Pagkilala sa DNA virus polymerase chain reaction. Polymerase chain reaction (PCR). Kanino ito nakatalaga

Ang pagsasagawa ng PCR analysis (PCR diagnostics) ay nagsisimula sa pagkolekta ng materyal para sa pagsusuri ng isang gynecologist, urologist o dermatovenereologist. Ang kalidad at pagiging maaasahan ng mga resulta na kasunod na nakuha ay sinisiguro ng pinakamataas na kwalipikasyon at malawak na karanasan ng mga doktor ng sentrong medikal ng Euromedprestige, na sinusunod ang lahat ng kinakailangang mga patakaran para sa pagsasagawa ng pagsusuri sa PCR: kumpletong sterility, ang paggamit ng mga eksklusibong disposable na materyales.

Ang nakolektang materyal mula sa brush ay inilalagay sa isang lalagyan na may asin. Pagkatapos ng sampling, ang mga sample ay dapat maihatid sa PCR laboratory sa lalong madaling panahon.

Ang pagsusuri ng PCR sa laboratoryo ay nagaganap sa tatlong yugto:

1. Paghihiwalay ng DNA
2. Pagpapalakas ng mga fragment ng DNA
3. Pagtuklas ng mga produkto ng DNA amplification

Ang pagkuha ng DNA ay ang paunang yugto ng mga diagnostic ng PCR, ang kakanyahan nito ay ang mga sumusunod: kinukuha ng doktor ang materyal para sa pananaliksik mula sa pasyente at isasailalim ito sa espesyal na pagproseso. Sa panahon ng pagproseso, ang DNA double helix ay nahahati sa magkakahiwalay na mga hibla. Ang isang espesyal na likido ay idinagdag sa materyal ng pasyente, na natutunaw ang mga organikong sangkap na nakakasagabal sa "kadalisayan" ng reaksyon. Inaalis nito ang mga lipid, amino acid, peptides, carbohydrates, protina at polysaccharides. Ang resulta ay DNA o RNA.

Ang prinsipyo ng paraan ng PCR ay ang "bumuo" ng mga bagong impeksyon sa DNA o RNA. Hindi ito magagawa nang walang pag-alis ng cellular na materyal.

Ang dami ng oras na ginugol sa pagkuha ng DNA ay nakasalalay sa sanhi ng impeksyon at sa uri ng materyal na ginamit para sa pagsusuri sa PCR. Halimbawa, tumatagal ng 1.5-2 oras upang maihanda ang dugo para sa susunod na hakbang.

0Array ( => Mga Pagsusuri) Array ( => 2) Array ( =>.html) 2

Pagpapalakas ng DNA

Upang maisagawa ang susunod na yugto ng mga diagnostic ng DNA - pagpapalaki ng DNA - ginagamit ng mga doktor ang tinatawag na mga DNA matrice - mga molekula ng DNA ng mga impeksyon, kung saan ang DNA "cloning" ay kasunod na magaganap. Nabanggit na na ang pagkakaroon ng kumpletong DNA ng impeksyon ay hindi kinakailangan; para sa yugtong ito, sapat na ang isang maliit na piraso ng molekula ng DNA, na natatangi sa microbe na ito (impeksyon).

Sa puso ng DNA amplification at, nang naaayon, sa gitna ng buong prinsipyo ng reaksyon ng PCR ay ang natural na proseso ng pagkumpleto ng DNA para sa lahat ng nabubuhay na bagay - pagtitiklop ng DNA, na isinasagawa sa pamamagitan ng pagdodoble ng isang solong DNA chain.

Simula sa isang piraso ng DNA, kinokopya ito ng katulong sa laboratoryo at pinapataas ang bilang ng mga kopya sa isang chain reaction: pagkatapos ng unang cycle ay mayroon ka nang 2 fragment, pagkatapos ng pangalawang cycle - 4, pagkatapos ng pangatlo - 8, pagkatapos ng ikaapat - 16, pagkatapos ay 32, 64, 128, 256 ... Sa bawat cycle, ang bilang ng cycle, at pagkatapos ng thirty, doble na ang bilang ng mga kopya ty - sa bilyon-bilyon. Ang cycle ay tumatagal ng ilang minuto at nababawasan sa isang tiyak na pagbabago sa temperatura ng rehimen sa isang napakaliit na chemical reactor. Dito, sa sapat na dami, ang lahat ng mga kinakailangang sangkap ng synthesis ay nasa solusyon, una sa lahat, ang mga nucleotides A, G, T at C, pati na rin ang banayad na paghahanda ng mga kemikal na operasyon ay isinasagawa upang ang isang eksaktong kopya ay agad na ginawa mula sa bawat natapos na segment ng DNA, pagkatapos ay isang kopya ang ginawa mula sa kopyang ito muli, ito ang branched chain reaction.

Sa pamamagitan ng paglakip ng mga panimulang aklat sa kadena ng DNA - artipisyal na na-synthesize na "mga piraso" ng DNA (mga pares ng nucleotide) na katulad ng DNA ng mga mikrobyo (impeksyon) - dalawang maikli, na binubuo ng dalawang kadena ng mga seksyon ng DNA, ang mga helice ay nabuo, na kinakailangan para sa synthesis ng hinaharap na DNA.

Ang synthesis ng isang bagong chain ay nangyayari sa pamamagitan ng pagkumpleto ng bawat isa sa dalawang strand ng DNA. Ang proseso ng amplification ay nangyayari sa tulong ng isang tiyak na site - DNA polymerase, na nagbigay ng pangalan sa pamamaraan ng laboratoryo. Ang polymerase ay gumaganap bilang isang katalista para sa reaksyon at sinusubaybayan ang sunud-sunod na pagkakabit ng mga base ng nucleotide sa lumalaking bagong DNA strand.

Kaya, ang DNA amplification ay isang maramihang pagtaas sa bilang ng mga kopya ng DNA na tiyak, ibig sabihin, likas lamang sa isang partikular na organismo. Hindi na kailangang kumpletuhin ang buong DNA chain para makita ang causative agent ng impeksyon. Ang lugar lamang na katangian ng bacterium na ito bilang indibidwal ang kailangan.

5360 kuskusin. Ang halaga ng isang komprehensibong programa na may gastroenterologist

25% OFF SA RECEPTION NG ISANG CARDIOLOGIST

- 25%pangunahin
Pagbisita ng doktor
therapist sa katapusan ng linggo

5 160 kuskusin. sa halip na 5,420 rubles. Pagsusuri ng mga lalaki para sa mga impeksyon sa urolohiya

ALERGOLOHIYA 5 120 kuskusin. sa halip na 5,590 rubles.

Ang lahat ng maraming paulit-ulit na hakbang ng amplification ay nangyayari sa iba't ibang temperatura. Para sa pagsusuri ng PCR, ginagamit ang mga espesyal na naka-program na kagamitan - PCR - isang termostat o isang amplifier, na awtomatikong nagbabago ng mga temperatura. Ang amplification ay isinasagawa ayon sa isang paunang natukoy na programa na naaayon sa uri ng impeksyon na nakita. Depende sa programa at sa uri ng impeksyon na nakikita, ang proseso ng automated PCR ay tumatagal mula 2 hanggang 3 oras.

Ang isang mahalagang papel sa mga diagnostic ng PCR ay nilalaro ng kwalipikasyon ng katulong sa laboratoryo na nagsasagawa ng pagsusuri, ang tamang setting ng kagamitan ng PCR at ang interpretasyon ng mga resulta ay nakasalalay dito. Ang mga doktor ng Euromedprestige Medical Center ay may malawak na karanasan sa pagsasagawa ng mga diagnostic ng DNA, na tinitiyak ang pagiging maaasahan ng mga resulta ng pag-aaral at ginagarantiyahan ang positibong tagumpay sa paggamot ng mga nakakahawang sakit. Upang makapasa sa mga pagsusuri sa PCR at magsagawa ng kumpletong pagsusuri at paggamot ng mga nakakahawang sakit sa aming sentrong medikal na "Euromedprestige".

