Диагностика ВИЧ-инфекции включает в себя два этапа: установление собственно факта зараженности ВИЧ-инфекцией и определение стадии заболевания. За определением стадии неразрывно следует и выяснение характера течения заболевания, а затем и формирование прогноза у данного больного, а также выбор тактики лечения.
Как известно, диагностика любого инфекционного заболевания основана на сопоставлении эпидемиологических, клинических и лабораторных данных, и преувеличение значения одной из групп этих данных может привести к диагностическим ошибкам.
Эпидемиологические критерии ВИЧ-инфекции .
Первым этапом диагностики ВИЧ-инфекции является сбор эпидемиологического анамнеза и других эпидемиологических данных об обследуемом пациенте. Отсутствие эпидемиологических данных может существенно затруднить диагностику ВИЧ-инфекции и препятствовать проведению противоэпидемических мероприятий.
Эпидемиологические критерии иногда могут быть решающими в постановке диагноза ВИЧ-инфекции, но могут иметь и вспомогательное значение. Критерием высокой вероятности инфицирования является обнаружение у обследуемого лица таких факторов риска заражения, как переливание донорской крови, полученной от ВИЧ-инфицированного лица, рождение обследуемой женщиной ВИЧ-инфицированного ребенка. Велика вероятность инфицирования в случае рождения обследуемого от ВИЧ-инфицированной матери, полового контакта с ВИЧ-инфицированным лицом, совместного парентерального приема наркотиков с ВИЧ-инфицированным лицом. Определенный риск заражения обнаруживается при достоверных парентеральных вмешательствах, которые осуществляются инструментами, вероятно, контаминированными ВИЧ (то есть во внутрибольничных и подобных им очагах ВИЧ-инфекции с парентеральным путем передачи ВИЧ).
О заметном риске заражения речь может идти в тех случаях, когда обследуемый сообщает о половых связях или о парентеральном приеме наркотиков на территориях, где ВИЧ значительно распространен среди той группы населения, к которой принадлежит обследуемый.
В то же время половые связи и прием наркотиков на территориях с низким распространением ВИЧ-инфекции не исключает возможности заражения ВИЧ.
Отсутствие достоверных факторов риска заражения ВИЧ может ставить под сомнение данные лабораторных исследований. В таких случаях рекомендуется повторить лабораторные исследования.
Клинические критерии ВИЧ-инфекции.
Ранняя диагностика ВИЧ-инфекции обеспечивает своевременность терапии больного и развертывание профилактических мероприятий в очаге, предупреждающих неумышленную передачу вируса от инфицированного здоровому человеку. Наконец, ранняя диагностика позволяет своевременное проведение диспансеризации, психологической помощи, социальной реабилитации. Первые успехи в терапии больных позволяют при ранней диагностике значительно продлить жизнь больным и даже надеяться на излечение.
Сложность ранней диагностики, базирующейся на клинической картине заключается в неспецифичности, полиморфности симптоматики в стадии II, уже не говоря об отсутствии клиники в стадии I. Тем не менее во всех случаях немотивированной утомляемости, наличия ночных потов, головной боли, особенно на фоне кратковременной лихорадки (3-10 дней) с температурой 38-38,50 С, сопровождающейся тонзиллитом, длительного диарейного синдрома, похудания за короткое время, необходимо в первую очередь исключить ВИЧ-инфекцию. Постановке диагноза в этот период помогает выявление при объективном обследовании разнообразной кожной сыпи (пятна, папулы, розеолы, гнойнички) или фурункулеза. Наличие лимфаденопатии, даже в случаях увеличения одной группы лимфатических узлов и тем более при генерализованной уже с большей долей вероятности позволяет заподозрить клинически ВИЧ-инфекцию. Для болезни особенно характерно увеличение заднешейных, подчелюстных, над- и подключичных, подмышечных и локтевых лимфатических узлов. Как правило, они увеличиваются размером до 2-5 см в диаметре, безболезненны, плотно-эластичной консистенции, изредка сливаются в конгломерат. Весьма характерно для ВИЧ-инфекции увеличение более чем одного узла, более чем одной группы (за исключением паховых), длящееся свыше 3 мес.
Нередко в ранней фазе болезни наличие психо-неврологической симптоматики: чувство тревоги, депрессия, шаткость походки, снижение остроты зрения, судорожные припадки с признаками поражения психо-эмоциональной сферы (нарушение памяти, забывчивость, неадекватность поведения, притупление эмоций). К наиболее характерным признакам ранней стадии ВИЧ-инфекции относятся:
1. Снижение массы тела менее, чем на 10%;
2. Изменения на коже и слизистых оболочек (себорйный дерматит, фолликулит, пруриго, псориаз, грибковые поражения ногтей, рецидивирующие язвы в полости рта, некротический гингивит);
3 . Опоясывающий герпес у лиц моложе 50 лет;
4. Рецидивирующие инфекции верхних дыхательных путей;
В промежуточной стадии болезни, характеризующейся клиникой развернутой суперинфекции, сформировавшейся в результате иммунодефицита наиболее характерны:
1 . Прогрессирующее снижение массы тела свыше 10%;
2 . Диарея неясного генеза, продолжающаяся свыше 1 мес..;
3 . Кандидоз полости рта;
4 . Лейкоплакия;
5. Туберкулез легких;
6. Периферическая нейропатия;
7. Локализованные формы саркомы Капоши;
8. Диссеминирующий опоясывающий герпес;
9. Тяжелая, рецидивирующая бактериальная инфекция (пневмония, синуситы, пиомиозит).
Для поздней стадии , позволяющей диагностировать ВИЧ-инфекцию, или, во всяком случае, проводить дифференциальную диагностику, относятся:
1. Пневмоцистная пневмония;
2 . Токсоплазмоз;
3. Криптококкоз;
4. CMV-инфекция;
5. Простой герпес;
6. Прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия;
7. Гистоплазмоз;
8. Кандидозный эзофагит;
9. МАК-инфекция;
10. Сальмонеллезная септицемия;
11. Внелегочной туберкулез;
12. Лимфома, саркома Капоши;
13. Кахексия;
14. ВИЧ-энцефалопатия.
В 1988 ВОЗ предложила в целях клинической диагностики проводить балловую оценку симптомов , имеющихся у подозреваемого на ВИЧ-инфекцию больного:
Персистирующая генерализованная лимфаденопатия 0
Изменения на коже и слизистых оболочках 1
Снижение массы тела 1
Выраженная утомляемость 1
Простой герпес 2
Диарея длительностью свыше 1 мес. 4
Лихорадка длительностью свыше 1 мес. 4
Снижение массы тела свыше 10% 4
Туберкулез легких 5
Рецидивирующая бактериальная инфекция 5
Лейкоплакия полости рта 5
Стоматит, молочница рта 5
Локализованная саркома Капоши 8
Кахексия 12
При этом сумма баллов от 0 до 3 оценивается как вероятность ВИЧ-инфекции очень мала, 4 -11 баллов - заболевание вероятно, а 12 и свыше - очень вероятно.
В целом клиническая диагностика ВИЧ-инфекции – это, прежде всего диагностика спектра СПИД-ассоциированной патологии у больного вторичным иммунодефицитом. Так как ВИЧ-индикаторные заболевания включают 23 нозологические формы, наиболее целесообразен синдромальный подход к диагностике. Почти всегда имеет место у больного синдром общей интоксикации (немотивированная слабость, вялость, быстрая утомляемость) развивающийся на фоне длительного субфебрилитета или лихорадки неясного генеза, чаще в ночное и утреннее время, сопровождающейся обильным потом. Постоянен синдром немотивированной генерализованной периферической лимфаденопатии, в 20% сопровождающийся гепато- спленомегалией различной степени выраженности. Один из ведущих синдромов болезни - синдром бронхо-легочной патологии, правда глубокие поражения легочной ткани в виде пневмоцистной пневмонии развиваются в далеко зашедших случаях болезни, ибо развивается пневмоцистоз на фоне глубокого иммунодефицита. Зато длительностью свыше 1 месяца синдром немотивированной диареи относится к рано появляющимся, для него характерна устойчивость к медикаментозной терапии. Один из синдромов ВИЧ-инфекции - волнообразно текущая артралгия неясной этиологии. К характернейшим проявлениям болезни следует отнести и синдром поражений кожи и слизистых, проявляющийся неспецифической макуло-папулезной сыпью, устойчивой к терапии стероидами экземой, стафилококковым импетиго. К дерматологическим проявлениям также относятся рецидивирующие грибковые (микоз, кандидоз, бактериальные (фолликулиты, фурункулез, гидроаденит), вирусные (герпес) поражения кожи и слизистых оболочек. Наконец, ВИЧ-инфекцию характеризуют и новообразования, в основном в виде саркомы Капоши и лимфомы, а также некоторых других видов опухолей.
