Mikroskop(iz grčkog mikros- mali i skopeo- Gledam) - optički uređaj za dobijanje uvećane slike malih objekata i njihovih detalja nevidljivih golim okom.
Prvi poznati mikroskop kreirali su 1590. godine u Holandiji nasljedni optičari Zaharija I Hans Jansen , koji je montirao dva konveksna sočiva unutar jedne cijevi. Kasnije Descartes u svojoj knjizi "Dioptrija" (1637) opisao je složeniji mikroskop, sastavljen od dva sočiva - ravno-konkavnog (okular) i bikonveksnog (objektiv). Dalje poboljšanje optike je to omogućilo Anthony van Leeuwenhoek 1674. godine napravio sočiva sa povećanjem dovoljnim za obavljanje jednostavnih naučnih opservacija i prvi put 1683. opisao mikroorganizme.
Moderni mikroskop (slika 1) sastoji se od tri glavna dijela: optičkog, svjetlosnog i mehaničkog.
Glavni detalji optički dio Mikroskop se sastoji od dva sistema povećala: okulara okrenutog prema oku istraživača i sočiva okrenutog prema uzorku. Okulari Imaju dva sočiva, gornja se zove glavna, a donja se zove zbirna sočiva. Okviri okulara pokazuju šta proizvode. povećati(×5, ×7, ×10, ×15). Broj okulara na mikroskopu može varirati, a samim tim monokular I binocular mikroskopi (namijenjeni za promatranje predmeta s jednim ili dva oka), kao i trinokulari , koji vam omogućava da povežete sisteme dokumentacije (foto i video kamere) na mikroskop.
Objektivi su sistem sočiva zatvorenih u metalni okvir, od kojih prednja (prednja) sočiva proizvodi uvećanje, a korektivna sočiva iza nje otklanjaju nedostatke u optičkoj slici. Brojevi na okviru sočiva takođe označavaju šta proizvode. povećati (×8, ×10, ×40, ×100). Većina modela dizajniranih za mikrobiološka istraživanja, dolazi sa nekoliko sočiva sa različitih stepeni uvećanje i rotirajući mehanizam dizajniran za njihovu brzu promjenu - turret , često nazivan " turret ».
Rasvjetni dio dizajniran za stvaranje svjetlosni tok, koji vam omogućava da osvijetlite objekt na takav način da optički dio mikroskop je izuzetno precizno obavljao svoje funkcije. Svjetlosni dio mikroskopa s direktnim prijenosom svjetlosti nalazi se iza objekta ispod sočiva i uključuje Izvor svjetlosti (lampa i električno napajanje) i optičko-mehanički sistem (kondenzator, dijafragma podesiva polja i otvora). Kondenzator sastoji se od sistema sočiva koji su dizajnirani da prikupljaju zrake koje dolaze iz izvora svjetlosti u jednoj tački - fokus , koji mora biti u ravni objekta koji se razmatra. Zauzvrat d dijafragma nalazi se ispod kondenzatora i dizajniran je da reguliše (povećava ili smanjuje) protok zraka koji prolaze iz izvora svjetlosti.
Mehanički dio Mikroskop sadrži dijelove koji kombiniraju optičke i svjetlosne dijelove opisane gore, a također omogućavaju postavljanje i kretanje uzorka koji se proučava. Shodno tome, mehanički dio se sastoji od osnove mikroskop i držač , na čijem su vrhu pričvršćene tube - šuplja cijev dizajnirana za smještaj sočiva, kao i gore pomenute kupole. Ispod je pozornici , na koji se montiraju dijapozitivi sa uzorcima koji se proučavaju. Pozornica se može pomerati horizontalno pomoću odgovarajućeg uređaja, kao i gore i dole, što omogućava podešavanje oštrine slike pomoću bruto (makrometrijski) I precizni (mikrometrijski) vijci.
Povećati, koji mikroskop proizvodi određuje se proizvodom uvećanja objektiva i uvećanja okulara. Pored mikroskopije svijetlog polja, široko se koristi u posebne metode Provedene su studije: tamnopoljskim, fazno-kontrastnim, luminescentnim (fluorescentnim) i elektronskim mikroskopom.
Primarni(vlastiti) fluorescencija javlja se bez posebnog tretmana lijekovima i inherentan je nizu bioloških aktivne supstance, kao što su aromatične aminokiseline, porfirini, hlorofil, vitamini A, B2, B1, neki antibiotici (tetraciklin) i hemoterapeutske supstance (akrihin, rivanol). Sekundarni (inducirano) fluorescencija nastaje kao rezultat obrade mikroskopskih predmeta fluorescentnim bojama - fluorohromima. Neke od ovih boja su difuzno raspoređene u ćelijama, druge se selektivno vezuju za određene ćelijske strukture ili čak za određene hemikalije.
Za izvođenje ove vrste mikroskopije, posebne luminescentni (fluorescentni) mikroskopi , drugačiji od uobičajenog svetlosni mikroskop prisustvo moćnog izvor svjetlosti (živa-kvarcna lampa ultra visokog pritiska ili halogena kvarcna lampa sa žarnom niti), koja emituje pretežno u dugotalasnom ultraljubičastom ili kratkotalasnom (plavo-ljubičastom) području vidljivog spektra.
