Puncture ng mga rehiyonal na lymph node
Ang balat sa ibabaw ng mga lymph node ay ginagamot ng 96% na alkohol at 3-5% na solusyon sa alkohol ng yodo. Pagkatapos ay gamitin ang 1st at 2nd daliri ng kaliwang kamay upang ayusin ang lymph node. Gamit ang iyong kanang kamay, kumuha ng sterile syringe na may ilang patak ng isotonic sodium chloride solution, na ini-inject parallel sa longitudinal axis ng lymph node. Ang karayom ay itinutulak sa iba't ibang direksyon sa kabaligtaran na dingding ng kapsula ng node at ang mga nilalaman ng hiringgilya ay dahan-dahang iniksyon. Gamit ang mga daliri ng kaliwang kamay, ang lymph node ay bahagyang minamasahe. Kapag ang karayom ay dahan-dahang binawi, ang syringe plunger ay sabay-sabay na hinugot, na hinihigop ang mga nilalaman ng lymph node. Ang materyal ay inilapat sa isang glass slide (kung ang dami ng materyal ay maliit, isang patak ng isotonic sodium chloride solution ay idinagdag) at tinatakpan ng isang coverslip. Ang pag-aaral ng katutubong gamot ay isinasagawa sa isang madilim na larangan ng pagtingin gamit ang isang light-optical microscope na may dark-field condenser (40, 7x, 10x o 15x na layunin). Ang Treponema pallidum ay matatagpuan din sa mga kulay na paghahanda. Kapag nabahiran ayon sa Romanovsky-Giemsa, ang maputlang treponema ay nabahiran ng rosas, ayon kay Fontan at Morozov - kayumanggi (itim), ayon sa pamamaraang Burri, ang hindi nabahiran na treponema ay ipinahayag laban sa isang madilim na background.Serological diagnosis
Ang mga karaniwang (klasikal) at tiyak na mga reaksyon ng serological ay may malaking kahalagahan sa pag-diagnose ng syphilis, pagtatasa ng pagiging epektibo ng paggamot, pagtatatag ng isang criterion ng lunas, at pagtukoy ng mga nakatagong form na lumalaban. Ang mga karaniwang o klasikong serological reactions (SSR) ay kinabibilangan ng:- Reaksyon ng Wasserman (WR),
- sedimentary reactions ng Kahn at Sachs-Vitebsky (cytocholic),
- reaksyon sa salamin (express method),
- treponema pallidum immobilization reaction (reaksyon ng treponema pallidum),
- immunofluorescence reaksyon (RIF).
Reaksyon ng Wasserman (WR)
- binuo ni A. Wasserman kasama sina A. Neisser at C. Bruck noong 1906. Ang reaksyon ng Wasserman ay batay sa phenomenon ng complement fixation (Bordet-Gengou reaction) at pinapayagan ang pagtukoy ng anti-lipid antibodies (reagins). Ayon sa mga modernong konsepto, ang reaksyon ng Wasserman ay nakakakita ng mga antibodies sa mga lipid ng macroorganism, hindi Treponema pallidum, at ang reaksyon ay nagpapakita ng isang proseso ng autoimmune na sanhi ng denaturation ng mga tisyu ng macroorganism ng Treponema pallidum na may pagbuo ng isang lipoprotein complex ( conjugate), kung saan ang mga lipid (haptens) ay isang determinant.Ang RV ay karaniwang nasuri na may dalawa o tatlong antigens. Ang pinakakaraniwang ginagamit ay ang mataas na sensitibong cardiolipin antigen (bovine heart extract na pinayaman ng kolesterol at lecithin) at treponemal antigen (sonicated suspension ng anatogenic cultured treponemes pallidum). Kasama ang serum ng pasyente, ang mga antigen na ito ay bumubuo ng immune complex na may kakayahang mag-adsorbing at mag-binding complement. Upang biswal na matukoy ang nabuo na kumplikado (reagins + antigen + complement), ang hemolytic system (isang halo ng mga erythrocytes ng tupa na may hemolytic serum) ay ginagamit bilang isang tagapagpahiwatig. Kung ang complement ay nakatali sa phase 1 ng reaksyon (reagins + antigen + complement), hindi mangyayari ang hemolysis - ang mga pulang selula ng dugo ay namuo sa isang madaling kapansin-pansing precipitate (positibo sa PB). Kung sa phase 1 complement ay hindi nakagapos dahil sa kawalan ng reagin sa test serum, ito ay gagamitin ng hemolytic system at ang hemolysis ay magaganap (RT negative). Ang antas ng kalubhaan ng hemolysis kapag ang pagtatanghal ng RV ay tinasa ng mga plus: kumpletong kawalan ng hemolysis ++++ o 4+ (ang RV ay positibo nang husto); halos hindi nagsimulang hemolysis +++ o 3+ (positibo ang RV); makabuluhang hemolysis ++ o 2+ (mahinang positibo ang RV); hindi malinaw na larawan ng hemolysis ± (nagdududa ang RV); kumpletong hemolysis - (Wassermann reaksyon negatibo).
Bilang karagdagan sa qualitative assessment ng PB, mayroong quantitative assessment na may iba't ibang serum dilution (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Ang reagin titer ay tinutukoy ng maximum na dilution na nagbibigay pa rin ng isang positibong resulta (4+). Ang quantitative staging ng RV ay mahalaga sa pagsusuri ng ilang klinikal na anyo ng syphilitic infection, gayundin sa pagsubaybay sa pagiging epektibo ng paggamot. Sa kasalukuyan, ang reaksyon ng Wasserman ay ginagawa gamit ang dalawang antigens (cardiolipin at treponemal voiced Reiter strain). Bilang isang patakaran, ang RV ay nagiging positibo sa 5-6 na linggo pagkatapos ng impeksyon sa 25-60% ng mga pasyente, sa 7-8 na linggo - sa 75-96%, sa 9-19 na linggo - sa 100%, kahit na sa mga nakaraang taon minsan mas maaga. o mamaya. Kasabay nito, ang titer ng reagin ay unti-unting tumataas at umabot sa pinakamataas na halaga (1:160-1:320 at pataas) sa kaso ng mga pangkalahatang pantal (pangalawang sariwang syphilis). Kapag positibo ang RV, ginagawa ang diagnosis ng pangunahing seropositive syphilis.