Наличие у пациента не менее двух клинических и двух клинико-лабораторных (лейко- лифо- нейтропения, гипогаммаглобулинемия) из числа вышеперечисленных симптомов позволяет с высокой степенью уверенности диагностировать ВИЧ-инфекцию. Но в то же время в случае выявления двух из таких весьма часто встречающихся у больных синдромов, как лихорадка и лимфаденопатия, сохраняющихся на протяжении месяца и свыше, стойкая немотивированная диарея, снижение массы тела более чем на 10% или обильные ночные поты дают основание на постановку диагноза и тщательного лабораторного обследования.
В стадии 2а заболевание можно заподозрить только по симптому персистирующей генерализованной лимфаденопатии у больного из группы риска или при наличии эпиданамнеза.
В стадии 2б (ранней или слабовыраженной) еще сохраняется соматическое благополучеие, нормальная активность. Поражения кожи и слизистых оболочек нетяжелые, рецидивирующие инфекции респираторного тракта не носят генерализованного характера, потеря массы тела не превышает 10%.
Согласно рекомендациям ВОЗ, надежная клиническая диагностика ВИЧ-инфекции у взрослых и детей возможна при наличии одного из 12 СПИД-индикаторных заболевания: 1) кандидоз пищевода, трахеи, бронхов, легких; 2) внелегочной криптококкоз; 3) криптоспоридиоз с диареей более одного месяца; 4) цитомегаловирусное поражение какого-либо органа (за исключением и помимо печени, селезенки и лимфатических узлов у больного старше 1 месяца); 5) инфекция, обусловленная вирусом простого герпеса, персистирующая более 1 месяца у больного старше 1 месяца; 6) саркома Капоши у больного моложе 60 лет; 7) лимфома головного мозга у больного моложе 60 лет; 8) лимфоцитарная интерстициальная пневмония у ребенка до 13 лет, 9) диссеминированная инфекция, вызванная бактериями группы Micobacterium avium intracellulare или M.Kansassii; 10) пневмоцистная пневмония; 11) прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия; 12) токсоплазмоз центральной нервной системы у больных старше 1 месяца. Наличие одного из этих заболеваний позволяет диагностировать ВИЧ-инфекцию при отсутствии серологического иммуноферментного исследования крови или даже при получении серонегативного результата.
Не менее сложна дифференсация фаз болезни, т.е. разграничение стадий по клиническим критериям. По мнению специалистов CDC (США) наиболее объективный критерий - количество Т-хелперов, а не клинические проявления, ибо многие из этих состояний часто встречаются у лиц, не инфицированных ВИЧ. В 1991 году Центр определил, что постановка диагноза СПИД может быть в случаях, если: а) у инфицированного имеется одно из 23 СПИД-ассоциированных состояний или б) он ВИЧ-инфицирован и имеет менее 200 СD4+ клеток/ мм.
Лабораторное критерии ВИЧ-инфекции.
Обследованию на ВИЧ-инфекцию в первую очередь подлежат:
2 . Лица с клиникой кандидозного эзофагита, кандидоза бронхов и легких, диссеминированного или внелегочного кокцидиомикоза, пневмоцистной пневмонии, внелегочного криптококкоза, криптоспоридиоза с диареей юлительностью свыше 1 мес., цитомегаловирусного поражения внутренних органов кроме печени, селезенки, лимфатических узлов у больных старше 6 мес., цитмегаловируснго ретинита с потерей зрения, герпетической инфекции с многоочаговыми язвами длительностью свыше 1 мес., бронхитом, пневмонией или эзофагитом, рецидивирующего опоясывающего герпеса, дессиминированного или внелегочного гистоплазмоза, туберкулеза легких или внелегочного, изоспориоза с диареей длительностью свыше 1 мес., распространенной или внелегочной МАК-инфекции, прогрессирующей многофокусной лейкоэнцефалопатии, токсоплазмоза мозга, сальмонеллезной септицемии, саркомы Капоши, лимфомы, лимфоидной интерстициальной пневмонии (у детей)
В настоящее время для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции используются различные методы обнаружения ВИЧ, антигенов и генного материала ВИЧ, а также методы обнаружения антител к ВИЧ. Все эти методы обладают различной эффективностью, требуют различного оборудования и разного уровня подготовки персонала. Результаты этих исследований требуют грамотной интерпретации.
… диагностика любого инфекционного заболевания основана на сопоставлении эпидемиологических, клинических и лабораторных данных, и преувеличение значения одной из групп этих данных может привести к диагностическим ошибкам.
Диагностика ВИЧ-инфекции включает в себя два этапа
:
I
этап
- установление собственно факта зараженности ВИЧ-инфекцией
;
II
этап
- определение стадии заболевания
.
УСТАНОВЛЕНИЕ ФАКТА ЗАРАЖЕННОСТИ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ
Установление собственно факта зараженности ВИЧ-инфекцией (то есть выявление ВИЧ-инфицированных) в свою очередь также включает в себя два этапа
:
I этап
- иммуноферментный анализ
(ИФА)
: метод ИФА является скрининговым (отборочным) - отбор предположительно инфицированных лиц, то есть его целью является выявление подозрительных лиц и отсеивние здоровых лиц; антитела к ВИЧ выявляют с помощью других антител к искомым антителам (антитела против других антител). Эти «вспомогательные» антитела метят ферментом. Все скрининговые тесты обязаны быть высокочувствительными, чтобы не пропустить больного. Из-за этого их специфичность не очень высокая, то есть ИФА может дать положительный ответ («вероятно болен») у неинфицированных людей (например, у больных аутоиммунными заболеваниями: ревматизм, системная красная волчанка и др.). Частота ложноположительных результатов при использовании различных тест-систем колеблется от 0,02 до 0,5%. Если у человека ИФА дало положительный результат, то для подтверждения факта инфицирования ВИЧ необходимо обследоваться дальше. При проведении ИФА в 3 - 5% случаев возможны ложноотрицательные результаты - если инфицирование произошло относительно недавно и уровень антител еще очень низкий, или в терминальной стадии болезни, характеризующейся тяжелым поражением иммунной системы с глубоким нарушением процесса антителообразования. Поэтому при наличии данных, свидетельствующих о контакте с инфицированными ВИЧ обычно проводят повторные исследования через 2 - 3 месяца.
II этап
- иммуноблоттинг
(в модификации Western Blot, вестерн-блот)
: является более сложным методом и служит для подтверждения факта инфицирования. Этот метод выявляет не комплексные антитела к ВИЧ, а антитела к отдельным его структурным белкам (p24, gp120, gp41 и др.). Результаты иммуноблоттинга считаются положительными, если выявляются антитела хотя бы к трем белкам, один из которых кодируется генами env , другой - генами gag , третий - генами pol . Если обнаруживаются антитела к одному или двум белкам, результат считается сомнительным и требует подтверждения. В большинстве лабораторий диагноз ВИЧ-инфекции ставится, если одновременно выявляются антитела к белкам р24 , р31 , gp4l и gpl20/gp160. Суть метода: вирус разрушают на компоненты (антигены), которые состоят из ионизированных аминокислотных остатков, а потому все компоненты имеют отличающийся друг от друга заря; затем с помощью электрофореза (электрического тока) антигены распределяются на поверхности полоски - если в исследуемой сыворотке есть антитела к ВИЧ, то они будут взаимодействовать со всеми группами антигенов, а это можно выявить.
Следует помнить , что антитела к ВИЧ появляются у 90-95% инфицированных в течение 3-х месяцев после заражения, у 5-9% инфицированных антитела к ВИЧ появляются через 6 месяцев и у 0,5-1 % инфицированных антитела к ВИЧ появляются в более поздние сроки. В стадии СПИДа количество антител может снижаться, вплоть до полного исчезновения.
В иммунологии существует такое понятие, как «серологическое окно» - период от инфицирования до появления такого количества антител, которое можно выявить. Для ВИЧ этот период обычно продолжается от 2 до 12 недель, в редких случаях дольше. В период «серологического окна» по анализам человек здоров, но на самом деле является зараженным ВИЧ. Установлено, что ДНК ВИЧ может находиться в геноме человека не менее трех лет без признаков активности и антитела к ВИЧ (маркеры ВИЧ-инфицирования) не появляются.
