Επειδή το τεστ FISH μπορεί να ανιχνεύσει γενετικές ανωμαλίες που προκαλούν καρκίνο, είναι μια αποτελεσματική μέθοδος για τη διάγνωση ορισμένων τύπων καρκίνου. Το τεστ χρησιμοποιείται επίσης για την επιβεβαίωση της διάγνωσης και παρέχει πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με την πιθανή έκβαση της νόσου και τη σκοπιμότητα της χημειοθεραπείας.
Για παράδειγμα, σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού, ένα τεστ ιστού FISH που λαμβάνεται κατά τη διάρκεια μιας βιοψίας βοηθά στον προσδιορισμό της παρουσίας αντιγράφων του γονιδίου HER2 στα κύτταρα.
Τα κύτταρα με αντίγραφα του γονιδίου HER2 έχουν περισσότερους υποδοχείς HER2, οι οποίοι λαμβάνουν σήματα που διεγείρουν την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων στο μαστό. Επομένως, για ασθενείς με αντίγραφα του γονιδίου HER2, συνιστάται η χρήση του Herceptin (trastuzumab), ενός φαρμάκου που αναστέλλει την ικανότητα των υποδοχέων HER2 να λαμβάνουν σήματα.
Λόγω του υψηλού κόστους και της σχετικής μη προσβασιμότητας του τεστ FISH, χρησιμοποιείται πιο συχνά μια άλλη εξέταση για την ανίχνευση του καρκίνου του μαστού, η ανοσοϊστοχημεία (IHC).
Υπάρχει διαμάχη στους ιατρικούς κύκλους σχετικά με την υψηλή απόδοση του τεστ FISH σε σύγκριση με τα τυπικά τεστ. Ωστόσο, λόγω της τεχνολογικής προόδου, το τεστ FISH γίνεται φθηνότερο και πιο προσιτό σε ποικίλα κλινικά περιβάλλοντα.
Πώς λειτουργεί το τεστ FISH
Κατά τη διεξαγωγή μιας δοκιμής FISH σε δείγμα ιστού ασθενούς, χρησιμοποιούνται φθορίζουσες ετικέτες που συνδέονται μόνο σε ορισμένες περιοχές των χρωμοσωμάτων. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια ενός μικροσκοπίου φθορισμού, προσδιορίζονται οι περιοχές των χρωμοσωμάτων με τις οποίες έχουν έρθει σε επαφή οι ανιχνευτές φθορισμού και η παρουσία πιθανών ανωμαλιών που προκαλούν την ανάπτυξη καρκίνου.
Τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να εμφανίσουν τις ακόλουθες ανωμαλίες:
- μετατόπιση - η μεταφορά ενός τμήματος ενός χρωμοσώματος σε μια νέα θέση στο ίδιο ή άλλο χρωμόσωμα.
- αναστροφή - μια στροφή ενός τμήματος ενός χρωμοσώματος κατά 180 μοίρες ενώ διατηρείται μια σύνδεση με το ίδιο το χρωμόσωμα.
- διαγραφή - απώλεια μέρους ενός χρωμοσώματος.
- διπλασιασμός - διπλασιασμός ενός τμήματος ενός χρωμοσώματος, που οδηγεί σε υπερβολικό περιεχόμενο αντιγράφων ενός γονιδίου σε ένα κύτταρο.
Οι μετατοπίσεις βοηθούν στη διάγνωση ορισμένων τύπων λευχαιμίας, λεμφώματος και σαρκώματος. Η παρουσία διπλασιασμού στα καρκινικά κύτταρα του μαστού βοηθά τον γιατρό να επιλέξει την καλύτερη θεραπεία.
Το πλεονέκτημα του τεστ FISH έναντι των τυπικών κυτταρογενετικών δοκιμών (που εξετάζουν τη γενετική σύνθεση των κυττάρων) είναι ότι μπορεί να ανιχνεύσει ακόμη και τις μικρότερες γενετικές αλλαγές που δεν μπορούν να φανούν με ένα συμβατικό μικροσκόπιο.
Ένα άλλο σημαντικό χαρακτηριστικό του τεστ FISH είναι ότι μπορεί να πραγματοποιηθεί σε κύτταρα που δεν έχουν ακόμη αρχίσει να αναπτύσσονται ενεργά. Άλλες δοκιμές πραγματοποιούνται σε κύτταρα μόνο αφού έχουν αναπτυχθεί στο εργαστήριο για δύο εβδομάδες, επομένως η όλη διαδικασία μπορεί να διαρκέσει έως και τρεις εβδομάδες, με τα αποτελέσματα των δοκιμών FISH να είναι διαθέσιμα εντός λίγων ημερών.
Παραδείγματα τεστ FISH για διάγνωση καρκίνου
Αν και το τεστ FISH χρησιμοποιείται πιο συχνά για την ανάλυση γενετικών ανωμαλιών στον καρκίνο του μαστού, παρέχει επίσης σημαντικές πληροφορίες για άλλους τύπους καρκίνου.
Για παράδειγμα, κατά τη διάγνωση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, μια δοκιμή FISH για κύτταρα ούρων είναι πιο ακριβής από τις εξετάσεις για άτυπα κύτταρα. Επιπλέον, σας επιτρέπει να προσδιορίσετε την υποτροπή του καρκίνου της ουροδόχου κύστης 3-6 μήνες νωρίτερα.