Sa pangalawang sariwang at pangalawang paulit-ulit na syphilis, ang RV ay positibo sa 100% ng mga pasyente, ngunit sa mga maubos na pasyente na may mahinang kaligtasan sa sakit, ang isang negatibong resulta ay maaaring maobserbahan. Kasunod nito, ang reagin titer ay unti-unting bumababa at sa kaso ng pangalawang paulit-ulit na syphilis ito ay karaniwang hindi lalampas sa 1:80-1:120.
Para sa tertiary syphilis Ang RV ay positibo sa 65-70% ng mga pasyente at isang mababang titer ng reagin ay karaniwang sinusunod (1:20-1:40). Sa mga huling anyo ng syphilis (syphilis ng mga panloob na organo, sistema ng nerbiyos), ang positibong RV ay sinusunod sa 50-80% ng mga kaso. Ang reagin titer ay mula 1:5 hanggang 1:320.
Para sa latent syphilis Ang positibong RV ay sinusunod sa 100% ng mga pasyente. Ang reagin titer ay mula 1:80 hanggang 1:640, at may late latent syphilis mula 1:10 hanggang 1:20. Ang mabilis na pagbaba ng reagin titer (hanggang sa kumpletong negatibiti) sa panahon ng paggamot ay nagpapahiwatig ng pagiging epektibo ng paggamot.
Mga disadvantages ng reaksyon ng Wasserman- hindi sapat na sensitivity (negatibo sa unang yugto ng pangunahing syphilis). Negatibo din ito sa 1/3 ng mga pasyente kung nagamot na sila sa mga antibiotic sa nakaraan, sa mga pasyenteng may tertiary active syphilis na may mga sugat sa balat at mucous membrane, osteoarticular apparatus, internal organs, central nervous system, at may late congenital. syphilis.
Kakulangan ng pagtitiyak- ang reaksyon ng Wasserman ay maaaring maging positibo sa mga taong hindi pa nagkaroon at walang syphilis. Sa partikular, ang mga false-positive (nonspecific) na mga resulta ng RV ay sinusunod sa mga pasyente na dumaranas ng systemic lupus erythematosus, leprosy, malaria, malignant neoplasms, pinsala sa atay, malawak na myocardial infarction at iba pang mga sakit, at kung minsan sa ganap na malusog na mga tao.
May nakitang panandaliang maling positibong reaksyon ng Wasserman sa ilang kababaihan bago o pagkatapos ng panganganak, sa mga umaabuso sa droga, pagkatapos ng anesthesia, o pag-inom ng alak. Bilang isang panuntunan, mahina ang pagpapahayag ng false-positive RV, kadalasang may mababang titer ng reagin (1:5-1:20), positibo (3+) o mahinang positibo (2+). Sa panahon ng mass serological survey, ang dalas ng maling positibong resulta ay 0.1-0.15%. Upang mapagtagumpayan ang hindi sapat na sensitivity, ginagamit nila ang malamig na pagsubok (reaksyon ng Kolyar) at sa parehong oras ito ay ginanap sa iba pang mga serological reaksyon.
Mga sedimentary na reaksyon ng Kahn at Sachs-Vitebsky
Ang reaksyon ng Wasserman ay ginagamit sa kumbinasyon ng dalawa sedimentary reactions (Kahn at Sachs-Vitebsky), kapag itinanghal, mas puro antigens ang inihahanda. Express method (microreaction on glass) - tumutukoy sa mga reaksyon ng lipid at batay sa reaksyon ng pag-ulan. Ito ay inilalagay sa isang tiyak na cardiolipin antigen, 1 patak nito ay halo-halong may 2-3 patak ng test blood serum sa mga balon ng isang espesyal na glass plate.Advantage- bilis ng pagtanggap ng tugon (sa 30-40 minuto). Ang mga resulta ay tinasa ayon sa dami ng sediment na nadeposito at sa laki ng mga natuklap. Ang pagpapahayag ay tinukoy bilang CSR - 4+, 3+, 2+ at negatibo. Dapat tandaan na ang mga maling positibong resulta ay mas madalas na sinusunod kaysa sa RV. Bilang isang patakaran, ang express na paraan ay ginagamit para sa mass examinations para sa syphilis, para sa mga eksaminasyon sa clinical diagnostic laboratories, somatic department at ospital. Batay sa mga resulta ng express method, ang diagnosis ng syphilis ay ipinagbabawal; ang paggamit nito sa mga buntis na kababaihan, mga donor, pati na rin para sa kontrol pagkatapos ng paggamot ay hindi kasama.
Treponema pallidum immobilization reaction (TPI)
Treponema pallidum immobilization reaction (TPI)- iminungkahi noong 1949 nina R. W. Nelson at M. Mayer. Ito ang pinaka tiyak na pagsusuri sa diagnostic para sa syphilis. Gayunpaman, ang pagiging kumplikado at mataas na gastos ng produksyon ay naglilimita sa paggamit nito. Sa serum ng dugo ng mga pasyente, ang mga antibodies na partikular sa video (immobilsins) ay tinutukoy, na humahantong sa kawalang-kilos ng Treponema pallidum sa pagkakaroon ng pandagdag. Ang antigen ay live pathogenic na Treponema pallidum na nakahiwalay sa mga kuneho na nahawaan ng syphilis. Gamit ang isang mikroskopyo, ang nawalang motility (immobilized) Treponema pallidum ay binibilang at ang mga resulta ng RIBT ay tinasa: ang immobilization ng Treponema pallidum mula 51 hanggang 100% ay positibo; mula 31 hanggang 50% - mahinang positibo; mula 21 hanggang 30% - nagdududa; mula 0 hanggang 20% - negatibo.Mahalaga ang RIBT sa differential diagnosis upang makilala ang mga maling positibong serological na reaksyon mula sa mga reaksyong dulot ng syphilis. Ang huli ay nagiging positibo kaysa sa RV, RIF at samakatuwid hindi ito ginagamit upang masuri ang mga nakakahawang anyo ng syphilis, bagaman sa pangalawang panahon ng syphilis ito ay positibo sa 85-100% ng mga pasyente.