В данный период («серологическое окно») выявить ВИЧ-инфицированного и даже через 1-2 недели после заражения возможно с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это чрезвычайно чувствительный метод - теоретически можно выявить 1 ДНК на 10 мл среды. Суть метода заключается в следующем: с помощью полимеразной цепной реакции получают много копий нуклеиновой кислоты (вирус является нуклеиновой кислотой -ДНК или РНК - в белковой оболочке), которые потом выявляют с помощью меченых ферментов или изотопов, а также по характерному строению. ПЦР является дорогостоящим методом диагностики, поэтому при скрининге и в плановом порядке не используется.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАДИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ
В основе развития СПИДа лежит , в первую очередь, разрушение Т-лимфоцитов-хелперов, маркируемых моноклональными антителами - кластерами дифференцировки – как CD4. В связи с этим проведение диагностики и наблюдение за прогрессированием заболевания невозможно без контроля субпопуляции Т-хелперов, который наиболее удобно осуществлять с помощью лазерного клеточного сортировщика.
При слабо выраженной ВИЧ-инфекции количество Т-лимфоцитов - чрезвычайно вариабельный показатель. В целом, снижение числа клеток CD4 (абсолютное и относительное) обнаруживается у лиц, ВИЧ-инфицирование которых произошло не менее года назад. С другой стороны, на ранних стадиях инфекции нередко оказывается резко повышенным число Т-супрессоры (CD8) как в периферической крови, так и в увеличенных лимфоузлах.
При выраженном СПИДе абсолютное большинство больных имеет сниженное общее число Т-лимфоцитов (менее 1000 в 1 мкл крови, в том числе лимфоцитов CD4 - менее чем 22 в 1 мкл, тогда как абсолютное значение содержания CD8 остаётся в пределах нормы). Соответственно, резко снижается соотношение CD4/ CD8. Ответ Т-лимфоцитов in vitro на стандартные антигены и митогены снижается в строгом соответствии с относительно сниженным числом CD4.
Для поздних стадии СПИДа характерны общая лимфопения, нейтропения, тромбоцитопения (соответственно, снижение числа лимфоцитов, нейтрофилов и тромбоцитов), анемия. Эти изменения могут быть следствием центрального угнетения кроветворения за счёт поражения кроветворных органов вирусом, а также - аутоиммунного разрушения клеточных субпопуляции на периферии. Кроме того, для СПИДа характерно умеренное увеличение количества гамма-глобулинов с доминирующим увеличением содержания IgG. Больные с выраженными симптомами СПИДа нередко имеют повышенный уровень IgA. На некоторых стадиях заболевания существенно повышается уровень таких маркёров СПИДа, как 1-микроглобулин, кислотостабильный -интерферон, 1-тимозин. То же происходит с секрецией свободного неоптерина - метаболита макрофагов. Пока не представляется возможным оценить относительную значимость каждого из перечисленных тестов, число которых постоянно возрастает. Поэтому их следует рассматривать во взаимодействии с маркёрами ВИЧ-инфекции как иммуновирусологического, так и цитологического характера. Для клинического анализа крови характерны лейкопения, лимфопения (соответственно, снижение числа лейкоцитов и лимфоцитов).
1 стадия - «стадия инкубации
»
- антитела к ВИЧ еще не выявляются; диагноз ВИЧ-инфекции на данной стадии ставится на основании эпидемиологических данных и лабораторно должен подтверждаться обнаружением в сыворотке крови пациента вируса иммунодефицита человека, его антигенов, нуклеиновых кислот ВИЧ;
2 стадия - «стадия первичных проявлений
»
- в данном периоде уже имеется выработка антител:;
2А стадия - «бессимптомная
»
- ВИЧ-инфекция проявляется только выработкой антител;
2Б стадия - «острая ВИЧ-инфекция без вторичных заболеваний
»
- в крови больных могут обнаруживаться широкоплазменные лимфоциты - «мононуклеары» и часто отмечается транзиторное снижение уровня СD4-лимфоцитов (острая клиническая инфекция отмечается у 50-90% инфицированных лиц в первые 3 месяца после заражения; начало периода острой инфекции, как правило, опережает сероконверсию, т.е. появление антител к ВИЧ);
2В стадия - «острая ВИЧ-инфекция с вторичными заболеваниями
»
- на фоне снижения уровня СD4-лимфоцитов и развившегося вследствие этого иммунодефицита появляются вторичные заболевания различной этиологии (ангина, бактериальная и пневмоцистная пневмония, кандидозы, герпетическия инфекция и др.);
3 стадия - «латентная
»
- в ответ на прогрессирование иммунодефицита происходит модификация иммунного ответа в виде избыточного воспроизводства СD4-клеток с последующим постепенным снижением уровня СD4-лимфоцитов, в среднем со скоростью 0,05-0,07x109/л в год; в крови обнаруживаются антитела к ВИЧ;
4 стадия - «стадия вторичных заболеваний
»
- истощение лимфоцитов популяции CD4, концентрация антител к вирусу значительно снижается (в зависимости от тяжести вторичных заболеваний выделяют стадии 4А, 4Б, 4В);
5 стадия - «терминальная стадия
»
- типично снижение количества СD4-клеток ниже 0,05x109/л; концентрация антител к вирусу значительно снижается или антитела могут не определяться.
Диагностика ВИЧ– одна из первостепенных задач, что стоят перед работниками кожно-венерологического диспансера, а также сотрудниками поликлиники.
Заболевание характеризуется врачами, как очень коварное. Характеризуется хроническим течением и не поддается полноценному лечению. Его важно своевременно выявлять, чтобы брать под контроль и предотвращать бесконтрольное распространение. В чем особенности вируса иммунодефицита человека, и как им можно заразиться, часто интересуются пациенты.
Какие есть способы диагностики болезни, и какие признаки позволяют заподозрить инфицирование?
Сегодня отовсюду можно услышать о том, насколько опасна ВИЧ-инфекция. Однако мало кто объясняет, в чем эта опасность заключается. В результате пациенты обладают неполным набором информации и, как следствие, не воспринимают угрозу всерьез. А ведь ВИЧ отличается крайней опасностью. Его относят к медленно прогрессирующим вирусным заболеваниям, склонным к хроническому течению. Поражается при этой патологии в первую очередь иммунная система.
Врачи обращают внимание пациентов на то, что смерть происходит не от самого вируса иммунодефицита, как такового.
Человек погибает от сопутствующих инфекций, обеспечить полноценную защиту от которых организм уже не способен. Также причиной гибели становятся раковые опухоли, с которыми оказывается не в состоянии бороться сниженный иммунитет.
На самом деле механизм воздействия ВИЧ-инфекции на иммунную систему довольно сложен. Как отмечают доктора, пациентам вовсе не обязательно понимать его досконально. Достаточно знать, что заболевание способно снижать уровень иммунитета до критических значений. В результате организм окажется неспособен защищаться от различных воздействий извне, что приведет к гибели рано или поздно.
Как происходит заражение
Важно понимать, что ВИЧ-инфекция сегодня окружена большим количеством самых разнообразных мифов.
Пациенты очень плохо информированы о том, в каких случаях можно заразиться, а когда здоровье находится вне опасности.
Первое, что необходимо запомнить, это то, что ВИЧ отличается очень сильной неустойчивостью в окружающей среде. Это значит, что патогенный микроорганизм способен полноценно и длительно жить только в человеческом теле. Он не переносит нагревания свыше 50 градусов (умирает мгновенно). Также не способен противостоять процессам высыхания. Далеко не все жидкости организма содержат достаточное количество вируса для того, чтобы произошло заражение.
Наибольшую опасность представляют:
- кровь;
- предэякулят;
- сперма;
- выделения из женского влагалища;
- лимфа;
- грудное молоко.
Если любая из этих жидкостей контактирует со слизистыми оболочками, в которых есть микротравмы, или с пораженной травмами кожей, происходит заражение.
Также оно возможно в том случае, если инородная жидкость попадает напрямую в кровоток. Слюна и слезы, вопреки распространенному мнению, угрозы не представляют. Из-за особенностей вируса и его низкой выживаемости передается он несколькими способами:
- половой путь т.е. при незащищенных половых контактах, которые неминуемо влекут за собой соприкосновение биологических жидкостей и восприимчивых к патогену слизистых оболочек организма;
- парентеральный путь т.е. перенос вируса с кровью при ее переливании или из-за использования нестерильного инструментария в медицинских целях;
- вертикальный путь т.е. от матери к ребенку (сегодня если женщина принимает антиретровирусную терапию и отказывается от кормления грудью, вероятность заражения ребенка в родах сводится к минимуму).