Sa panahon ng pagtuklas ng mga produkto ng amplification, ang nagresultang timpla ng mga produkto ng amplification ay pinaghihiwalay. Ang mga espesyal na solusyon ay idinagdag sa pinaghalong, na nagbibigay sa mga fragment ng DNA ng kakayahang mag-fluoresce - sumasalamin sa orange-red luminous stripes. Ang resultang glow ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng DNA ng mga virus, microbes o bacteria sa materyal na kinuha mula sa pasyente para sa pagsusuri ng PCR.

Polymerase chain reaction (PCR)- pang-eksperimentong paraan ng molecular biology, na isang partikular na amplification ng mga nucleic acid na dulot ng synthetic oligonucleotide primers sa vitro.

Ang ideya ng pagbuo ng paraan ng PCR ay pag-aari ng Amerikanong mananaliksik na si Kary Mullis, na noong 1983 ay lumikha ng isang pamamaraan na naging posible upang palakasin ang DNA sa panahon ng cyclic na pagdodoble gamit ang DNA polymerase enzyme sa ilalim ng mga artipisyal na kondisyon. Ilang taon pagkatapos ng paglalathala ng ideyang ito, noong 1993, natanggap ni K. Mullis ang Nobel Prize para dito.

Sa simula ng paggamit ng pamamaraan, pagkatapos ng bawat siklo ng pag-init-paglamig, kinakailangan na magdagdag ng DNA polymerase sa pinaghalong reaksyon, dahil mabilis itong na-inactivate sa mataas na temperatura. Ang pamamaraan ay napaka hindi epektibo, na nangangailangan ng maraming oras at enzyme. Noong 1986, ito ay makabuluhang binago sa pamamagitan ng paggamit ng DNA polymerase mula sa thermophilic bacteria. Ang mga enzyme na ito ay maaaring makatiis sa maraming mga siklo ng reaksyon, na nagpapahintulot sa iyo na i-automate ang PCR. Ang isa sa mga pinakakaraniwang ginagamit na thermostable DNA polymerases ay nahiwalay sa bacteria. Thermus aquaticus at pinangalanan Taq- DNA polymerase.

Ang kakanyahan ng pamamaraan. Ang pamamaraan ay batay sa maramihang piling pagkopya ng isang partikular na rehiyon ng DNA gamit ang enzyme na Taq-DNA polymerase. Ginagawang posible ng polymerase chain reaction na makakuha ng mga amplificate na hanggang ilang libong base pairs ang haba. Upang madagdagan ang haba ng produkto ng PCR sa 20-40 thousand base pairs, isang halo ng iba't ibang polymerases ang ginagamit, ngunit ito ay mas mababa pa kaysa sa haba ng chromosomal DNA ng isang eukaryotic cell.

Ang reaksyon ay isinasagawa sa isang programmable thermostat (amplifier) ​​- isang aparato na maaaring magsagawa ng sapat na mabilis

paglamig at pag-init ng mga test tube (karaniwan ay may katumpakan na hindi bababa sa 0.1 °C). Pinapayagan ka ng mga amplifier na magtakda ng mga kumplikadong programa, kabilang ang mga may posibilidad ng isang "mainit na pagsisimula" at kasunod na imbakan. Para sa real-time na PCR, ang mga device na nilagyan ng fluorescent detector ay ginawa. Available din ang mga instrumento na may awtomatikong takip at microplate compartment, na nagpapahintulot sa mga ito na maisama sa mga automated system.

Karaniwan, sa panahon ng PCR, 20-45 cycle ang ginagawa, ang bawat isa ay binubuo ng tatlong yugto: denaturation, primer annealing, elongation (Fig. 6.1 at 6.2). Sa fig. Ipinapakita ng 6.1 ang dynamics ng mga pagbabago sa temperatura sa test tube sa panahon ng PCR cycle.

kanin. 6.1. Graph ng pagbabago ng temperatura sa test tube sa isang cycle ng polymerase chain reaction

DNA template denaturation ay isinasagawa sa pamamagitan ng pag-init ng pinaghalong reaksyon sa 94-96 ° C para sa 5-90 s upang ang mga chain ng DNA ay magkalat. Dapat pansinin na bago ang unang cycle, ang pinaghalong reaksyon ay pinainit nang 2-5 min upang ganap na ma-denature ang paunang matrix, na ginagawang posible na bawasan ang dami ng mga nonspecific na produkto ng reaksyon.

kanin. 6.2. Scheme ng unang cycle ng polymerase chain reaction

Unang yugto ng pagsusubo. Sa isang unti-unting pagbaba sa temperatura, ang mga panimulang aklat ay magkakaugnay sa template. Ang temperatura ng pagsusubo ay nakasalalay sa komposisyon ng mga panimulang aklat at kadalasan ay 4-5°C na mas mababa kaysa sa kinakalkula na temperatura ng pagkatunaw. Ang tagal ng yugto ay 5-60 s.

Sa susunod na yugto - pagpapahaba- mayroong isang synthesis ng anak na babae strand ng DNA sa maternal matrix. Ang temperatura ng pagpahaba ay nakasalalay sa polymerase. Ang karaniwang ginagamit na Taq at Pfu DNA polymerases ay pinaka-aktibo sa 72°C. Ang oras ng pagpahaba, higit sa lahat ay nakadepende sa haba ng produkto ng PCR, ay karaniwang 1 minuto bawat 1000 base pairs.

Sa dulo ng artikulo, tingnan
Polymerase chain reaction (PCR, PCR) naimbento noong 1983 ni Carey Mullis (American scientist). Kasunod nito, natanggap niya ang Nobel Prize para sa imbensyon na ito. Sa kasalukuyan, ang mga diagnostic ng PCR ay isa sa mga pinaka-tumpak at sensitibong pamamaraan para sa pag-diagnose ng mga nakakahawang sakit.
Polymerase chain reaction (PCR)- isang eksperimentong pamamaraan ng molecular biology, isang paraan ng makabuluhang pagtaas ng maliliit na konsentrasyon ng ilang mga fragment ng nucleic acid (DNA) sa isang biological na materyal (sample).
Ang pamamaraan ng PCR ay batay sa paulit-ulit na pagdodoble ng isang tiyak na seksyon ng DNA sa tulong ng mga enzyme sa ilalim ng mga artipisyal na kondisyon (in vitro). Bilang resulta, sapat na dami ng DNA ang ginawa para sa visual detection. Sa kasong ito, tanging ang lugar na nakakatugon sa mga tinukoy na kundisyon ang kinokopya, at kung ito ay nasa sample na pinag-aaralan.
Bilang karagdagan sa simpleng pagtaas ng bilang ng mga kopya ng DNA (ang prosesong ito ay tinatawag na amplification), pinapayagan ng PCR ang maraming iba pang mga manipulasyon na may genetic material (pagpapakilala ng mga mutasyon, splicing ng mga fragment ng DNA), at malawakang ginagamit sa biological at medikal na kasanayan, halimbawa, upang masuri ang mga sakit (namamana, nakakahawa), upang magtatag ng paternity, upang i-clone ang mga gene, ipakilala ang mga mutasyon ng gene, ihiwalay ang mga bagong mutasyon ng gene.

Pagtitiyak at aplikasyon

Pagsasagawa ng PCR

Para sa PCR, sa pinakasimpleng kaso, ang mga sumusunod na bahagi ay kinakailangan:

• DNA template na naglalaman ng seksyon ng DNA na palakihin;
• dalawang panimulang aklat na pantulong sa mga dulo ng nais na fragment;
• thermostable DNA polymerase;
• deoxynucleotide triphosphates (A, G, C, T);
• Mg2+ ions na kailangan para sa polymerase operation;
• solusyon sa buffer.