Το τεστ FISH βοηθά επίσης στην ανίχνευση χρωμοσωμικών ανωμαλιών στη λευχαιμία, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων που είναι ενδεικτικά μιας επιθετικής μορφής χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας (ΧΛΛ). Οι ασθενείς με επιθετική μορφή ΧΛΛ μπορεί να χρειαστούν επείγουσα θεραπεία, ενώ για λιγότερο επιθετικές μορφές, η παρατήρηση μπορεί να είναι επαρκής.
Διαμάχη για το τεστ FISH
Δεν συμφωνούν όλοι οι ειδικοί ότι το τεστ FISH είναι το πιο ακριβές τεστ για τη διάγνωση καρκίνων ευαίσθητων στο Herceptin.
Το 2010, επιστήμονες από το Ινστιτούτο Mayo (Ιρλανδία) δήλωσαν ότι το λιγότερο ακριβό τεστ IHC είναι σχεδόν εξίσου αποτελεσματικό στον προσδιορισμό της ευαισθησίας στο Herceptin με το τεστ FISH.
Άλλοι ειδικοί επέκριναν το τεστ FISH επειδή απέτυχε να ανιχνεύσει μικρές μεταλλάξεις, όπως μικρές διαγραφές, εισαγωγές και σημειακές μεταλλάξεις, και επειδή αγνοούσε ορισμένες αναστροφές.
Βελτίωση του τεστ FISH
Παρά το γεγονός ότι η τεχνολογία δοκιμής FISH δεν επιτρέπει ακόμη την ανάλυση όλων των τμημάτων των χρωμοσωμάτων, αναπτύσσεται συνεχώς προς αυτή την κατεύθυνση.
Για παράδειγμα, το 2007, Καναδοί επιστήμονες ανακοίνωσαν την ανάπτυξη ενός μικροσκοπίου μικροσκοπίου μεγέθους slide που θα επέτρεπε τη διεξαγωγή μιας δοκιμής FISH χρησιμοποιώντας μια συσκευή που χωράει στην παλάμη του χεριού σας.
Ονομάζεται FISH Test on a Chip, αυτό το βελτιωμένο τεστ θα δώσει αποτελέσματα σε μια μέρα και θα κοστίσει λιγότερο από άλλες δοκιμές.
Προσδιορισμός της κατάστασης του όγκου HER-2 με τη μέθοδο FISH- μελέτη προδιάθεσης για ανάπτυξη όγκου και επιλογή έγκαιρης κατάλληλης θεραπείας για τον καρκίνο του μαστού (BC) ή τον καρκίνο του στομάχου (GC).
HER-2 (HER-2/neu)- Ο υποδοχέας-2 του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα είναι μια πρωτεΐνη που μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Δημιουργείται από ένα ειδικό γονίδιο που ονομάζεται γονίδιο HER-2/neu. Το HER-2 είναι ο υποδοχέας για έναν συγκεκριμένο αυξητικό παράγοντα που ονομάζεται ανθρώπινος επιδερμικός αυξητικός παράγοντας που εμφανίζεται φυσικά στους ανθρώπους. Όταν ο ανθρώπινος επιδερμικός αυξητικός παράγοντας προσκολλάται στους υποδοχείς HER-2 στα καρκινικά κύτταρα του μαστού, μπορεί να διεγείρει την ανάπτυξη και τη διαίρεση αυτών των κυττάρων. Σε υγιή ιστό, το HER-2 μεταδίδει σήματα που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυττάρων, αλλά η υπερέκφραση του HER-2 μπορεί να οδηγήσει σε κακοήθη κυτταρικό μετασχηματισμό.
Η υπερέκφραση του HER-2 σε ορισμένους υποτύπους καρκίνου του μαστού οδηγεί σε αυξημένο πολλαπλασιασμό και αγγειογένεση, δυσρύθμιση της απόπτωσης (γενετικά προγραμματισμένη αυτοκαταστροφή των κυττάρων). Έχει αποδειχθεί ότι η υπερέκφραση αυτού του υποδοχέα στον ιστό όγκου στον καρκίνο του μαστού σχετίζεται με μια πιο επιθετική πορεία της νόσου, ένα αυξημένο μεταστατικό δυναμικό του όγκου και μια λιγότερο ευνοϊκή πρόγνωση. Η ανακάλυψη μιας συσχέτισης μεταξύ της υπερέκφρασης του HER-2 και της κακής πρόγνωσης του καρκίνου του μαστού οδήγησε στην αναζήτηση τέτοιων θεραπευτικών προσεγγίσεων που στοχεύουν ειδικά στον αποκλεισμό του ογκογονιδίου HER-2/neu (στοχευμένη θεραπεία αντι-HER2).
Καρκίνος του Μαστού (Π.Χ.)- κακοήθης όγκος του αδενικού ιστού του μαστού. Το RZhM κατέχει την πρώτη θέση μεταξύ όλων των κακοήθων ασθενειών στις γυναίκες.
Ανάλογα με την παρουσία βιολογικών δεικτών όγκου - έκφραση ορμονικών υποδοχέων (οιστρογόνα και/ή προγεστερόνη), απομονώνεται η έκφραση του HER-2 - θετικός στον ορμονικό υποδοχέα, HER-2 θετικός και τριπλά αρνητικός καρκίνος του μαστού.
Οι τύποι καρκίνου του μαστού HER-2/neu-θετικοί (HER-2+) χαρακτηρίζονται από υψηλή έκφραση της πρωτεΐνης HER-2/neu.
Οι τύποι καρκίνου του μαστού HER=2/neu-negative (HER-2-) χαρακτηρίζονται από χαμηλή έκφραση ή απουσία της πρωτεΐνης HER-2/neu.