Важно понимать, что если для заражения через кожу микротравмы или открытые раны обязательны, то для заражения через слизистую это не обязательно условие. Объясняется разница тем, что слизистые оболочки и кожные покровы человеческого организма имеют совершенно разное строение. Эту разницу необходимо учитывать.
По каким признакам заподозрить ВИЧ
Многие пациенты интересуются вопросом о том, по каким признакам обычно можно заподозрить заражение вирусом иммунодефицита человека.
- необоснованное повышение температуры системного типа, которое нельзя объяснить какой-либо другой инфекцией, и которое сохраняется в течение длительного времени, несмотря на предпринимаемые для лечения меры;
- сильное увеличение лимфатических узлов в размерах (в первую очередь страдают узлы в области паха, но возможно и их вовлечение во всем организме);
- сильное снижение массы тела, которое нельзя объяснить диетами, стрессами, гормональными сбоями и другими причинами;
- жалобы на расстройства стула, которые преследуют пациента в течение длительного времени, а найти причину, по которой они появились, не удается;
- выраженная склонность к переходу любых инфекционных заболеваний в хронические формы, причем природа возбудителя особого значения не имеет, хронизируются как бактериальные, так и вирусные патологии;
- развиваются заболевания, провоцируемые условно-патогенной микрофлорой, которая не представляет угрозы для человека, чей иммунитет работает в полной мере (например, микоплазмоз, уреаплазмоз, кандидоз и др.).
Клиника ВИЧ-инфекции очень неспецифична, как отмечают доктора. Из-за этого часто возникают трудности с постановкой диагноза. Многие пациенты вовсе игнорируют тревожные симптомы, предпочитая не обращаться за врачебной помощью. Даже в том случае, если заболевание сильно сказывается на их общем самочувствии.
Важно понимать, что ВИЧ-инфекция в течение длительного времени может вообще не давать о себе знать. А когда первые признаки появятся, человек может даже не связать их с возможностью своего заражения и делать попытки лечиться в домашних условиях.
Способы диагностики
Лабораторная диагностика ВИЧ разработана довольно давно и с успехом применяется для того, чтобы диагностировать это опасное заболевание.
Недуг нельзя опознать только по симптомам. Поэтому подтверждение диагноза на основании лабораторных методик часто играет решающую роль.
Существуют различные методы диагностики ВИЧ. В России в первую очередь предпочтение отдается иммунному блоттингу, а также ИФА-реакциям. Эти способы используются часто в качестве скрининговых, например, при проверке медицинского персонала.
ИФА-системы
Часто пациенты спрашивают у своих врачей, с какого способа стоит начать диагностический поиск при подозрении на заражение вирусом иммунодефицита человека.
Любой грамотный доктор скажет, что предпочтение стоит отдать иммуноферментному анализу. Именно эта методика на территории России является первым диагностическим этапом.
Принцип работы ИФА прост. В лаборатории врачами были созданы специальные белки. Они способны обнаруживать антитела, вырабатываемые организмом в ответ на контакт с ВИЧ, и взаимодействовать с ними. Затем к системе добавляют специальный фермент-индикатор, который изменяет свой цвет. На конечном этапе материал обрабатывается с помощью специального аппарата, и врач получает итоговый результат.
ИФА пользуется большой популярностью.
Прежде всего из-за того, что получить результаты можно даже в том случае, если с момента внедрения патогенна в организм прошло не более нескольких недель.
Важно понимать, что иммуноферментный анализ определяет не сам вирус в крови, а антитела к нему.
У многих людей они могут начать вырабатываться позже, чем через две недели, из-за чего результат может быть ошибочным. Существует несколько поколений ИФА-тестов.
Самыми современными и высокоточными считаются те, что относятся к 3 и 4 поколениям. Врачи отмечают, что лучше всего, если есть выбор, отдавать предпочтение Европейским реагентам, так как их точность достигает 99%. Сроки получения результатов ИФА составляют в среднем от 2 до 10 дней.
Почему ИФА может быть ложной
Важно понимать, что иммуноферментный анализ может давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Хотя риск подобного развития событий крайне мал.
Ложноотрицательные результаты пациент может получить в том случае, если анализ был сдан слишком рано, и антитела еще не успели образоваться в организме.
Чтобы исключить подобную реакцию, пациентам рекомендуется сдавать анализ несколько раз с различным промежутком времени.
Ложноположительный тест встречается при некоторых заболеваниях. Например, получить положительные результаты могут пациенты с:
- алкогольным гепатитом;
- миеломами в большом количестве;
- некоторыми аутоиммунными болезнями;
- женщины в период беременности и др.
При подобных заболеваниях кровь человека пополняется антителами. Они могут напоминать по структуре антитела к ВИЧ, что вводит реагенты в замешательство, провоцируя реакцию. Конечно, в последние годы тестовые системы становятся все более и более чувствительными. Однако пока до конца решить проблему ложных результатов не удалось.
Иммуноблоттинг
В современных условиях поставить положительный диагноз ВИЧ, опираясь только на ИФА, нельзя. Необходимо подтверждение полученных результатов, которое выполняется с помощью реакции иммунного блоттинга (иммуноблоттинг, ИБ).
Чтобы выполнить ИБ, в лаборатории должны присутствовать специальные тестовые полоски. На них наносятся вирусные белки. Перед тем, как проводить анализ, кровь пациента, взятую из вены, подготавливают специальным образом.
Полученный биологический материал добавляют в гель, в котором происходит разделение белков по их весу. Затем в полученную массу опускают предварительно заготовленную полосу.
Полоса намокает (происходит блоттинг), на ней выявляются полосы, если в материале есть белки ВИЧ-инфекции. Если белки отсутствуют, намокание не изменяет внешний вид полосы.
Существует несколько трактовок иммуноблоттинга. Однако по какому бы способу конкретная больница или лаборатория не выполняла расшифровку, вероятность правильности постановки диагноза составляет 99,9%.
Может ли иммуноблоттинг давать неверные результаты, часто интересуются пациенты? Да, это возможно, например, если пациент болен туберкулезом, находится в состоянии беременности, страдает от онкологии.
ПЦР в помощь
ПЦР – еще один метод, который может диагностировать вирус иммунодефицита человека в крови и других биологических жидкостях, где его концентрация достаточно высока.
Как отмечают доктора, полимеразная цепная реакция может дать положительный результат уже через 10 дней после того, как произошел первый контакт организма с инфекцией.
Важно понимать, что ПЦР в ряде случаев дает ложноположительные результаты. Объясняется это тем, что метод обладает очень высокой чувствительностью.
В результате нередко он реагирует на похожие антитела, свидетельствующие о совсем других патологических процессах в организме пациента.
Несмотря на высокую чувствительность и невысокую вероятность получения ложных результатов, ПЦР не используется повсеместно. Объясняется это несколькими факторами. Во-первых, для выполнения полимеразной цепной реакции требуется специальное оборудование, цена на которое довольно велика. Во-вторых, персонал, работающий с оборудованием, должен обладать высокой квалификацией, что тоже может вызывать затруднения. Эти особенности в комплексе делают ПЦР дорогим методом диагностики и, как следствие, доступным далеко не всем.
Несмотря на то, что ПЦР не является скрининговым методом, его применяют, например, для проверки новорожденного на заражение вирусом иммунодефицита человека.
Экспресс-системы для диагностики
Врачи и ученые потратили множество усилий на то, чтобы создать экспресс-тесты для оценки зараженности ВИЧ-инфекцией. Как отмечают доктора, при использовании этих систем есть возможность получить результат уже через 15 минут после того, как тест был проведен.
Экспресс-тесты на ВИЧ строятся на принципе иммунохроматографии. В систему обычно входит полоска, пропитанная специальными реагентами.
Задача пациента состоит в том, чтобы нанести на нее кровь, сперму или любую другую биологическую жидкость, в которой могут содержаться антитела к вирусу.
Если они обнаружатся, то на полоске появятся две цветные полосы, одна из которых контрольная, а другая диагностическая. Если не обнаружатся, то выявится только контрольная полоса.
Важно понимать, что экспресс-тесты не дают 100% гарантии того, что человек не заражен или, напротив, заражен ВИЧ-инфекцией. В любом случае результаты, полученные с их помощью, необходимо подтверждать в лаборатории с помощью иммуноблоттинга.