Sa tertiary period ng syphilis na may pinsala sa mga panloob na organo, musculoskeletal system, at nervous system, ang RIBT ay positibo sa 98-100% ng mga kaso ( Madalas negatibo ang RV).
Dapat tandaan na ang RIBT ay maaaring false positive kung ang test serum ay naglalaman ng mga treponemocidal na gamot (penicillin, tetracycline, macrolites, atbp.), na nagiging sanhi ng hindi tiyak na immobilization ng Treponema pallidum. Para sa layuning ito, ang dugo ay sinusuri para sa RIBT nang hindi mas maaga kaysa sa 2 linggo pagkatapos ng pagtatapos ng pag-inom ng mga antibiotic at iba pang mga gamot.
Ang RIBT, tulad ng RIF, ay dahan-dahang negatibo sa panahon ng proseso ng paggamot, kaya hindi ito ginagamit bilang kontrol sa panahon ng proseso ng paggamot.
Immunofluorescence reaction (RIF)
Immunofluorescence reaction (RIF)- binuo noong 1954 ng A.Coons at unang ginamit para sa diagnosis ng syphilitic infection ni Deacon, Falcone, Harris noong 1957. Ang RIF ay batay sa isang hindi direktang pamamaraan para sa pagtukoy ng mga fluorescent antibodies. Ang antigen para sa produksyon ay tissue pathogenic Treponema pallidum na naayos sa mga glass slide, kung saan inilapat ang test serum. Kung ang test serum ay naglalaman ng mga anti-treponemal antibodies na may kaugnayan sa IgM at IgG, malakas silang nagbubuklod sa antigen - treponema, na nakita sa isang fluorescent microscope gamit ang mga anti-species ("anti-human") fluorescent serum.Mga resulta ng RIF ay isinasaalang-alang sa pamamagitan ng intensity ng glow ng maputlang treponema sa paghahanda (dilaw-berdeng glow). Sa kawalan ng antitreponemal antibodies sa suwero, ang treponema pallidum ay hindi napansin. Sa pagkakaroon ng mga antibodies, ang isang glow ng maputlang treponema ay napansin, ang antas ng kung saan ay ipinahayag sa mga plus: 0 at 1+ - negatibong reaksyon; mula 2+ hanggang 4+ - positibo.
Ang RIF ay tumutukoy sa mga reaksyon ng treponemal ng grupo at ibinibigay sa isang 10- at 200-tiklop na pagbabanto ng test serum (RIF-10 at RIF-200). Ang RIF-10 ay itinuturing na mas sensitibo, ngunit ang hindi tiyak na positibong mga resulta ay madalas na nakukuha kaysa sa RIF-200 (ito ay may mas mataas na pagtitiyak). Karaniwan, Ang RIF ay nagiging positibo nang mas maaga kaysa sa RV- positibo sa pangunahing seronegative syphilis sa 80% ng mga pasyente, sa 100% sa pangalawang panahon ng syphilis, palaging positibo sa latent syphilis at sa 95-100% ng mga kaso sa late form at congenital syphilis.
Pagtitiyak ng RIF tumataas pagkatapos ng pre-treatment ng test serum na may sorbent-ultrasonic treponemal antigen, na nagbubuklod sa mga antibodies ng grupo (RIF - abs).
Mga indikasyon para sa RIBT at RIF- diagnosis ng latent syphilis upang kumpirmahin ang pagiging tiyak ng complex ng mga reaksyon ng lipid sa kaso ng pinaghihinalaang impeksyon sa syphilitic batay sa isang positibong RV. Ang positibong RIBT at RIF ay katibayan ng latent syphilis. Sa kaso ng false-positive RV sa iba't ibang sakit (systemic lupus erythematosus, malignant neoplasms, atbp.) at kung ang paulit-ulit na resulta ng RIBT at RIF ay negatibo, ito ay nagpapahiwatig ng hindi tiyak na katangian ng RV. Hinala ng late syphilitic lesions ng internal organs, musculoskeletal system, nervous system kung ang mga pasyente ay may negatibong RV. Ang hinala ng pangunahing seronegative syphilis, kapag sa mga pasyente na may paulit-ulit na pag-aaral ng paglabas mula sa ibabaw ng isang pagguho (ulser), pagbutas mula sa pinalaki na mga rehiyonal na lymph node, ang treponema pallidum ay hindi napansin - sa kasong ito, ang RIF - 10 lamang ang ibinibigay.
Kapag sinusuri ang mga taong may negatibong RV na nagkaroon ng pangmatagalang pakikipagtalik at pakikipag-ugnayan sa bahay sa mga pasyenteng may syphilis, na isinasaalang-alang ang malamang na posibilidad na gamutin sila kamakailan gamit ang mga anti-syphilitic na gamot na nagdulot ng negatibong RV. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA - enzymelinked immunosorbent assay) - paraan na binuo ni E. Engvall et al., S. Avrames (1971). Ang esensya ay binubuo sa pagsasama-sama ng isang syphilitic antigen na na-sorbed sa ibabaw ng isang solid-phase carrier na may antibody mula sa blood serum na pinag-aaralan at pagtukoy ng isang partikular na antigen-antibody complex gamit ang enzyme-labeled anti-species immune blood serum. Pinapayagan ka nitong suriin ang mga resulta ng ELISA nang biswal sa pamamagitan ng antas ng pagbabago sa kulay ng substrate sa ilalim ng pagkilos ng enzyme na kasama sa conjugate. Ang hindi maaasahang mga resulta ng ELISA ay maaaring mangyari bilang resulta ng hindi sapat na pagbabanto ng mga sangkap, paglabag sa mga kondisyon ng temperatura at oras, hindi pagkakapare-pareho ng pH ng mga solusyon, kontaminasyon ng mga kagamitang babasagin sa laboratoryo, at hindi tamang pamamaraan para sa paghuhugas ng media.