Υπολογίζεται ότι μία στις πέντε γυναίκες με καρκίνο του μαστού είναι θετική HER-2. Οι περισσότεροι καρκίνοι του μαστού είναι ορμονοεξαρτώμενοι: τα οιστρογόνα και η προγεστερόνη έχουν διεγερτική δράση σε αυτούς (πολλαπλασιαστικό και νεοπλασματικό). Στον HER-2-θετικό καρκίνο του μαστού, υπάρχει περίσσεια υποδοχέων HER-2 στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται «θετική κατάσταση HER-2» και διαγιγνώσκεται στο 15-20% των γυναικών με καρκίνο του μαστού.
HER-2- υποδοχέας ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα τύπου 2, ο οποίος υπάρχει στους ιστούς και φυσιολογικά, συμμετέχει στη ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης και διαφοροποίησης. Η περίσσευσή του στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων (υπερέκφραση) καθορίζει την ταχεία ανεξέλεγκτη ανάπτυξη του νεοπλάσματος, τον υψηλό κίνδυνο μετάστασης και τη χαμηλή αποτελεσματικότητα ορισμένων τύπων θεραπείας. Ο θετικός σε HER-2 καρκίνος του μαστού είναι μια ιδιαίτερα επιθετική μορφή της νόσου, επομένως ο ακριβής προσδιορισμός της κατάστασης του HER-2 είναι καθοριστικής σημασίας για την επιλογή της θεραπευτικής τακτικής.
Καρκίνος στομάχου (SC)- ένας κακοήθης όγκος που προέρχεται από το επιθήλιο του γαστρικού βλεννογόνου.
Ο καρκίνος του στομάχου κατέχει την 4η θέση στη δομή της ογκολογικής νοσηρότητας και τη 2η στη δομή της ογκολογικής θνησιμότητας στον κόσμο. Η συχνότητα του καρκίνου του στομάχου στους άνδρες είναι 2 φορές μεγαλύτερη από ό,τι στις γυναίκες. Η Ρωσία ανήκει στις περιοχές με υψηλή συχνότητα γαστρικού καρκίνου και θνησιμότητα από αυτή την ασθένεια. Η διάγνωση του καρκίνου του στομάχου στα αρχικά στάδια είναι δύσκολη λόγω της μακράς ασυμπτωματικής πορείας της νόσου. Συχνά ο καρκίνος του στομάχου ανιχνεύεται στα τελευταία στάδια, όταν το ποσοστό 5ετούς επιβίωσης δεν ξεπερνά το 5-10%, και η χημειοθεραπεία παραμένει η μόνη θεραπεία.
Η κύρια μέθοδος θεραπείας του καρκίνου του στομάχου είναι η χειρουργική. Ωστόσο, στους περισσότερους ασθενείς κατά τη στιγμή της διάγνωσης, προσδιορίζεται μια εκτεταμένη καρκινική διεργασία, η οποία καθιστά αδύνατη την πραγματοποίηση μιας ριζικής επέμβασης και απαιτεί συστηματική φαρμακευτική θεραπεία. Η διεξαγωγή χημειοθεραπείας αυξάνει στατιστικά σημαντικά τη συνολική επιβίωση των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του στομάχου, βελτιώνοντας την ποιότητα ζωής τους.
Το ογκογονίδιο HER-2 (erbB-2) εντοπίστηκε αρχικά στους όγκους του μαστού. Η ενίσχυση και η υπερέκφραση αυτού του γονιδίου είναι ένα σχετικά ειδικό συμβάν για καρκινώματα μαστού και πρακτικά δεν εμφανίζεται σε όγκους άλλων εντοπισμών. Ο καρκίνος του στομάχου φαίνεται να είναι μία από τις λίγες εξαιρέσεις: η ενεργοποίηση του HER-2 σημειώνεται σε περίπου 10-15% των κακοήθων νεοπλασμάτων αυτού του οργάνου και συσχετίζεται με την επιθετική πορεία της νόσου.
Η υπερέκφραση του HER-2 είναι ένας κακός προγνωστικός παράγοντας. Σύμφωνα με διάφορες μελέτες, η ενίσχυση του γονιδίου HER-2 σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου συσχετίζεται με χαμηλά ποσοστά συνολικής επιβίωσης.
Η μέθοδος FISH χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της κατάστασης του HER-2 σε GC και BC.
ΨΑΡΙ- η έρευνα σάς επιτρέπει να προσδιορίσετε τις ποιοτικές και ποσοτικές αλλαγές στα χρωμοσώματα για τη διάγνωση κακοήθων ασθενειών του αίματος και συμπαγών όγκων.
Σήμερα, οι μελέτες FISH χρησιμοποιούνται ευρέως σε όλο τον κόσμο.
Μέθοδος FISH (fluorescent hybridization in situ) - η μελέτη του αριθμού των γονιδίων HER-2/neu μέσα στα καρκινικά κύτταρα.
Ενδείξεις:
- καρκίνος του μαστού - για σκοπούς πρόγνωσης και επιλογής θεραπείας.
- καρκίνος του στομάχου - για σκοπούς πρόγνωσης και επιλογής θεραπείας.
Καθορίζεται από τον θεράποντα ιατρό.
Απαιτείται ιστολογικό πρωτόκολλο και ανοσοϊστοχημικό πρωτόκολλο, γυαλί IHC.
