61. Reaksyon ng immunofluorescence. Mekanismo, mga bahagi, aplikasyon. Direkta at hindi direktang paraan ng pagtatakda.
Mayroong tatlong pangunahing uri ng pamamaraan: direkta, hindi direkta (Larawan 13.10), na may pandagdag. Ang reaksyon ng Koons ay isang mabilis na paraan ng diagnostic para sa pag-detect ng mga microbial antigens o pag-detect ng mga antibodies.
Direktang paraan ng RIF ay batay sa katotohanan na ang mga tissue antigen o microbes na ginagamot sa immune sera na may mga antibodies na may label na fluorochromes ay maaaring kumikinang sa mga sinag ng UV ng isang luminescent microscope.
Hindi direktang paraan ng RIF ay upang matukoy ang antigen-antibody complex gamit ang antiglobulin (anti-antibody) serum na may label na fluorochrome. Upang gawin ito, ang mga smear mula sa isang suspensyon ng mga microbes ay ginagamot ng mga antibodies ng antimicrobial rabbit diagnostic serum. Pagkatapos ay ang mga antibodies na hindi nakagapos ng mga microbial antigens ay hinuhugasan, at ang mga antibodies na natitira sa mga mikrobyo ay makikita sa pamamagitan ng paggamot sa smear na may antiglobulin (anti-rabbit) serum na may label na fluorochromes. Bilang resulta, nabuo ang isang kumplikadong microbe + antimicrobial rabbit antibodies + anti-rabbit antibodies na may label na fluorochrome. Ang kumplikadong ito ay sinusunod sa isang fluorescent microscope, tulad ng sa direktang pamamaraan.
Ang mga kumikinang na fluorochrome dyes (fluoriscein isothiocyanate, atbp.) ay ginagamit bilang isang label.
Mayroong iba't ibang mga pagbabago ng RIF. Para sa mga express diagnostic ng mga nakakahawang sakit - upang makita ang mga mikrobyo o ang kanilang mga antigen sa materyal ng pagsubok, ginagamit ang RIF ayon kay Koons.
Mayroong dalawang paraan ng RIF ayon kay Koons: direkta at hindi direkta.
Mga direktang bahagi ng RIF:
1) ang materyal na pinag-aaralan (isang pagdumi na pinaghihiwalay ng nasopharynx, atbp.);
2) may label na tiyak na immune serum na naglalaman ng AT-la sa nais na antigen;
3) isotonic sodium chloride solution.
Ang isang pahid mula sa materyal na pansubok ay ginagamot ng may label na antiserum.
Ang isang reaksyon ng AG-AT ay nangyayari. Luminescent microscopic na pagsusuri sa lugar kung saan ang AG-AT complexes ay naisalokal ay nagpapakita ng fluorescence - luminescence.
Mga hindi direktang bahagi ng RIF:
1) ang materyal na pinag-aaralan;
2) tiyak na antiserum;
3) antiglobulin serum (AT-la laban sa immunoglobulin) na may label na fluorochrome;
4) Isotonic sodium chloride solution.
Ang isang pahid mula sa materyal na pansubok ay unang ginagamot ng immune serum sa nais na antigen, at pagkatapos ay may label na antiglobulin serum.
Ang mga luminous na AG-AT complex - na may label na AT ay nakita gamit ang isang fluorescent microscope.
Ang bentahe ng hindi direktang paraan ay hindi na kailangang maghanda ng malawak na hanay ng fluorescent specific sera, at isang fluorescent antiglobulin serum lamang ang ginagamit.
Ang isang 4-component variety ng indirect RIF ay nakahiwalay din, kapag ang complement (guinea pig serum) ay ipinakilala din. Sa isang positibong reaksyon, nabuo ang isang AG-AT complex - may label na - AT-complement.
Sa kasalukuyan, malawakang ginagamit ang mga serological test (SR), kung saan ang mga may label na antigen o antibodies ay kasangkot. Kabilang dito ang immunofluorescence, radioimmunoassay, enzyme immunoassay, immunoblotting, flow cytometry, at electron microscopy.
Nag-aplay sila:
1) para sa serodiagnosis ng mga nakakahawang sakit, i.e. para sa pagtuklas ng mga antibodies gamit ang isang hanay ng mga kilalang conjugated (chemically combined) antigens na may iba't ibang mga label (enzymes, fluorochrome dyes);
2) upang matukoy ang microorganism o ang serovar nito gamit ang standard na may label na diagnostic antibodies (mabilis na diagnostics).
Ang diagnostic sera ay inihahanda sa pamamagitan ng pagbabakuna ng mga hayop na may naaangkop na antigen, pagkatapos ay ang mga immunoglobulin ay ihihiwalay at pinagsasama-sama ng mga makinang na tina (fluorochromes), enzymes, at radioisotopes.
Ang diagnostic monoclonal antibodies ay nakukuha gamit ang mga hybrid na selula na nabuo sa pamamagitan ng pagsasanib ng isang immune B-lymphocyte na may myeloma cell. Ang mga Hybridoma ay mabilis na dumami sa vitro sa cell culture at makagawa ng immunoglobulin na katangian ng kinuhang B-lymphocyte.
