGA ginagamit upang matukoy ang mga virus na may kakayahang pagsama-samahin ang iba't ibang mga erythrocytes. Upang gawin ito, ang medium ng kultura na naglalaman ng pathogen ay hinahalo sa isang kilalang komersyal na antiserum at ipinakilala sa kultura ng cell. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog, ang kakayahan ng kultura sa hemagglutination ay tinutukoy at, sa kawalan nito, ang isang konklusyon ay ginawa tungkol sa mismatch ng virus na may antiserum. Ang pagsugpo sa cytopathic effect sa pamamagitan ng viral interference Ang reaksyon ng inhibition ng cytopathic effect dahil sa interference ng mga virus ay ginagamit upang makilala ang isang pathogen na nakakasagabal sa isang kilalang cytopathogenic virus sa isang kultura ng mga sensitibong selula. Upang gawin ito, ang isang komersyal na serum (halimbawa, sa rubella virus kung ito ay pinaghihinalaang) ay ipinakilala sa medium ng kultura na naglalaman ng pinag-aralan na virus, incubated at infect ang pangalawang kultura; pagkalipas ng 1-2 araw, isang kilalang cytopathogenic virus (halimbawa, anumang ECHO virus) ay ipinapasok dito. Kung mayroong isang cytopathogenic effect, napagpasyahan na ang unang kultura ay nahawahan ng virus na naaayon sa inilapat na AT.
Direktang immunofluorescence.
Sa iba pang mga pagsubok, ang direktang reaksyon ng immunofluorescence (ang pinakamabilis, pinakasensitibo at nagagawang muli) ay natagpuan ang pinakamalaking distribusyon. Halimbawa, ang pagkakakilanlan ng CMV sa pamamagitan ng cytopathogenic effect ay nangangailangan ng hindi bababa sa 2-3 linggo, at kapag gumagamit ng may label na monoclonal antibodies, ang pagkakakilanlan ay posible pagkatapos ng 24 na oras. gamit ang fluorescent microscopy (nagbibigay-daan sa iyong makita ang pagkakaroon ng fluorescence ng mga nahawaang selula).
Immunoelectron microscopy (katulad ng naunang pamamaraan) ay nagbibigay-daan sa iyo na matukoy ang iba't ibang uri ng mga virus na nakita ng electron microscopy (halimbawa, iba't ibang uri ng herpesviruses), na hindi maaaring gawin batay sa mga morphological features. Sa halip na antisera, ang AT na may label sa iba't ibang paraan ay ginagamit para sa pagkakakilanlan, ngunit ang pagiging kumplikado at mataas na halaga ng pamamaraan ay nililimitahan ang aplikasyon nito.
Ang pagtuklas ng mga antiviral antibodies (AT) sa serum ng dugo. RTGA. RSK. REEF.
Mga pamamaraan ng immunosorptive para sa pagtuklas ng mga antiviral antibodies.
Ang isang mas simple at mas madaling paraan ay ang pagtuklas ng mga antiviral antibodies (AT) sa serum. Ang mga sample ng dugo ay dapat kunin ng dalawang beses: kaagad pagkatapos ng simula ng mga klinikal na palatandaan at pagkatapos ng 2~3 linggo. Napakahalaga na suriin ang eksaktong dalawang sample ng serum. Ang mga resulta ng isang pag-aaral ay hindi maituturing na konklusibo dahil sa kawalan ng kakayahang maiugnay ang hitsura ng AT sa kasalukuyang kaso. Posible na ang mga antibodies na ito ay umiikot pagkatapos ng isang nakaraang impeksiyon. Sa ganoong sitwasyon, ang papel na ginagampanan ng pag-aaral ng suwero na nakuha sa panahon ng convalescence ay halos hindi ma-overestimated. Ang pagkakaroon ng sakit sa panahon ng pagkuha ng unang sample ay ipinahiwatig ng hindi bababa sa isang apat na beses na pagtaas sa AT titer, na nakita sa panahon ng pag-aaral ng pangalawang sample.
Ang mga pamamaraan na nakalista sa ibaba ay hindi pinapayagan ang pagkakaiba-iba ng mga antibodies (AT) na nabuo sa panahon ng sakit at umiikot pagkatapos ng paggaling (ang tagal ng panahong ito ay nagbabago para sa iba't ibang mga impeksyon). Dahil para sa sapat na pagsusuri, kinakailangan upang kumpirmahin ang isang makabuluhang pagtaas sa mga titer ng AT sa dalawang sample, ang unang sample ay sinusuri sa talamak na yugto, at ang pangalawa - sa panahon ng pagbawi (pagkatapos ng 2-3 na linggo). Ang mga resultang nakuha ay retrospective at mas angkop para sa epidemiological survey. Nakikita ng RTGA ang mga antibodies na na-synthesize laban sa mga hemagglutinin ng mga virus (halimbawa, ang influenza virus).
Pinapadali ng pamamaraan ang pagtuklas ng mga naturang antibodies (AT) sa serum ng pasyente. Ang RSK ay ang pangunahing paraan ng serodiagnosis ng mga impeksyon sa viral (kabilang sa mga magagamit). Ang reaksyon ay nagpapakita ng complement-fixing IgM at IgG, ngunit hindi ito pinagkaiba; upang ma-optimize ang mga resulta na nakuha, ang pagbabalangkas ng reaksyon ay nangangailangan ng ilang mga kasanayan ng mga tauhan.
REEF. Kung ang isang biopsy ng nahawaang tissue ay magagamit at ang komersyal na fluorescein-labeled AT kit ay magagamit, direktang immunofluorescence ay maaaring kumpirmahin ang diagnosis.