Ang PCR ay isinasagawa sa isang amplifier - isang aparato na nagbibigay ng pana-panahong paglamig at pag-init ng mga test tube, kadalasang may katumpakan ng hindi bababa sa 0.1 ° C. Upang maiwasan ang pagsingaw ng pinaghalong reaksyon, isang mataas na kumukulo na langis, tulad ng vaseline, ay idinagdag sa test tube. Ang pagdaragdag ng mga tiyak na enzyme ay maaaring tumaas ang ani ng reaksyon ng PCR.
Pag-unlad ng reaksyon

Karaniwan, kapag nagsasagawa ng PCR, 20 - 35 na mga cycle ay ginaganap, ang bawat isa ay binubuo ng tatlong yugto. Ang double-stranded na template ng DNA ay pinainit sa 94 - 96°C (o 98°C kung partikular na thermostable polymerase ang ginagamit) sa loob ng 0.5 - 2 minuto upang pahintulutan ang DNA strands na maghiwalay. Ang yugtong ito ay tinatawag na denaturation - ang mga bono ng hydrogen sa pagitan ng dalawang kadena ay nawasak. Minsan, bago ang unang cycle, ang pinaghalong reaksyon ay pinainit nang 2-5 minuto upang ganap na ma-denature ang template at mga panimulang aklat.
Kapag ang mga strand ay pinaghiwalay, ang temperatura ay binabaan upang payagan ang mga panimulang aklat na magbigkis sa nag-iisang stranded na template. Ang yugtong ito ay tinatawag na pagsusubo. Ang temperatura ng pagsusubo ay nakasalalay sa mga panimulang aklat at kadalasang pinipili 4 - 5°C sa ibaba ng kanilang punto ng pagkatunaw. Oras ng yugto - 0.5 - 2 minuto.

Ginagaya ng DNA polymerase ang template strand gamit ang primer bilang primer. Ito ang yugto ng pagpahaba. Ang temperatura ng pagpahaba ay nakasalalay sa polymerase. Ang mga madalas na ginagamit na polymerase ay pinaka-aktibo sa 72°C. Ang oras ng pagpahaba ay depende sa uri ng DNA polymerase at sa haba ng fragment na pinapalaki. Karaniwan, ang oras ng pagpahaba ay kinukuha na isang minuto para sa bawat libong base pairs. Matapos ang pagtatapos ng lahat ng mga cycle, ang isang karagdagang yugto ng pangwakas na pagpahaba ay madalas na isinasagawa upang makumpleto ang lahat ng mga single-stranded na fragment. Ang yugtong ito ay tumatagal ng 10 - 15 minuto.
Paghahanda ng materyal para sa pananaliksik at transportasyon nito sa laboratoryo

Para sa isang matagumpay na pagsusuri, mahalaga na tama na kolektahin ang materyal mula sa pasyente at maayos na ihanda ito. Ito ay kilala na sa mga diagnostic ng laboratoryo ang karamihan ng mga error (hanggang sa 70%) ay ginawa sa yugto ng paghahanda ng sample. Upang kumuha ng dugo sa laboratoryo ng INVITRO, ang mga sistema ng vacuum ay kasalukuyang ginagamit, na, sa isang banda, ay hindi gaanong nakakapinsala sa pasyente, at, sa kabilang banda, pinapayagan ang materyal na kunin sa paraang hindi ito nakakaugnay sa alinman sa mga tauhan o sa kapaligiran. Iniiwasan nito ang kontaminasyon (contamination) ng materyal at tinitiyak ang objectivity ng PCR analysis.

DNA - deoxyribonucleic acid - isang biological polymer, isa sa dalawang uri ng nucleic acid na nagbibigay ng imbakan, paghahatid mula sa henerasyon hanggang sa henerasyon at pagpapatupad ng genetic program para sa pagbuo at paggana ng mga buhay na organismo. Ang pangunahing papel ng DNA sa mga cell ay ang pangmatagalang imbakan ng impormasyon tungkol sa istraktura ng RNA at mga protina.

Ang RNA - ribonucleic acid ay isang biological polymer, katulad ng kemikal na istraktura nito sa DNA. Ang molekula ng RNA ay binuo mula sa parehong mga yunit ng monomer - mga nucleotide bilang DNA. Sa kalikasan, ang RNA ay karaniwang umiiral bilang isang solong strand. Sa ilang mga virus, ang RNA ay ang carrier ng genetic na impormasyon. Sa cell, ito ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa paglipat ng impormasyon mula sa DNA patungo sa protina. Ang RNA ay synthesize sa isang template ng DNA. Ang prosesong ito ay tinatawag na transkripsyon. May mga seksyon sa DNA na naglalaman ng impormasyon na responsable para sa synthesis ng tatlong uri ng RNA, na naiiba sa kanilang mga pag-andar: messenger o messenger RNA (mRNA), ribosomal (rRNA) at transport (tRNA). Ang lahat ng tatlong uri ng RNA ay kasangkot sa synthesis ng protina sa isang paraan o iba pa. Gayunpaman, ang impormasyon sa synthesis ng protina ay nakapaloob lamang sa mRNA.

Ang mga nucleotide ay ang pangunahing paulit-ulit na yunit sa mga molekula ng nucleic acid, ang produkto ng isang kemikal na tambalan ng isang nitrogenous base, isang limang-carbon na asukal (pentose) at isa o higit pang mga grupo ng pospeyt. Ang mga nucleotide na nasa mga nucleic acid ay naglalaman ng isang grupo ng pospeyt. Ang mga ito ay pinangalanan ayon sa nitrogenous base na naglalaman ng mga ito - adenine (A) na naglalaman ng adenine, guanine (G) - guanine, cytosine (C) - cytosine, thymine (T) - thymine, uracil (U) - uracil. Ang DNA ay binubuo ng 4 na uri ng nucleotides - A, T, G, C, RNA ay mayroon ding 4 na uri - A, U, G, C. Ang asukal sa komposisyon ng lahat ng DNA nucleotides ay deoxyribose, RNA ay ribose. Sa panahon ng pagbuo ng mga nucleic acid, ang mga nucleotide, sa pamamagitan ng pagbubuklod, ay bumubuo ng isang sugar-phosphate na gulugod ng molekula, sa isang gilid kung saan mayroong mga base.

Ang panimulang aklat ay isang maikling DNA na ginamit upang kopyahin ang template strand. Ang bawat isa sa mga panimulang aklat ay pantulong sa isa sa mga chain ng double-stranded na template, na nag-frame sa simula at dulo ng amplified na rehiyon.

Panitikan

1. Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Mga prinsipyo at aplikasyon. Per. mula sa Ingles. - M.: Mir, 2002. - 589 p., paglalarawan. ISBN 5-03-003328-9
2. Shchelkunov S.N. Genetic engineering - Novosibirsk: Sib. univ. publishing house, 2004. - 496 p.; may sakit. ISBN 5-94087-098-8
3. Patrushev L.I. Mga artipisyal na genetic system - M .: Nauka, 2005 - Sa 2 volume - ISBN 5-02-033278-X

MAHALAGA!

Ang impormasyon sa seksyong ito ay hindi dapat gamitin para sa self-diagnosis o self-treatment. Sa kaso ng sakit o iba pang exacerbation ng sakit, tanging ang dumadating na manggagamot ang dapat magreseta ng mga diagnostic na pagsusuri. Para sa diagnosis at tamang paggamot, dapat kang makipag-ugnayan sa iyong doktor.