Ang mga may label na SR ay hindi mas mababa sa iba pang mga SR sa pagiging tiyak, at nilalampasan nila ang lahat ng mga SR sa kanilang pagiging sensitibo.
Immunofluorescence reaction (RIF)
Ang mga kumikinang na fluorochrome dyes (fluorescein isothiocyanate, atbp.) ay ginagamit bilang isang label.
Mayroong iba't ibang mga pagbabago ng RIF. Para sa express - diagnosis ng mga nakakahawang sakit - upang makita ang mga microbes o ang kanilang mga antigens sa test material, ginagamit ang RIF ayon kay Koons.
Mayroong dalawang paraan ng RIF ayon kay Koons: direkta at hindi direkta.
Mga direktang bahagi ng RIF:
1) ang materyal na pinag-aaralan (stool, discharge ng nasopharynx, atbp.);
2) may label na tiyak na immune serum na naglalaman ng mga antibodies sa nais na antigen;
3) isotonic sodium chloride solution.
Ang isang pahid mula sa materyal na pansubok ay ginagamot ng may label na antiserum.
Ang isang reaksyon ng AG-AT ay nangyayari. Ang luminescent microscopic na pagsusuri sa lugar kung saan naisalokal ang mga AG-AT complex ay nagpapakita ng fluorescence ng label (Larawan 34).
Mga bahagi hindi direktang RIF, na nilayon para sa mga express diagnostics ng influenza A:
1) naghuhugas ng materyal sa pagsubok mula sa nasopharynx ng isang pasyente na may pinaghihinalaang trangkaso;
2) tiyak na antiserum na may mga antibodies laban sa influenza A virus;
3) antiglobulin serum (AT laban sa immunoglobulin) na may label na fluorochrome;
4) isotonic sodium chloride solution.
Ang isang pahid mula sa materyal na pansubok ay unang ginagamot ng immune serum sa nais na antigen, at pagkatapos ay may label na antiglobulin serum.
Ang mga immune complex na AG-AT - may label na AT ay nakita gamit ang isang fluorescent microscope.
Ang bentahe ng hindi direktang paraan ay hindi na kailangang maghanda ng malawak na hanay ng fluorescent specific sera, at isang fluorescent antiglobulin serum lamang ang ginagamit.
Para sa serological diagnosis ng influenza A, ibig sabihin, upang makita ang mga antibodies laban sa influenza A virus sa paggamit ng serum ng dugo hindi direktang RIF gumamit ng influenza diagnosticum (influenza A virus antigen). Ang serodiagnosis ng mga impeksyon sa viral ay higit sa lahat ay retrospective at ginagamit upang kumpirmahin ang diagnosis at epidemiological analysis.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): mapagkumpitensyang paraan (pagtukoy ng HBs-AG ng hepatitis B virus) at hindi direktang paraan (serological diagnosis ng HIV infection)
Enzyme immunoassay (ELISA)
Ang mga enzyme ay ginagamit bilang isang label: peroxidase, alkaline phosphatase, atbp.
Ang tagapagpahiwatig ng reaksyon ay ang kakayahan ng mga enzyme na magdulot ng mga reaksyon ng kulay kapag nakalantad sa naaangkop na substrate. Halimbawa, ang substrate para sa peroxidase ay isang solusyon ng orthophenyldiamine (OPD) o tetramethylbenzidine (TMB).
Ang pinaka-tinatanggap na ginagamit na solid-phase na ELISA (Larawan 35), hindi direkta at mapagkumpitensyang mga pamamaraan (Larawan 36).
Ang mga resulta ng ELISA ay maaaring masuri nang biswal at sa pamamagitan ng pagsukat ng optical density sa isang spectrophotometer (ELISA analyzer).
Ang mga benepisyo ng ELISA ay kinabibilangan ng:
Ang pagiging simple ng mga pamamaraan ng pagsusuri ng tugon;
Katatagan ng conjugates;
Madaling pumayag sa automation.
Ang mga sumusunod na uri ng ELISA ay ibinigay bilang mga halimbawa:
A) uri ng mapagkumpitensya
Idinisenyo upang makita ang antigen sa ibabaw ng hepatitis B virus (HBs Ag) sa serum at plasma sa diagnosis ng viral hepatitis B at matukoy ang pagdadala ng HBs Ag.
Mga Bahagi:
1) materyal ng pagsubok - suwero o plasma ng dugo;
2) antibodies sa HBs Ag adsorbed sa ibabaw ng isang balon ng isang polystyrene microplate;
3) conjugate - mouse monoclonal antibodies sa HBs Ag na may label na peroxidase;
4) orthophenylenediamine (OPD) - substrate;
5) phosphate-saline buffer;
6) control sera:
Positibo (serum na may HBs Ag);
Negatibo (serum na walang HBs Ag).