Ovaj izvor se koristi za pobuđivanje fluorescencije prije nego što svjetlost koju emituje prođe kroz specijalni uzbudljivo (plavo-ljubičasta) svjetlosni filter i reflektuje se smetnje razdjelnik zraka rekord , gotovo potpuno odsijecajući zračenje duže valne dužine i prenosi samo onaj dio spektra koji pobuđuje fluorescenciju. Istovremeno, u modernim modelima fluorescentnih mikroskopa, uzbudljivo zračenje pogađa uzorak kroz sočivo (!) Nakon ekscitacije fluorescencije, rezultirajuća svjetlost ponovo ulazi u sočivo, nakon čega prolazi kroz onu koja se nalazi ispred okulara. zaključavanje (žuta) svjetlosni filter , odsecanjem kratkotalasnog uzbudljivog zračenja i prenošenjem luminiscentne svetlosti od leka do oka posmatrača.
Zbog upotrebe ovakvog sistema svetlosnih filtera, intenzitet sjaja posmatranog objekta je obično nizak, pa je fluorescentnu mikroskopiju potrebno izvesti u posebnim zamračenim prostorijama .
Važan uslov pri izvođenju ove vrste mikroskopije je i upotreba nefluorescentna imerzija I omotavajući medij . Konkretno, da bi se ugasila intrinzična fluorescencija kedra ili drugog ulja za potapanje, dodaju se male količine nitrobenzena (od 2 do 10 kapi po 1 g). Zauzvrat, puferska otopina glicerola, kao i nefluorescentni polimeri (polistiren, polivinil alkohol) mogu se koristiti kao medij za lijekove. Inače, pri izvođenju luminiscentne mikroskopije koriste se obična staklena stakalca i pokrovni stakalci, koji propuštaju zračenje u korištenom dijelu spektra i nemaju vlastitu luminiscenciju.
Shodno tome, važne prednosti fluorescentne mikroskopije su:
1) slika u boji;
2) visok stepen kontrast samosvjetlećih objekata na crnoj pozadini;
3) mogućnost proučavanja ćelijskih struktura koje selektivno apsorbuju različite fluorohrome, koji su specifični citokemijski indikatori;
4) sposobnost utvrđivanja funkcionalnih i morfoloških promena u ćelijama u dinamici njihovog razvoja;
5) mogućnost specifičnog bojenja mikroorganizama (pomoću imunofluorescencije).
Elektronska mikroskopija
Postavljene su teorijske osnove za korištenje elektrona za promatranje mikroskopskih objekata W. Hamilton , koji je uspostavio analogiju između prolaska svjetlosnih zraka u optički nehomogenim medijima i putanja čestica u poljima sile, kao i de Broglie , koji je iznio hipotezu da elektron ima i korpuskularna i valna svojstva.
Štaviše, zbog izuzetno kratke talasne dužine elektrona, koja se smanjuje direktno proporcionalno primenjenom naponu ubrzanja, teoretski izračunata granica rezolucije , koji karakteriše sposobnost uređaja da zasebno prikazuje male, maksimalno locirane detalje objekta, za elektronski mikroskop je 2-3 Å ( Angstrom , gdje je 1Å=10 -10 m), što je nekoliko hiljada puta veće od onog kod optičkog mikroskopa. Prva slika objekta formiranog od elektronskih zraka dobijena je 1931. godine. njemački naučnici M. Knollem I E. Ruska .
U dizajnu modernih elektronskih mikroskopa izvor elektrona je metal (obično volfram), iz kojeg se, nakon zagrijavanja do 2500 ºS, dobiva rezultat termoionsku emisiju emituju se elektroni. Uz pomoć električnih i magnetnih polja, formiran je protok elektrona Možete ubrzati i usporiti, kao i skrenuti u bilo kojem smjeru i fokusirati. Dakle, ulogu sočiva u elektronskom mikroskopu ima skup odgovarajuće dizajniranih magnetnih, elektrostatičkih i kombinovanih uređaja pod nazivom „ elektronska sočiva" .
Neophodan uslov za kretanje elektrona u obliku snopa na velikoj udaljenosti je i stvaranje vakuum , budući da će u ovom slučaju prosječna slobodna putanja elektrona između sudara s molekulima plina značajno premašiti udaljenost preko koje se moraju kretati. Za ove svrhe dovoljno je održavati u radnoj komori negativni pritisak približno 10 -4 Pa.
Prema prirodi proučavanja predmeta, elektronski mikroskopi se dijele na proziran, reflektirajući, emisioni, raster, sjena I ogledalo , među kojima su prve dvije najčešće korištene.
Optički dizajn transmisijski (transmisioni) elektronski mikroskop je u potpunosti ekvivalentan odgovarajućem dizajnu optičkog mikroskopa u kojem je svjetlosni snop zamijenjen elektronskim snopom, a sistemi staklenih leća su zamijenjeni sistemima elektronskih sočiva. Shodno tome, transmisioni elektronski mikroskop se sastoji od sljedećih glavnih komponenti: sistem osvetljenja, objektna kamera, sistem fokusiranja I blok registracije finalne slike , koji se sastoji od kamere i fluorescentnog ekrana.
Svi ovi čvorovi su međusobno povezani, formirajući takozvani "mikroskopski stup", unutar kojeg se održava vakuum. Drugi važan zahtjev za predmet koji se proučava je njegova debljina manja od 0,1 mikrona. Konačna slika objekta se formira nakon odgovarajućeg fokusiranja snopa elektrona koji prolazi kroz njega fotografski film ili fluorescentni ekran , presvučen posebnom supstancom - fosforom (slično ekranu u TV cevima) i pretvarajući elektronsku sliku u vidljivu.