Ερμηνεία αποτελεσμάτων
Τα αποτελέσματα των δοκιμών FISH εκφράζονται ως εξής:
1. Θετικό (αυξημένη περιεκτικότητα, υπάρχει ενίσχυση του γονιδίου HER-2):
- HER-2 θετικός καρκίνος του μαστού.
- HER-2 αρνητικός καρκίνος του μαστού.
Σε όλες τις περιπτώσεις, χωρίς εξαίρεση, ο σχηματισμός και η ανάπτυξη συνδέεται με τη δραστηριότητα του γονιδίου τύπου HER2. Είναι αυτός που είναι υπεύθυνος για το πόση πρωτεΐνη θα διατεθεί στο γυναικείο σώμα για την ανάπτυξη του ιστού του μαστού. Όταν τα πρώτα υγιή κύτταρα μετασχηματίζονται σε κακοήθη κύτταρα, οι υποδοχείς γονιδίων λαμβάνουν πληροφορίες ότι απαιτείται πρόσθετη διαίρεση του κυτταρικού υλικού.
Το γονίδιο ξεκινά ένα πρόγραμμα για την κατασκευή πρόσθετου ιστού μέσα στο στήθος, αν και στην πραγματικότητα αυτό το κυτταρικό υλικό θα χρησιμοποιηθεί από τον όγκο για την ανάπτυξη και την ανάπτυξή του. Έτσι, το καρκίνωμα, στην πραγματικότητα, εξαπατά τον οργανισμό, και τον αναγκάζει να θρέψει τον καρκίνο σε βάρος των δικών του πόρων.
Το καθήκον της ανάλυσης ψαριών στον καρκίνο του μαστού είναι ακριβώς ο εντοπισμός της δυσλειτουργίας του γονιδίου HER2 και η λήψη κατάλληλων μέτρων απόκρισης όσον αφορά τη συνταγογράφηση της κατάλληλης ιατρικής θεραπείας.
Εάν μια δοκιμή ψαριών δεν πραγματοποιηθεί έγκαιρα για καρκίνο του μαστού, τότε ακόμη και αν χρησιμοποιηθούν ορισμένα φάρμακα στη διαδικασία θεραπείας, αυτό μπορεί να οδηγήσει στο γεγονός ότι ο όγκος θα συνεχίσει να αναπτύσσεται επιθετικά, καλύπτοντας όλους τους νέους ιστούς του μαστού. Αυτές είναι οι λεγόμενες συνέπειες της εσφαλμένα συνταγογραφούμενης θεραπείας λόγω της έλλειψης αντικειμενικών δεδομένων για τη λειτουργία του γονιδίου HER2.
Κατά τη διαδικασία μετάδοσης της ανάλυσης ψαριών, ο γιατρός εισάγει στο αίμα του ασθενούς ειδικές ουσίες που περιέχουν χρωστικά στοιχεία που μπορούν να απεικονίσουν την εικόνα των χρωμοσωμικών διαταραχών. Έτσι, ο γιατρός μπορεί να δει οπτικά και να μελετήσει περαιτέρω τις γενετικές ανωμαλίες στο γονιδίωμα της γυναίκας που οδήγησαν στην ανάπτυξη καρκίνου του μαστού.
Εάν επιβεβαιωθούν ανωμαλίες στο έργο του γονιδίου HER2, τότε συνταγογραφείται η κατάλληλη θεραπεία. Εάν όχι, τότε ο γιατρός, χρησιμοποιώντας άλλες εξετάσεις, διαπιστώνει διαφορετικό λόγο για την ανάπτυξη καρκίνου του μαστού.
Ένα άλλο σημαντικό πλεονέκτημα της ανάλυσης ψαριών είναι ότι σε λίγες μέρες ο ασθενής λαμβάνει μια ολοκληρωμένη αναφορά σχετικά με τη γενετική προδιάθεση για την ανάπτυξη ενός συγκεκριμένου καρκίνου. Με τη βοήθεια αυτής της ιατρικής δοκιμής, είναι δυνατή η ταυτόχρονη διάγνωση της παθολογίας όχι μόνο του μαστικού αδένα, αλλά και όλων των κοιλιακών οργάνων.
Ενημερωτικό βίντεο
Σύντομη απάντηση: Η μέθοδος υβριδισμού in situ φθορισμού (FISH - fluorescence in situ hybridization) περιλαμβάνει τη χρήση μοναδικών αλληλουχιών νουκλεοτιδίων DNA ως ανιχνευτή για την αναζήτηση των επιθυμητών αλληλουχιών DNA στο υλικό που λαμβάνεται από τον ασθενή. Η μέθοδος βασίζεται στη συμπληρωματική δέσμευση ενός ανιχνευτή DNA στο DNA των χρωμοσωμάτων μετάφασης ή των κυττάρων μεσοφάσης. Ο ανιχνευτής DNA και το δοκιμαστικό DNA μετουσιώνονται για να σχηματίσουν μονόκλωνο DNA. Ο ανιχνευτής DNA προστίθεται στο παρασκεύασμα χρωμοσώματος και επωάζεται για ορισμένο χρόνο. Η παρουσία ή η απουσία ενός ανιχνευτή σημασμένου με φθορόχρωμα στο DNA μετά τον υβριδισμό προσδιορίζεται με εξέταση χρωμοσωμάτων χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού.