Passive hemagglutination reaction (RPHA)
Iminungkahi bilang diagnostic test para sa syphilis ni T.Rathlev (1965,1967), T.Tomizawa (1966). Ang macromodification ng reaksyon ay tinatawag na TRHA, ang micromodification ay MNA-TR, ang automated na bersyon ay AMNA-TR, ang reaksyon na may polyurea macrocapsule sa halip na mga pulang selula ng dugo ay MSA-TR. Ang sensitivity at specificity ng RPGA ay katulad ng RIBT, RIF, ngunit ang RPGA ay may mas kaunting sensitivity sa mga unang anyo ng syphilis kumpara sa RIF-abs at mas mataas na sensitivity sa mga susunod na anyo ng congenital syphilis. Ang RPGA ay inihahatid sa qualitative at quantitative na mga bersyon.Teknik sa pagkolekta ng dugo para sa mga serological na pagsusuri
Upang mag-aral para sa RV, RIF, RIBT, ang dugo ay kinukuha mula sa ulnar vein sa walang laman na tiyan o hindi mas maaga sa 4 na oras pagkatapos kumain gamit ang isang sterile syringe o isang karayom (sa pamamagitan ng gravity). Sa site ng koleksyon, ang balat ay pre-treat na may 70% na alkohol. Ang hiringgilya at karayom ay dapat hugasan ng isotonic sodium chloride solution. Ang 5-7 ML ng test blood ay ibinubuhos sa isang malinis, tuyo, malamig na tubo ng pagsubok. Ang isang blangkong piraso ng papel na may apelyido ng pasyente, mga inisyal, kasaysayan ng medikal o numero ng card ng outpatient, at ang petsa ng koleksyon ng dugo ay nakadikit sa test tube. Pagkatapos kumuha ng dugo, ang test tube ay inilalagay sa refrigerator na may temperatura na +4°+8°C hanggang sa susunod na araw. Sa susunod na araw, ang serum ay pinatuyo para sa pagsubok. Kung ang dugo ay hindi ginamit sa susunod na araw, ang serum ay dapat na pinatuyo mula sa namuong dugo at nakaimbak sa refrigerator nang hindi hihigit sa 1 linggo. Para sa RIBT testing, ang test tube ay dapat na espesyal na inihanda at sterile. Sa kaso ng paglabag sa mga patakaran para sa pagkolekta ng dugo para sa pananaliksik, ang hindi pagsunod sa mga kondisyon ay maaaring magresulta sa pagbaluktot ng mga resulta.Hindi inirerekumenda na kumuha ng dugo para sa pagsusuri pagkatapos kumain, uminom ng alak, uminom ng iba't ibang mga gamot, pagkatapos magbigay ng iba't ibang mga bakuna, o sa panahon ng panregla sa mga kababaihan.
Para sa pananaliksik gamit ang express method, ang dugo ay kinuha mula sa dulo ng daliri, tulad ng ginagawa kapag kumukuha ito para sa ESR, ngunit ang dugo ay kinuha mula sa 1 capillary pa. Ang express method ay maaari ding gawin gamit ang blood serum na nakuha sa pamamagitan ng venipuncture. Kung may pangangailangan para sa pagsusuri ng dugo sa mga malalayong laboratoryo, ang dry serum ay maaaring ipadala sa halip na dugo (dry drop method). Upang gawin ito, sa susunod na araw pagkatapos ng pagkuha ng dugo, ang suwero ay pinaghihiwalay mula sa namuong dugo at iginuhit sa isang sterile syringe sa halagang 1 ml. Pagkatapos ang serum ay ibubuhos sa anyo ng 2 magkahiwalay na bilog sa isang strip ng makapal na papel na pansulat (wax paper o cellophane) na may sukat na 6x8 cm. Ang apelyido, mga inisyal ng paksa at ang petsa ng pag-sample ng dugo ay nakasulat sa libreng gilid ng papel. Ang papel na may suwero ay protektado mula sa direktang sikat ng araw at iniwan sa temperatura ng silid hanggang sa susunod na araw. Ang serum ay natutuyo sa anyo ng maliliit na bilog ng isang makintab na madilaw-dilaw na malasalamin na pelikula. Pagkatapos nito, ang mga piraso ng papel na may pinatuyong serum ay pinagsama tulad ng pulbos ng parmasyutiko at ipinadala sa laboratoryo, na nagpapahiwatig ng diagnosis at ang layunin kung saan ito sinusuri.
Serological na pagtutol
Sa ilang (2% o higit pa) na mga pasyente na may syphilis, sa kabila ng kumpletong antisyphilitic therapy, mayroong isang pagbagal (kawalan) ng mga negatibong serological reaksyon pagkatapos ng pagtatapos ng paggamot hanggang sa 12 buwan o higit pa. Ang tinatawag na serological resistance ay nangyayari, na naging madalas na sinusunod sa mga nakaraang taon. Mayroong mga anyo ng serological resistance:- totoo(absolute, unconditional) - kinakailangan na magsagawa ng karagdagang anti-syphilitic na paggamot, na pinagsama sa nonspecific na therapy upang mapataas ang immune forces ng katawan.
- Kamag-anak- pagkatapos ng buong paggamot, ang treponema pallidums ay bumubuo ng cyst o L-form, na nasa katawan sa isang mababang-virulent na estado at, bilang isang resulta, ang karagdagang paggamot ay hindi nagbabago sa mga tagapagpahiwatig ng serological reaksyon, lalo na ang RIF at RIBT.
Pseudo-resistance- pagkatapos ng paggamot, sa kabila ng mga positibong reaksyon ng serological, ang Treponema pallidum ay wala sa katawan. Walang antigen sa katawan, ngunit ang produksyon ng mga antibodies ay nagpapatuloy, na nakikita sa panahon ng serological reaksyon.
Maaaring umunlad ang serological resistance dahil sa:
- hindi sapat na paggamot nang hindi isinasaalang-alang ang tagal at yugto ng sakit;
- hindi sapat na dosis at lalo na dahil sa kabiguan na isaalang-alang ang bigat ng katawan ng mga pasyente;
- paglabag sa agwat sa pagitan ng pangangasiwa ng gamot;
- pagtitiyaga ng treponema pallidum sa katawan sa kabila ng kumpletong tiyak na paggamot, dahil sa kanilang paglaban sa penicillin at iba pang mga chemotherapy na gamot sa pagkakaroon ng mga nakatagong, encysted lesyon sa mga panloob na organo, nervous system, lymph nodes, na hindi naa-access sa mga antibacterial na gamot (treponema pallidum ay madalas na matatagpuan sa mga tisyu ng peklat maraming taon pagkatapos ng pagtatapos ng therapy, sa mga lymph node kung minsan ay posible na makita ang treponema pallidum 3-5 taon pagkatapos ng antisyphilitic therapy);
- pagbawas ng mga pwersang proteksiyon sa iba't ibang sakit at pagkalasing (endocrinopathies, alkoholismo, pagkagumon sa droga, atbp.);
- pangkalahatang pagkahapo (pagkain ng pagkain na mahina sa bitamina, protina, taba).