Polymerase chain reaction (PCR)- ay isang pamamaraan ng biochemical na teknolohiya sa molecular biology, na isinasagawa na may layuning madagdagan ang isa o higit pang mga kopya ng mga fragment ng DNA ng ilang degree, na nagpapahintulot sa iyo na lumikha mula sa ilang libo hanggang sa milyon-milyong mga kopya ng isang tiyak na pagkakasunud-sunod ng DNA.

Binuo noong 1983 ni Cary Mullis, ang paraan ng PCR ay isa na ngayong karaniwan at kadalasang kailangang-kailangan na paraan na ginagamit sa mga laboratoryo ng medikal at biyolohikal na pananaliksik para sa maraming iba't ibang mga aplikasyon. Kabilang dito ang DNA cloning para sa sequencing, DNA-based phylogeny, o functional analysis ng mga gene; diagnosis ng mga namamana na sakit; pagkakakilanlan ng genetic fingerprints (ginagamit sa mga sangay ng forensic science at sa paternity testing), pati na rin ang pagtuklas at pagsusuri ng mga nakakahawang sakit. Noong 1993, ginawaran si Mullis ng Nobel Prize sa Chemistry kasama si Michael Smith para sa kanilang trabaho sa PCR.

Ang pamamaraan ay batay sa thermal cycling, na binubuo ng mga paulit-ulit na cycle ng heating at cooling reactions sa denature at pagkopya ng DNA ng mga enzyme. Ang mga panimulang aklat, (maiikling piraso ng DNA) na naglalaman ng mga pagkakasunud-sunod na pantulong sa target na site kasama ang DNA polymerase (kung saan pinangalanan ang pamamaraan), ay mga pangunahing bahagi upang humimok ng pumipili at muling pagpapalakas. Sa proseso ng PCR, ang synthesized DNA mismo ay ginagamit bilang isang template para sa pagtitiklop, na nagtatakda ng isang chain reaction kung saan ang template na DNA ay pinalaki nang exponentially. Ang PCR ay maaaring makabuluhang mabago upang maisagawa ang isang malawak na hanay ng mga genetic manipulations.

Halos lahat ng PCR application ay gumagamit ng thermostable DNA polymerase gaya ng Taq polymerase, isang enzyme na orihinal na nakahiwalay sa bacteria. Thermusaquaticus. Ang DNA polymerase na ito ay enzymatically na nag-iipon ng bagong strand ng DNA mula sa mga building blocks ng DNA - mga nucleotides, gamit ang single-stranded DNA bilang template at DNA oligonucleotides (tinatawag ding DNA primers) na kailangan para simulan ang DNA synthesis. Ang karamihan sa mga pamamaraan ng PCR ay gumagamit ng thermal cycling, ibig sabihin, kahaliling pag-init at paglamig ng sample ng PCR sa isang tiyak na serye ng mga hakbang sa temperatura. Ang mga thermal cycling na hakbang na ito ay kinakailangan muna upang pisikal na paghiwalayin ang dalawang strand ng DNA double helix sa mataas na temperatura sa isang proseso na tinatawag na DNA denaturation. Sa mas mababang temperatura, ang bawat strand ay gagamitin bilang isang template sa DNA synthesis ng DNA polymerase upang piliing palakasin ang target na rehiyon ng DNA. Selectivity ng mga resulta ng PCR gamit ang mga primer na pantulong sa target na rehiyon ng DNA para sa amplification sa ilalim ng ilang partikular na kondisyon ng thermal cycling.

Mga prinsipyo ng PCR diagnostics

Ginagamit ang PCR upang palakihin ang isang partikular na seksyon ng isang DNA chain (target DNA). Karamihan sa mga pamamaraan ng PCR ay karaniwang nagpapalaki ng mga fragment ng DNA hanggang sa ~10,000 base pairs (kb), bagama't ang ilang mga pamamaraan ay nagpapahintulot sa mga fragment na ma-scale hanggang 40 kb ang laki. Ang reaksyon ay gumagawa ng isang limitadong halaga ng panghuling amplified na produkto, na kinokontrol ng mga magagamit na reagents sa reaksyon at feedback-inhibition ng mga produkto ng reaksyon.

Ang pangunahing PCR kit ay nangangailangan ng ilang bahagi at reagents. Kabilang dito ang:

• template ng DNA, na naglalaman ng target na rehiyon ng DNA na palakihin.
• dalawang panimulang aklat, pandagdag sa 3' dulo ng bawat sense at antisense strands ng target na DNA.
• Taq polymerase o ibang DNA polymerase na gumagana sa pinakamabuting kalagayan na temperatura na humigit-kumulang 70°C.
• Mga deoxynucleoside triphosphate(dNTPs; triphosphate group na naglalaman ng mga nucleotides), ang mga bloke ng gusali kung saan ang DNA polymerase ay nag-synthesize ng bagong DNA strand.
• solusyon sa buffer, na nagbibigay ng angkop na kondisyong kemikal para sa pinakamainam na aktibidad at katatagan ng DNA polymerase.
• divalent cations, magnesiyo o mangganeso ions; Ang Mg2+ ay karaniwang ginagamit, ngunit ang Mn2+ ay maaari ding gamitin para sa PCR-mediated DNA mutagenesis, dahil ang mas mataas na konsentrasyon ng Mn2+ ay nagpapataas ng error rate sa panahon ng DNA synthesis.
• Mga monovalent na kasyon potassium ions.

Karaniwang isinasagawa ang PCR sa dami ng reaksyon na 10-200 µl sa maliliit na tubo ng reaksyon (volume 0.2-0.5 ml) sa isang thermal cycler-amplifier. Pinapainit at pinapalamig ng cycler ang mga tubo ng reaksyon upang makamit ang mga temperatura na kinakailangan para sa bawat hakbang ng reaksyon. Maraming modernong cyclers ang gumagamit ng Peltier effect, na nagpapahintulot sa pagpainit at paglamig ng PCR tube assembly sa pamamagitan lamang ng pag-reverse ng direksyon ng electrical current. Ang mga tubo ng reaksyon na may manipis na pader ay nagtataguyod ng paborableng thermal conductivity upang matiyak ang mabilis na thermal equilibrium. Ang mga matatandang siklista na walang pinainit na takip ay nangangailangan ng isang layer ng langis sa ibabaw ng pinaghalong reaksyon o isang butil ng wax sa isang vial.

Pagkakasunud-sunod ng pamamaraan

Karaniwan, ang PCR ay binubuo ng isang serye ng 20-40 na paulit-ulit na pagbabago sa temperatura na tinatawag na mga cycle, na ang bawat cycle ay karaniwang binubuo ng 2-3 discrete temperature steps, karaniwang tatlo. Ang pagbibisikleta ay madalas na nagsisimula at nagtatapos sa isang hakbang sa temperatura (tinatawag na pag-asa) sa mataas na temperatura (> 90 ° C) para sa panghuling pagpapalawak ng produkto o maikling imbakan. Ang mga temperatura na ginamit at ang tagal ng kanilang aplikasyon sa bawat cycle ay depende sa maraming mga parameter. Kabilang dito ang enzyme na ginagamit para sa DNA synthesis, ang konsentrasyon ng mga divalent ions at dNTP sa reaksyon, at ang melting point (Tm) ng mga primer.