Pag-unlad:
2. Incubation 1 oras sa 37°C.
3. Paghuhugas ng mga balon.
4. Pagpapakilala ng conjugate.
5. Incubation 1 oras sa 37°C.
6. Paghuhugas ng mga balon.
7. Pagpapakilala ng OFD. Sa pagkakaroon ng HBs Ag, ang solusyon sa mga balon ay nagiging dilaw.
8. Ang accounting para sa ELISA ay isinasagawa sa pamamagitan ng optical density gamit ang isang photometer. Ang antas ng optical density ay magiging inversely proportional sa konsentrasyon ng inimbestigahan na HBs Ag.
Ang reaksyon ay nagpapatuloy sa tatlong yugto:
1. Ang HBs Ag ng pinag-aralan na serum (plasma) ay nagbubuklod sa mga homologous antibodies na na-adsorb sa ibabaw ng balon. Ang IR AG-AT ay nabuo. (HBs Ag - anti HBs AT).
2. Ang mga antibodies sa HBs Ag na may label na peroxidase ay nagbubuklod sa natitirang libreng HBs Ag determinants ng AG-AT complex. Isang complex ng AT-AG na may label na AT (anti HBs AT - HBs Ag - anti HBs AT na may label na peroxidase) ay nabuo.
3. Nakikipag-ugnayan ang OPD sa peroxidase ng AT-AG-AT complex at nangyayari ang yellow staining.
B) hindi direktang uri
Ito ang pangunahing reaksyon sa pagsubok para sa diagnosis ng impeksyon sa HIV.
Layunin: Serological diagnosis ng HIV infection - pagtuklas ng mga antibodies sa HIV antigens.
Mga Bahagi:
1) materyal sa pagsubok - serum ng dugo (AB hanggang AG-m HIV);
2) synthetic peptides na ginagaya ang 2 antigens ng HIV: gp 120 at gp 41, na-adsorbed sa ibabaw ng balon ng polystyrene;
3) peroxidase-labeled antiglobulin serum na nakuha sa pamamagitan ng pagbabakuna ng mga kuneho na may human globulins (AT hanggang AT);
5) phosphate-buffered saline;
6) control sera:
positibo;
Negatibo.
Pag-unlad:
1. Pagpapakilala ng control at test sera.
2. Incubation 30 minuto sa 37°C.
3. Paglalaba.
4. Pagpapakilala ng enzyme-labeled antiglobulin serum.
5. Incubation 30 minuto sa 37°C.
6. Paglalaba.
7. Pagpapakilala ng OFD.
Ang reaksyon ay nagpapatuloy sa 3 yugto:
1. Ang mga antibodies sa HIV ng pinag-aralan na serum ay nagbubuklod sa mga homologous antigens (gp 120 at gp 41), at ang IR AG-AT (HIV AG - AT sa HIV) ay nabuo sa ibabaw ng sorbent.
2. Pagbubuo ng IC AG-AT-AT na may label na peroxidase, dahil Ang mga antibodies ng pinag-aralan na suwero ay mga antigen para sa antiglobulin serum.
3. Nakikipag-ugnayan ang OPD sa peroxidase ng AG-AT-AT complex, at nangyayari ang dilaw na kulay ng solusyon sa balon. Ang antas ng aktibidad ng enzymatic ay direktang proporsyonal sa konsentrasyon ng mga pinag-aralan na antibodies.
Immunofluorescent method (RIF, immunofluorescence reaction, Koons reaction) ay isang paraan para sa pag-detect ng mga partikular na antigen gamit ang mga antibodies na pinagsama-sama ng fluorochrome. Ito ay may mataas na sensitivity at specificity.
Ginagamit ito para sa pagpapahayag ng mga diagnostic ng mga nakakahawang sakit (pagkilala ng pathogen sa materyal ng pagsubok), pati na rin para sa pagpapasiya ng mga antibodies at mga receptor sa ibabaw at mga marker ng leukocytes (immunophenotyping) at iba pang mga cell.
Ang pagtuklas ng bacterial at viral antigens sa mga nakakahawang materyales, tissue ng hayop, at cell culture gamit ang fluorescent antibodies (sera) ay malawakang ginagamit sa diagnostic practice. Ang paghahanda ng fluorescent sera ay batay sa kakayahan ng ilang fluorochromes (halimbawa, fluorescein isothiocyanate) na pumasok sa isang kemikal na bono na may mga serum na protina nang hindi nilalabag ang kanilang immunological specificity.
Mayroong tatlong uri ng pamamaraan: direkta, hindi direkta, na may pandagdag. Ang direktang paraan ng RIF ay batay sa katotohanan na ang mga tissue antigens o microbes na ginagamot sa immune sera na may mga antibodies na may label na mga fluorochromes ay maaaring kumikinang sa mga sinag ng UV ng isang fluorescent microscope. Ang mga bakterya sa isang smear, na ginagamot ng tulad ng isang luminescent serum, ay kumikinang sa paligid ng cell sa anyo ng isang berdeng hangganan.