- magkakasamang nonspecific na sakit ng mga panloob na organo, mga karamdaman ng cardiovascular system, rayuma, dysfunction ng endocrine at nervous system, malubhang talamak na dermatoses, malignant neoplasms;
- pinsala sa nervous system (malubhang pinsala, concussion, mental trauma);
- pagbubuntis; talamak na pagkalasing sa alkohol, nikotina, droga; mga nakakahawang sakit (malaria, tuberculosis, viral hepatitis, dysentery, tipus, tipus at umuulit na lagnat).
Ang immunofluorescence reaction (RIF) ay isang serological reaction na nagbibigay-daan sa pagtuklas ng mga antibodies sa mga kilalang antigens. Ang pamamaraan ay nagsasangkot ng microscopy ng stained smears.
Ang reaksyong ito ay ginagamit sa immunology, virology at microbiology. Pinapayagan ka nitong matukoy ang pagkakaroon ng mga virus, bakterya, fungi, protozoa at ICC. Ang RIF ay napakalawak na ginagamit sa diagnostic practice para sa pagtuklas ng mga viral at bacterial antigens sa nakakahawang materyal. Ang pamamaraan ay batay sa kakayahan ng isang fluorochrome na magbigkis sa mga protina nang hindi nakakagambala sa kanilang immunological specificity. Pangunahing ginagamit sa pagsusuri ng mga impeksyon sa ihi.
Mayroong mga sumusunod na pamamaraan para sa pagsasagawa ng immunofluorescence reaksyon: direkta, hindi direkta, na may pandagdag. Ang direktang paraan ay nagsasangkot ng paglamlam sa materyal na may mga fluorochromes. Dahil sa kakayahan ng microbial o tissue antigens na kumikinang sa mga sinag ng UV ng isang fluorescence microscope, ang mga ito ay tinukoy bilang mga cell na may maliwanag na kulay na berdeng hangganan.
Ang hindi direktang pamamaraan ay nagsasangkot ng pagtukoy sa antigen+antibody complex. Upang gawin ito, ang pang-eksperimentong materyal ay ginagamot ng mga antibodies mula sa antimicrobial rabbit serum na inilaan para sa mga diagnostic. Matapos magbigkis ang mga antibodies sa mga mikrobyo, ihihiwalay sila sa mga hindi nakagapos at ginagamot ng isang serum na anti-kuneho na may label na fluorochrome. Pagkatapos nito, ang complex ng microbe + animicrobial antibodies + anti-rabbit antibodies ay tinutukoy gamit ang isang ultraviolet microscope sa parehong paraan tulad ng sa direktang paraan.
Ang reaksyon ng immunofluorescence ay kailangang-kailangan sa pagsusuri ng syphilis. Sa ilalim ng impluwensya ng fluorochrome, ang causative agent ng syphilis ay nakilala bilang isang cell na may dilaw-berdeng hangganan. Ang kawalan ng luminescence ay nangangahulugan na ang pasyente ay hindi nahawaan ng syphilis. Ang pagsusulit na ito ay madalas na inireseta para sa isang positibong reaksyon ng Wasserman. Ang pamamaraang ito ay napaka-epektibo sa pagsusuri, dahil pinapayagan ka nitong makilala ang pathogen sa mga unang yugto ng sakit.
Bilang karagdagan sa katotohanan na pinapayagan ka ng RIF na mag-diagnose ng syphilis, ginagamit din ito upang matukoy ang pagkakaroon ng mga pathogen tulad ng chlamydia, mycoplasma, trichomonas, pati na rin ang mga pathogens ng gonorrhea at genital herpes.
Para sa pagsusuri, ginagamit ang mga smear o venous blood. Ang pamamaraan para sa pagkuha ng isang smear ay ganap na walang sakit at hindi nagdudulot ng anumang panganib. Ito ay kinakailangan upang maghanda para sa pagsusuri na ito. Labindalawang oras bago hindi inirerekomenda na gumamit ng mga produktong pangkalinisan tulad ng malo o gels. Gayundin, kung minsan, ayon sa mga indikasyon ng doktor, ang provocation ay isinasagawa. Upang gawin ito, inirerekumenda na kumain ng maanghang na pagkain o alkohol, o mag-iniksyon ng isang nakakapukaw na sangkap, tulad ng gonovaccine o pyrogenal. Bilang karagdagan, ang agwat sa pagitan ng pagkuha ng mga antibacterial na gamot at pagkuha ng pagsusulit ay dapat na hindi bababa sa labing-apat na araw.
Kapag tinatasa ang mga resulta, dapat isaalang-alang ng isa ang katotohanan na ang luminescence ay sinusunod hindi lamang sa mga nabubuhay na bakterya, kundi pati na rin sa mga patay, lalo na itong nalalapat sa chlamydia. Pagkatapos ng isang kurso ng antibiotics, ang mga patay na selula ng chlamydia ay kumikinang din.
Sa wastong paghahanda ng pasyente at pagsunod sa pamamaraan ng smear taking, ang pagsusuri na ito ay nagpapahintulot sa iyo na makilala ang mga sakit sa mga unang yugto, na napakahalaga para sa napapanahong paggamot. Ang mga positibong aspeto ng pamamaraang ito ay ang maikling panahon upang makakuha ng mga resulta, kadalian ng pagpapatupad at mababang halaga ng pagsusuri.
Kasama sa mga kawalan ang katotohanan na ang isang medyo malaking halaga ng materyal sa pagsubok ay kinakailangan upang maisagawa ang pagsusuri. Bilang karagdagan, ang isang nakaranasang espesyalista lamang ang dapat suriin ang mga resulta.