• Yugto ng pagsisimula: Ang hakbang na ito ay binubuo ng pag-init ng reaksyon sa isang temperatura na 94-96°C (o 98°C kung ginagamit ang mga polymerase na mataas ang init), na isinasagawa sa loob ng 1-9 minuto. Ang hakbang ay kinakailangan lamang para sa DNA polymerases na nangangailangan ng heat activation, ang tinatawag na hot start PCR.
• Hakbang sa denaturation: Ito ang unang regular na thermal cycling event at binubuo ng pag-init ng reaksyon sa 94-98°C sa loob ng 20-30 segundo. Nagiging sanhi ito ng cleavage ng DNA template na may pagkasira ng hydrogen bonds sa pagitan ng mga complementary base at pagbuo ng single-stranded DNA molecules.
• Hakbang ng pagsusubo: Ang temperatura ng reaksyon ay binabawasan sa 50-65°C sa loob ng 20-40 segundo, na nagpapahintulot sa mga panimulang aklat na magbigkis sa single-stranded na template ng DNA. Karaniwan ang temperatura ng pagsusubo ay humigit-kumulang 3-5 degrees Celsius sa ibaba ng Tm ng mga panimulang aklat na ginamit. Ang matatag na DNA-DNA hydrogen bond ay nabubuo lamang kapag ang primer sequence ay mas malapit na tumugma sa sequence template. Ang polymerase ay nagbubuklod sa primer-template hybrid at nagpasimula ng DNA synthesis.
• Yugto ng pagpapalawak / pagpapahaba: Ang temperatura sa hakbang na ito ay depende sa DNA polymerase na ginamit; Ang Taq polymerase ay may pinakamainam na temperatura ng aktibidad sa 75-80°C; ang temperaturang 72°C ay karaniwang ginagamit para sa enzyme na ito. Sa hakbang na ito, ang DNA polymerase ay nag-synthesize ng bagong DNA strand na pandagdag sa DNA template strand sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mga dNTP na pantulong sa template sa 5" hanggang 3" na direksyon, na nag-uugnay sa 5"-phosphate group ng dNTP sa 3"-hydroxyl group sa dulo ng resultang (lumalawak) na DNA. Ang oras ng pagpapalawak ay nakasalalay sa parehong DNA polymerase na ginamit at ang haba ng fragment ng DNA na palakihin. Karaniwan, sa pinakamabuting kalagayan na temperatura nito, ang DNA polymerase ay nagpapapolimerize ng isang libong base kada minuto. Sa ilalim ng pinakamainam na kondisyon, i.e. sa kawalan ng mga paghihigpit dahil sa paglilimita sa mga substrate o reagents, sa bawat hakbang ng pagpapalawak, ang dami ng target na DNA ay nadodoble, na nagreresulta sa isang exponential (geometric) amplification ng isang fragment ng DNA.
• Panghuling extension: Ito ang tanging hakbang, kung minsan ay ginagawa sa 70-74°C sa loob ng 5-15 minuto pagkatapos ng huling PCR cycle, upang matiyak na ang anumang natitirang single-stranded na DNA ay ganap na lumawak.
• Panghuling inaasahan: Ang hakbang na ito sa 4-15 °C nang walang katiyakan ay maaaring gamitin upang mapanatiling maikli ang reaksyon. Upang suriin kung na-synthesize ng PCR ang inaasahang fragment ng DNA (tinatawag din minsan bilang "amplimer" o "amplicon"), ginagamit ang agarose gel electrophoresis upang paghiwalayin ang mga produkto ng PCR ayon sa laki. Ang laki ng mga produkto ng PCR ay tinutukoy sa pamamagitan ng paghahambing sa isang hagdan ng DNA (molecular weight marker) na naglalaman ng mga fragment ng DNA na alam ang laki, na ginawa sa isang gel kasama ng mga produkto ng PCR.

Mga yugto ng polymerase chain reaction

Ang proseso ng PCR ay maaaring nahahati sa tatlong hakbang:

1. Exponential Amplification: Sa bawat cycle, nadodoble ang dami ng produkto (ipagpalagay na 100% ang kahusayan ng reaksyon). Napakasensitibo ng reaksyon: kaunting DNA lang ang kailangan.
2. Yugto ng pag-level: bumagal ang reaksyon habang nawawalan ng aktibidad ang DNA polymerase at ang pagkonsumo ng mga reagents tulad ng dNTPs at mga primer ay nagiging sanhi ng kanilang paglimita .
3. Talampas: Hindi na naiipon ang produkto dahil sa pagkaubos ng mga reagents at enzymes.

Pag-optimize ng PCR

Sa pagsasagawa, ang PCR ay maaaring mabigo sa iba't ibang dahilan, lalo na dahil sa pagiging sensitibo nito sa kontaminasyon, na nagiging sanhi ng pagpapalakas ng mga by-product ng DNA. Sa pagsasaalang-alang na ito, maraming mga pamamaraan at pamamaraan ang binuo upang ma-optimize ang mga kondisyon ng PCR. Ang dayuhang kontaminasyon ng DNA ay pinangangasiwaan ng mga protocol at pamamaraan ng laboratoryo na naglilinis ng mga pre-PCR mixtures ng mga potensyal na contaminant ng DNA. Karaniwang kasama rito ang paghihiwalay ng mga PCR kit mula sa mga lugar ng pagsusuri o paglilinis ng mga produkto ng PCR, gamit ang mga disposable plastic na kagamitan, at masusing paglilinis sa ibabaw ng trabaho sa pagitan ng mga hakbang ng reaksyon. Ang mga diskarte sa disenyo ng panimulang aklat ay may mahalagang papel sa pagpapabuti ng paghihiwalay ng mga produkto ng PCR at sa pag-iwas sa pagbuo ng mga by-product, at ang paggamit ng mga alternatibong bahagi ng buffer o polymerase enzyme ay maaaring makatulong sa pagpapalaki ng mahaba o kung hindi man ay may problemang mga rehiyon ng DNA. Ang pagdaragdag ng mga reagents tulad ng formamide sa mga buffer system ay maaaring tumaas ang pagiging tiyak at pagbawi ng PCR. Maaaring isagawa ang computer simulation ng teoretikal na resulta ng PCR (electronic PCR) upang tumulong sa panimulang disenyo.

Paglalapat ng PCR

Selective DNA isolation

Pinapayagan ng PCR ang paghihiwalay ng mga fragment ng DNA mula sa genomic DNA sa pamamagitan ng selective amplification ng isang partikular na rehiyon ng DNA. Ang application na ito ng PCR ay umaakma sa maraming pamamaraan, tulad ng paglikha ng hybridization probes para sa Southern o Northern blotting at DNA cloning method, na nangangailangan ng malaking halaga ng DNA na kumakatawan sa isang partikular na rehiyon ng DNA. Ang PCR ay nagbibigay ng mga pamamaraang ito ng mataas na nilalaman ng purong DNA, na nagpapahintulot sa pagsusuri ng mga sample ng DNA, kahit na may maliit na halaga ng panimulang materyal.

Kasama sa iba pang mga aplikasyon ng PCR ang DNA sequencing upang matukoy ang hindi kilalang mga PCR-amplified sequence, kung saan ang isa sa mga amplification primer ay maaaring gamitin sa Sanger sequencing, DNA sequence isolation upang mapabilis ang mga recombinant na teknolohiya ng DNA na kinasasangkutan ng pagpasok ng isang DNA sequence sa isang plasmid o genetic na materyal ng ibang organismo. Ang mga kolonya ng bakterya (E. coli) ay maaaring mabilis na ma-screen ng PCR upang itama ang disenyo ng vector DNA. Maaari ding gamitin ang PCR para sa genetic fingerprinting; isang pamamaraan na ginagamit sa forensic na gamot upang makilala ang isang tao o organismo sa pamamagitan ng paghahambing ng eksperimentong DNA gamit ang iba't ibang paraan ng PCR.

Ang ilang "fingerprint" na mga paraan ng PCR ay may mataas na kapangyarihan sa diskriminasyon at maaaring gamitin upang matukoy ang mga genetic na relasyon sa pagitan ng mga indibidwal, tulad ng magulang-anak o sa pagitan ng magkakapatid, at ginagamit sa pagsusuri sa paternity. Ang pamamaraan na ito ay maaari ding ilapat upang matukoy ang mga ebolusyonaryong relasyon sa pagitan ng mga organismo.