Тест-системы экспресс типа удобны пациентам, которые хотят в домашних условиях успокоить себя. Однако, как отмечают доктора, даже если с их помощью человек получил отрицательный результат, при подозрениях на негативные изменения в организме все же стоит обратиться к врачу.
К какому врачу обратиться при подозрении на заражение
Многие пациенты задаются вопросом о том, к какому врачу им обращаться в том случае, если есть подозрение на заражение ВИЧ-инфекцией. В первую очередь рекомендуется посетить врача венеролога. Именно этот медицинский работник специализируются на заболеваниях, которые способны передаваться от человека к человеку половым путем.
Венеролог сможет провести грамотный осмотр, собрать анамнез и принять решение о том, какие обследования необходимы пациенту для точной постановки диагноза. По своему усмотрению он также может направить пациента в инфекционную больницу. Особенно в том случае, если все же подозревает у него ВИЧ.
Вирус иммунодефицита человека – распространенное заболевание. Столкнуться с ним может любой человек, ведущий активную половую жизнь.
Знание особенностей распространения и диагностики этой болезни в современных реалиях является жизненно-необходимым, если пациент хочет сохранить свое здоровье и долголетие. Только своевременное обращение к доктору позволит взять инфекцию под контроль и защититься от нее!
Диагностика ВИЧ-инфекции проводится для постановки окончательного диагноза. Если пациент уверен в инфицировании, не следует заниматься самолечением: необходимо обратиться к специалисту.
Под маской СПИДа могут скрываться многие заболевания, которые излечиваются при обращении к врачу. Тесты на инфекцию являются наиболее распространенным и ранним методом диагностики.
Определение степени инфицирования продолжается в лаборатории при сдаче анализа крови методом ИФА или ПЦР.
В связи с ухудшением эпидемиологических показателей по ВИЧ-инфекции, большое значение приобрело раннее распознавание недуга. Врач проводит дифференциальную диагностику ВИЧ-инфекции, собирает эпидемиологические сведения о болезни.
В процессе изучения способов заражения специалист проводит такие исследования, как:
- изучение механизма развития ВИЧ-инфекции;
- диагностику сопутствующих недугов.
Методы диагностики ВИЧ-инфекции направлены на выявление антител в ИФА, а при подтверждении диагноза специалист проводит разъяснительную работу с больным о соблюдении им правил во избежание распространения недуга.
Тестирование на СПИД назначается детям, рожденным от инфицированных матерей, после проведенного антиретровирусного лечения. Скрининговые анализы определяют антитела к ВИЧ 1 и 2.
Иммуноблот носит подтверждающий характер, и выявляет антитела к белкам ВИЧ-инфекции.
Ранняя диагностика иммунодефицита позволяет больному в короткие сроки изменить образ жизни, начать лечение и получить психологическую помощь. Характерные жалобы пациента всегда помогают врачу заподозрить СПИД и направить кровь пациента на исследование в лабораторию.
Экспресс-тесты 4 поколения на СПИД
Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции, проводимая с тестами 4 поколения, позволяет определить недуг в острой фазе болезни. Тест Determine HIV-1/2 Ag/Ab Combo высокочувствителен к антигенам и антителам в сыворотке крови больного. Специфичность исследования составляет 99,19% – по Ab-линии, и 99,64% – по Ag-линии, а положительное прогностическое значение определяется в пределах 55%.
Чувствительность анализа выявляется путем определения ранее известных результатов. При получении положительных данных вероятность ошибочных цифр достигает 45%.
В домашних условиях проводится тест по мазку из полости рта. Исследование комфортное, простое и безболезненное для пациента. Тест-полоска «ИммуноХром- ½ -Экспресс» применяется для проведения анализа,и обеспечивает стабильный результат, если больной соблюдает инструкцию, прилагаемую к препарату. При обнаружении двух одинаковых фиолетовых полосок, расположенных в тестовой зоне и области контроля, тест считается положительным. Наличие одной полоски расшифровывается как отрицательный результат анализа.
Время, затраченное на исследование, составляет от 15 до 30 мин.
Диагностика недуга в инкубационном периоде
Поражение иммунной системы происходит при внедрении вируса в организм пациента. Срок инкубационного периода колеблется в пределах 3 месяцев.
После нежелательного и опасного контакта с партнером необходимо сдать анализ на ПЦР и на основании полученных результатов сделать вывод о наличии ВИЧ-инфекции в организме. Максимальный период для начала диагностики иммунодефицита составляет 8-9 месяцев, а в исключительных случаях он продлевается до 2 лет.
Для окончательной диагностики недуга исследование проводят в течение года; через каждые 3 месяца пациент сдает кровь на ВИЧ. Немедленное обращение к специалисту после опасного контакта снижает вероятность заражения на 90%.
Для лабораторной диагностики раннего периода болезни используют метод полимеразной реакции, определяющий нуклеиновые кислоты. Результаты анализа расшифровывают в течение нескольких часов, при соблюдении полной анонимности.
Тест на ВИЧ/СПИД креатив МП-ВИЧ ½ проводится в домашних условиях, через 4 недели после опасного контакта. Тест-кассеты определяют антитела к вирусу ВИЧ № 1 и 2.
Методы экспресс-диагностики у детей на СПИД
Младенцы, рожденные от инфицированных матерей, подвергаются процедуре выявления вируса СПИДа. Серологические методы установления недуга не всегда подтверждаются у малышей в возрасте 5- 18 месяцев, но результат имеет последующее положительное значение в иммуноблоте.
Высокочувствительный метод ПЦР позволяет определить наличие в организме ребенка вируса СПИДа.
ДНК возбудителя обнаруживают у ребенка на первом месяце жизни. Система определения провируса иммунодефицита предназначена для установления концентрации РНК возбудителя.
Для анализа пригодна цельная кровь или ее высохшие пятна. Образец помещают в пробирку с консервантом ЭДТА в пропорции 1:20. Хранят материал при температуре 2-8 °C двое суток, исключив замораживание крови.
Образцы сухой крови получают методом нанесения цельной жидкости на специальную бумагу. Материал для диагностики хранят при температуре не более 8 °C. Срок использования карточек не превышает 8 месяцев.
Осмотр новорожденного и взятие анализа проводят в следующие сроки: через 2 суток после рождения, в двухмесячном возрасте, через 3-6 месяцев. Обнаружение гена провируса ВИЧ через несколько часов после рождения указывает на инфицирование плода во внутриутробный период. Инфицирование может произойти во время родов или при грудном вскармливании малыша.
Данные, подтверждающие присутствие ДНК вируса в двух контрольных образцах, указывают на развитие ВИЧ-инфекции у малыша.
Диспансерное наблюдение отменяют после получения отрицательных тестов методом ПЦР спустя 4 месяца после рождения ребенка.
Ошибки при проведении исследования
Ложноположительный анализ на присутствие вируса иммунодефицита в крови пациента по многим причинам искажает точность определения недуга. Ошибки подстерегают больного при проведении теста в домашних условиях.
Ложный результат появляется при наличии у пациента таких состояний, как перекрестная реакция, беременность, у доноров крови, при инфицировании вирусом гриппа, заболевании дыхательных путей, аутоиммунных недугах, раке, склерозе.
Аллергия способствует выработке антигенов, чужеродных организму пациента. Они распознаются тест-системой с выдачей ложного результата. Грибковая, вирусная инфекции способствуют неправильному определению наличия вируса СПИДа.
Следует пролечить инфекцию, а затем проходить обследование на СПИД. Для получения качественного результата исследования, пациент обязан рассказать врачу о сопутствующих недугах и проводимом лечении.
Диагностика методом ИФА
Общий спектр антител, обнаруженных методом иммуноферментного анализа, появляется у 95% лиц, зараженных вирусом СПИДа. Положительный двойной результат в ИФА предусматривает наличие второго подтверждающего этапа – теста иммуноблота. Он состоит из исследования антител и их соотношения к индивидуальным белковым структурам возбудителя. Исследование ИФА имеет две реакции: ферментативную и иммунологическую. В основе анализа находится взаимодействие антител и антигенов.
Последовательно определяют антитела, иммунный комплекс, активность фермента. Специалист проводит расшифровку данных анализа. Отрицательные показатели указывают на отсутствие ВИЧ-инфекции у больного.
При отсутствии антител и недавнем заражении, врач устанавливает ложноотрицательный результат.
При небрежном хранении образцов материала для изучения вируса полученные показатели могут быть ложными.
Тест, проведенный после вакцинации пациента, дает положительный результат и не может быть достоверным.
Следует правильно готовить разведение сывороток, чистку использованных планшетов, приобретать краситель высокого качества.