Ang hindi direktang paraan ng RIF ay binubuo sa pagtukoy sa antigen-antibody complex gamit ang antiglobulin (anti-antibody) serum na may label na fluorochrome. Upang gawin ito, ang mga smear mula sa isang suspensyon ng mga microbes ay ginagamot ng mga antibodies ng antimicrobial rabbit diagnostic serum. Pagkatapos ay ang mga antibodies na hindi nakagapos ng mga microbial antigens ay hinuhugasan, at ang mga antibodies na natitira sa mga mikrobyo ay makikita sa pamamagitan ng paggamot sa smear na may antiglobulin (anti-rabbit) serum na may label na fluorochromes. Bilang resulta, nabuo ang isang kumplikadong microbe + antimicrobial rabbit antibodies + anti-rabbit antibodies na may label na fluorochrome. Ang kumplikadong ito ay sinusunod sa isang fluorescent microscope, tulad ng sa direktang pamamaraan.
Mekanismo. Sa isang glass slide, ang isang smear ay inihanda mula sa materyal na pagsubok, na naayos sa isang apoy at ginagamot sa immune rabbit serum na naglalaman ng mga antibodies laban sa mga pathogen antigens. Upang bumuo ng isang antigen-antibody complex, ang paghahanda ay inilalagay sa isang mamasa-masa na silid at inilublob sa 37 °C sa loob ng 15 minuto, pagkatapos nito ay lubusan itong hugasan ng isotonic sodium chloride solution upang alisin ang mga antibodies na hindi nakagapos sa antigen. Pagkatapos, ang isang fluorescent antiglobulin serum laban sa mga globulin ng kuneho ay inilapat sa paghahanda, na incubated para sa 15 minuto sa 37 ° C, at pagkatapos ay ang paghahanda ay lubusan na hugasan ng isotonic sodium chloride solution. Bilang isang resulta ng pagbubuklod ng fluorescent antiglobulin serum na may mga tiyak na antibodies na naayos sa antigen, ang mga luminous na antigen-antibody complex ay nabuo, na napansin ng fluorescent microscopy.
4. 75 mt/m3 ng streptococcus, 12 mt/m3 ng staphylococcus at 1 mt/m3 ng tuberculosis bacteria ay natagpuan sa hangin ng silid-tulugan ng mga bata ng nursery. Magbigay ng sanitary-bacteriological assessment ng hangin at magbalangkas ng plano para sa sanitasyon nito.
TICKET SA PAGSUSULIT Blg. _54
Mga retrovirus. HIV infection (AIDS) at mga pathogens nito.
Ang human immunodeficiency virus ay nagdudulot ng impeksyon sa HIV, na nagreresulta sa pagbuo ng acquired immune deficiency syndrome.
Ang causative agent ng HIV infection ay isang lymphotropic virus na kabilang sa Retroviridae family ng Lentivirus genus.
Morphological properties: RNA-containing virus. Partikulo ng virus na spherical na hugis Ang shell ay binubuo ng isang double layer ng lipids na natagos ng glycoproteins. Ang lipid envelope ay nagmula sa plasma membrane ng host cell kung saan ang virus ay nagpaparami. Ang glycoprotein molecule ay binubuo ng 2 subunits na matatagpuan sa ibabaw ng virion at tumatagos sa lipid envelope nito.
Ang core ng virus ay hugis-kono at binubuo ng mga capsid protein, isang bilang ng matrix proteins at protease proteins. Ang genome ay bumubuo ng dalawang hibla ng RNA; upang maisagawa ang proseso ng pagpaparami, ang HIV ay may reverse transcriptase, o reversetase.
Ang genome ng virus ay binubuo ng 3 pangunahing structural genes at 7 regulatory at functional genes. Ang mga functional na gene ay gumaganap ng mga function ng regulasyon at tinitiyak ang pagpapatupad ng mga proseso ng pagpaparami at ang paglahok ng virus sa nakakahawang proseso.
Ang virus ay pangunahing nakakaapekto sa T- at B-lymphocytes, ilang mga cell ng monocytic series (macrophages, leukocytes), mga cell ng nervous system.
Mga katangian ng kultura: sa kultura ng cell ng T-lymphocytes at monocytes ng tao (sa pagkakaroon ng IL-2).
Antigenic na istraktura: 2 uri ng virus - HIV-1 at HIV-2 HIV-1, ay may higit sa 10 genotypes (subtypes): A, B, C, D, E, F ..., naiiba sa komposisyon ng amino acid ng mga protina.
Ang HIV-1 ay nahahati sa 3 grupo: M, N, O. Karamihan sa mga isolates ay kabilang sa M group, kung saan 10 subtype ang nakikilala: A, B, C, D, F-l, F-2, G, H, I, K. Paglaban : Sensitibo sa pisikal at kemikal na mga kadahilanan, namamatay kapag pinainit. Ang virus ay maaaring magpatuloy nang mahabang panahon sa isang tuyo na estado, sa pinatuyong dugo.
Pathogenicity factor, pathogenesis: Ang virus ay nakakabit sa lymphocyte, tumagos sa cell at nagpaparami sa lymphocyte. Bilang resulta ng pagpaparami ng HIV sa isang lymphocyte, ang huli ay nawasak o nawawala ang kanilang mga functional na katangian. Bilang resulta ng pagpaparami ng virus sa iba't ibang mga selula, ito ay naipon sa mga organo at tisyu, at ito ay matatagpuan sa dugo, lymph, laway, ihi, pawis, at dumi.