DNA amplification at quantification

Dahil pinapataas ng PCR ang bilang ng kopya ng mga target na rehiyon ng DNA, maaaring gamitin ang PCR upang pag-aralan ang napakaliit na halaga ng sample. Ito ay madalas na kritikal para sa forensic na pagsisiyasat kung saan ang mga bakas na halaga ng DNA lamang ang magagamit bilang ebidensya. Ang PCR ay maaari ding gamitin upang pag-aralan ang sinaunang DNA na sampu-sampung libong taong gulang. Ang mga pamamaraan ng PCR na ito ay matagumpay na ginamit sa mga hayop tulad ng 40,000 taong gulang na mammoth, gayundin sa DNA ng tao, sa mga aplikasyon mula sa pagsusuri ng mga Egyptian mummies hanggang sa pagkilala sa isang Russian tsar.

Tinatantya ng quantitative na mga pamamaraan ng PCR ang dami ng isang naibigay na sequence na nasa isang sample, isang paraan na kadalasang ginagamit upang mabilang ang antas ng expression ng gene. Ang real-time na PCR ay isang itinatag na tool sa quantification ng DNA na sumusukat sa akumulasyon ng DNA ng produkto pagkatapos ng bawat cycle ng PCR amplification.

PCR sa pagsusuri ng mga sakit

Pinapayagan ng PCR ang maagang pagsusuri ng mga malignant na sakit tulad ng leukemia at lymphoma, na kasalukuyang lubos na binuo sa pananaliksik sa kanser at ginagamit na nang regular. Maaaring direktang isagawa ang PCR sa mga genomic DNA sample upang matukoy ang translocation-specific na malignant na mga cell na may sensitivity na hindi bababa sa 10,000 beses na mas mataas kaysa sa iba pang mga pamamaraan.

Pinapayagan din ng PCR ang pag-detect ng mga hindi nalilinang o mabagal na paglaki ng mga organismo tulad ng mycobacteria, anaerobic bacteria, at mga virus mula sa tissue culture at mga modelo ng hayop. Ang batayan para sa mga aplikasyon ng diagnostic ng PCR sa larangan ng microbiology ay ang pagkilala sa mga nakakahawang ahente at ang pagkita ng kaibahan ng mga non-pathogenic na strain mula sa mga pathogenic dahil sa mga partikular na gene.

Ang viral DNA ay maaari ding matukoy ng PCR. Ang mga panimulang aklat ay dapat na tiyak sa target na DNA sequence ng virus, at ang PCR ay maaaring gamitin para sa diagnostic DNA test o sequencing ng viral genome. Ang mataas na sensitivity ng PCR ay ginagawang posible na makakita ng mga virus sa lalong madaling panahon pagkatapos ng impeksyon at kahit na bago ang pagsisimula ng sakit. Ang maagang pagtuklas ng virus na ito ay maaaring magbigay sa mga doktor ng makabuluhang opsyon sa paggamot. Ang dami ng virus ("viral load") sa isang pasyente ay maaari ding matukoy sa pamamagitan ng quantitative PCR-based DNA analysis.