Ang pagbabalangkas ng reaksyon ay kinabibilangan ng pagpapapisa ng itlog ng pinag-aralan na tissue na may AT, ang kanilang kasunod na pag-alis at fluorescent microscopy ng sample. Ang mga immunosorptive na pamamaraan para sa pag-detect ng mga antiviral antibodies Ang mga immunosorptive na pamamaraan (halimbawa, ELISA at RIA) ay higit na nagbibigay-kaalaman, dahil hiwalay silang nakakakita ng IgM at IgG, na ginagawang posible na gumawa ng ilang mga konklusyon tungkol sa dinamika ng nakakahawang proseso o ang estado ng paggaling. Upang makita ang AT, ang isang kilalang antigen ay na-adsorbed sa isang solidong substrate (halimbawa, sa mga dingding ng mga test tube, plastic microplate, Petri dishes) at iba't ibang dilution ng serum ng pasyente ay idinagdag. Pagkatapos ng naaangkop na incubation, ang mga hindi nakatali na AT ay aalisin, ang antiserum na may label na enzyme laban sa Ig ng tao ay idinagdag, ang pamamaraan para sa pagpapapisa ng itlog at paghuhugas ng mga hindi nakatali na AT ay paulit-ulit, at anumang chromogenic substrate (sensitibo sa pagkilos ng enzyme) ay idinagdag. Dahil ang pagbabago ng kulay ay proporsyonal sa nilalaman ng mga tiyak na antibodies, posible na matukoy ang kanilang titer sa pamamagitan ng spectrophotometric na pamamaraan. Sa pagsusuri ng impeksyon sa HIV, natagpuan ng paraan ng immunoblotting ang pinakamalaking pamamahagi.
Pagtuklas ng mga viral antigens (AH). ELISA. Sa kasalukuyan, ang mga komersyal na kit ay lumitaw na para sa pagtuklas ng AH ng ilang mga pathogen, na nagpapahintulot sa kanila na makilala sa loob ng 5-10 minuto. Upang makita ang AG sa solid phase, ang kilalang AT ay adsorbed at serum na naglalaman ng AG ay idinagdag; pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog, ang hindi nakatali na AG ay decanted, ang sistema ay hinuhugasan, at may label na mga antibodies na tiyak sa mga adsorbed antibodies. Ang pamamaraan ng pagpapapisa ng itlog at paghuhugas ay paulit-ulit, ang isang chromogenic substrate ay ipinakilala, ang isang positibong resulta ay naitala kapag ang kulay ng system ay nagbabago. Ang hybridization ng DNA ay isang napaka-espesipikong pamamaraan na nagbibigay-daan sa pagkilala sa genome ng virus pagkatapos ng hybridization nito sa mga pantulong na molekula ng DNA. Ang mga enzyme at isotopes ay ginagamit bilang mga marker.
Tinutukoy ng pamamaraan ang kakayahan ng viral DNA na mag-hybrid sa may label na complementary DNA; ang pagtitiyak ng pamamaraan ay direktang proporsyonal sa haba ng komplementaryong kadena. Isang promising na paraan para sa in situ hybridization ng mga nucleic acid. Upang i-set up ang reaksyon, inilalapat ang may label na DNA sa mga biopsy ng tissue (kabilang ang mga naayos na may formalin o nakapaloob sa mga bloke ng paraffin) at ang pakikipag-ugnayan sa komplementaryong DNA ay naitala. Ang pamamaraan ay ginagamit upang makita ang herpes simplex virus, human papilloma, Epstein-Barr, atbp.
PCR. Ang pamamaraan ay makabuluhang pinatataas ang sensitivity ng paraan ng hybridization, pinatataas ang nilalaman ng viral DNA sa materyal na nakuha mula sa pasyente, at pinapabilis din ang oras upang makuha ang resulta.
Pagtuklas sa serum ng dugo ang mga antibodies ng pasyente laban sa mga antigen ng pathogen ay nagpapahintulot sa iyo na gumawa ng diagnosis ng sakit. Ginagamit din ang mga serological na pag-aaral upang makilala ang mga microbial antigens, iba't ibang biologically active substance, mga grupo ng dugo, tissue at tumor antigens, immune complex, cell receptor, atbp.
Kapag naghihiwalay ng mikrobyo mula sa pasyente, nakikilala ang pathogen sa pamamagitan ng pag-aaral ng mga antigenic na katangian nito gamit ang immune diagnostic sera, ibig sabihin, blood sera ng hyperimmunized na hayop na naglalaman ng mga partikular na antibodies. Ito ang tinatawag na serological identification mga mikroorganismo.
Malawakang ginagamit sa microbiology at immunology agglutination, precipitation, neutralization reactions, reactions involving complement, using labeled antibodies and antigens (radioimmunological, enzyme immunoassay, immunofluorescent method). Ang mga nakalistang reaksyon ay naiiba sa nakarehistrong epekto at pamamaraan ng pagtatanghal, gayunpaman, lahat sila ay batay sa reaksyon ng pakikipag-ugnayan ng antigen sa antibody at ginagamit upang makita ang parehong mga antibodies at antigens. Ang mga reaksyon ng kaligtasan sa sakit ay nailalarawan sa pamamagitan ng mataas na sensitivity at pagtitiyak.
Mga tampok ng pakikipag-ugnayan ng isang antibody na may isang antigen ay ang batayan ng mga diagnostic na reaksyon sa mga laboratoryo. Reaksyon sa vitro sa pagitan ng antigen at antibody ay binubuo ng isang tiyak at di-tiyak na yugto. SA tiyak na yugto mayroong isang mabilis na tiyak na pagbubuklod ng aktibong site ng antibody sa determinant ng antigen. Pagkatapos ay dumating di-tiyak na yugto - mas mabagal, na kung saan ay ipinahayag sa pamamagitan ng nakikitang pisikal na phenomena, halimbawa, ang pagbuo ng mga natuklap (agglutination phenomenon) o namuo sa anyo ng labo. Ang yugtong ito ay nangangailangan ng ilang mga kundisyon (electrolytes, pinakamainam na pH ng daluyan).