Sa impeksyon sa HIV, ang bilang ng mga T-4 lymphocytes ay bumababa, ang B-lymphocyte function ay may kapansanan, ang natural na killer function ay pinipigilan at ang pagtugon sa antigens ay nababawasan at ang produksyon ng mga pandagdag, lymphokines at iba pang mga kadahilanan na kumokontrol sa immune functions (IL) ay nagambala, na nagreresulta sa dysfunction ng immune system.
Klinika: apektado ang sistema ng paghinga (pneumonia, brongkitis); CNS (abscesses, meningitis); Gastrointestinal tract (pagtatae), malignant neoplasms (tumor ng internal organs) ay nangyayari.
Ang impeksyon sa HIV ay nagpapatuloy sa ilang yugto: 1) panahon ng pagpapapisa ng itlog, na may average na 2-4 na linggo; 2) ang yugto ng mga pangunahing pagpapakita, na nailalarawan sa simula ng matinding lagnat, pagtatae; ang yugto ay nagtatapos sa isang asymptomatic phase at ang pagtitiyaga ng virus, ang pagpapanumbalik ng kagalingan, gayunpaman, ang HIV antibodies ay nakita sa dugo, 3) ang yugto ng pangalawang sakit, na ipinakita sa pamamagitan ng pinsala sa respiratory, nervous system. Ang impeksyon sa HIV ay nagtatapos sa huling, ika-4 na yugto ng terminal - AIDS.
Microbiological diagnostics.
Ang mga pag-aaral sa virological at serological ay kinabibilangan ng mga pamamaraan para sa pagtukoy ng mga antigen at antibodies ng HIV. Para dito, ginagamit ang ELISA, IB at PCR. Ang sera ng mga pasyenteng may HIV-1 at HIV-2 ay naglalaman ng mga antibodies sa lahat ng mga viral protein. Gayunpaman, upang kumpirmahin ang diagnosis, tinutukoy ang mga antibodies sa gp41, gpl20, gpl60, p24 na protina sa HIV-1 at mga antibodies sa gp36, gpl05, gpl40 sa HIV-2. Lumalabas ang mga antibodies sa HIV 2-4 na linggo pagkatapos ng impeksyon at makikita sa lahat ng yugto ng HIV.
Paraan para sa pag-detect ng virus sa dugo, mga lymphocytes. Gayunpaman, sa anumang positibong sample, isang reaksyon ng IB ang inilalagay upang kumpirmahin ang mga resulta. Ginagamit din ang PCR, na maaaring makakita ng impeksyon sa HIV sa incubation at maagang klinikal na panahon, ngunit ang sensitivity nito ay bahagyang mas mababa kaysa sa ELISA.
Ang mga klinikal at serological na diagnosis ay kinumpirma ng immunological na pag-aaral kung ipinapahiwatig nila ang pagkakaroon ng immunodeficiency sa sinusuri na pasyente.
Diagnostic ELISA test system para sa pagtukoy ng mga antibodies sa HIV - kasama ang viral antigen na na-adsorb sa isang carrier, mga antibodies laban sa Ig ng tao. Ginagamit para sa AIDS serodiagnosis.
Paggamot: paggamit ng reverse transcriptase inhibitors na kumikilos sa mga activated cell. Ang mga gamot ay thymidine derivatives - azidothymidine at phosphazide.
Pag-iwas. Tukoy - hindi.
Impluwensya ng pisikal at kemikal na mga kadahilanan sa mga mikrobyo. Mutation at ang kahalagahan nito para sa praktikal na gamot. Mga halimbawa. Ang halaga ng ekolohiya.
Pagkilos ng mga kemikal at biyolohikal na kadahilanan.
Pagkilos ng mga kemikal
Maaaring pigilan o ganap na pigilan ng mga kemikal ang paglaki ng mga mikroorganismo. Kung ang isang kemikal ay pumipigil sa paglaki ng bakterya, ngunit pagkatapos ng pagtanggal, ang kanilang paglago ay magpapatuloy.
Ang mga ahente ng antimicrobial, na isinasaalang-alang ang kemikal na istraktura at mekanismo ng kanilang bactericidal na pagkilos sa bakterya, ay maaaring nahahati sa mga sumusunod na grupo: mga ahente ng oxidizing, halogens, metal compound, acid at alkalis, surfactant, alkohol, tina, phenol at formaldehyde derivatives.
Mga oxidizer. Kasama sa pangkat na ito ang hydrogen peroxide at potassium permanganate.
Halogens. Chlorine, yodo at ang kanilang mga paghahanda: bleach, chloramine B, pantocid, alcohol iodine solution 5%, iodinol, iodoform.
Mga compound ng mabibigat na metal (mga asin ng lead, tanso, sink, pilak, mercury; organometallic silver compounds: protargol, collargol). Ang mga compound na ito ay maaaring magkaroon ng parehong antimicrobial at magkakaibang lokal na epekto sa mga tisyu ng macroorganism.