Αναλυτική απάντηση:
Μέθοδος υβριδισμού φθορισμού επί τόπουσας επιτρέπει να προσδιορίσετε μεμονωμένα χρωμοσώματα ή μεμονωμένες περιοχές τους σε παρασκευάσματα χρωμοσωμάτων μεταφάσης ή πυρήνων μεσοφάσης με βάση τη συμπληρωματική αλληλεπίδραση ενός ανιχνευτή DNA συζευγμένου με μια φθορίζουσα ετικέτα και την επιθυμητή περιοχή στο χρωμόσωμα. Για την οπτικοποίηση πεπτιδικών-νουκλεϊκών ενώσεων στο χρωμόσωμα, χρησιμοποιούνται ανιχνευτές PNA που βασίζονται σε ένα προϊόν πρωτεΐνης.
Η μέθοδος βασίζεται στη συμπληρωματική δέσμευση ενός ανιχνευτή DNA στο DNA των χρωμοσωμάτων μετάφασης ή των κυττάρων μεσοφάσεως και περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα:
1. Μετουσίωσηςδίκλωνο DNA ανιχνευτή και DNA στόχου σε μονόκλωνο υπό την επίδραση υψηλής θερμοκρασίας ή χημικών παραγόντων.
2. Παραγωγή μικτών γενώνΑνιχνευτής DNA με στόχο DNA σύμφωνα με την αρχή της συμπληρωματικότητας με το σχηματισμό ενός δίκλωνου υβριδικού μορίου
3. Πλύσιμο μετά τον υβριδισμόγια την αφαίρεση μη υβριδισμένου ανιχνευτή DNA
4. Ανάλυσησήματα υβριδισμού με μικροσκόπιο φθορισμού
ΠλεονεκτήματαΟι μέθοδοι μοριακής γενετικής διάγνωσης FISH περιλαμβάνουν ταχεία ανάλυση μεγάλου αριθμού κυττάρων, υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα και την ικανότητα μελέτης μη καλλιεργήσιμων και μη διαιρούμενων κυττάρων.
Ελαττώματαμέθοδος είναι η αδυναμία λήψης πληροφοριών σχετικά με τη φυσική κατάσταση του μελετημένου DNA ή τμήματος χρωμοσώματος.
Το FISH χρησιμοποιείται στην προγεννητική μοριακή γενετική διάγνωση και για τον χαρακτηρισμό όγκων. στην παιδιατρική πρακτική, χρησιμοποιείται, κατά κανόνα, για τον εντοπισμό υπομικροσκοπικών διαγραφών που σχετίζονται με συγκεκριμένες δυσπλασίες. Τα σύνδρομα που βασίζονται σε μικροδιαγραφές θεωρούνταν παλαιότερα ασθένειες άγνωστης αιτιολογίας, καθώς οι χρωμοσωμικές διαγραφές και ανακατατάξεις που προκαλούν την ανάπτυξη αυτών των ασθενειών συνήθως δεν απεικονίζονται με παραδοσιακές μεθόδους χρωμοσωμικής ανάλυσης. Τέτοιες μικρές διαγραφές σε συγκεκριμένες περιοχές των χρωμοσωμάτων μπορούν να ανιχνευθούν με μεγάλη ακρίβεια από το FISH. Οι ασθένειες που προκαλούνται από υπομικροσκοπικές διαγραφές περιλαμβάνουν Σύνδρομα Prader-Willi, Angelman, Williams, Miller-Dieker, Smith-Magenis και σύνδρομο καρδιοπροσωπικού προσώπου. Το FISH διευκολύνει τη διάγνωση αυτών των συνδρόμων σε άτυπες περιπτώσεις, ιδιαίτερα στη βρεφική ηλικία, όταν πολλά διαγνωστικά σημαντικά σημεία της νόσου εξακολουθούν να απουσιάζουν. Η χρήση αυτής της μεθόδου μοριακής γενετικής διάγνωσης ενδείκνυται επίσης στην εφηβεία και την ενήλικη ζωή, όταν τα τυπικά κλινικά σημεία της νόσου, χαρακτηριστικά της παιδικής ηλικίας, υφίστανται αλλαγές.
121. Ανιχνευτές DNA. Η χρήση τους στον προσδιορισμό κληρονομικών ασθενειών.
Σύντομη κριτική
Ο ανιχνευτής DNA είναιένα σύντομο θραύσμα DNA συζευγμένο με φλουορεσκεΐνη, ένα ένζυμο ή ένα ραδιενεργό ισότοπο, το οποίο χρησιμοποιείται για υβριδισμό στη συμπληρωματική περιοχή του μορίου DNA-στόχου.
Κύριο μέρος
Διαγνωστικά συστήματα DNA
Πληροφορίες για όλη την ποικιλία των ιδιοτήτων ενός οργανισμού περιέχονται στο γενετικό του υλικό. Έτσι, η παθογένεια των βακτηρίων καθορίζεται από την παρουσία ενός συγκεκριμένου γονιδίου ή συνόλου γονιδίων σε αυτά και εμφανίζεται μια κληρονομική γενετική ασθένεια ως αποτέλεσμα βλάβης σε ένα συγκεκριμένο γονίδιο. Το τμήμα DNA που καθορίζει αυτό το βιολογικό χαρακτηριστικό έχει μια αυστηρά καθορισμένη αλληλουχία νουκλεοτιδίων και μπορεί να χρησιμεύσει ως διαγνωστικός δείκτης.
Πολλές γρήγορες και αξιόπιστες διαγνωστικές μέθοδοι βασίζονται στον υβριδισμό νουκλεϊκών οξέων - το ζευγάρωμα δύο συμπληρωματικών τμημάτων διαφορετικών μορίων DNA. Η διαδικασία σε γενικές γραμμές είναι η εξής.