Immunofluorescence reaction (RIF, paraan ng Koons) ay isang mabilis na paraan ng diagnostic para sa pagtukoy ng mga microbial antigens o pagtukoy ng mga antibodies. Ang RIF ay batay sa paggamit fluorescein isothiocyanate¾ FITC o iba pang mga fluorochrome, na nauugnay sa kemikal, pinagsama sa AT. Kasabay nito, ang may label na Abs ay nagpapanatili ng immunological specificity at nakikipag-ugnayan sa mahigpit na tinukoy na corpuscular Ags.
Mayroong dalawang pangunahing uri ng pamamaraan: direkta at hindi direkta.
Direktang paraan ng RIF ay batay sa katotohanan na ang mga tissue antigens o microbes na ginagamot ng tukoy na sera na may mga antibodies na may label na fluorochromes ay maaaring kumikinang sa mga sinag ng UV ng isang fluorescent microscope. Ang mga bakterya sa isang smear na ginagamot sa tulad ng isang luminescent serum glow kasama ang paligid ng cell sa anyo ng isang berde o dilaw na hangganan.
Hindi direktang paraan ng RNIF binubuo ng pagtukoy sa antigen-antibody complex gamit ang antiglobulin (anti-antibody) serum na may label na fluorochrome. Upang gawin ito, ang mga smear mula sa mga microbes na pinag-aaralan ay ginagamot ng mga antibodies mula sa antimicrobial rabbit diagnostic serum. Pagkatapos ay ang mga antibodies na hindi nakagapos ng mga microbial antigens ay hinuhugasan, at ang mga antibodies na natitira sa mga microbes ay makikita sa pamamagitan ng paggamot sa smear na may antiglobulin (anti-rabbit) serum na may label na fluorochromes. Bilang resulta, nabuo ang isang complex ng microbe + antimicrobial rabbit antibodies + anti-rabbit antibodies na may label na fluorochrome. Ang kumplikadong ito ay sinusunod sa isang fluorescent microscope, tulad ng sa direktang pamamaraan.
Mekanismo, mga layunin ng enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), mga sangkap
Solid phase ELISA ay ang pinaka-karaniwang bersyon ng ELISA, kapag ang isa sa mga bahagi ng immune reaksyon (antigens o antibodies) ay sorbed sa isang solid carrier, halimbawa, sa mga balon ng polystyrene microplates (Fig. 27). Kapag tinutukoy ang mga antibodies, ang blood serum ng pasyente, antiglobulin serum na may label na enzyme, substrate para sa enzyme (H 2 O 2 o phosphatide) at isang chromogen (isang indicator na nagpapakulay sa produkto ng fermentation) ay sunud-sunod na idinaragdag sa mga balon ng microplate na may sorbed antigens. Sa bawat oras pagkatapos magdagdag ng isa pang sangkap, ang mga hindi nakatali na reagents ay aalisin mula sa mga balon sa pamamagitan ng masusing paghuhugas. Kung positibo ang resulta, nagbabago ang kulay ng chromogen solution. Ang isang solid-phase carrier ay maaaring maging sensitibo hindi lamang sa antigen, kundi pati na rin sa mga antibodies. Pagkatapos ang ninanais na antigen ay idinagdag sa mga balon na may sorbed antibodies, ang immune serum laban sa antigen na may label na enzyme ay idinagdag, at pagkatapos ay isang substrate para sa enzyme at isang chromogen ay idinagdag.
kanin. 27. Ang prinsipyo ng ELISA para sa pagtuklas ng mga antimicrobial antibodies
Mekanismo, sangkap ng radioimmunoassay (RIA)
Radioimmunoassay (RIA)¾isang napakasensitibong pamamaraan batay sa reaksyon ng antigen-antibody gamit ang mga antigen o antibodies na may label na radioisotopes (l25 J, 14 C, 3 H, 51 Cr, atbp.). Pagkatapos ng kanilang pakikipag-ugnayan, ang nagreresultang radioactive immune complex ay pinaghihiwalay at ang radioactivity nito ay tinutukoy sa naaangkop na counter (beta o gamma radiation): ang intensity ng radiation ay direktang proporsyonal sa bilang ng mga nakagapos na antigen at antibody molecule. Sa solid-phase na bersyon ng RIA, ang isa sa mga sangkap ng reaksyon (antigen o antibodies) ay na-sorbed sa isang solidong carrier, halimbawa, sa mga balon ng polystyrene micropanels. Sa isa pang bersyon ng pamamaraan, ang mapagkumpitensyang RIA, ang gustong antigen at ang antigen na may label na radionuclide ay nakikipagkumpitensya sa isa't isa para sa pagbubuklod ng limitadong halaga ng immune serum antibodies. Ang pagpipiliang ito ay ginagamit upang matukoy ang dami ng antigen sa materyal ng pagsubok. Ginagamit ang RIA upang matukoy ang mga microbial antigens, matukoy ang mga hormone, enzyme, gamot at immunoglobulin, pati na rin ang iba pang mga sangkap na nakapaloob sa materyal ng pagsubok sa mababang konsentrasyon ng ¾ 10 -10 -10 -12 g/l.
Sa kasalukuyan, ang serological reactions (SR) ay malawakang ginagamit, kung saan ang mga may label na antigens o antibodies ay kasangkot. Kabilang dito ang immunofluorescence reaction, radioimmune at enzyme immunoassay method, immunoblotting reaction, flow cytometry at electron microscopy.
Nag-aplay sila:
1) para sa serodiagnosis ng mga nakakahawang sakit, ibig sabihin, upang makita ang mga antibodies gamit ang isang hanay ng mga kilalang conjugated (chemically combined) antigens na may iba't ibang mga label (enzymes, fluorochrome dyes);
2) upang matukoy ang isang microorganism o ang serovar nito gamit ang standard na may label na diagnostic antibodies (mabilis na diagnostics).
Ang diagnostic sera ay inihahanda sa pamamagitan ng pagbabakuna ng mga hayop na may naaangkop na antigen, pagkatapos ay ihihiwalay ang mga immunoglobulin at pinagsasama-sama ng mga makinang na tina (fluorochromes), enzymes, at radioisotopes.