Mga acid at alkalis. Ang pagkilos ng bactericidal ng mga acid at alkalis ay batay sa pag-aalis ng tubig ng mga microorganism, mga pagbabago sa pH ng nutrient medium, hydrolysis ng mga colloidal system, at ang pagbuo ng acidic o alkaline albuminates.
Ang mga tina ay may mga katangian upang pigilan ang paglaki ng bakterya. Mabagal silang kumilos ngunit mas pinipili.
Ang formaldehyde ay isang walang kulay na gas. Sa pagsasagawa, isang 40% aqueous solution ng formaldehyde (formalin) ang ginagamit. Ang formaldehyde na puno ng gas at natunaw sa tubig ay may masamang epekto sa mga vegetative at spore form ng bacteria.
Pagkilos ng mga biological na kadahilanan
Ang pagkilos ng mga biological na kadahilanan ay ipinakita lalo na sa antagonism ng mga mikrobyo, kapag ang mga produktong basura ng ilang mga mikrobyo ay nagdudulot ng pagkamatay ng iba.
Antibiotics (mula sa salitang Griyego na anti - laban, bios - buhay) - mga biologically active substance na nabuo sa panahon ng buhay ng fungi, bacteria, hayop, halaman at nilikha synthetically, na may kakayahang piliing sugpuin at patayin ang mga microorganism, fungi, rickettsiae, malalaking virus, protozoa at mga indibidwal na helminth.
3. Ang reaksyon ng biological na aktibidad ng bacterial enzymes sa rayuma, diagnostic at praktikal na kahalagahan, ang proteksiyon na papel ng mga antibodies laban sa mga enzyme sa nakuha na kaligtasan sa sakit (pagpapasiya ng anti-hyaluronidase at anti-O-streptolysin).
Ang rayuma ay isang karaniwang nakakahawang-allergic na sakit na nakakaapekto sa nag-uugnay na tisyu, pangunahin ang cardiovascular system, pati na rin ang mga joints, internal organs, at ang central nervous system. Ito ay pinaniniwalaan na ang sanhi ng pag-unlad ng rayuma ay ang pag-activate ng mga pathogenic microorganism, pangunahin ang grupo A beta-hemolytic streptococcus. Siya ang gumaganap ng pangunahing papel sa etiology at pathogenesis ng rheumatic disease. Una, ang sakit ay bubuo laban sa background ng isang impeksyon sa streptococcal. Pangalawa, ang isang malaking bilang ng mga antibodies sa mga microorganism ng pangkat na ito ay matatagpuan sa dugo ng mga pasyente. Pangatlo, ang pag-iwas sa sakit ay matagumpay na isinasagawa gamit ang mga antibacterial na gamot.
Sa rheumatoid arthritis, ang mga synovial membrane, para sa hindi kilalang mga kadahilanan, ay naglalabas ng malaking halaga ng enzyme na glucose-6-phosphate dehydrogenase, na sumisira din sa mga disulfide bond sa cell membrane. Sa kasong ito, mayroong "leakage" ng proteolytic enzymes mula sa cellular lysosomes, na nagdudulot ng pinsala sa mga kalapit na buto at kartilago. Tumutugon ang katawan sa pamamagitan ng paggawa ng mga cytokine, na kinabibilangan din ng tumor necrosis factor α TNF-α. Ang mga kaskad ng mga reaksyon sa mga selula, na na-trigger ng mga cytokine, ay lalong nagpapalala sa mga sintomas ng sakit. Ang talamak na rheumatoid na pamamaga na nauugnay sa TNF-α ay kadalasang nagdudulot ng pinsala sa kartilago at magkasanib na humahantong sa pisikal na kapansanan.
Ginagamit ng pamamaraang ito ang phenomenon ng luminescence.
Ang kakanyahan ng kababalaghan ng luminescence ay nakasalalay sa katotohanan na kapag ang iba't ibang uri ng enerhiya (ilaw, elektrikal, atbp.) ay hinihigop ng mga molekula ng ilang mga sangkap, ang kanilang mga atomo ay napupunta sa isang nasasabik na estado, at pagkatapos, bumalik sa kanilang orihinal na estado. , naglalabas ng hinihigop na enerhiya sa anyo ng liwanag na radiation.
Sa RIF, luminescence ay nagpapakita ng sarili sa anyo ng fluorescence - ito ay isang glow na nangyayari sa sandali ng pag-iilaw na may kapana-panabik na liwanag at huminto kaagad pagkatapos na ito ay natapos.
Maraming mga sangkap at mga nabubuhay na mikroorganismo ay may sariling pag-ilaw (ang tinatawag na pangunahin), ngunit ang intensity nito ay napakababa. Ang mga sangkap na may matinding pangunahing pag-ilaw at ginagamit upang magbigay ng mga katangian ng fluorescent sa mga di-fluorescent na sangkap ay tinatawag na fluorochromes. Ang ganitong sapilitan na pag-ilaw ay tinatawag na pangalawa.
Upang pukawin ang fluorescence sa fluorescent microscopy, ang ultraviolet o blue-violet na bahagi ng spectrum (wavelength 300-460 nm) ay kadalasang ginagamit. Para sa mga layuning ito, ang mga laboratoryo ay may luminescent microscope ng iba't ibang mga modelo - ML-1-ML-4, "Lumam".