1. Στερέωση μονόκλωνου στόχου DNA σε φίλτρο μεμβράνης.
2. Εφαρμογή ενός επισημασμένου μονόκλωνου ανιχνευτή DNA, ο οποίος, υπό ορισμένες συνθήκες (θερμοκρασία και ιοντική ισχύς), ζευγαρώνει με το DNA στόχο.
3. Πλύσιμο του φίλτρου για απομάκρυνση της περίσσειας μη δεσμευμένου επισημασμένου ανιχνευτή DNA.
4. Ανίχνευση μορίων ανιχνευτή/υβριδικού στόχου.
Σε διαγνωστικές δοκιμές που βασίζονται στον υβριδισμό νουκλεϊκού οξέος, τρία συστατικά είναι βασικά: ένας ανιχνευτής DNA, ένας στόχος DNA και μια μέθοδος ανίχνευσης σήματος υβριδισμού. Το σύστημα ανίχνευσης πρέπει να είναι πολύ συγκεκριμένο και πολύ ευαίσθητο.
* Η φλουορεσκεΐνη (διοξιφθοράνη, ουρανίνη Α) είναι μια οργανική ένωση, μια φθορίζουσα χρωστική. Στην αναλυτική χημεία, η φλουορεσκεΐνη χρησιμοποιείται ως δείκτης φωταύγειας οξέος-βάσης. Στη βιοχημεία και τη μοριακή βιολογία, τα ισοθειοκυανικά παράγωγα της φλουορεσκεΐνης ως βιολογικές βαφές για τον προσδιορισμό αντιγόνων και αντισωμάτων.
* Ανίχνευση είναι η ανίχνευση, η ταύτιση, η εύρεση κάτι.
*σύζευξη=σύζευξη
*Εάν ένα μείγμα DNA, για παράδειγμα, ανθρώπου και ποντικού, λιώσει και ανόπτεται σε έναν "δοκιμαστικό σωλήνα", τότε ορισμένα τμήματα αλυσίδων DNA ποντικού θα ανασυνδυαστούν με συμπληρωματικά τμήματα αλυσίδων ανθρώπινου DNA για να σχηματίσουν υβρίδια. Ο αριθμός τέτοιων περιοχών εξαρτάται από τον βαθμό συγγένειας του είδους. Όσο πιο κοντά είναι τα είδη μεταξύ τους, τόσο περισσότερες περιοχές συμπληρωματικότητας των κλώνων του DNA. Αυτό το φαινόμενο ονομάζεται Υβριδισμός DNA-DNA.
122. Μέθοδοι και προϋποθέσεις για τη χρήση άμεσων διαγνωστικών DNA.
Σύντομη κριτική:
Χρησιμοποιώντας άμεσες μεθόδους, ανιχνεύονται διαταραχές στην πρωτογενή νουκλεοτιδική αλληλουχία του DNA (μεταλλάξεις και οι τύποι τους). Οι άμεσες μέθοδοι χαρακτηρίζονται από ακρίβεια που φτάνει σχεδόν το 100%.
Ο σκοπός της άμεσης διάγνωσης είναι να εντοπίσει μεταλλαγμένα αλληλόμορφα (ανωμαλίες στην πρωτογενή αλληλουχία νουκλεοτιδίων DNA, μεταλλάξεις και τους τύπους τους).
Το μειονέκτημα της άμεσης διάγνωσης DNA είναι η ανάγκη να γνωρίζουμε την ακριβή θέση του γονιδίου και το φάσμα των μεταλλάξεων του. Μέθοδοι άμεσης διάγνωσης DNA ενδείκνυνται για ασθένειες όπως η φαινυλκετονουρία (μετάλλαξη R408W), η κυστική ίνωση - (η πιο κοινή μετάλλαξη delF508), η χορεία του Huntington (επέκταση των επαναλήψεων τρινουκλεοτιδίων-επαναλήψεις CTG) κ.λπ.
Πλήρης απάντηση:
Χρησιμοποιώντας άμεσες μεθόδους, ανιχνεύονται διαταραχές στην πρωτογενή νουκλεοτιδική αλληλουχία του DNA (μεταλλάξεις και οι τύποι τους). Οι άμεσες μέθοδοι χαρακτηρίζονται από ακρίβεια που φτάνει σχεδόν το 100%. Ωστόσο, στην πράξη, αυτές οι μέθοδοι μπορούν να εφαρμοστούν υπό ορισμένες προϋποθέσεις:
1) γνωστός κυτταρογενετικός εντοπισμός του γονιδίου που ευθύνεται για την ανάπτυξη μιας κληρονομικής νόσου,
2) το γονίδιο της νόσου πρέπει να κλωνοποιηθεί και να είναι γνωστή η νουκλεοτιδική του αλληλουχία.
Ο σκοπός της άμεσης διάγνωσης είναι να εντοπίσει μεταλλαγμένα αλληλόμορφα (ανωμαλίες στην πρωτογενή αλληλουχία νουκλεοτιδίων DNA, μεταλλάξεις και τους τύπους τους). Η υψηλή ακρίβεια της άμεσης διαγνωστικής μεθόδου DNA στις περισσότερες περιπτώσεις δεν απαιτεί ανάλυση DNA όλων των μελών της οικογένειας, καθώς η ανίχνευση μιας μετάλλαξης στο αντίστοιχο γονίδιο καθιστά δυνατή την επιβεβαίωση της διάγνωσης με σχεδόν 100% ακρίβεια και τον προσδιορισμό του γονότυπου όλα τα μέλη της οικογένειας ενός άρρωστου παιδιού, συμπεριλαμβανομένων των ετερόζυγων φορέων.