U ovom slučaju, formiranje slike u transmisionom elektronskom mikroskopu povezano je uglavnom sa različitim stepenima rasejanje elektrona različitim oblastima uzorka koji se proučava i, u manjoj mjeri, s razlikom u apsorpciji elektrona ovim područjima. Kontrast je također poboljšan korištenjem “ elektronske boje (osmijum tetroksid, uranil, itd.), selektivno se vezujući za određene oblasti objekta. Moderni transmisioni elektronski mikroskopi, dizajnirani na sličan način, pružaju maksimalno korisno uvećanje do 400.000 puta, što odgovara rezoluciju na 5.0 Å. Može se otkriti transmisijskom elektronskom mikroskopom tanka struktura bakterijske ćelije se nazivaju ultrastruktura .
IN reflektirajući (skenirajući) elektronski mikroskop slika se stvara korišćenjem elektrona koji se reflektuju (razbacuju) od površinskog sloja objekta kada je ozračen pod malim uglom (otprilike nekoliko stepeni) prema površini. U skladu s tim, formiranje slike je posljedica razlike u raspršenju elektrona u različitim točkama objekta ovisno o mikroreljefu njegove površine, a sam rezultat takve mikroskopije pojavljuje se u obliku strukture površine promatranog objekta. Kontrast se može poboljšati raspršivanjem metalnih čestica na površinu objekta. Postignuta rezolucija mikroskopa ovog tipa je oko 100 Å.
Mikroskop ima mehaničke i optičke dijelove. Mehanički dio predstavlja tronožac (koji se sastoji od postolja i držača cijevi) i na njega montirana cijev sa revolverom za pričvršćivanje i promjenu sočiva. Mehanički deo takođe obuhvata: stepen za pripremu, uređaje za pričvršćivanje kondenzatora i svetlosnih filtera, mehanizme ugrađene u stativ za grubo (makro-mehanizam, makro-puž) i fino (mikro-mehanizam, mikro-puž) pomeranje postolje ili držač cijevi.
Optički dio predstavljaju sočiva, okulari i sistem rasvjete, koji se sastoji od Abbe kondenzatora smještenog ispod pozornice objekta i ugrađenog iluminatora sa niskonaponskom žarnom niti i transformatorom. Sočiva su uvrnuta u revolver, a odgovarajući okular, kroz koji se posmatra slika, postavljen je na suprotnoj strani cijevi.
Slika 1. Struktura mikroskopa
Mehanički dio uključuje tronožac, koji se sastoji od postolja i držača cijevi. Baza služi kao oslonac za mikroskop i nosi cijelu strukturu stativa. U postolju se nalazi i utičnica za ogledalo ili ugrađeno svjetlo.
- predmetni sto koji se koristi za postavljanje preparata i njihovo horizontalno kretanje;
- sklop za montažu i vertikalni svjetlosni filteri.
U većini modernih mikroskopa, fokusiranje se izvodi vertikalnim pomicanjem pozornice objekta pomoću makro- i mikromehanizma sa stacionarnim držačem cijevi. Ovo vam omogućava da instalirate različite dodatke (mikrofoto, itd.) na držač cijevi. U nekim dizajnima mikroskopa dizajniranih za rad s mikromanipulatorom, fokusiranje se provodi vertikalnim pomicanjem držača cijevi sa stacionarnom pozornicom.
Mikroskopska cijev- jedinica koja se koristi za postavljanje sočiva i okulara na određenoj udaljenosti jedan od drugog. To je cijev, u čijem se gornjem dijelu nalazi okular ili okulari, au donjem dijelu nalazi se uređaj za pričvršćivanje i promjenu sočiva. Obično je ovo revolver s nekoliko utičnica za brzo mijenjanje sočiva različitih povećanja. U svakom ležištu revolvera sočivo je fiksirano na način da uvijek ostaje centrirano u odnosu na optičku os mikroskopa. Trenutno se dizajn cijevi značajno razlikuje od prethodnih mikroskopa po tome što dijelovi cijevi koji nose okulare i revolver sa sočivima nisu strukturno povezani. Ulogu srednjeg dijela cijevi može obavljati stativ.
Mehanička dužina cijevi bioloških mikroskopa je obično 160 mm. U cijevi između sočiva i okulara mogu se nalaziti prizme koje mijenjaju smjer zraka i srednja sočiva koja mijenjaju okularno povećanje i optičku dužinu cijevi.
Postoje različiti izmjenjivi dizajni dijela cijevi koji nosi okulare (ravni i nagnuti) i koji se razlikuju po broju okulara (okularnih priključaka):
- monokular- sa jednim okularom, za posmatranje jednim okom;
- binocular- sa dva okulara, za istovremeno posmatranje sa dva oka, koji se mogu razlikovati u dizajnu u zavisnosti od modela mikroskopa;
- trinocular- sa dva okulara i projekcionim izlazom, koji omogućava da se istovremeno sa vizuelnim posmatranjem sa dva oka projektuje slika leka odgovarajućom optikom na kompjuterski monitor ili drugi prijemnik slike.
Pored držača cijevi sa cijevi, mehanički dio mikroskopa uključuje:
- nosač za pričvršćivanje stola za objekte;
- stepen koji se koristi za postavljanje preparata i horizontalno kretanje u dva okomita smjera u odnosu na os mikroskopa. Dizajn nekih stolova omogućava rotiranje preparata. Vertikalno pomicanje pozornice objekta vrši se makro- i mikromehanizmom.