Ang pagbubuklod ng isang antigen determinant (epitope) sa aktibong site ng isang antibody Fab fragment ay dahil sa mga puwersa ng van der Waals, hydrogen bond, at hydrophobic na pakikipag-ugnayan. Ang lakas at dami ng antigen na nakagapos ng mga antibodies ay nakadepende sa affinity, avidity ng antibodies at kanilang valency.
Sa tanong tungkol sa express diagnostics:
1. Maaaring masuri ang isang kulturang nakahiwalay sa dalisay nitong anyo.
2. Sa mga laboratoryo na may espesyal na kagamitan (dapat may pahintulot)
3. Pagsunod sa mga mahigpit na alituntunin tulad ng: isang nakahiwalay na silid, mga kinakailangang espesyal na proteksiyon na suit, ipinag-uutos na kumpletong sanitization ng mga lugar pagkatapos magtrabaho kasama ang pathogen, sanitization ng mga mananaliksik pagkatapos ng trabaho.
Mga paraan ng express diagnostics.
1. Bacteriology - pinagsamang polytropic nutrient media para sa mabilis na pag-aaral ng morphs, tinctor, biochem. ari-arian. Ang paggamit ng isang enzyme indicator tape, ang electrophysical method, ang paraan ng mga paper disc na pinapagbinhi ng iba't ibang mga sangkap (glucaso, lactose, atbp.)
2. Mga diagnostic ng Phage.
3. Serodiagnosis - Ang pamamaraan ni Mancini, reaksyon ng pag-ulan sa gel ayon sa Ascoli, RA, RPHA.
4. Bacterioscopy - direkta at hindi direktang RIF.
Ipahayag ang mga pamamaraan ng diagnostic para sa:
Cholera - M. Z. Ermolyeva, immobilization district na may cholera diagnostic serum, RIF.
Tularemia - RA sa salamin, RPGA
Chume - phage typing, ang paraan ng carbohydrate paper disks, RPHA.
Anthrax - Paraan ng Ascoli, RIF, RPGA.
Ang likas na katangian ng paglago: mayroong tatlong nagkakalat (facultative anaerobes), malapit sa ibaba (obligate anaerobes) at ibabaw (obligate aerobes.)
Paghihiwalay ng purong kultura ng anaerobic bacteria
Sa pagsasanay sa laboratoryo, madalas na kinakailangan upang gumana sa anaerobic microorganisms. Ang mga ito ay mas mabilis sa nutrient media kaysa sa aerobes, madalas silang nangangailangan ng mga espesyal na pandagdag sa paglago, nangangailangan sila ng pagtigil ng suplay ng oxygen sa panahon ng kanilang paglilinang, ang kanilang panahon ng paglago ay mas mahaba. Samakatuwid, ang pakikipagtulungan sa kanila ay mas kumplikado at nangangailangan ng malaking pansin ng mga bacteriologist at mga katulong sa laboratoryo.
Mahalagang protektahan ang materyal na naglalaman ng anaerobic pathogens mula sa mga nakakalason na epekto ng atmospheric oxygen. Samakatuwid, inirerekumenda na kunin ang materyal mula sa foci ng purulent infection sa panahon ng kanilang pagbutas gamit ang isang syringe, ang oras sa pagitan ng pagkuha ng materyal at paghahasik nito sa isang nutrient medium ay dapat na maikli hangga't maaari.
Dahil ang mga espesyal na nutrient media ay ginagamit para sa paglilinang ng anaerobic bacteria, na hindi dapat maglaman ng oxygen at may mababang potensyal na redox (-20 -150 mV), ang mga tagapagpahiwatig ay ipinakilala sa kanilang komposisyon - resazurin, methylene blue at iba pa, na tumutugon sa isang pagbabago sa potensyal na ito. Sa paglaki nito, ang mga walang kulay na anyo ng mga tagapagpahiwatig ay ipinagpatuloy at binabago ang kanilang kulay: ang resazurin ay nabahiran ng medium pink, at methylene blue - asul. Ang ganitong mga pagbabago ay nagpapahiwatig ng imposibilidad ng paggamit ng media para sa paglilinang ng anaerobic microbes.
Nakakatulong ito upang bawasan ang potensyal na redox ng pagpasok sa medium ng hindi bababa sa 0.05% agar, na, sa pamamagitan ng pagtaas ng lagkit nito, ay nakakatulong upang mabawasan ang supply ng oxygen. Ito, sa turn, ay nakakamit din sa pamamagitan ng paggamit ng sariwa (hindi lalampas sa dalawang oras pagkatapos ng produksyon) at pinababang kulturang media.
Dapat pansinin na dahil sa mga kakaibang uri ng fermentative na metabolismo ng anaerobic bacteria, nangangailangan sila ng media na mas mayaman sa nutrients at bitamina. Ang pinakakaraniwang ginagamit ay mga pagbubuhos ng cardio-utak at atay, toyo at yeast extract, casein hydrolytic digest, peptone, tryptone. Ito ay ipinag-uutos na magdagdag ng mga kadahilanan ng paglago tulad ng tween-80, hemin, menadione, buo o hemolyzed na dugo.
Ang paghihiwalay ng isang purong kultura ng mga aerobic microorganism ay binubuo ng isang bilang ng mga hakbang.
Sa unang araw (yugto 1 ng pag-aaral), ang pathological na materyal ay dinadala sa isang sterile na lalagyan (test tube, flask, vial). Pinag-aaralan ito para sa hitsura, pagkakapare-pareho, kulay, amoy at iba pang mga palatandaan, ang isang pahid ay inihanda, pininturahan at sinusuri sa ilalim ng mikroskopyo. Sa ilang mga kaso (talamak na gonorrhea, salot), sa yugtong ito posible na gumawa ng isang nakaraang pagsusuri, at bilang karagdagan, piliin ang media kung saan ihahasik ang materyal. Kinuha ko ito gamit ang isang bacteriological loop (madalas na ginagamit), na may isang spatula na sumusunod sa pamamaraan ng Drygalsky, na may cotton-gauze swab. Ang mga tasa ay sarado, nakabaligtad, nilagdaan ng isang espesyal na lapis at inilagay sa isang termostat sa pinakamabuting kalagayan na temperatura (37 ° C) sa loob ng 18-48 taon. Ang layunin ng yugto ay upang makakuha ng mga nakahiwalay na kolonya ng mga mikroorganismo.