Το μειονέκτημα της άμεσης διάγνωσης DNA είναι η ανάγκη να γνωρίζουμε την ακριβή θέση του γονιδίου και το φάσμα των μεταλλάξεων του.
Μέθοδοι άμεσης διάγνωσης DNA ενδείκνυνται για ασθένειες όπως η φαινυλκετονουρία (μετάλλαξη R408W), η κυστική ίνωση - (η πιο κοινή μετάλλαξη delF508), η χορεία του Huntington (επέκταση των επαναλήψεων τρινουκλεοτιδίων-επαναλήψεις CTG) κ.λπ.
Ωστόσο, μέχρι σήμερα, τα γονίδια πολλών ασθενειών δεν έχουν χαρτογραφηθεί, η οργάνωση εξωνίου-ιντρονίου τους είναι άγνωστη και πολλές κληρονομικές ασθένειες χαρακτηρίζονται από έντονη γενετική ετερογένεια, η οποία δεν επιτρέπει την πλήρη χρήση άμεσων διαγνωστικών μεθόδων DNA. Επομένως, το περιεχόμενο πληροφοριών της μεθόδου της άμεσης διάγνωσης DNA ποικίλλει ευρέως. Έτσι, στη διάγνωση της χορείας του Huntington, της αχονδροπλασίας, είναι 100%, με φαινυλκετονουρία, κυστική οξέωση, επινεφρινογεννητικό σύνδρομο - από 70 έως 80%, και με νόσο Wilson-Konovalov και μυοπάθεια Duchenne / Becker - 45-60%. Από αυτή την άποψη, χρησιμοποιούνται έμμεσες μέθοδοι μοριακής γενετικής διάγνωσης κληρονομικών ασθενειών.
Η τεχνική FISH, Fluorescent in situ hybridization, αναπτύχθηκε στα μέσα της δεκαετίας του 1980 και χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της παρουσίας ή απουσίας συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA στα χρωμοσώματα, καθώς και του δορυφόρου άλφα του DNA που βρίσκεται στο κεντρομερίδιο του χρωμοσώματος 6, CEP6( 6p11.1-q11. 1).
Αυτό έδωσε μια σημαντική στροφή στη διάγνωση ογκολογικών ασθενειών μελανοκυτταρικής προέλευσης λόγω της ανίχνευσης αντιγόνων όγκου. Στο πλαίσιο της κακοήθειας, προσδιορίζεται μια μετάλλαξη σε τρία αντιγόνα: CDK2NA (9p21), CDK4 (12q14) και CMM1 (1p). Από αυτή την άποψη, η δυνατότητα αντικειμενικής διαφορικής διάγνωσης με βάση τον προσδιορισμό των γενετικών χαρακτηριστικών των μελανοκυτταρικών όγκων του δέρματος έχει μεγάλη σημασία για την έγκαιρη διάγνωση του μελανώματος και των προδρόμου του.Στον πυρήνα με ένα φυσιολογικό σύνολο μελετημένων γονιδίων και χρωμοσώματος 6 , δύο γονίδια RREB1 βαμμένα με κόκκινο χρώμα, δύο γονίδια MYB παρατηρούνται, με κίτρινο, δύο γονίδια CCND1 με πράσινο χρώμα και δύο κεντρομερή χρωμοσώματος 6 με μπλε χρώμα. Για διαγνωστικούς σκοπούς, χρησιμοποιούνται δείγματα φθορισμού.
Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της αντίδρασης: μετράται ο αριθμός των κόκκινων, κίτρινων, πράσινων και μπλε σημάτων σε 30 πυρήνες κάθε δείγματος, προσδιορίζονται τέσσερις παράμετροι διαφόρων παραλλαγών γενετικών διαταραχών, στις οποίες το δείγμα είναι γενετικά σύμφωνο με το μελάνωμα. Για παράδειγμα, ένα δείγμα αντιστοιχεί σε μελάνωμα εάν ο μέσος αριθμός γονιδίου CCND1 ανά πυρήνα είναι ≥2,5. Ο αριθμός αντιγράφων άλλων γονιδίων εκτιμάται σύμφωνα με την ίδια αρχή. Ένα φάρμακο θεωρείται θετικό σε FISH εάν πληρούται τουλάχιστον μία από τις τέσσερις προϋποθέσεις. Τα δείγματα στα οποία και οι τέσσερις παράμετροι είναι κάτω από τα σημεία διακοπής θεωρούνται αρνητικά για FISH.
Ο προσδιορισμός συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA στα χρωμοσώματα πραγματοποιείται σε τομές δειγμάτων βιοψίας ή χειρουργικού υλικού. Σε πρακτική εφαρμογή, η αντίδραση FISH είναι η εξής: το υλικό δοκιμής που περιέχει DNA στους πυρήνες των μελανοκυττάρων υποβάλλεται σε επεξεργασία για να καταστρέψει μερικώς το μόριό του προκειμένου να σπάσει τη δίκλωνη δομή και έτσι να διευκολύνει την πρόσβαση στην επιθυμητή περιοχή γονιδίου. Τα δείγματα ταξινομούνται ανάλογα με τον τόπο προσκόλλησης στο μόριο DNA. Το υλικό για την αντίδραση FISH στην κλινική πράξη είναι τομές ιστού παραφίνης, επιχρίσματα και αποτυπώματα.