- uređaji za pričvršćivanje i vertikalno pomeranje kondenzatora i njegovo centriranje, kao i za postavljanje svetlosnih filtera.
Tema 1. ĆELIJA
§6. STRUKTURA MIKROSKOPA
Vi ste upoznati sa struktura mikroskop i naučite kako izračunati njegovo uvećanje.
Hoćemo li raditi sa mikroskopom?
Šta možete vidjeti mikroskopom osim bakterija?
Mikroskop (od grčkog "micros" - mali i "skopeo" - gledam, istražujem) - je uređaj za uvećanje koji vam omogućava da pregledate objekt vrlo male veličine. Dizajn školskog mikroskopa je gotovo isti kao kod najboljih istraživačkih mikroskopa prve polovine XX veka. (Jr. 6). S ispravnim postavkama, školski mikroskop vam omogućava da vidite ne samo ćeliju, već i njene pojedinačne unutrašnje strukture. A ako imate iskustva, možete čak izvesti neke zanimljive eksperimente.
Mikroskop se sastoji od tijela i elemenata optičkog sistema kroz koje prolazi svjetlost.
Dijelovi tijela su:
✓ baza;
Rice. V. Izgled i glavne komponente školskog mikroskopa
✓ stepen objekta na koji se postavlja prototip fiksira se na stol pomoću dva fleksibilna držača;
U stativu s promjenjivim uglom nagiba, na kojem se nalazi veliki vijak za grubo podešavanje jasnoće (makro vijak) i manji vijak za fino podešavanje jasnoće (mikro vijak);
✓ cijev, na čijem je donjem dijelu pričvršćen rotirajući nastavak sa sočivima, i u gornji dio okular je instaliran.
Elementi optičkog sistema mikroskopa uključuju:
✓ konkavno ogledalo koje se može rotirati;
U dijafragmi, koja se nalazi ispod pozornice;
✓ rotirajući dodatak sa sočivima različitih uvećanja;
✓ okular kroz koji se posmatra predmet proučavanja.
Ogledalo se koristi za podešavanje najboljeg osvjetljenja preparata. Otvor blende regulira kontrast i svjetlinu slike: ako je otvor blende zatvoren, slika je vrlo kontrastna, ali tamna; ako je otvor blende potpuno otvoren, kontrast je nizak i ima puno svjetla, pa je slika previše osvijetljena.
Rice. 7. Objektivi (a), okular (b) školskog mikroskopa i njihove oznake
Objekti. Školski mikroskop ima tri sočiva: vrlo malo (4x), malo (10x) i veliko (40x) uvećanje. Kako bi se lakše mijenjali, uvrnuti su u rotirajući nastavak. Sočivo koje je postavljeno okomito prema dolje prema objektu proučavanja, uključeno u optički sistem, ostali su isključeni. Okretanjem kupole možete promijeniti radno sočivo i tako prelaziti s jednog povećanja na drugo. Kada povežete drugo sočivo na optički sistem, čuje se lagani klik - ovo je opružna brava okretnog nastavka.
Sočivo je glavni element optičkog sistema mikroskopa. Brojevi na sočivu označavaju njegove tehničke karakteristike.
U gornjem redu, prvi broj označava uvećanje sočiva (pozicija 7).
Proizvod povećanja objektiva i uvećanja okulara pokazuje ukupno povećanje mikroskopa. Na primjer, sa uključenim objektivom 4x i okularom 10x, ukupno povećanje mikroskopa je: 4 ∙ 10 = 40 (puta).
Prilikom rada sa mikroskopom, prototip se postavlja na binu, učvršćuje se držačima i uključuje sočivo malog povećanja (10x). Rotacijom ogledala, svjetlost se usmjerava na preparat, i macroquint podesite jasnoću. Zatim, ako je potrebno, uključite objektiv s velikim povećanjem, podesite jasnoću mikrovijkom i kontrastirajte sliku s otvorom blende.
Prilikom rada s mikroskopom, pridržavajte se sljedećih pravila:
1. Okular i sočiva objektiva moraju biti zaštićeni od kontaminacije i mehaničkih oštećenja: ne dodirujte ih prstima ili tvrdim predmetima, ne dozvolite da voda ili druge supstance dođu u kontakt sa njima.
2. Zabranjeno je odvrtati okvire okulara i sočiva, niti rastavljati mehaničke dijelove mikroskopa - popravljaju se samo u posebnim radionicama.
3. Morate nositi mikroskop s obje ruke vertikalni položaj, držeći uređaj jednom rukom na stativu, a drugom na njegovoj bazi.
TERMINI I KONCEPTI KOJE TREBA NAUČITI
Objektiv, opšte mikroskopsko uvećanje.
KONTROLNA PITANJA
1. Od kojih elemenata se sastoji optički sistem mikroskopa?
2. Da li elementi optičkog sistema mikroskopa pružaju ukupno povećanje?
3. Za šta se koristi konkavno ogledalo?
4. Koja je svrha dijafragme?
5. Da li je sočivo uključeno na početku rada sa mikroskopom?
6. Koje je maksimalno povećanje koje se može postići korištenjem sočiva i okulara prikazanih na slici 7?
7. Koja pravila treba da se pridržavate kada radite sa mikroskopom?
ZADACI
Pažljivo pregledajte svoj školski mikroskop i pronađite sve njegove komponente. Snimite okular i uvećanja objektiva. Izračunajte uvećanje mikroskopa za svaki objektiv.Rezultate upišite u tablicu u svoju bilježnicu.