Gayunpaman, kung minsan upang itambak ang materyal, ito ay inihahasik sa likidong nutrient media.
Ang mga pahid ay inihanda mula sa mga kahina-hinalang kolonya, na nabahiran ng pamamaraang Gram upang pag-aralan ang mga morphological at tinctorial na katangian ng mga pathogen, at ang motile bacteria ay sinusuri sa isang "nakabitin" o "durog" na patak. Ang mga palatandaang ito ay may napakahusay na halaga ng diagnostic sa paglalarawan ng ilang uri ng mga mikroorganismo.
Ang mga labi ng mga pinag-aralan na kolonya ay maingat na inalis mula sa ibabaw ng daluyan nang hindi hawakan ang iba at inoculated sa isang slant agar o sa mga sektor ng isang Petri dish na may isang nutrient medium upang makakuha ng isang purong kultura. Ang mga test tube o mga pinggan na may mga pananim ay inilalagay sa isang termostat sa pinakamabuting kalagayan na temperatura sa loob ng 18-24 na oras.
Sa likidong nutrient media, ang bakterya ay maaari ding lumago nang iba, kahit na ang mga tampok ng mga pagpapakita ng paglago ay mas mahirap kaysa sa mga solid.
Ang mga bakterya ay may kakayahang magdulot ng nagkakalat na labo ng daluyan, habang ang kulay nito ay maaaring hindi magbago o makakuha ng kulay ng pigment. Ang pattern ng paglago na ito ay madalas na sinusunod sa karamihan ng facultative anaerobic microorganisms.
Minsan may nabubuong precipitate sa ilalim ng tubo. Maaari itong maging madurog, homogenous, malapot, malansa, atbp. Ang medium sa itaas nito ay maaaring manatiling transparent o maging maulap. Kung ang mga mikrobyo ay hindi bumubuo ng isang pigment, ang namuo ay may matingkad o madilaw-dilaw na kulay. Bilang isang patakaran, ang anaerobic bacteria ay lumalaki sa isang katulad na ranggo.
Ang paglago ng pader ay ipinakita sa pamamagitan ng pagbuo ng mga natuklap, mga butil na nakakabit sa mga panloob na dingding ng test tube. Ang daluyan ay nananatiling transparent.
Ang aerobic bacteria ay kadalasang lumalaki sa ibabaw. Kadalasan ang isang pinong walang kulay o mala-bughaw na pelikula ay nabuo sa anyo ng isang halos hindi kapansin-pansin na patong sa ibabaw, na nawawala kapag ang daluyan ay inalog o nabalisa. Ang pelikula ay maaaring kahalumigmigan, makapal, may niniting, malansa na pagkakapare-pareho at dumikit sa loop, na lumalawak para dito. Gayunpaman, mayroon ding isang siksik, tuyo, malutong na pelikula, ang kulay nito ay nakasalalay sa pigment, na ginawa ng mga mikroorganismo.
Kung kinakailangan, ang isang smear ay ginawa, nabahiran, sinusuri sa ilalim ng isang mikroskopyo, at ang mga mikroorganismo ay binibinhan ng isang loop sa ibabaw ng isang siksik na nutrient medium upang makakuha ng mga nakahiwalay na kolonya.
Sa ikatlong araw (yugto 3 ng pag-aaral), ang likas na katangian ng paglago ng isang purong kultura ng mga mikroorganismo ay pinag-aralan at ang pagkakakilanlan nito ay isinasagawa.
Una, binibigyang pansin ang mga katangian ng paglaki ng mga mikroorganismo sa daluyan at ang isang pahid ay ginawa, paglamlam nito gamit ang pamamaraang Gram, upang masuri ang kultura para sa kadalisayan. Kung ang bakterya ng parehong uri ng morpolohiya, laki at tinctorial (kakayahang magkulay) na mga katangian ay sinusunod sa ilalim ng mikroskopyo, napagpasyahan na ang kultura ay dalisay. Sa ilang mga kaso, na sa pamamagitan ng hitsura at mga katangian ng kanilang paglaki, ang isa ay maaaring gumawa ng isang konklusyon tungkol sa uri ng mga nakahiwalay na pathogens. Ang pagtukoy sa mga species ng bakterya sa pamamagitan ng kanilang mga morphological features ay tinatawag na morphological identification. Ang pagtukoy sa uri ng mga pathogen sa pamamagitan ng kanilang mga kultural na katangian ay tinatawag na cultural identification.
Gayunpaman, ang mga pag-aaral na ito ay hindi sapat upang makagawa ng pangwakas na konklusyon tungkol sa uri ng mga nakahiwalay na mikrobyo. Samakatuwid, pinag-aaralan nila ang mga biochemical na katangian ng bakterya. Ang mga ito ay medyo iba-iba.
Kadalasan, pinag-aaralan ang saccharolytic, proteolytic, peptolytic, hemolytic properties, ang pagbuo ng decarboxylase, oxidase, catalase, plasmacoagulase, DNase, fibrinolysin enzymes, ang pagbawas ng nitrates sa nitrite, at mga katulad nito. Para dito, may mga espesyal na nutrient media na inoculated sa mga microorganism (variegated Hiss series, MPB, curdled whey, milk, atbp.).
Ang pagtukoy sa uri ng pathogen sa pamamagitan ng biochemical properties nito ay tinatawag na biochemical identification.