Положительный результат иммуноболтинга проявляется при сочетании полос ГП 41 и ГП 120 и антигена. На отрицательный результат указывает отсутствие полос.
При формировании диагностического заключения учитывают результаты тестов, показатели обследования больного в стационаре, эпидемиологический опрос пациента.
Клинико-лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции имеет три направления:
- Установление факта инфицированностм ВИЧ, диагноза ВИЧ-инфекции.
- Определение стадии клинического течения болезни и выявление вторичных заболеваний.
- Прогноз прогрессии клинического течения заболевания, лабораторный контроль эффективности проводимого лечения и побочных эффектов антиретровирусных препаратов.
1. Установление инфицированности ВИЧ, диагноза ВИЧ-инфекции
Для определения ВИЧ-инфицированности используют следующие специфические показатели: антитела к ВИЧ, антигены ВИЧ, РНК ВИЧ и ДНК провируса. Антитела к ВИЧ определяются методом иммуноферментного анализа (ИФА) или иммуноблотинга, являющегося по сути разновидностью ИФА. Антигены (белки) ВИЧ определяются методом ИФА. С помощью молекулярно-генетических методов полимеразной цепной реакции (ПНР) и bДНК можно определять РНК ВИЧ и ДНК провируса. Применение дополнительно метода гибридизации нуклеиновых кислот со специфическими ДНК-зондами позволяет проверить специфичность последовательностей ДНК, полученных при проведении ПЦР. Чувствительность ПЦР - обнаружение вирусных генов в одной из пяти тысяч клеток .
При первичной инфекции наблюдается следующая динамика маркеров ВИЧ в крови инфицированных. В первый месяц в результате активации репликативного процесса происходит резкое увеличение вирусной нагрузки (содержание РНК ВИЧ в плазме), затем, вследствие диссеминации вируса и массового инфицирования клеток-мишеней в крови и лимфатических узлах, становится возможным определение провирусной ДНК. Первостепенную диагностическую ценность имеет факт выявления ДНК провируса, интегрированной в геном клетки-мишени.
Вирусная нагрузка отражает интенсивность репликативного процесса в инфицированных клетках. В период первичной инфекции уровень вирусной нагрузки различен при инфицировании разными субтипами ВИЧ, однако динамика его изменений примерно одинакова. Так, при инфицировании субтипом В, например, если в первый месяц после заражения значение вирусной нагрузки составляет 700 копий/мл, то во 2-й месяц происходит снижение до 600, в 3-й - до 100, в 4-й - до 50 копий/мл. Такая динамика наблюдается на фоне нарастания содержания в крови специфических антител к ВИЧ. Содержание провирусной ДНК в мононуклеарах крови ВИЧ-инфицированных характеризуется относительным постоянством в течение первых 6 мес с незначительными флюктуациями у некоторых субтипов. Таким образом РНК- и ДНК-нагрузки не являются тождественными.
В стадии инкубации в течение некоторого времени не происходит образования специфических антител к ВИЧ в количестве, достаточном для определения существующими лабораторными методами. До регистрации антител в течение очень короткого времени наблюдается появление в крови белка Nef, которым репрессирует репликативный процесс, и структурного белка р24. Антиген р24 может быть выявлен в крови методом иммупоферментного анализа уже через 1-2 пед после заражения и определяться до 8-й нед, затем его содержание резко снижается. Далее в клиническом течении ВИЧ-инфекции отмечается второй подъем содержания в крови белка р24. Он приходится на период формирования СПИД. Исчезновение в крови свободных (не связанных антителами) сердцевинных белков р24 и появление специфических антител к белкам ВИЧ знаменуют наступление сероконверсии (рис. 9.6).
Виремия и антигенемия вызывают образование специфических антител класса IgM (анти-р24, анти-gр41, анти-gр120, анти-gр160). Свободные антитела классов IgM и IgG к белку р24 могут появиться, начиная со 2-й нед, их содержание повышается в течение 2-4 нед, достигая определенного уровня, на котором сохраняется в течение месяцев (IgM) и лет (IgG) (рис. 9.7).
Появление полной сероконверсии, когда в периферической крови регистрируется высокий уровень специфических антител класса IgG к структурным белкам ВИЧ р24, gp41, gp120, gр160, существенно облегчает диагностику ВИЧ-инфекции. Антитела к ВИЧ появляются у 90-95% инфицированных в течение 3-х мес после заражения, у 5-9% - в период от 3 до 6 мес от момента заражения и у 0,5-1% - в более поздние сроки.
Не смотря на то, что антитела к ВИЧ появляются в последнюю очередь, основным лабораторным диагностическим показателем до настоящего времени является выявление специфических антител методом ИФА и иммуноблотинга.
Данные, представленные в табл.9.2 [показать] и 9.3 [показать] , наглядно демонстрируют высокую чувствительность современных иммуноферментпых тест-систем при определении антител к ВИЧ, превосходящую чувствительность иммуноблотинга. В некоторых случаях при получении первичного положительного результата в ИФА подтвердить его в иммуноблотинге можно только через 2-3 нед.
| Таблица 9.3. Пример мониторинга сероконверсии (по Н.Fleury, 2000) | |||||
| Момент определения | Антиген р24, пг/мл | Антитела к белкам ВИЧ | |||
| ИФА, ОП обр /ОП кр ** | Иммуноблотинг | ||||
| HIV DUO | Gen-screen | Uniform | |||
| Пациент 1 | |||||
| Первично | 17 | 1,24 | меньше 1 | меньше 1 | * |
| Через 4 дня | 67 | 1,36 | 1,85 | меньше 1 | - |
| Через 7 дней | * | 2,33 | 6,84 | меньше 1 | - |
| Через 2 дня | * | 6,77 | 15,0 | 4,8 | gp160 |
| Пациент 2 | |||||
| Первично | 400 | 13 | меньше 1 | меньше 1 | - |
| Через 5 дней | 450 | 18 | 2,11 | меньше 1 | - |
| Через 10 дней | * | 33 | 12,19 | 2,9 | gp160 |
| Примечание: * - определение не проводились
** - отношение оптической плотности исследуемого образца сывороткм к критическому (пороговому) значению оптической плотности |
|||||
При обследовании больных ВИЧ-инфекцией (ВИЧ-инфицированных) с использованием тест-систем иммуноблотинга ведущих фирм мира во всех случаях выявляются антитела к gp160 и р24/25, к другим белкам антитела обнаруживают в 38,8-93,3% случаев (табл. 9.4 [показать] ).
Трудности с выявлением антител у больных ВИЧ-инфекцией могут возникнуть в периоды массивной виремии и антигенемии, когда имеющиеся специфические антитела в крови связаны с вирусными частицами, и репликативный процесс опережает наработку новых противовирусных антител. Такая ситуация может возникать и исчезать в течение инфекционного процесса .
У пациентов с исходно ослабленной иммунной системой виремия и антигенемия появляются раньше и сохраняются на высоком уровне до исхода заболевания. У таких больных отмечается низкое содержание свободных антител к ВИЧ, обусловленное двумя причинами - недостаточной продукцией антител В-лимфоцитами и связыванием антител вирионами и растворимыми белками ВИЧ, поэтому для определения инфицированности требуются тест-системы с повышенной чувствительностью или модификации методов анализа, предусматривающие этап высвобождения антител из иммунных комплексов .
Наиболее часто снижение содержания антител к ВИЧ по указанным причинам происходит в терминальной стадии, когда антитела к ВИЧ в сыворотке кроим могут не улавливаться не с помощью методов иммуноферментного анализа, ни метода иммумоблотинга (Western blot). Кроме появления специфических антител к ВИЧ иммунный ответ в первые 4 мес характеризуется снижением содержания в крови инфицированного CD4+- и увеличением СD8+-клеток. Далее содержание клеток, несущих рецепторы СD4 и СD8, стабилизируется и остается неизменным в течение некоторого времени. Увеличение содержания СD8-лимфоцитов является защитной реакцией, т.к. клеточнозависимая цптотоксичность реализуется СD8+-лимфоцитами, которые направлены на уничтожение ВПЧ-инфицированных клеток. Вначале цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ) реагируют на регуляторный белок Nef вируса, что играет важную роль в снижении вирусной (РНК) нагрузки в плазме ВИЧ-инфицированного в первые месяцы. Затем формируется ответ ЦТЛ и к другим, в т.ч. структурным, белкам ВИЧ, в результате чего через 12 мес после заражения цптотоксический эффект значительно возрастает.