Sa virological practice, dalawang pangunahing paraan ng fluorescent microscopy ang ginagamit: fluorochromization at fluorescent antibodies (o RIF).
Fluorochromization- ito ang paggamot ng mga paghahanda na may fluorochrome upang mapataas ang lakas at kaibahan ng kanilang luminescence. Ang pinakamalaking interes ay ang fluorochrome acridine orange, na nagiging sanhi ng polychromatic fluorescence ng mga nucleic acid. Kaya, kapag ang mga paghahanda ay ginagamot sa fluorochrome na ito, ang deoxyribonucleic acid ay lumiliwanag nang maliwanag sa berde, at ribonucleic acid - ruby red.
Ang pamamaraan ng RIF ay binubuo sa katotohanan na ang mga antibodies na konektado sa isang fluorochrome ay nagpapanatili ng kakayahang pumasok sa isang tiyak na relasyon sa isang homologous antigen. Ang nagreresultang antigen + antibody complex, dahil sa pagkakaroon ng fluorochrome sa loob nito, ay nakita sa ilalim ng isang fluorescent microscope ng isang katangian na glow.
Upang makakuha ng mga antibodies, ginagamit ang mataas na aktibong hyperimmune sera, kung saan ang mga antibodies ay nakahiwalay at may label na fluorochrome. Ang pinakakaraniwang ginagamit na fluorochromes ay ang FITC-fluorescein isothiocyanate (berdeng ilaw) at PCX-rhodamine sulfochloride (pulang ilaw). Ang isang antibody na may label na fluorochrome ay tinatawag na conjugate.
Ang paraan ng paghahanda at paglamlam ng mga paghahanda ay ang mga sumusunod:
- maghanda ng mga pahid, mga kopya mula sa mga organo o sa mga cover slip - isang nahawaang cell culture sa mga glass slide; Magagamit din ang mga histosection;
- ang mga paghahanda ay tuyo sa hangin at naayos sa pinalamig na acetone sa temperatura ng silid o sa minus 15 °C (mula 15 minuto hanggang 4-16 na oras);
- nabahiran ng direkta o hindi direktang pamamaraan; panatilihin ang mga tala sa ilalim ng isang fluorescent microscope ayon sa intensity ng glow, na tinatantya sa mga krus.
Sa parallel, maghanda at mantsa ng mga paghahanda mula sa isang malusog na hayop - kontrol.
Mayroong dalawang pangunahing paraan ng paglalapat ng fluorescent antibodies: direkta at hindi direkta.
Direktang pamamaraan (isang hakbang). Ang isang conjugate (fluorescent serum sa pinaghihinalaang virus) ay inilapat sa nakapirming paghahanda, na incubated sa loob ng 30 minuto sa temperatura na 37 ° C sa isang mahalumigmig na silid. Pagkatapos ang gamot ay hugasan mula sa hindi nakatali na conjugate na may asin (pH 7.2 - 7.5), pinatuyo sa hangin, inilapat ang hindi fluorescent na langis at sinusuri sa ilalim ng mikroskopyo.
Ang direktang paraan ay nagbibigay-daan sa pagtuklas at pagkakakilanlan ng antigen. Upang gawin ito, kailangan mong magkaroon ng fluorescent serum para sa bawat virus.
Hindi direktang pamamaraan (dalawang yugto). Ang isang walang label na serum na naglalaman ng mga antibodies sa pinaghihinalaang virus ay inilapat sa nakapirming paghahanda, na incubated sa loob ng 30 minuto sa 37 °C, ang mga hindi nakatali na antibodies ay nahuhugasan. Ang isang fluorescent na anti-species na serum ay inilalapat sa paghahanda, na naaayon sa uri ng hayop na gumagawa ng mga homologous na antiviral antibodies, at inilublob sa loob ng 30 minuto sa 37 °C. Pagkatapos ang gamot ay hugasan mula sa hindi nakatali na may label na mga antibodies, pinatuyo sa hangin, inilapat ang hindi fluorescent na langis at sinusuri sa ilalim ng isang fluorescent microscope.
Ang mga anti-species na sera ay nakukuha sa pamamagitan ng pagbabakuna sa mga hayop na may mga globulin ng mga species na nagsisilbing producer ng anti-viral antibodies. Kaya, kung ang mga antiviral antibodies ay nakuha sa mga kuneho, pagkatapos ay ginagamit ang fluorescent anti-rabbit serum.
Ang hindi direktang pamamaraan ay nagbibigay-daan hindi lamang upang makita at makilala ang antigen, ngunit din upang makita at matukoy ang titer ng antibody. Bilang karagdagan, ang pamamaraang ito ay maaaring makakita ng mga antigen ng iba't ibang mga virus na may isang solong may label na sera, dahil ito ay batay sa paggamit ng anti-species na sera. Mas karaniwang ginagamit ang anti-rabbit, anti-bovine, anti-horse sera at sera laban sa guinea pig globulin.