PARAAN NG PAGKULTURA
AT ISOLATION NG PURE BACTERIA CULTURE
Para sa matagumpay na paglilinang, bilang karagdagan sa wastong napiling media at maayos na na-seed, ang mga pinakamainam na kondisyon ay kinakailangan: temperatura, halumigmig, aeration (supply ng hangin). Ang paglilinang ng mga anaerobes ay mas mahirap kaysa sa aerobes; iba't ibang mga pamamaraan ang ginagamit upang alisin ang hangin mula sa nutrient medium.
Ang paghihiwalay ng ilang uri ng bakterya (purong kultura) mula sa materyal na pagsubok, na kadalasang naglalaman ng pinaghalong iba't ibang microorganism, ay isa sa mga yugto ng anumang pag-aaral sa bacteriological. Ang isang purong microbial culture ay nakuha mula sa isang nakahiwalay na microbial colony.
Kapag ihiwalay ang isang purong kultura mula sa dugo (hemoculture), ito ay preliminarily "paglago" sa isang likidong daluyan: 10-15 ml ng sterile na dugo ay inoculated sa 100-150 ml ng isang likidong daluyan. Ang ratio ng inihasik na dugo at nutrient medium 1:10 ay hindi sinasadya - ito ay kung paano nakakamit ang pagbabanto ng dugo (ang hindi natunaw na dugo ay may masamang epekto sa mga microorganism).
Mga hakbang para sa paghihiwalay ng purong kultura ng bakterya
Stage I (katutubong materyal)
Microscopy (magaspang na ideya ng microflora).
Paghahasik sa siksik na nutrient media (pagkuha ng mga kolonya).
Stage II (isolated colonies)
Ang pag-aaral ng mga kolonya (kultural na katangian ng bakterya).
Microscopic na pag-aaral ng microbes sa isang stained smear
(morphological properties ng bacteria).
Inoculation sa nutrient agar slant upang ihiwalay ang isang purong kultura.
Stage III (purong kultura)
Pagpapasiya ng kultura, morphological, biochemical
at iba pang mga katangian para sa pagkilala sa kultura ng bakterya
PAGKILALA NG BACTERIA
Ang pagkilala sa mga nakahiwalay na kultura ng bakterya ay isinasagawa sa pamamagitan ng pag-aaral ng morpolohiya ng bakterya, ang kanilang kultura, biochemical at iba pang mga katangian na likas sa bawat species.
Katulad na impormasyon.
Mga antigen- mga genetically alien substance na, kapag ipinakilala sa katawan ng isang hayop o tao, ay nagiging sanhi ng isang tiyak na immune response - ang synthesis ng mga antibodies, ang pagbuo ng sensitized T-lymphocytes, immunological memory o tolerance. Ang mga dayuhang sangkap ay mga istrukturang kemikal na wala sa katawan. Banyaga sa katawan ng tao ang mga virus, mikroorganismo, gayundin ang mga selula, tisyu, organo ng mga hayop at iba pang tao. Ang mga antigen ay may ilang mga receptor para sa pagbubuklod sa mga antibodies at nagagawang tumugon sa kanila kapwa sa katawan ng hayop o tao (in vivo) at sa labas ng katawan - in vitro (in vitro).
Antibodies- mataas na molekular na timbang na mga protina ng globulin na bahagi ng serum ng dugo. Ang mga antibodies ay na-synthesize sa ilalim ng impluwensya ng isang antigen at nagagawang partikular na tumugon (pagsamahin) sa kaukulang antigen. Ang lahat ng mga antibodies ay may katangian na istraktura ng immunoglobulin; naiiba sa immunological, biological at pisikal na katangian; at nahahati sa 5 klase - IgG, IgA, IgM, IgD at IgE.
Mga reaksyon ng serological
Sa laboratory practice, ginagamit nila serological reaksyon- mga reaksyon sa laboratoryo sa pagitan ng mga antigen at antibodies, na humahantong sa mga rehistradong pagbabago sa sistemang pinag-aaralan. Ang mga reaksyong ito ay tinatawag na serological, dahil ang serum (serum) na naglalaman ng mga antibodies ay ginagamit para sa kanilang produksyon.
Ang mga serological na pag-aaral na isinagawa upang tuklasin ang mga partikular na antibodies at pathogen antigen sa mga nakakahawang sakit ay mas naa-access na mga pamamaraan ng diagnostic sa laboratoryo kaysa sa bacteriological detection ng pathogen. Sa ilang mga kaso, ang mga serological na pag-aaral ay nananatiling ang tanging paraan para sa pag-diagnose ng mga nakakahawang sakit.
Ang ilang mga pamamaraan para sa pagtuklas ng mga antibodies na ginagamit sa pagsasanay sa laboratoryo
Ang lahat ng mga serological na reaksyon ay batay sa pakikipag-ugnayan ng isang antigen at isang antibody na may pagbuo ng mga immune complex na maaaring makita sa mga in vitro test (i.e. "in vitro" - sa labas ng isang buhay na organismo). Ang mga reaksyon ng antigen-antibody sa in vitro system ay maaaring sinamahan ng ilang mga phenomena - agglutination, precipitation, lysis, at iba pa. Ang mga panlabas na pagpapakita ng reaksyon ay nakasalalay sa mga katangian ng physicochemical ng antigen (laki ng butil, pisikal na estado), ang klase at uri ng mga antibodies, pati na rin ang mga pang-eksperimentong kondisyon (katamtamang pagkakapare-pareho, konsentrasyon ng asin, pH, temperatura).
1. Makadagdag na nagbubuklod na reaksyon
Komplemento ay isang sistema ng mga protina ng plasma ng dugo, na kinabibilangan ng 9 na bahagi na ipinahiwatig ng titik C (C1, C2, C3, ... C9), kadahilanan B, kadahilanan D at isang bilang ng mga regulatory protein. Ang ilan sa mga sangkap na ito ay binubuo ng 2-3 protina, halimbawa ang C1 ay isang kumplikado ng tatlong protina. Ang mga protina na ito ay umiikot sa daluyan ng dugo at naroroon sa mga lamad ng cell. Ang pandagdag ay ang pinakamahalagang sistema ng parehong likas at nakuha na kaligtasan sa sakit. Ang sistemang ito ay dinisenyo upang protektahan ang katawan mula sa pagkilos ng mga dayuhang ahente at kasangkot sa pagpapatupad ng immune response ng katawan. Ang pandagdag ay natuklasan sa pagtatapos ng ika-19 na siglo ng Belgian scientist na si J. Borde.