Mga pagkakaiba-iba sa mga pangunahing pamamaraan ng polymerase chain reaction

• PCR na partikular sa allele: diagnostic o cloning method batay sa single nucleotide polymorphisms (SNPs) (mga single base differences sa DNA). Nangangailangan ng paunang kaalaman sa pagkakasunud-sunod ng DNA, kabilang ang mga pagkakaiba sa pagitan ng mga alleles, at gumagamit ng mga primer na ang 3' dulo ay sumasaklaw sa mga SNP. Ang mahigpit na PCR amplification ay hindi gaanong mahusay sa pagkakaroon ng hindi pagkakatugma sa pagitan ng template at primer, kaya ang matagumpay na amplification na may primer na partikular sa SNP ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng mga partikular na SNP sa sequence.
• PCR assembly o polymerase cycling assembly (PCP): artipisyal na synthesis ng mahabang DNA sequence ng PCR sa isang pool ng mahabang oligonucleotides na may maiikling magkapatong na mga segment. Ang mga oligonucleotides ay nagpapalit-palit sa pagitan ng sense at antisense strand na mga direksyon, at ang magkakapatong na mga segment ay tumutukoy sa pagkakasunud-sunod ng mga fragment ng PCR, at sa gayon ay piling bumubuo ng panghuling mahabang produkto ng DNA.
• Asymmetric PCR: mas gusto ang pagpapalaki ng isang strand ng DNA sa isang double-stranded na template ng DNA. Ginagamit sa sequencing at hybridization probing kung saan kailangan ang amplification ng isa lang sa dalawang complementary strand. Ang PCR ay isinasagawa gaya ng dati, ngunit may malaking labis na mga panimulang aklat para sa kadena na inilaan para sa pagpapalakas. Dahil sa mabagal na (aritmetika na pag-unlad) amplification sa dulo ng reaksyon pagkatapos ng paggamit ng isang naglilimita na panimulang aklat, kinakailangan ang mga karagdagang PCR cycle. Ang pinakahuling pagbabago ng prosesong ito, na kilala bilang "LATE-PCR" (linearity after exponential phase - PCR) ay gumagamit ng limiting primer na may mas mataas na melting point (Tm) kaysa sa sobrang primer upang mapanatili ang kahusayan ng reaksyon, dahil bumababa ang konsentrasyon ng naglilimitang primer sa gitna ng reaksyon.
• I-dial-out ang PCR: isang lubos na parallel na paraan upang makakuha ng tumpak na mga molekula ng DNA para sa gene synthesis. Ang kumplikadong pool ng mga molekula ng DNA ay binago ng mga natatanging flank tag sa napakalaking parallel sequencing. Ang mga primer na nakadirekta sa tag ay nagbibigay ng mga sequenced molecule sa pamamagitan ng PCR.
• Helicase dependent amplification: katulad ng tradisyonal na PCR ngunit nangangailangan ng pare-parehong temperatura kaysa sa pagbibisikleta sa pamamagitan ng mga siklo ng denaturation at annealing/expansion. Ang DNA helicase, isang enzyme na nag-unwind ng DNA, ay ginagamit sa halip na heat denaturation.
• Mainit na simula ng PCR: Isang pamamaraan na binabawasan ang hindi partikular na amplification sa panahon ng paunang pag-setup ng mga hakbang sa PCR. Maaaring gawin nang manu-mano sa pamamagitan ng pag-init ng mga bahagi ng reaksyon sa temperatura ng denaturation (hal. 95 °C) bago idagdag ang polymerase. Ang mga espesyal na sistema ng enzyme ay binuo na pumipigil sa aktibidad ng polymerase sa temperatura ng silid, alinman sa pamamagitan ng antibody binding o sa pagkakaroon ng mga covalently bound inhibitors na naghihiwalay lamang pagkatapos ng isang hakbang sa pag-activate ng mataas na temperatura. Ang hot start/cold finish PCR ay nakakamit gamit ang novel hybrid polymerases na hindi aktibo sa ambient temperature at agarang na-activate sa elongation temperature.
• Intermicrosatellite sequence specific PCR (ISSR): Paraan ng fingerprinting ng PCR DNA na nagpapataas ng bilang ng kopya ng mga rehiyon sa pagitan ng mga simpleng pag-uulit na pagkakasunud-sunod upang makakuha ng natatanging fingerprint mula sa pinalakas na haba ng fragment.
• Baliktad PCR malawakang ginagamit upang tukuyin ang mga sequence region sa paligid ng genomic insert. Kabilang dito ang isang serye ng mga cleavage ng DNA at self-ligation, na nagreresulta sa mga kilalang sequence sa magkabilang dulo ng hindi kilalang sequence.
• PCR mediated sa pamamagitan ng ligation: Gumagamit ng maliliit na DNA linker na naka-link sa DNA ng interes at ilang primer na naka-link sa DNA linker; ginagamit para sa DNA sequencing, genome walking, at DNA footprinting.
• PCR na tukoy sa methylation(MSP): Binuo nina Stephen Bailin at Jim Herman sa Johns Hopkins School of Medicine, ginagamit ito upang makita ang methylation ng mga isla ng CpG sa genomic DNA. Ang DNA ay unang ginagamot ng sodium bisulfite, na nagko-convert sa mga unmethylated cytosine base sa uracil, na kinikilala ng mga PCR primer bilang thymine. Dalawang PCR ang ginagawa sa binagong DNA gamit ang mga set ng magkaparehong primer maliban sa anumang CpG na isla sa loob ng primer sequence. Sa mga puntong ito, kinikilala ng isang hanay ng mga panimulang aklat ang DNA na may mga cytosine upang madagdagan ang bilang ng kopya ng methylated DNA, at ang isang set ay kinikilala ang DNA na may uracil o thymine upang palakihin ang hindi namethylated DNA. Ang MSP gamit ang qPCR ay maaari ding isagawa upang makakuha ng quantitative kaysa sa qualitative na impormasyon sa methylation.
• Miniprimer - PCR: ang mga thermostable polymerases (S-Tbr) ay ginagamit, na maaaring umabot mula sa mga maiikling primer ("smalligos"), na may bilang na 9 o 10 nucleotides. Ang diskarteng ito ay nagbibigay-daan sa PCR na i-target ang mga rehiyon na nauugnay sa mas maliliit na primer at ginagamit upang palakasin ang mga conserved DNA sequence gaya ng 16S (o eukaryotic 18S) rRNA gene.
• Multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA): nagbibigay-daan sa pagpapalakas ng maramihang mga target na may isang pares lamang ng mga panimulang aklat, kaya iniiwasan ang mga limitasyon sa paglutas ng multiplex PCR.
• Multiplex PCR ay binubuo ng ilang hanay ng mga panimulang aklat sa isang pinaghalong PCR upang makakuha ng mga amplicon na may iba't ibang laki na tiyak para sa iba't ibang mga pagkakasunud-sunod ng DNA. Sa pamamagitan ng pagtutok sa ilang mga gene sa parehong oras, posible na makakuha ng karagdagang impormasyon sa panahon ng isang pagsubok, na kung hindi man ay mangangailangan ng ilang beses na mas maraming reagents at mas maraming oras upang makumpleto. Ang mga temperatura ng pagsusubo para sa bawat set ng panimulang aklat ay dapat na i-optimize upang gumana nang tama sa loob ng isang reaksyon, at may mga laki ng amplicon. Iyon ay, ang haba ng kanilang base pair ay dapat na sapat na naiiba upang bumuo ng mga natatanging banda kapag nakikita ng gel electrophoresis.
• Nested PCR: pinapataas ang pagiging tiyak ng amplification ng DNA, sa pamamagitan ng pagbabawas ng background dahil sa hindi partikular na amplification ng DNA. Dalawang hanay ng mga panimulang aklat ang ginagamit sa dalawang magkasunod na PCR. Sa unang reaksyon, isang pares ng mga panimulang aklat ang ginagamit upang i-synthesize ang mga produkto ng DNA, na, bilang karagdagan sa nilalayon na layunin, ay maaari pa ring binubuo ng mga hindi partikular na pinalakas na mga fragment ng DNA. Pagkatapos ay gagamitin ang mga produkto sa pangalawang PCR na may isang set ng mga primer na ang mga binding site ay ganap o bahagyang naiiba sa 3' dulo ng bawat primer na ginamit sa unang reaksyon. Ang nested PCR ay kadalasang mas matagumpay sa partikular na pagpapalaki ng mahabang DNA fragment kaysa sa tradisyonal na PCR, ngunit nangangailangan ito ng mas detalyadong kaalaman sa mga target na sequence.
• PCR na may magkakapatong na extension o splicing na may magkakapatong na extension(SOE): Isang genetic engineering technique na ginagamit upang pagsamahin ang dalawa o higit pang piraso ng DNA na naglalaman ng mga pantulong na pagkakasunud-sunod. Ginagamit upang ikonekta ang mga piraso ng DNA na naglalaman ng mga gene na kumokontrol sa mga pagkakasunud-sunod o mutasyon; pinahihintulutan ng pamamaraan ang paglikha ng mga tiyak at mahabang konstruksyon ng DNA.
• Quantitative PCR (QPCR): ginagamit upang sukatin ang dami ng produkto ng PCR (kadalasan sa real time). Binibilang ang mga paunang dami ng DNA, cDNA o RNA. Ang qPCR ay malawakang ginagamit upang matukoy ang pagkakaroon ng isang DNA sequence sa isang sample at ang numero ng kopya nito sa sample. Ang real-time na quantitative PCR ay may napakataas na antas ng katumpakan. Gumagamit ang mga pamamaraan ng QRT-PCR (o QF-PCR) ng mga fluorescent dyes gaya ng Sybr Green, EvaGreen, o fluorophore-containing DNA probes gaya ng TaqMan para sukatin ang dami ng amplified na produkto sa real time. Minsan tinutukoy bilang RT-PCR (real-time PCR) o RQ-PCR. Ang QRT-PCR o RTQ-PCR ay mas angkop na mga pagdadaglat dahil karaniwang tumutukoy ang RT-PCR sa reverse transcription PCR na kadalasang ginagamit kasabay ng qPCR.
• Reverse transcription PCR (RT-PCR): upang madagdagan ang bilang ng kopya ng DNA mula sa RNA. Ang reverse transcriptase ay nag-transcribe ng RNA sa cDNA, na pagkatapos ay pinalakas ng PCR. Ang RT-PCR ay malawakang ginagamit sa expression profiling upang makita ang expression ng gene o upang matukoy ang pagkakasunud-sunod ng isang RNA transcript, kabilang ang mga site ng pagsisimula at paghinto ng transkripsyon. Kung alam ang genomic DNA sequence ng isang gene, maaaring gamitin ang RT-PCR upang i-map ang lokasyon ng mga exon at intron sa gene. Ang 5' dulo ng isang gene (naaayon sa transcription start site) ay karaniwang tinutukoy ng RACE-PCR (mabilis na paglaki ng mga dulo ng cDNA).
• solid phase PCR: sumasaklaw sa ilang mga kahulugan, kabilang ang "Amplification of Polonia" (kung saan ang PCR ng mga kolonya ay ginawa sa isang gel matrix, halimbawa), "Bridge PCR" (ang mga primer ay covalently na nakakabit sa isang solidong support surface), tradisyonal na solid phase PCR (kung saan ang "asymmetric PCR" ay ginagamit sa pagkakaroon ng mga primer na may solidong suporta na may isang sequence na nauukol sa isang solidong bahagi ng PCR na naaayon sa isang solidong bahagi ng PCR), isang solidong phase ng PCR na naaayon sa isa sa mga solidong bahagi ng PCR), d sa pamamagitan ng paggamit ng mataas na Tm at nested na solid-support primer na may opsyong maglapat ng thermal "step" upang isulong ang pagbuo ng solid-support primers).
• Thermal Asymmetric Interleaved PCR (TAIL-PCR): ay ginagamit upang ihiwalay ang isang hindi kilalang sequence kasunod ng isang kilalang sequence. Sa isang kilalang sequence, ang TAIL-PCR ay gumagamit ng isang nested na pares ng mga primer na may iba't ibang temperatura ng pagsusubo; Ang primer degenerate ay ginagamit upang palakihin sa ibang direksyon mula sa hindi kilalang sequence.
• Touchdown PCR (Step PCR): isang variant ng PCR na naglalayong bawasan ang hindi partikular na background sa pamamagitan ng unti-unting pagbaba sa temperatura ng pagsusubo habang umuusad ang mga cycle ng PCR. Ang temperatura ng pagsusubo sa mga unang cycle ay karaniwang ilang degrees (3-5°C) sa itaas ng Tm ng mga primer na ginamit, habang sa mga susunod na cycle, ang temperatura ay ilang degrees (3-5°C) sa ibaba ng Tm ng mga primer. Ang mas mataas na temperatura ay nagbibigay ng higit na partikularidad para sa panimulang pagbubuklod, at ang mas mababang temperatura ay nagbibigay-daan para sa mas mahusay na amplification mula sa mga partikular na produkto na nabuo sa mga unang cycle.
• PAN-AC: Gumagamit ng isothermal na kondisyon para sa amplification at maaaring ilapat sa mga buhay na selula.
• Universal mabilis na paglalakad sa genome: para sa paglalakad sa genome at genetic fingerprinting gamit ang mas tiyak na "two-sided" PCR kaysa sa tradisyonal na "one-sided" approach (gamit lang ang isang gene-specific primer at isang karaniwang primer - na maaaring humantong sa artifactual na "ingay") dahil sa isang mekanismong kinasasangkutan ng lasso pattern formation. Ang mga pinasimpleng derivatives ng UFW ay "Lane RAGE" (lasso nested PCR para sa mabilis na pag-amplification ng genomic DNA ends), "5" RACE Lane" at "3" RACE Lane.
• SasilicoPCR(digital PCR, virtual PCR, e-PCR, e-PCR) ay tumutukoy sa mga computational tool na ginagamit upang kalkulahin ang mga resulta ng isang theoretical polymerase chain reaction gamit ang isang naibigay na hanay ng mga primer (probes) upang palakihin ang mga sequence ng DNA mula sa isang sequenced genome o transcriptome.