Схемы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции
С учетом приведенной динамики специфических маркеров ВИЧ-инфекции на практике целесообразно придерживаться следующих схем лабораторной диагностики у взрослых (рис. 9.8-9.10).
На схемах отражены три основных этапа первичной лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции:
- Скрининговый.
- Референтный.
- Экспертный.
Необходимость нескольких этапов лабораторной диагностики обусловлена прежде всего экономическими соображениями. Так, например, стоимость проведения с помощью отечественных тест-систем одного экспертного исследования методом иммуноблотинг составляет до 40 долларов США, скринингового (методом ИФА) - около 0,2, то есть соотношение составляет 1:200.
На первом этапе (рис. 9.8) у обследуемых проводится определение антител к ВИЧ с помощью одной иммуноферментной тест-системы, предназначенной для детекции антител к обоим типам вируса - ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Фирмами-производителями в предлагаемых тест-системах в качестве антигенной основы используются вирусный лизат, рекомбинантные белки, синтетические пептиды. Каждый из перечисленных носителей антигенных детерминант ВИЧ обладает своими достоинствами и недостатками. Поэтому при выборе тест-систем приблизительно равной стоимости следует предпочитать наборы с наибольшей чувствительностью (желательно 100%). Среди тест-систем одинаковой стоимости и чувствительности целесообразно остановиться на имеющих максимальную специфичность.
На основе лизата вируса были созданы первые тест-системы для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. В 80-х годах такие тест-системы характеризовались чувствительностью менее 100% и низкой специфичностью, проявляющейся большим количеством (до 60%) ложноположительных результатов.
При формировании вириона в культуре лимфоцитов его оболочка создается из наружной мембраны и поэтому содержит антигены главного комплекса гистосовместимости I и II классов. Это обстоятельство обусловливает ложно-положительные реакции в том случае, если в крови пациентов присутствуют антитела к аллоантигенам гистосовместимости.
Позднее для получения вируса было предложено использовать культуру макрофагов, в которых вирусные частицы формируются преимущественно внутриклеточно путем почкования не от наружной мембраны клетки, а от мембран эндоплазматического ретикулума. Такая технология позволила снизить количество ложноположительных результатов.
Одними из лучших по самым важным характеристикам - чувствительности и специфичности - признаны иммуноферментные тест-системы, в составе которых использована комбинация очищенного вирусного лизата с синтетическими пептидами, представляющими собой наиболее антигензначимые участки белков вируса, или рекомбинантными белками.
Чувствительность тест-системы зависит также и от характеристик других компонентов наборов. Так, тест-системы, в которых использованы конъюгаты, распознающие антитела не только класса IgG, но и IgM, и IgА, позволяют выявлять более раннюю фазу сероконверсии. Перспективным представляется применение тест-систем, с помощью которых можно одновременно определять и противовирусные антитела, и антиген р24, что делает еще более ранней лабораторную диагностику ВИЧ-инфекции.
Первичный положительный результат необходимо перепроверять повторным исследованием образца в той же тест-системе, но желательно другой серии и другим лаборантом. Если при повторном исследовании получен отрицательный результат, исследование проводится третий раз.
После подтверждения положительного результата желательно осуществить повторное взятие крови и исследовать ее на антитела к ВИЧ как первичную. Повторное взятие крови позволяет предупредить ошибку, обусловленную неточностью маркировки пробирок и заполнения бланков направлений.
Серопозитивная на скрининговом этапе сыворотка крови направляется на референтные исследования, выполняемые с использованием двух-трех высокоспецифичных ИФА тест-систем. В случае двух положительных результатов проводят экспертное исследование методом иммуноблотинга.
Применение в референтной диагностике иммуноферментных тест-систем, с помощью которых можно дифференцировать специфические антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, облегчает дальнейшую работу и позволяет исследовать позитивный образец на экспертном этапе сразу с использованием соответствующего иммуноблотинга (ВИЧ-1 или ВИЧ-2).
Лабораторное экспертное заключение об инфицированности ВИЧ выносится только на основании положительного результата иммуноблотинга (Western blot). При проведении экспертной диагностики необходимо пользоваться предложенными в 1990 г. группой экспертов ВОЗ номенклатурой генов и генных продуктов ВИЧ (табл. 9.5 [показать] ).
Специфичность полос на иммуноблоте следует оценивать очень внимательно и тщательно, используя при этом результаты исследований контрольных сывороток (положительной и отрицательной), которые проводятся параллельно с исследованием опытных проб, и образец иммуноблота с обозначением белков ВИЧ (прилагается фирмой-производителем к тест-системе). Интерпретацию полученных результатов следует проводить согласно прилагаемой к тест-системе инструкции. Как правило, критерием позитивности является обязательное наличие антител к двум белкам (предшественнику, наружному или трансмембранному), кодируемым геном env, и возможное присутствие антител к продуктам двух других структурных генов ВИЧ - gag и pol (табл. 9.6 [показать] ).
| Таблица 9.6. Критерии интерпретации результатов иммуноблотинга для ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (ВОЗ, 1990) | |||
| Результат | ВИЧ-1 | ВИЧ-2 | |
| Положительный | +/- полосы pol +/- полосы gag | 2 полосы env (предшественник, наружный gр или трансмембранный gp) +/- полосы pol +/- полосы gag |
|
| Отрицательный | Отсутствие ВИЧ-1 специфических полос | Отсутстпне ВИЧ-2 специфических полос | |
| Неопределенный | Другие профили, не рассматриваемые как позитивные или негативные | ||
В случае получения сомнительного результата необходимо пользоваться перечнем рекомендации для окончательного выяснения результатов иммуноблотинга (табл. 9.7 [показать] ).
| Таблица 9.7. Рекомендации для окончательного выяснения неопределенных результатов иммуноблотинга (ВОЗ, 1990) | |
| Наличие полос, соответствующих белкам ВИЧ | Интерпретация результата, дальнейшие действия |
| ВИЧ-1 | |
| Только р17 | |
| Только р24 и gp160 | Столь необычная картина может иметь место в начале сероконверсии. Следует провести немедленное повторное исследование образца. В случае получения того же профиля, необходимо через 2 нед после взятия 1-й пробы взять второй образец для тестирования в иммуноблотинге |
| Другие профили | Эти профили (gag и/или роl без env) могут свидетельствовать о сероконверсии или неспецифнческих реакциях |
| ВИЧ-2 | |
| Только р16 | Может классифицироваться как отрицательный, дополнительных определений не требует |
| I полоса env при наличии или отсутствии gag/роl | Следует провести повторное тестирование того же образца, но с использованием другой серии реагентов |
| Только р24 или gp140 | Этот необычный профиль может иметь место в начале сероконверсии. Следует провести немедленное повторное исследование образца. В случае получения того же профиля, через 2 нед после взятия 1-й пробы необходимо взять второй образец для тестирования в иммуноблотинге |
| Другие профили | Эти профили (gag и/или роl без env) могут свидетельствовать о сероконверсии или неспецифических реакциях. |
По рекомендациям Российского научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИД, положительным считается результат при наличии антител хотя бы к одному из белков gp41, gp120, gp160 в сочетании с антителами к другим специфическим белкам ВИЧ-1 или без них . Настоящие рекомендации сделаны па основании опыта работы с сыворотками детей из внутрибольничных очагов, у которых часто определялись антитела только к одному из белков оболочки вируса.
Основная часть первично обследованных серопозитивных в ИФА пациентов относится к фазе персистируюшей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) или к бессимптомной фазе. Поэтому на иммуноблоте (нитроцеллюлозной полоске, на которой иммобилизованы белки ВИЧ) определяется, как правило, следующая комбинация антител к ВИЧ-1: антитела к оболочечным белкам gp160, gp120 и gp41, кодируемым геном env, в сочетании с антителами к сердцевинным белкам р24 (белок нуклеокапсида, кодируемый геном gag) и р31/34 (эндонуклеаза, кодируемая геном pol).
Положительные реакции только с белками gag и/или роl могут иметь место в случае ранней фазы сероконверсии, а также указывать на инфекцию, вызванную ВИЧ-2, или неспецифическую реакцию.
В случае получения сомнительного результата возможно использование различных методических приемов, позволяющих уточнить факт ВИЧ-инфекции.
В зависимости от технических возможностей (наличия диагностических наборов и реактивов, оснащенности специальной аппаратурой и подготовки персонала) экспертной лаборатории проводят дополнительные диагностические исследования (рис.9.10).