Complement fixation reaction (CFR)- isang serological test na ginagamit upang mabilang ang mga antibodies at antigens sa pag-aayos ng komplemento. Unang inilarawan nina Bordet at Zhangu (Bordet - Gengou) noong 1901. Ang RSK ay batay sa katotohanan na ang antigen-antibody complex ay nakakakuha ng pandagdag na idinagdag sa pinaghalong reaksyon. Kapag ang mga antigen at antibodies ay tumutugma sa isa't isa, bumubuo sila ng isang immune complex, kung saan nakakabit ang pandagdag. Ang partikular na immune complex ay sumisipsip sa pandagdag na idinagdag sa system, i.e. pagbubuklod ng pandagdag ng antigen-antibody complex. Ang mas maraming antibodies, mas maraming pandagdag ang naayos. Kung ang antigen-antibody complex ay hindi nabuo, kung gayon ang pandagdag ay nananatiling libre.
Ang pagiging kumplikado ng CSC ay ang reaksyon ng pagbuo ng "antigen - antibody - complement" complex ay hindi nakikita. Ang isang karagdagang indicator hemolytic system ay ginagamit upang matukoy ang mga bahagi ng reaksyon. Gamit ang reaksyon ng hemolysis, ang isang quantitative determination ng complement residue ay isinasagawa pagkatapos ng pagtatapos ng reaksyon ng antigen na may antiserum.
Ang complement fixation test (RCT) ay ginagamit upang makita ang mga antibodies sa isang partikular na antigen o matukoy ang uri ng antigen ng isang kilalang antibody. Ang kumplikadong serological reaksyon na ito ay nagsasangkot ng dalawang sistema at pandagdag. Ang unang sistema - bacteriological (pangunahing), ay binubuo ng isang antigen at isang antibody. Ang pangalawang sistema ay hemolytic (tagapagpahiwatig). Kabilang dito ang mga erythrocytes ng tupa (antigen) at ang kanilang katumbas na hemolytic serum (antibody).
Ang RSK ay inilalagay sa dalawang hakbang: una, ang antigen ay pinagsama sa test blood serum, kung saan hinahanap ang mga antibodies, at pagkatapos ay idinagdag ang pandagdag. Kung ang antigen at antibody ay magkatugma, pagkatapos ay isang immune complex ay nabuo na nagbubuklod ng pandagdag. Sa kawalan ng mga antibodies sa suwero, ang immune complex ay hindi nabuo at ang pandagdag ay nananatiling libre. Dahil ang proseso ng complement adsorption ng complex ay biswal na hindi nakikita, isang heme system ang idinagdag upang ipakita ang prosesong ito.
Dahil sa mataas na sensitivity nito, ginagamit ang complement fixation reaction (CFR) para sa serological diagnosis ng bacterial at viral infection, allergic na kondisyon, at para sa pagkilala ng mga antigens (isolated bacterial culture).
Reaksyon sa pag-ulan (RP)(mula sa Latin na praecipitatio - precipitation, falling down) ay batay sa pag-ulan ng isang tiyak na immune complex na binubuo ng isang natutunaw na antigen at isang tiyak na antibody sa pagkakaroon ng isang electrolyte. Bilang resulta ng reaksyon, isang maulap na singsing o isang maluwag na namuo ay nabuo - isang namuo. Ang isang reaksyon ng pag-ulan ay nangyayari sa pagitan ng isang nalulusaw sa tubig na antigen at isang antibody, na nagreresulta sa malalaking complex na namuo
3. Flocculation reaksyon
Flocculation reaction (ayon kay Ramon)(mula sa Latin na floccus - wool flakes, flocculi - shreds, flakes; flocculation - ang pagbuo ng maluwag na flocculent aggregates (flocculi) mula sa maliliit na particle ng dispersed phase) - ang hitsura ng opalescence o flocculent mass (immunoprecipitation) sa isang test tube sa panahon ng reaksyon ng lason - antitoxin o anatoxin - antitoxin. Ito ay ginagamit upang matukoy ang aktibidad ng antitoxic serum o toxoid.
Ang reaksyon ng flocculation ay batay sa pagtuklas ng "paunang" flocculation - labo sa panahon ng pagbuo ng isang complex ng exotoxin (anatoxin) + antitoxin sa pinakamainam na quantitative ratios ng mga sangkap.
4. Agglutination reaksyon
Agglutination(mula sa Latin na agglutinatio - bonding) ay ang reaksyon ng pakikipag-ugnayan ng isang antigen na may isang tiyak na antibody, na nagpapakita ng sarili sa anyo ng pagbubuklod. Sa kasong ito, ang mga antigen sa anyo ng mga particle-corpuscles (microbial cells, erythrocytes, atbp.) Ay pinagsama-sama ng mga antibodies at namuo (agglutinate) sa anyo ng mga natuklap. Ang mga aglutinate ay karaniwang nakikita ng mata. Para maganap ang reaksyon, ang pagkakaroon ng mga electrolyte (halimbawa, isotonic sodium chloride solution) ay kinakailangan, na nagpapabilis sa proseso ng agglutination.
Gamit ang agglutination test (RA), reactio agglutinationis (English agglutination test), antibodies o corpuscular antigens ay nakita. Depende sa uri ng immunodiagnosticum na ginamit, may mga reaksyon ng microbial agglutination, hemagglutination, latex agglutination, coagglutination, atbp.