ZA ZNATILJEŽLJE
Kako odrediti veličinu najmanjih objekata koji se mogu vidjeti optičkim mikroskopom?
Veličina najmanjeg objekta koji se može vidjeti okom ili povećalom određena je njegovom rezolucijom.
Rezolucija je najmanja udaljenost između dvije tačke na kojoj su njihove slike još uvijek razdvojene i ne spajaju se u jednu. Rezolucija ljudskog oka je 200 µm (0,2 mm), optičkog mikroskopa - 0,2 µm (0,0002 mm), elektronskog mikroskopa - 0,0002 µm (0,0000002 mm). Ako je veličina objekta manja od rezolucije, tada se ovaj objekt više ne može razmatrati, i obrnuto. Dakle, rezolucija je ta koja određuje šta se može vidjeti u mikroskopu, a šta ne.
Vrijednost indikatora pomoću koje se izračunava rezolucija sočiva ispisuje se na njegovom tijelu odmah nakon indikatora uvećanja sočiva. Zove se otvor blende sočiva.
Iza otvora blende izračunava se rezolucija objektiva:
Rezolucija (u mikronima) = 0,3355/otvor blende objektiva.
Dobivena vrijednost je zaokružena na desetine.
Primer: na sočivu sa crvenim prstenom (slika 7), gornja linija je označena: „4 / 0,10“. Broj "4" označava povećanje objektiva - četiri puta, a "0,10" - otvor blende. Rezolucija ovog objektiva
bit će ovako:
0,3355 / 0,10 = 3,355 « 3,4 (µm).
Materijali i oprema. Mikroskopi: MBR-1, BIOLAM, MIKMED-1, MBS-1; set trajnih mikroslajdova
Mikroskop je optički uređaj koji vam omogućava da dobijete inverznu sliku objekta koji se proučava i ispita male detalje njegove strukture, čije dimenzije leže izvan rezolucije oka.
Šta je rezolucija?
Zamislite da golim okom osoba može razlikovati dvije vrlo bliske linije ili tačke samo ako je razmak između njih najmanje 0,10 mm (100 mikrona). Ako je ova udaljenost manja, tada će se dvije linije ili tačke spojiti u jednu. Dakle, rezolucija ljudsko oko jednako 100 µm. Dakle, što je veća rezolucija sočiva, to se više detalja o strukturi posmatranog objekta može otkriti. Za sočivo (x8) rezolucija je 1,68 mikrona, za sočivo (x40) - 0,52 mikrona.
Najbolji svjetlosni mikroskop poboljšava sposobnost ljudskog oka za oko 500 puta, odnosno njegova rezoluciona moć je oko 0,2 µm ili 200 nm.
Rezolucija i uvećanje nisu ista stvar. Ako koristite svjetlosni mikroskop da snimite dvije linije koje se nalaze na udaljenosti manjoj od 0,2 mikrona, tada će se, bez obzira na to kako uvećate sliku, linije spojiti u jednu. Možete dobiti veliko uvećanje, ali ne i poboljšati njegovu rezoluciju.
Razlikovati korisno I beskorisno povećanje. Pod korisnim podrazumijevamo takvo povećanje posmatranog objekta da je moguće otkriti nove detalje njegove strukture. Beskorisno je povećanje u kojem je povećanjem objekta stotinama ili više puta nemoguće otkriti nove strukturne detalje. Na primjer, ako se slika dobivena mikroskopom (korisno!) višestruko uvećava projiciranjem na ekran, tada se neće otkriti novi, finiji detalji strukture, već će se u skladu s tim povećati samo veličina postojećih struktura.
Obično se koristi u nastavnim laboratorijama svjetlosni mikroskopi, u kojem se mikroslajdovi pregledavaju uz korištenje prirodnog ili umjetnog svjetla. Najčešće svjetlosni biološki mikroskopi: BIOLAM, MIKMED, MBR (biološki radni mikroskop), MBI (biološki istraživački mikroskop) i MBS (biološki stereoskopski mikroskop). Oni pružaju uvećanje u rasponu od 56 do 1350 puta. Stereomikroskop(MBS) pruža istinski trodimenzionalnu percepciju mikro-objekta i povećava od 3,5 do 88 puta.
Postoje dva sistema u mikroskopu: optički I mehanički(Sl. 1). TO optički sistem uključuju sočiva, okulare i rasvjetni uređaj (kondenzator s dijafragmom i svjetlosnim filterom, ogledalo ili električno svjetlo).
Slika 1. Izgled mikroskopa Biomed 1 i Biomed 2
Objektiv - jedan od najvažnijih delova mikroskopa, budući da određuje korisno uvećanje objekta. Objektiv se sastoji od metalnog cilindra sa ugrađenim sočivima, čiji broj može varirati. Uvećanje sočiva je označeno brojevima na njemu. U obrazovne svrhe obično se koriste x8 i x40 objektivi. Kvaliteta sočiva je određena njegovom rezolucijom.
Objektiv zahtijeva vrlo pažljivo rukovanje, posebno za sočiva sa velikim uvećanjem, jer imaju radnu distancu, tj. udaljenost od pokrivnog stakla do prednjeg sočiva mjeri se u desetinkama milimetra. Na primjer, radna udaljenost za sočivo (x40) je 0,6 mm.