В ряде случаев целесообразно применение молекулярно-генетических методов, позволяющих определить генетические последовательности ВИЧ в сыворотке, в лимфоцитах крови или пунктатах лимфоузлов. Проверку специфичности последовательностей ДНК, полученных в результате ПЦР, можно провести методом гибридизации нуклеиновых кислот со специфическими ДНК-зондами.
Методы радиоиммунопреципитации (РИП) и непрямой иммунофлюоресценции (ИФл) могут быть также использованы для окончательной верификации сывороток с сомнительными результатами в иммуноблотинге .
Обнаружение РНК ВИЧ в плазме крови качественным или количественным методом не является значимым для диагностики инфекции ВИЧ. Такой результат должен быть подтвержден стандартными методами, такими как иммуноблотинг, через 2-4 мес после получения первичного сомнительного или отрицательного ответа.
Выделение ВИЧ в культуре клеток является истиной в последней инстанции. Однако метод сложен, дорог и выполняется только в специально оборудованных научно-исследовательских лабораториях.
Содержание СD4+ - клеток в крови является неспецифическим показателем, однако в спорных случаях (ИФА "+", иммуноблот "-", наличие клинических признаков ВИЧ-инфекции/СПИД) он может быть использован в качестве ориентира для принятия экспертного решения. Если же в лаборатории имеется возможность выполнения только иммуноблотинга, то следует придерживаться рекомендаций, изложенных в табл. 9.7 и на рис. 9.9.
Лица, при экспертном исследовании сыворотки которых получены сомнительные (неопределенные) результаты, за исключением случаев выявления антител только к р17 (ВИЧ-1) или р16 (ВИЧ-2), должны проходить повторное тестирование в течение 6 мес (через 3 мес). В случае истинной ВИЧ-инфекции по прошествии 3-6 мес в спектре антител наблюдают "положительную" динамику - дополнительное образование антител к другим белкам вируса. Ложная реакция характеризуется сохранением в течение длительного времени сомнительной картины иммунного блотинга или исчезновением подозрительных полос. Если по истечении указанного срока результаты повторного иммуноблотинга будут отрицательными или останутся сомнительными, то при отсутствии факторов риска, клинических симптомов или других факторов, связанных с ВИЧ-инфицированием, человек может считаться серонегативным в отношении антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Ложноположительные результаты, обусловленные содержанием в крови пациентов антител к аллоантигенам гистосовместимости, входящим в состав оболочки ВИЧ, проявляются на иммуноблоте в виде полос на уровне gp41 и gp31. Причины других неспецифических реакций (например, к р24, часто встречающейся у лиц с аутоиммунными процессами) пока не выяснены.
Совершенствование технологии производства иммунноферментных тест-систем позволило достичь высокой чувствительности - до 99,99%, в то время как чувствительность метода иммуноблотинга составляет 97%. Поэтому отрицательный резукльтат в иммуноблотинге при положительных результатах в ИФА может указывать на начальный период сероконверсии, характеризующийся низким уровнем специфических антител. Поэтому необходимо повторить исследование через 1,5-2 мес., то есть отрезок времени, необходимый для завершения сероконверсии, достижения в крови концентрации специфических антител, достаточной для выявления методом иммуноблотинга.
Положительный результат (результаты) исследования на референтном или только скрининговом этапе лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, то есть положительный результат в какой-либо иммуноферментной тест-системе, в итоге не подтвержденный экспертными методами, интерпретируется как наличие в крови обследуемого антител перекрестного реагирования. Под перекрестным реагированием подразумевают связывание антителами неспецифических участков на белках или пептидах ВИЧ, используемых в качестве антигенной основы в той тест-системе, в которой получен положительный результат.
При отсутствии иммунодефицита и клинических признаков ВИЧ-инфекции такие лица считаются серонегативными в отношении антител к ВИЧ и должны быть сняты с учета.
Окончательный диагноз ВИЧ-инфекцин устанавливается только на основании всех клинических, эпидемиологических и лабораторных данных. Сообщить пациенту диагноз инфицированности ВИЧ имеет право только лечащий врач.
Основным методом подтверждающей (экспертной) лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является иммуноблотинг. Однако, учитывая его более низкую по сравнению с ИФА чувствительность, рядом исследователей было предложено использование комбинации нескольких тест-систем для окончательного определения наличия специфических антител к ВИЧ. Так, например, G. van der Groen с соавт. предложили альтернативный иммуноблотингу способ проверки положительных результатов скринингового этапа лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Он предполагает исследование материала параллельно в трех тест-системах, которые основаны на различных методах детекции специфических антител к ВИЧ (несколько вариантов ИФА, реакция агглютинации) с использованием антигенов различной природы. Авторам удалось подобрать такие комбинации тест-систем, использование которых обеспечивает 100% чувствительность н специфичность при сравнении с результатами, полученными в иммуноблотинге.
Дешевизна такого метода экспертной диагностики является несомненным преимуществом, однако отсутствие информации, к каким конкретно белкам вируса имеются антитела в крови пациента, не позволяет оценивать специфичность реакции в каждом отдельном случае, а также отслеживать изменения спектра антител на ранней стадии сероконверсии.
Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, имеет свои особенности . С момента рождения в течение длительного времени (до 15 мес) в крови таких детей могут циркулировать материнские антитела к ВИЧ. Через плацентарный барьер проникают только иммуноглобулины класса IgG, поэтому выявление у ребенка специфических к ВПЧ нммупоглобулинов классов IgМ и IgA позволяет подтвердить инфицированность, но отрицательный результат не может свидетельствовать об отсутствии ВИЧ.
У детей в возрасте до 1 мес репликации ВПЧ еще нет, и единственным методом верификации является ПЦР. Определение антигена р24 у детей старше 1 мес также является подтверждающим методом.
Отсутствие антител к ВИЧ у новорожденных не означает, что вирус не проник через плацентарный барьер. В любом случае дети ВИЧ-инфицированных матерей подлежат лабораторно-диагностическому обследованию и наблюдению в течение 36 мес от рождения .
Результаты лабораторных исследований на маркеры ВИЧ-инфекции требуют осторожной интерпретации и должны рассматриваться только в совокупности с данными эпидемиологического и клинического обследований. С другой стороны, следует заметить, что несмотря на высокую чувствительность современных методов, отрицательные результаты исследований не могут полностью исключить наличие ВИЧ-инфекции. Поэтому отрицательный результат исследования, например, методом иммуноблотинга, может быть сформулирован только как отсутствие специфических антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Диагностика ВИЧ-инфекции у серонегативных больных
Качество тест-систем, применяемых в лабораторной диагностике ВИЧ-инфекции, с каждым годом улучшается, повышается их чувствительность. Однако высокая изменчивость ВИЧ может привести к появлению новых типов, антитела к которым могут быть не распознаны существующими тест-системами. Кроме того, известны случаи атипичного гуморального ответа иммунной системы организма-хозяина на вирус. Так, L.Montagnier в 1996 г. сообщил о двух больных СПИД, у которых на протяжении предшествующих нескольких лет не были выявлены в крови специфические антитела, диагноз поставлен на основе клинических данных и подтвержден лабораторно только выделением ВПЧ-1 в культуре клеток. В таких случаях необходимо использовать рекомендации ВОЗ, согласно которым клиническая диагностика ВИЧ-инфекции у взрослых и детей возможна при наличии одного из 12 СПИД-индикаторных заболеваний:
- кандидоз пищевода, трахеи, бронхов, легких;
- внелегочной криптококкоз;
- криптоспоридиоз с диареей более одного мес;
- цитомегаловирусное поражение какого-либо органа (за исключением и помимо печени, селезенки и лимфатических узлов у больного старше 1 мес):
- инфекция, обусловленная вирусом простого герпеса, персистирующая более 1 мес у больного старше 1 мес;
- лимфома головного мозга у больного моложе 60 лет;
- лимфоцитарная интерстициальная пневмония у ребенка до 13 лет;
- диссиминированная инфекция, вызванная бактериями группы Micobacterium avium intracellulare или M.Kansassii;
- пневмоцистная пневмония;
- прогрессирующая многоочаговая лейко-энцефалопатия;
- токсоплазмоз центральной нервной системы у больных старше 1 мес.
Наличие одного из этих заболеваний позволяет диагностировать ВИЧ-инфекцию при отсутствии возможности проведения лабораторного исследования крови на наличие антител к ВИЧ или даже при получении серонегативного результата.
Источник : Медицинская лабораторная диагностика, программы и алгоритмы. Под ред. проф. Карпищенко А.И., СПб, Интермедика, 2001