5. Pangalan ng mga antibodies na kasangkot sa mga reaksyon ng precipitation
Ang mga antibodies na kasangkot sa mga sedimentary na reaksyon ay nakatanggap ng tradisyonal na pangalan para sa kanilang pakikipag-ugnayan sa antigen:
agglutinins - sanhi ng agglutination ng corpuscular antigen - agglutinogen at precipitation ng antigen-antibody complex (agglutinate);
precipitin - bumuo ng isang namuo na may natutunaw na antigen - precipitinogen.
Ang mga bacteriolysin (nagdudulot ng lysis ng bakterya) at hemolysin (na sanhi ng lysis ng mga pulang selula ng dugo) ay kasangkot sa mga lytic reaction.
mga reaksyon ng immune ginagamit sa diagnostic at immunological na pag-aaral sa mga may sakit at malusog na tao. Para sa layuning ito, mag-apply mga pamamaraan ng serological , ibig sabihin, mga pamamaraan para sa pag-aaral ng mga antibodies at antigens gamit ang mga reaksyon ng antigen-antibody na tinutukoy sa serum ng dugo at iba pang mga likido, pati na rin sa mga tisyu ng katawan.
Pagtuklas sa serum ng dugo ang mga antibodies ng pasyente laban sa mga antigen ng pathogen ay nagpapahintulot sa iyo na gumawa ng diagnosis ng sakit. Ginagamit din ang mga serological na pag-aaral upang makilala ang mga microbial antigens, iba't ibang biologically active substance, mga grupo ng dugo, tissue at tumor antigens, immune complex, cell receptor, atbp.
Kapag naghihiwalay ng mikrobyo mula sa pasyente, nakikilala ang pathogen sa pamamagitan ng pag-aaral ng mga antigenic na katangian nito gamit ang immune diagnostic sera, ibig sabihin, blood sera ng hyperimmunized na hayop na naglalaman ng mga partikular na antibodies. Ito ang tinatawag na serological identification mga mikroorganismo.
Malawakang ginagamit sa microbiology at immunology agglutination, precipitation, neutralization reactions, reactions involving complement, using labeled antibodies and antigens (radioimmunological, enzyme immunoassay, immunofluorescent method). Ang mga nakalistang reaksyon ay naiiba sa nakarehistrong epekto at pamamaraan ng pagtatanghal, gayunpaman, lahat sila ay batay sa reaksyon ng pakikipag-ugnayan ng antigen sa antibody at ginagamit upang makita ang parehong mga antibodies at antigens. Ang mga reaksyon ng kaligtasan sa sakit ay nailalarawan sa pamamagitan ng mataas na sensitivity at pagtitiyak.
Mga tampok ng pakikipag-ugnayan ng isang antibody na may isang antigen ay ang batayan ng mga diagnostic na reaksyon sa mga laboratoryo. Reaksyon sa vitro sa pagitan ng antigen at antibody ay binubuo ng isang tiyak at di-tiyak na yugto. SA tiyak na yugto mayroong isang mabilis na tiyak na pagbubuklod ng aktibong site ng antibody sa determinant ng antigen. Pagkatapos ay dumating di-tiyak na yugto - mas mabagal, na kung saan ay ipinahayag sa pamamagitan ng nakikitang pisikal na phenomena, halimbawa, ang pagbuo ng mga natuklap (agglutination phenomenon) o namuo sa anyo ng labo. Ang yugtong ito ay nangangailangan ng ilang mga kundisyon (electrolytes, pinakamainam na pH ng daluyan).
Ang pagbubuklod ng isang antigen determinant (epitope) sa aktibong site ng isang antibody Fab fragment ay dahil sa mga puwersa ng van der Waals, hydrogen bond, at hydrophobic na pakikipag-ugnayan. Ang lakas at dami ng antigen na nakagapos ng mga antibodies ay nakadepende sa affinity, avidity ng antibodies at kanilang valency.
Mga immunodeficiencies, parehong pangunahin at lalo na pangalawa ay laganap sa mga tao. Ang mga ito ang sanhi ng pagpapakita ng maraming mga sakit at mga kondisyon ng pathological, samakatuwid, nangangailangan sila ng pag-iwas at paggamot sa mga immunotropic na gamot.
34. Mga inactivated (corpuscular) na bakuna. Resibo. Aplikasyon. Mga kalamangan. Bahid.
Mga bakunang hindi aktibo (pinatay, particulate o molekular).- mga paghahanda na, bilang aktibong prinsipyo, ay kinabibilangan ng mga kultura ng mga pathogenic na virus o bacteria na pinatay ng isang kemikal o pisikal na pamamaraan (cellular, virion) o mga complex ng antigens na nakuha mula sa mga pathogenic microbes na naglalaman ng mga proteksiyon na antigens (subcellular, subvirion vaccines).
Upang ihiwalay ang mga antigenic complex (glycoproteins, LPS, protina) mula sa bakterya at mga virus, ginagamit ang trichloroacetic acid, phenol, enzymes, at isoelectric precipitation.
Ang mga ito ay nakuha sa pamamagitan ng lumalaking pathogenic bacteria at mga virus sa artipisyal na nutrient media, inactivated, nakahiwalay na mga antigenic complex, purified, itinayo sa anyo ng isang likido o lyophilic na paghahanda.
Ang bentahe ng ganitong uri ng bakuna ay ang relatibong kadalian ng pagkuha (pangmatagalang pag-aaral at paghihiwalay ng mga strain ay hindi kinakailangan). Kabilang sa mga disadvantage ang mababang immunogenicity, ang pangangailangan para sa triple na paggamit at mataas na reactogenicity ng mga pormal na bakuna. Gayundin, kumpara sa mga live na bakuna, panandalian lang ang immunity na kanilang nakukuha.
Sa kasalukuyan, ang mga sumusunod na pinatay na bakuna ay ginagamit: tipus, pinayaman ng Vi antigen; bakuna sa kolera, bakuna sa pertussis.
Ang mga pamamaraan para sa pagsusuri sa laboratoryo ng mga impeksyon sa viral ay nahahati sa maraming malalaking grupo.