Okular mnogo jednostavnije od sočiva. Sastoji se od 2-3 sočiva postavljena u metalni cilindar. Između sočiva postoji konstantan otvor blende koji definiše granice vidnog polja. Donje sočivo fokusira sliku objekta koji je sočivo konstruisalo u ravni dijafragme, a gornje služi direktno za posmatranje. Na njima je povećanje okulara označeno brojevima: x7, x10, x15. Okulari ne otkrivaju nove strukturne detalje, a u tom smislu i njihovo povećanje beskorisno. Dakle, okular, poput povećala, daje direktnu, virtuelnu, uvećanu sliku posmatranog objekta, koju konstruiše sočivo.
Za utvrđivanje opšte mikroskopsko uvećanje treba povećati uvećanje sočivo za uvećanje okulara. Na primjer, ako okular daje 10x uvećanje, a objektiv 20x, onda je ukupno povećanje 10x20 = 200x.
Rasvjetni uređaj sastoji se od ogledala ili električnog iluminatora, kondenzatora sa iris dijafragmom i svjetlosnog filtera koji se nalazi ispod pozornice objekta. Namijenjeni su za osvjetljavanje objekta snopom svjetlosti.
Ogledalo služi za usmjeravanje svjetlosti kroz kondenzator i otvor pozornice na predmet. Ima dvije površine: ravnu i konkavnu. U laboratorijama za difuzno svjetlo koristi se konkavno ogledalo.
Električna rasvjeta ugrađuje se ispod kondenzatora u utičnicu postolja.
Kondenzator sastoji se od 2-3 sočiva umetnuta u metalni cilindar. Kada se podiže ili spušta pomoću posebnog zavrtnja, svjetlost koja pada iz ogledala na predmet se kondenzira, odnosno raspršuje.
Iris dijafragma koji se nalazi između ogledala i kondenzatora. Služi za promenu prečnika svetlosnog toka koji ogledalo usmerava kroz kondenzator do predmeta, u skladu sa prečnikom prednjeg sočiva sočiva i sastoji se od tankih metalnih ploča. Koristeći polugu, možete ih spojiti, potpuno prekrivajući donje kondenzatorsko sočivo, ili ih razdvojiti, povećavajući protok svjetlosti.
Prsten sa mat staklom ili svjetlosni filter smanjuje osvetljenost objekta. Nalazi se ispod dijafragme i kreće se u horizontalnoj ravni.
Mehanički sistem Mikroskop se sastoji od postolja, kutije s mikrometarskim mehanizmom i mikrometarskim vijkom, cijevi, držača cijevi, zavrtnja za grubo nišanje, nosača kondenzatora, vijka za pomicanje kondenzatora, revolvera i uzorka.
Stani- Ovo je osnova mikroskopa.
Kutija sa mikrometarskim mehanizmom, izgrađen na principu međusobnog djelovanja zupčanika, fiksno je pričvršćen za postolje. Mikrometarski vijak služi za lagano pomicanje držača cijevi, a time i sočiva na udaljenosti mjerene u mikrometrima. Puni okret mikrometarskog vijka pomiče držač cijevi za 100 mikrona, a okret za jednu podjelu spušta ili podiže držač cijevi za 2 mikrona. Da bi se izbjeglo oštećenje mehanizma mikrometra, dopušteno je okretati vijak mikrometra u jednom smjeru ne više od pola okreta.
Tube ili cijev- cilindar u koji se odozgo ubacuju okulari. Cev je pokretno povezana sa glavom držača cevi, pričvršćena je vijkom za zaključavanje u određenom položaju. Otpuštanjem zavrtnja za zaključavanje, cijev se može ukloniti.
Revolver dizajniran za brzo mijenjanje sočiva koja se ušrafljuju u njegove utičnice. Centrirani položaj sočiva osigurava zasun smješten unutar revolvera.
Vijak za grubo nišanjenje služi za značajno pomeranje držača cevi, a samim tim i sočiva kako bi se objekat fokusirao pri malom uvećanju.
Tabela predmeta namijenjeno stavljanju lijeka na njega. Na sredini stola nalazi se okrugla rupa u koju se uklapa prednja leća kondenzatora. Na stolu se nalaze dva opružna terminala - stezaljke koje pričvršćuju lijek.
Nosač kondenzatora pokretno povezan sa kutijom mikrometarskog mehanizma. Može se podići ili spustiti pomoću zavrtnja koji rotira zupčanik koji se uklapa u žljebove češljastog reza.
Mikroskop (od grčkog mikros - mali i skopeo - gledam) je optički uređaj dizajniran za vizuelno ispitivanje malih objekata nevidljivih golim okom. U mikrobiologiji se koristi širok spektar mikroskopa koji imaju drugačiji dizajn i uređaja, ali međusobno slični u svojim osnovnim elementima.
Rice. 33. Struktura mikroskopa
1 - tronožac; 2 - cijev; 3 - glava; 4 - sto za objekte; 5 - makrovijak; 6 - mikrovijak;
7 - kondenzator; 8 - rasvjetni uređaj; 9 - sočivo; 10 - okular.
Mikroskop se sastoji od dva glavna dela: mehanički I optički(Sl. 33). Mehanički dio mikroskopa uključuje tronožac (1) koji se sastoji od masivnog postolja i držača cijevi.
Na gornji dio držača cijevi pričvršćena je monokularna ili binokularna cijev (2) i glava sa vodilicom lastin rep (3). Revolver se nalazi na ovoj vodilici. Revolver ima četiri rupe s navojem za uvrtanje sočiva i bravu za njihovo centriranje. Kuglasti dio revolvera rotira se na kuglicama (za brzu promjenu sočiva) i opremljen je kugličnim zaključavanjem.