Maraming mga pagbabago ng hindi direktang pamamaraan ang binuo. Ang paraan ng paggamit ng pandagdag ay nararapat na bigyang pansin. Ang pamamaraan ay binubuo sa paglalapat ng inactivated non-fluorescent specific serum at guinea pig na pandagdag sa nakapirming paghahanda, pinapanatili ito ng 30 minuto sa 37 °C, paghuhugas nito, at upang makita ang antigen + antibody + complement complex, paglalapat ng fluorescent anti-complementary serum , pinapanatili ito ng 30 minuto sa 37 °C , hinugasan, pinatuyo sa hangin at sinuri sa ilalim ng fluorescent microscope.
Mga kalamangan ng RIF: mataas na pagtitiyak at pagiging sensitibo; kadalian ng diskarte sa pagtatakda; nangangailangan ng pinakamababang bilang ng mga bahagi. Isa itong express diagnostic method, dahil makakakuha ka ng sagot sa loob ng ilang oras. Kasama sa mga disadvantage ang pagiging subjectivity sa pagtatasa ng intensity ng luminescence at, sa kasamaang-palad, minsan ang fluorescent sera ay hindi maganda ang kalidad. Sa kasalukuyan, ang RIF ay malawakang ginagamit sa pagsusuri ng mga viral na sakit sa hayop.
Kung makakita ka ng error, mangyaring i-highlight ang isang piraso ng teksto at i-click Ctrl+Enter.
№ 35 Immunofluorescence reaksyon. Mekanismo, mga bahagi, aplikasyon.
Immunofluorescent method (RIF, immunofluorescence reaction, Koons reaction) ay isang paraan para sa pag-detect ng mga partikular na antigen gamit ang mga antibodies na pinagsama-sama ng fluorochrome. Ito ay may mataas na sensitivity at specificity.
Ginagamit ito para sa pagpapahayag ng mga diagnostic ng mga nakakahawang sakit (pagkilala ng pathogen sa materyal ng pagsubok), pati na rin para sa pagpapasiya ng mga antibodies at mga receptor sa ibabaw at mga marker ng leukocytes (immunophenotyping) at iba pang mga cell.
Ang pagtuklas ng bacterial at viral antigens sa mga nakakahawang materyales, tissue ng hayop, at cell culture gamit ang fluorescent antibodies (sera) ay malawakang ginagamit sa diagnostic practice. Ang paghahanda ng fluorescent sera ay batay sa kakayahan ng ilang mga fluorochromes (halimbawa, fluorescein isothiocyanate) na pumasok sa isang kemikal na bono na may mga serum na protina, nang hindi nilalabag ang kanilang immunological specificity.
Mayroong tatlong uri ng pamamaraan: direkta, hindi direkta, na may pandagdag. Direktang paraan ng RIF ay batay sa katotohanan na ang mga tissue antigens o microbes na ginagamot sa immune sera na may mga antibodies na may label na fluorochromes ay maaaring kumikinang sa UV rays ng isang fluorescent microscope. Ang mga bakterya sa isang smear, na ginagamot ng tulad ng isang luminescent serum, ay kumikinang sa paligid ng cell sa anyo ng isang berdeng hangganan.
Hindi direktang paraan ng RIF binubuo sa pagtukoy sa antigen-antibody complex gamit ang antiglobulin (anti-antibody) serum na may label na fluorochrome. Upang gawin ito, ang mga smear mula sa isang suspensyon ng mga microbes ay ginagamot ng mga antibodies ng antimicrobial rabbit diagnostic serum. Pagkatapos ay ang mga antibodies na hindi nakagapos ng mga microbial antigens ay hinuhugasan, at ang mga antibodies na natitira sa mga mikrobyo ay makikita sa pamamagitan ng paggamot sa smear na may antiglobulin (anti-rabbit) serum na may label na fluorochromes. Bilang resulta, nabuo ang isang kumplikadong microbe + antimicrobial rabbit antibodies + anti-rabbit antibodies na may label na fluorochrome. Ang kumplikadong ito ay sinusunod sa isang fluorescent microscope, tulad ng sa direktang pamamaraan.
Mekanismo . Sa isang glass slide, ang isang smear ay inihanda mula sa materyal na pagsubok, na naayos sa isang apoy at ginagamot sa immune rabbit serum na naglalaman ng mga antibodies laban sa mga pathogen antigens. Upang makabuo ng isang antigen-antibody complex, ang paghahanda ay inilalagay sa isang mahalumigmig na silid at incubated sa 37 °C. sa loob ng 15 minuto, pagkatapos ay hugasan nang lubusan ng isotonic sodium chloride solution upang alisin ang mga antibodies na hindi nakagapos sa antigen. Pagkatapos, ang isang fluorescent antiglobulin serum laban sa mga globulin ng kuneho ay inilapat sa paghahanda, na incubated para sa 15 minuto sa 37 ° C, at pagkatapos ay ang paghahanda ay lubusan na hugasan ng isotonic sodium chloride solution. Bilang isang resulta ng pagbubuklod ng fluorescent antiglobulin serum na may mga tiyak na antibodies na naayos sa antigen, ang mga luminous na antigen-antibody complex ay nabuo, na napansin ng fluorescent microscopy.