Ang mga diagnostic monoclonal antibodies ay ginawa gamit ang mga hybrid na selula na nabuo sa pamamagitan ng pagsasama ng isang immune B lymphocyte sa isang myeloma cell. Ang mga Hybridoma ay may kakayahang mabilis na dumami sa vitro sa cell culture at makagawa ng immunoglobulin na katangian ng kinuhang B-lymphocyte.
Ang mga may label na SR ay hindi mababa sa pagiging tiyak sa iba pang mga SR, at sa kanilang pagiging sensitibo ay mas mataas sila sa lahat ng mga SR.
Immunofluorescence reaction (RIF)
Ang mga makinang fluorochrome dyes (fluorescein isothiocyanate, atbp.) ay ginagamit bilang mga label.
Mayroong iba't ibang mga pagbabago ng RIF. Para sa express diagnostics ng mga nakakahawang sakit, ang Koons RIF ay ginagamit upang matukoy ang mga mikrobyo o ang kanilang mga antigen sa materyal na pinag-aaralan.
Mayroong dalawang paraan ng RIF ayon kay Koons: direkta at hindi direkta.
Mga direktang bahagi ng RIF:
1) pagsubok na materyal (dumi, nasopharyngeal discharge, atbp.);
2) may label na tiyak na immune serum na naglalaman ng mga antibodies sa nais na antigen;
3) isotonic sodium chloride solution.
Ang isang pahid mula sa materyal na pansubok ay ginagamot ng may label na antiserum.
Ang reaksyon ng AG-AT ay nangyayari. Sa panahon ng luminescent microscopic na pagsusuri, ang fluorescence ng label ay nakita sa lugar kung saan ang mga AG-AT complex ay naisalokal (Fig. 34).
Mga bahagi hindi direktang RIF na nilayon para sa mabilis na pagsusuri ng trangkaso A:
1) ang materyal ng pagsubok ay hugasan mula sa nasopharynx ng isang pasyente na may pinaghihinalaang trangkaso;
2) tiyak na antiserum na may mga antibodies laban sa influenza A virus;
3) antiglobulin serum (AT laban sa immunoglobulin), na may label na fluorochrome;
4) isotonic sodium chloride solution.
Ang isang pahid mula sa materyal na pansubok ay unang ginagamot ng immune serum sa nais na antigen, at pagkatapos ay may label na antiglobulin serum.
Ang mga immune complex na AG-AT - may label na AT ay nakita gamit ang isang fluorescent microscope.
Ang bentahe ng hindi direktang pamamaraan ay hindi na kailangang maghanda ng malawak na hanay ng fluorescent specific sera, ngunit isang fluorescent antiglobulin serum lamang ang ginagamit.
Para sa serological diagnosis ng influenza A, ibig sabihin, upang matukoy ang mga antibodies laban sa influenza A virus sa paggamit ng serum ng dugo hindi direktang RIF gumamit ng influenza diagnosticum (influenza A virus antigen). Ang serodiagnosis ng mga impeksyon sa viral ay higit sa lahat ay retrospective sa kalikasan at ginagamit upang kumpirmahin ang diagnosis at epidemiological analysis.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): mapagkumpitensyang paraan (pagtukoy ng HBs-AG ng hepatitis B virus) at hindi direktang pamamaraan (serological diagnosis ng HIV infection)
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Ang mga enzyme ay ginagamit bilang mga label: peroxidase, alkaline phosphatase, atbp.
Ang isang tagapagpahiwatig ng isang reaksyon ay ang kakayahan ng mga enzyme na magdulot ng mga reaksyon ng kulay kapag kumikilos sa naaangkop na substrate. Halimbawa, ang substrate para sa peroxidase ay isang solusyon ng orthophenyldiamine (OPD) o tetramethylbenzidine (TMB).
Ang pinaka-tinatanggap na ginagamit ay solid-phase ELISA (Larawan 35), hindi direkta at mapagkumpitensyang mga pamamaraan (Larawan 36).
Ang mga resulta ng ELISA ay maaaring masuri nang biswal at sa pamamagitan ng pagsukat ng optical density sa isang spectrophotometer (ELISA analyzer).
Ang mga pakinabang ng ELISA ay kinabibilangan ng:
Ang pagiging simple ng mga paraan ng pagtatasa ng reaksyon;
Katatagan ng conjugates;
Madaling pumayag sa automation.
Ang mga sumusunod na uri ng ELISA ay ibinigay bilang mga halimbawa:
A) uri ng mapagkumpitensya
Idinisenyo para sa pagtuklas ng hepatitis B virus surface antigen (HBs Ag) sa serum at plasma ng dugo para sa diagnosis ng viral hepatitis B at pagpapasiya ng HBs Ag carriage.
Mga Bahagi:
1) materyal ng pagsubok - suwero o plasma ng dugo;
2) antibodies sa HBs Ag, adsorbed sa ibabaw ng balon ng isang polystyrene microplate;
3) conjugate - mouse monoclonal antibodies sa HBs Ag, na may label na peroxidase;
4) orthophenylenediamine (OPD) - substrate;
5) phosphate-saline buffer;
6) control sera:
Positibo (serum na may HBs Ag);
Negatibo (serum na walang HBs Ag).
Pag-unlad:
2. Incubation 1 oras sa 37°C.
3. Paghuhugas ng mga butas.
4. Pagdaragdag ng conjugate.
5. Incubation 1 oras sa 37°C.
6. Paghuhugas ng mga butas.
7. Pagpasok sa OFD. Sa pagkakaroon ng HBs Ag, ang solusyon sa mga balon ay nagiging dilaw.
8. Ang bilang ng ELISA ay isinasagawa sa pamamagitan ng optical density gamit ang isang photometer. Ang antas ng optical density ay magiging inversely proportional sa konsentrasyon ng Ag HBs na pinag-aaralan.
Ang reaksyon ay nangyayari sa tatlong yugto:
1. Ang HBs Ag ng test serum (plasma) ay nagbubuklod sa mga homologous antibodies na na-adsorb sa ibabaw ng balon. Ang IR AG-AT ay nabuo. (HBs Ag – anti HBs AT).