- Mga direktang pamamaraan, na binubuo sa pagtuklas nang direkta sa biological na materyal ng virus mismo o mga antibodies dito.
- Ang mga hindi direktang pamamaraan ay binubuo sa artipisyal na produksyon ng virus sa makabuluhang dami, at ang karagdagang pagsusuri nito.
Ang pinaka-kaugnay na mga pamamaraan ng diagnostic sa pang-araw-araw na pagsasanay ay kinabibilangan ng:
Mga pamamaraan ng serological diagnostic - pagtuklas sa serum ng dugo ng pasyente ng ilang antibodies o antigens bilang resulta ng reaksyon ng antigen-antibody (AG-AT). Iyon ay, kapag naghahanap ng isang tiyak na antigen sa isang pasyente, ang isang naaangkop na artipisyal na synthesized na antibody ay ginagamit, at, nang naaayon, sa kabaligtaran, kapag ang mga antibodies ay nakita, ang mga synthesized na antigens ay ginagamit.
Immunofluorescence reaction (RIF)
Batay sa paggamit ng dye-labeled antibodies. Sa pagkakaroon ng isang viral antigen, ito ay nagbubuklod sa mga may label na antibodies, at ang isang tiyak na kulay ay sinusunod sa ilalim ng mikroskopyo, na nagpapahiwatig ng isang positibong resulta. Sa pamamaraang ito, sa kasamaang-palad, imposible ang isang quantitative interpretation ng resulta, ngunit isang qualitative lamang.
Ang posibilidad ng quantitative determination ay nagbibigay ng enzyme immunoassay (ELISA). Ito ay katulad ng RIF, gayunpaman, hindi mga tina ang ginagamit bilang mga marker, ngunit ang mga enzyme na nagko-convert ng mga walang kulay na substrate sa mga kulay na produkto, na ginagawang posible upang mabilang ang nilalaman ng parehong antigens at antibodies.
- Ang mga hindi nakatali na antibodies at antigens ay nahuhugasan.
- Ang isang walang kulay na substrate ay idinagdag at ang paglamlam ay magaganap sa mga balon na may antigen na ating nakikita magkakaroon ng isang enzyme na nauugnay sa antigen, pagkatapos kung saan ang intensity ng luminescence ng kulay na produkto ay tinatantya sa isang espesyal na aparato.
Natutukoy ang mga antibodies sa katulad na paraan.
Ang reaksyon ng hindi direktang (passive) hemagglutination (RPHA).
Ang pamamaraan ay batay sa kakayahan ng mga virus na magbigkis ng mga pulang selula ng dugo. Karaniwan, ang mga pulang selula ng dugo ay nahuhulog sa ilalim ng tablet, na bumubuo ng tinatawag na button. Gayunpaman, kung mayroong isang virus sa biological na materyal na pinag-aaralan, ito ay magbubuklod sa mga erythrocytes sa isang tinatawag na payong na hindi mahuhulog sa ilalim ng balon.
Kung ang gawain ay upang makita ang mga antibodies, maaari itong gawin gamit hemagglutination inhibition reactions (HITA). Ang iba't ibang mga sample ay inilalagay sa balon na may virus at mga erythrocytes. Sa pagkakaroon ng mga antibodies, ibibigkis nila ang virus, at ang mga pulang selula ng dugo ay mahuhulog sa ilalim na may pagbuo ng isang "button".
Ngayon ay pag-isipan natin ang mga paraan ng direktang pag-diagnose ng mga nucleic acid ng mga pinag-aralan na virus, atuna sa lahat tungkol sa PCR (Polymerase Chain Reaction) .
Ang kakanyahan ng pamamaraang ito ay upang makita ang isang tiyak na fragment ng DNA o RNA ng isang virus sa pamamagitan ng paulit-ulit na pagkopya nito sa ilalim ng mga artipisyal na kondisyon. Ang PCR ay maaari lamang isagawa gamit ang DNA, iyon ay, para sa mga RNA virus, kailangan munang magsagawa ng reverse transcription reaction.
Ang direktang PCR ay isinasagawa sa isang espesyal na aparato na tinatawag na amplifier, o isang thermal cycler, na nagpapanatili ng kinakailangang temperatura. Binubuo ang pinaghalong PCR ng idinagdag na DNA, na naglalaman ng fragment ng interes sa amin, mga primer (isang maikling nucleic acid fragment na pantulong sa target na DNA, nagsisilbing primer para sa synthesis ng complementary strand), DNA polymerase, at nucleotides.
Mga hakbang sa pag-ikot ng PCR:
- Ang denaturation ay ang unang yugto. Ang temperatura ay tumataas sa 95 degrees, ang mga kadena ng DNA ay naghihiwalay sa bawat isa.
- Pagsusubo ng panimulang aklat. Ang temperatura ay binabaan sa 50-60 degrees. Hinahanap ng mga panimulang aklat ang komplementaryong rehiyon ng kadena at itali dito.
-
Synthesis. Ang temperatura ay muling itinaas sa 72, ito ang gumaganang temperatura para sa DNA polymerase, na, simula sa mga primer, ay nagtatayo ng mga chain ng anak na babae.
Ang cycle ay paulit-ulit ng maraming beses. Pagkatapos ng 40 cycle, 10 * 12 degrees ng mga kopya ng mga kopya ng nais na fragment ay nakuha mula sa isang molekula ng DNA.
Sa real-time na PCR, ang mga synthesize na kopya ng isang fragment ng DNA ay may label na dye. Inirerehistro ng aparato ang intensity ng glow at inilalagay ang akumulasyon ng nais na fragment sa kurso ng reaksyon.
Ang mga modernong pamamaraan ng mga diagnostic sa laboratoryo na may mataas na pagiging maaasahan ay ginagawang posible upang makita ang pagkakaroon ng isang virus - ang pathogen sa katawan, madalas bago lumitaw ang mga unang sintomas ng sakit.