U srednjem dijelu držača cijevi nalazi se stepen (4) koji ima stezaljke za pričvršćivanje klizača i bočne vijke za uzdužno i poprečno kretanje. To uvelike olakšava rad s preparatom i omogućava vam da pregledate predmet na različitim mjestima. U sredini pozornice postoji rupa kroz koju prolazi svjetlost. Neki istraživački mikroskopi su opremljeni dodatnim mikroskopom za mikropomeranje predmeta.
Držač cijevi u donjem dijelu nosi vodilicu sa velikim drškama (5) za grubo fokusiranje mikroskopa (makrometrijski vijak ili čegrtaljku) i malim ručkama (6) ili disk za fino fokusiranje mikroskopa (mikrometrijski vijak). Rotacijom čegrtaljke oku je vidljivo grubo vertikalno pomicanje stola ili cijevi predmeta. Koristeći mikrometarski šraf, stub ili cijev se pomiče gore-dolje na vrlo malu udaljenost, vidljivu samo pod mikroskopom. Jedan okret mikrometarskog vijka daje pomak od 0,1 mm. Ovo je dovoljno za precizno fokusiranje subjekta. Da biste izbjegli lomljenje zavrtnja mikrometra, nemojte ga okretati više od 1-1,5 okreta.
Optički dio Mikroskop uključuje sistem osvetljenja i sistem sočiva.
Osvetljenje sistem se nalazi ispod pozornice objekta i sastoji se od kondenzatora (7) i rasvjetnog uređaja (8). Kondenzator je najvažniji dio mikroskopa od kojeg ovisi uspjeh mikrobioloških istraživanja. Dizajniran je za prikupljanje raspršenih svjetlosnih zraka, koji se, prolazeći kroz kondenzatorska sočiva, koncentrišu u fokusu na ravninu predmetnog uzorka.
Kondenzator je fiksiran prstenom u okviru koji se nalazi na nosaču i drži se na mjestu malim vijkom. Osim toga, tu je i poseban bočni vijak koji vam omogućava da pomjerate kondenzator gore-dolje za 20 mm kako biste promijenili osvjetljenje vidnog polja. Na dnu kondenzatora nalazi se iris dijafragma. Otvor blende se podešava posebnom polugom, što omogućava promjenu svjetline osvjetljenja objekta. Na dnu kondenzatora nalazi se pokretni okvir (okvir) u koji su postavljeni svjetlosni filteri od mat ili plavog stakla. Svetlosni filteri se koriste za smanjenje stepena osvetljenja i poboljšanje jasnoće slike.
Svjetlosni zraci se usmjeravaju u kondenzator pomoću ogledala ili posebnog električnog rasvjetnog uređaja, koji ima svoje karakteristike dizajna za različite mikroskope.
Najvažniji dio mikroskopa je također sistem sočiva, koja stvara uvećanu inverznu i virtuelnu sliku objekta. Sastoji se od sočiva (9), smještenog u donjem dijelu cijevi i usmjerenog na predmet koji se proučava, i okulara (10), smještenog u gornjem dijelu cijevi.
Objektiv To je metalni cilindar u koji su fiksirana sočiva. Glavno (prednje) sočivo je usmjereno prema preparatu. Samo ona obezbeđuje neophodno povećanje slikanog objekta, svi ostali ispravljaju sliku i nazivaju se korekcijom. Rezolucija mikroskopa zavisi od prednjeg sočiva, tj. najmanja udaljenost na kojoj se mogu odvojeno razlikovati dvije blisko raspoređene tačke. U modernom optički mikroskopi Rezolucija sočiva je 0,2 mikrona. Što je veća zakrivljenost prednjeg sočiva, to je veći stepen uvećanja.
Međutim, prednje sočivo izaziva i negativne pojave koje ometaju istraživanja, od kojih su glavne sferna aberacija i kromatska aberacija.
Sferna aberacija nastaje zbog činjenice da se bočne zrake koje upadaju na rubove prednjeg sočiva lome jače od ostalih i čine sliku objekta mutnom i nejasnom. Stoga svaka tačka objekta izgleda kao krug. Da bi se ispravili nedostaci prednjeg sočiva, ahromat sočiva imaju sistem korekcijskih sočiva (od 3-4 do 10-12).
Kao najjednostavniji, ahromati pate od hromatskih aberacija. Kromatska aberacija je uzrokovana razgradnjom zraka bijelo svjetlo prolazeći kroz prednje sočivo u njegove sastavne dijelove spektra. Slika objekta izgleda kao da je okružena dugom. Staklena sočiva najviše lome plavo-ljubičaste zrake, a najmanje crvene zrake.
Eliminacija sfernih i hromatskih aberacija najpotpunije se postiže upotrebom apohromata. Sastoje se od seta sočiva različitih zakrivljenosti i napravljenih od različitih vrsta stakla. Ovo stvara uslove za osiguravanje jasnoće slike i za pravilnije prenošenje boje obojenih objekata.
U početku su se koristili ahromati,što je omogućilo eliminaciju hromatskih aberacija u odnosu na dva naj svijetle boje spektra Stoga je slika objekta bila lišena boja. Nakon toga su dobijene posebne vrste stakla, sočiva od kojih ne samo da su eliminisale bojenje predmeta, već su davale i jasnu sliku od zraka različite boje. Ova sočiva se zovu apohromati.