2. Ang mga antibodies sa HBs Ag, na may label na peroxidase, ay nagbubuklod sa mga natitirang libreng determinants ng HBs Ag sa AG-AT complex. Nabuo ang isang complex ng AT-AG na may label na AT (anti HBs AT - HBs Ag - anti HBs AT na may label na peroxidase).
3. Nakikipag-ugnayan ang OPD sa peroxidase ng AT-AG-AT complex at nangyayari ang dilaw na kulay.
B) hindi direktang uri
Ito ang pangunahing reaksyon sa pagsubok para sa pag-diagnose ng impeksyon sa HIV.
Layunin: Serological diagnosis ng HIV infection - pagtuklas ng mga antibodies sa HIV antigens.
Mga Bahagi:
1) test material – blood serum (AT hanggang HIV Ags);
2) synthetic peptides na ginagaya ang 2 antigens ng HIV: gp 120 at gp 41, na-adsorbed sa ibabaw ng balon ng polystyrene;
3) antiglobulin serum na may label na peroxidase, na nakuha sa pamamagitan ng pagbabakuna ng mga kuneho na may mga globulin ng tao (AT hanggang AT);
5) phosphate-buffered saline;
6) control sera:
Positibo;
Negatibo.
Pag-unlad:
1. Pagdaragdag ng kontrol at pagsubok na sera.
2. Incubation sa loob ng 30 minuto sa 37°C.
3. Paglalaba.
4. Pagdaragdag ng antiglobulin serum na may label na enzyme.
5. Incubation sa loob ng 30 minuto sa 37°C.
6. Paglalaba.
7. Pagpasok sa OFD.
Ang reaksyon ay nangyayari sa 3 yugto:
1. Ang mga antibodies sa HIV ng test serum ay nagbubuklod sa mga homologous antigens (gp 120 at gp 41), at ang IR AG-AT ay nabuo sa ibabaw ng sorbent (HIV Ag - AT sa HIV).
2. Pagbubuo ng IR AG-AT-AT, na may label na peroxidase, dahil Ang mga antibodies ng test serum ay mga antigen para sa antiglobulin serum.
3. Nakikipag-ugnayan ang OPD sa peroxidase ng AG-AT-AT complex, at nangyayari ang dilaw na kulay ng solusyon sa balon. Ang antas ng aktibidad ng enzymatic ay direktang proporsyonal sa konsentrasyon ng nasubok na mga antibodies.
61. Reaksyon ng immunofluorescence. Mekanismo, mga bahagi, aplikasyon. Direkta at hindi direktang paraan ng pagtatakda.
Mayroong tatlong pangunahing uri ng pamamaraan: direkta, hindi direkta (Larawan 13.10), na may pandagdag. Ang reaksyon ng Koons ay isang mabilis na paraan ng diagnostic para sa pagtukoy ng mga microbial antigens o pagtukoy ng mga antibodies.
Direktang paraan ng RIF ay batay sa katotohanan na ang mga tissue antigens o microbes na ginagamot sa immune sera na may mga antibodies na may label na fluorochromes ay maaaring kumikinang sa mga sinag ng UV ng isang fluorescent microscope. Ang mga bakterya sa isang smear na ginagamot sa gayong luminescent serum glow sa paligid ng cell sa ang anyo ng isang berdeng hangganan.
Hindi direktang paraan ng RIF binubuo ng pagtukoy sa antigen-antibody complex gamit ang antiglobulin (anti-antibody) serum na may label na fluorochrome. Upang gawin ito, ang mga smear mula sa isang suspensyon ng mga microbes ay ginagamot ng mga antibodies mula sa antimicrobial rabbit diagnostic serum. Pagkatapos ay ang mga antibodies na hindi nakagapos ng mga microbial antigens ay hinuhugasan, at ang mga antibodies na natitira sa mga microbes ay makikita sa pamamagitan ng paggamot sa smear na may antiglobulin (anti-rabbit) serum na may label na fluorochromes. Bilang resulta, nabuo ang isang complex ng microbe + antimicrobial rabbit antibodies + antirabbit antibodies na may label na fluorochrome. Ang kumplikadong ito ay sinusunod sa isang fluorescent microscope, tulad ng sa direktang pamamaraan.
Ang mga makinang fluorochrome dyes (fluorescein isothiocyanate, atbp.) ay ginagamit bilang mga label.
Mayroong iba't ibang mga pagbabago ng RIF. Para sa express diagnostics ng mga nakakahawang sakit, ang Koons RIF ay ginagamit upang matukoy ang mga mikrobyo o ang kanilang mga antigen sa materyal ng pagsubok.
Mayroong dalawang paraan ng RIF ayon kay Koons: direkta at hindi direkta.
Mga direktang bahagi ng RIF:
1) ang materyal na sinusuri (dumi na pinalabas ng nasopharynx, atbp.);
2) may label na tiyak na immune serum na naglalaman ng AT-la sa nais na antigen;
3) isotonic sodium chloride solution.
Ang isang pahid mula sa materyal na pansubok ay ginagamot ng may label na antiserum.
Ang reaksyon ng AG-AT ay nangyayari. Sa panahon ng isang luminescent microscopic na pagsusuri, ang fluorescence ay natukoy sa lugar kung saan ang mga AG-AT complex ay naisalokal.
Mga bahagi ng hindi direktang RIF:
1) ang materyal na pinag-aaralan;
2) tiyak na antiserum;
3) antiglobulin serum (AT-la laban sa immunoglobulin), na may label na fluorichrome;
4) Isotonic sodium chloride solution.
Ang isang pahid mula sa materyal na pansubok ay unang ginagamot ng immune serum sa nais na antigen, at pagkatapos ay may label na antiglobulin serum.
Luminescent AG-AT complexes - may label na AT ay nakita gamit ang isang fluorescent microscope.
Ang bentahe ng hindi direktang pamamaraan ay hindi na kailangang maghanda ng malawak na hanay ng fluorescent specific sera, ngunit isang fluorescent antiglobulin serum lamang ang ginagamit.
Mayroon ding 4 na bahagi na uri ng hindi direktang RIF, kapag ang pandagdag (guinea pig serum) ay ipinakilala din. Sa isang positibong reaksyon, nabuo ang isang complex ng AG-AT - may label na - AT-complement.