Η αντίδραση FISH σάς επιτρέπει να βρείτε αλλαγές που έχουν συμβεί στο μόριο του DNA ως αποτέλεσμα της αύξησης του αριθμού των αντιγράφων ενός γονιδίου, της απώλειας ενός γονιδίου, της αλλαγής στον αριθμό των χρωμοσωμάτων και των ποιοτικών αλλαγών - της κίνησης του γονιδίου τόποι τόσο στο ίδιο χρωμόσωμα όσο και μεταξύ δύο χρωμοσωμάτων.
Για την επεξεργασία των δεδομένων που ελήφθησαν χρησιμοποιώντας την αντίδραση FISH και τη μελέτη της σχέσης μεταξύ του αριθμού αντιγράφων των γονιδίων των τριών υπό μελέτη ομάδων, χρησιμοποιείται ο συντελεστής συσχέτισης Spearman.
Το μελάνωμα χαρακτηρίζεται από αύξηση του αριθμού αντιγράφων σε σύγκριση με τους σπίλους και τους δυσπλαστικούς σπίλους.
Ένας απλός σπίλος, σε σύγκριση με έναν δυσπλαστικό σπίλο, έχει λιγότερες ανωμαλίες αριθμού αντιγράφων (δηλαδή, πιο φυσιολογικά αντίγραφα).
Για τη δημιουργία κανόνων απόφασης για την πρόβλεψη του εάν ένα δείγμα ανήκει σε μια συγκεκριμένη κατηγορία (διαφορική διάγνωση απλών και δυσπλαστικών σπίλων), χρησιμοποιείται η μαθηματική συσκευή των «δέντρων απόφασης». Αυτή η προσέγγιση έχει αποδειχθεί στην πράξη και τα αποτελέσματα της εφαρμογής αυτής της μεθόδου (σε αντίθεση με πολλές άλλες μεθόδους, όπως τα νευρωνικά δίκτυα) μπορούν να ερμηνευθούν με σαφήνεια για τη δημιουργία κανόνων απόφασης για τη διαφοροποίηση απλών, δυσπλαστικών σπίλων και μελανώματος. Τα αρχικά δεδομένα σε όλες τις περιπτώσεις ήταν οι αριθμοί αντιγράφων τεσσάρων γονιδίων.
Το έργο της κατασκευής ενός κανόνα απόφασης για τη διαφορική διάγνωση χωρίζεται σε διάφορα στάδια. Στο πρώτο στάδιο, το μελάνωμα και ο σπίλος διαφοροποιούνται, χωρίς να λαμβάνεται υπόψη ο τύπος του σπίλου. Στο επόμενο στάδιο, δημιουργείται ένας κανόνας απόφασης για τον διαχωρισμό απλών και δυσπλαστικών σπίλων. Τέλος, στο τελευταίο στάδιο, είναι δυνατή η κατασκευή ενός «δέντρου απόφασης» για τον προσδιορισμό του βαθμού δυσπλασίας του δυσπλαστικού σπίλου.
Ένας τέτοιος διαχωρισμός του έργου της ταξινόμησης των σπίλων σε δευτερεύουσες εργασίες καθιστά δυνατή την επίτευξη υψηλής ακρίβειας προβλέψεων σε κάθε στάδιο. Τα δεδομένα εισόδου για την κατασκευή του δέντρου απόφασης είναι δεδομένα για τον αριθμό αντιγράφων τεσσάρων γονιδίων για ασθενείς με διάγνωση μελανώματος και ασθενείς με διάγνωση μη μελανώματος (ασθενείς με διάφορους τύπους σπίλων - απλοί και δυσπλαστικοί). Για κάθε ασθενή, διατίθενται αριθμοί αντιγράφων γονιδίων για 30 κύτταρα.
Έτσι, η διαίρεση της εργασίας πρόβλεψης της διάγνωσης σε διάφορα στάδια επιτρέπει τη δημιουργία κανόνων απόφασης υψηλής ακρίβειας όχι μόνο για τη διαφοροποίηση μεταξύ μελανώματος και σπίλων, αλλά και για τον προσδιορισμό του τύπου των σπίλων και την πρόβλεψη του βαθμού δυσπλασίας για έναν δυσπλαστικό σπίλο. Τα κατασκευασμένα "δέντρα απόφασης" είναι ένας σαφής τρόπος πρόβλεψης μιας διάγνωσης με βάση τους αριθμούς αντιγράφων γονιδίων και μπορούν εύκολα να χρησιμοποιηθούν στην κλινική πράξη για τη διαφοροποίηση καλοήθων, προκακοήθων και κακοήθων μελανοκυτταρικών όγκων του δέρματος. Η προτεινόμενη πρόσθετη μέθοδος διαφορικής διάγνωσης είναι ιδιαίτερα σημαντική στην εκτομή γιγάντιων συγγενών μελαγχρωματικών σπίλων και δυσπλαστικών σπίλων σε παιδιατρικούς ασθενείς, αφού τέτοιοι ασθενείς επισκέπτονται ιατρικά ιδρύματα με υψηλό ποσοστό διαγνωστικών σφαλμάτων. Τα αποτελέσματα της χρήσης της περιγραφόμενης μεθόδου είναι εξαιρετικά αποτελεσματικά, συνιστάται η χρήση της στη διάγνωση μελαγχρωματικών δερματικών όγκων, ειδικά σε ασθενείς με σύνδρομο FAMM.