Panachromats imaju još složeniji dizajn i omogućavaju vam da kreirate jasnije konture objekata kroz cijelo vidno polje
Za odabir sočiva, sljedeće oznake su ugravirane na njihovo tijelo: ahr. - ahromat, apo. - apohromat; pan. - panhromat
Postoje suva i imersiona sočiva. Kada koristite suvo sočivo, između njegovog prednjeg sočiva i predmetnog predmeta postoji sloj vazduha. Svjetlosni zraci iz zraka prolaze kroz staklo preparata, zatim opet kroz sloj zraka, uslijed čega se lome i raspršuju na granici različitih medija. Nakon ovakvih prijelaza kroz heterogene medije, samo dio svjetlosnih zraka prodire kroz sočivo. Da bi se uhvatio maksimalan broj svetlosnih zraka, prednja leća sočiva mora imati relativno veliki prečnik, veliku žižna daljina i male zakrivljenosti. Zbog toga suva sočiva imaju mali stepen uvećanja (8 x, 10 x, 20 x, 40 x).
Za postizanje većeg povećanja potrebno je stvoriti homogeno optičko okruženje između sočiva prednjeg objektiva i uzorka. To postaje moguće potapanjem sočiva u kap kedrovog ulja koja se nanosi na preparat. Ulje kedra ima indeks prelamanja n = 1,515, blizak indeksu prelamanja stakla lijeka (n = 1,52). Zbog toga svetlosnih zraka, prolazeći kroz imerzijsko ulje se ne raspršuju i, bez promjene smjera, ulaze u sočivo, pružajući jasnu vidljivost predmeta koji se proučava. U nedostatku kedrovog ulja koriste se zamjene: ulje breskve (n = 1,49); ricinusovo ulje(1,48-1,49); ulje karanfilića (1,53); imersiol, koji sadrži ulje breskve (50 g), kolofonij (10 g), naftalen (10 g), salol (1 g); mješavina jednakih količina ricinusovog (n = 1,47) i kopra (n - 1,52) ulja.
Uljna imersiona sočiva imaju oznaku “MI”, crnu traku na cilindru i udubljeno prednje sočivo, koje ga štiti od oštećenja u slučaju neopreznog kontakta sočiva sa lijekom. Stepen povećanja slike za sočiva sa uranjanjem ulja može biti 80 x, 90 x, 95 x, 100 x i 120 x.
Vodena imersiona sočiva imaju uvećanje slike od 40X. Označeni su slovima “VI” i bijelom trakom na cilindru. Takva sočiva su vrlo osjetljiva na promjene u debljini pokrovnog stakla, budući da se indeks prelamanja vode razlikuje od indeksa prelamanja stakla. Najbolji kvalitet slike se uočavaju kada se koriste naslovni listovi debljine 0,17 mm.
Većina mikroskopa je opremljena sa tri tipa objektiva (10 x, 20 x, 40 x i 90 x), koji pružaju malo, srednje i veliko uvećanje. Najmanji faktor uvećanja sočiva je 8 x. Kada se sočivo tretira dugo vremena acetonom ili benzinom da bi se uklonilo imersiono ulje, ljepilo koje povezuje sočiva se uništava. Ovo čini optički sistem sočiva neupotrebljivim.
Okular nalazi se na vrhu cijevi i povećava sliku koju daje sočivo. Sastoji se od dva plosnato-konveksna sočiva: gornjeg (oka) i donjeg, okrenutog prema objektu, sakupljajući sočiva. Oko istraživača, kao da nastavlja optički sistem mikroskopa, prelama zrake koje izlaze iz okulara i gradi uvećanu sliku objekta na mrežnjači.
Oba sočiva su zatvorena u metalni okvir. Na okviru okulara je ugraviran broj koji pokazuje koliko puta okular povećava uvećanje sočiva. Monokularni mikroskop koristi jedno sočivo, dok binokularni mikroskop koristi dva. Shodno tome, slika objekta je ravna ili stereoskopska. Binokularna cijev se može podesiti na bilo koju međuzjenicu u rasponu od 55 do 75 cm.
Faktor uvećanja okulara je naznačen na metalnom okviru očna sočiva(7 x, 10 x ili 15 x). Ukupno povećanje mikroskopa jednako je proizvodu faktora povećanja objektiva i faktora povećanja okulara. Dakle, najmanje povećanje bioloških mikroskopa je 56 puta (8 je povećanje objektiva pomnoženo sa 7 – povećanje okulara), a najveće - 1800 (120x15).
Međutim, uvećana slika objekta može, ali i ne mora biti jasna. Jasnoća slike je određena rezolucijom mikroskopa (korisno uvećanje), tj. minimalna udaljenost između dvije tačke kada se još nisu spojile u jednu. Što je veća rezolucija mikroskopa, to je manji objekt koji se može vidjeti.
Rezolucija mikroskopa zavisi od talasne dužine korišćene svetlosti i sume numeričkih otvora objektiva i kondenzatora:
gdje je α minimalna udaljenost između dvije tačke;
A 1 - numerički otvor sočiva;
A 2 je numerički otvor kondenzatora;
λ je talasna dužina upotrijebljene svjetlosti.
Numerički otvori objektiva i kondenzatora su naznačeni na njihovom tijelu. Možete povećati rezoluciju mikroskopa upotrebom ultraljubičasto zračenje. Međutim, ultraljubičasti mikroskopi su veoma skupi, što ih čini teškim za upotrebu. Najčešće se za povećanje rezolucije mikroskopa koristi imerzioni sistem.