Kasaysayan ng PCR

Sa isang artikulo sa Journal of Molecular Biology noong 1971, unang inilarawan ni Kleppe et al. ang isang pamamaraan gamit ang enzymatic assay upang kopyahin ang isang maikling DNA template na may mga primer sa ilalim ng mga kondisyong in vitro. Gayunpaman, ang maagang pagpapakita ng pangunahing prinsipyo ng PCR ay hindi nakatanggap ng maraming pansin, at ang pag-imbento ng polymerase chain reaction noong 1983 ay karaniwang na-kredito kay Carey Mullis.

Nang bumuo si Mullis ng PCR noong 1983, nagtatrabaho siya sa Emeryville, California para sa Cetus Corporation, isang maagang kumpanya ng biotech. Doon siya ay responsable para sa synthesis ng maikling DNA chain. Isinulat ni Mullis na siya ay naglihi ng PCR habang nagmamaneho sa highway ng Pacific Coast isang gabi sa kanyang sasakyan. Naglaro siya sa kanyang isipan ng isang bagong paraan upang pag-aralan ang mga pagbabago (mutations) sa DNA nang mapagtanto niya na sa halip ay nag-imbento siya ng isang paraan upang madagdagan ang numero ng kopya ng anumang seksyon ng DNA sa pamamagitan ng paulit-ulit na mga siklo ng pagdoble na dulot ng DNA polymerase. Sa Scientific American, ibinuod ni Mullis ang pamamaraan: “Simula sa isang molekula ng DNA genetic material, ang PCR ay maaaring makabuo ng 100 bilyong gayong mga molekula sa isang araw. Ang reaksyong ito ay madaling gawin. Nangangailangan ito ng hindi hihigit sa isang test tube, ilang simpleng reagents, at pinagmumulan ng init." Ginawaran siya ng Nobel Prize sa Chemistry noong 1993 para sa kanyang imbensyon, makalipas ang pitong taon nang isagawa niya at ng kanyang mga kasamahan sa Cetus ang kanyang panukala sa unang pagkakataon. Gayunpaman, nananatili ang ilang kontrobersya tungkol sa intelektwal at praktikal na kontribusyon ng ibang mga siyentipiko sa gawain ni Mullis, at kung siya ang nag-iisang imbentor ng prinsipyo ng PCR.

Ang paraan ng PCR ay batay sa paggamit ng angkop na DNA polymerase na may kakayahang makayanan ang mataas na temperatura na >90°C (194°F) na kinakailangan upang maputol ang dalawang strand ng DNA sa DNA double helix pagkatapos ng bawat ikot ng pagtitiklop. Ang mga polymerase ng DNA, na orihinal na ginamit para sa mga in vitro na eksperimento, na inilarawan ng PCR, ay hindi nakayanan ang gayong mataas na temperatura. Samakatuwid, ang mga maagang pamamaraan ng pagtitiklop ng DNA ay napaka hindi epektibo at nakakaubos ng oras, at nangangailangan ng malaking halaga ng DNA polymerase at patuloy na pagproseso sa buong proseso.

Pagtuklas noong 1976 ng Taq polymerase, isang DNA polymerase na nakahiwalay sa isang thermophilic bacterium, Thermusaquaticus, na natural na naninirahan sa mainit (50 hanggang 80°C (122 hanggang 176°F)) na mga kapaligiran tulad ng mga hot spring, ang nagbigay daan para sa isang kapansin-pansing pagpapabuti sa paraan ng PCR. Nahiwalay ang DNA polymerase sa T.Aquaticus, ay matatag sa mataas na temperatura at nananatiling aktibo kahit na pagkatapos ng denaturation ng DNA, kaya inaalis ang pangangailangan na magdagdag ng mga bagong DNA polymerases pagkatapos ng bawat cycle. Ginawa nitong posible na i-automate ang proseso ng DNA amplification batay sa isang thermal cycler.

Patent Wars

Ang iminungkahing paraan ng PCR ay patented ni Carey Mullis at na-kredito sa Cetus Corporation kung saan nagtrabaho si Mullis noong naimbento niya ang pamamaraan noong 1983. Ang Taq polymerase enzyme ay protektado rin ng mga patent. Mayroong ilang mga high-profile na demanda na nauugnay sa pamamaraan, kabilang ang isang hindi matagumpay na demanda na inihain ng DuPont. Nakuha ng kumpanya ng parmasyutiko na Hoffmann-La Roche ang mga karapatan sa mga patent noong 1992 at kasalukuyang hawak ang mga protektado pa rin.

Ang isang katulad na labanan sa patent sa Taq polymerase enzyme ay nagpapatuloy pa rin sa ilang hurisdiksyon sa buong mundo sa pagitan ng Roche at Promega. Ang mga legal na argumento ay lumampas sa mga tuntunin ng orihinal na mga patent ng PCR at Taq polymerase, na nag-expire noong Marso 28, 2005.

SEI HPE "Krasnoyarsk State Medical Academy

pinangalanang Yasenetsky Federal Agency for Health and Social Development »

Department of Medical Genetics at Clinical Neurophysiology, IPO

PANGUNAHING PRINSIPYO NG PARAAN

POLYMERASE CHAIN ​​REACTION

Methodical manual para sa mga mag-aaral ng 3-4 na kurso

sa mga espesyalidad ng pangkalahatang medisina (060101) at

Krasnoyarsk - 2007

Shnaider, N. A., Butyanov, R. A. Mga pangunahing prinsipyo ng paraan ng reaksyon ng polymerase chain. Manual na pamamaraan para sa ekstrakurikular na gawain ng mga mag-aaral ng 3-4 na kurso sa mga espesyalidad ng pangkalahatang medisina (060101) at pediatrics (060103). - Krasnoyarsk: Publishing house ng GOU VPO KrasGMA, 2007. - 42p.

Ang manu-manong pamamaraan ay ganap na sumusunod sa mga kinakailangan ng Pamantayan ng Estado (2000) at sumasalamin sa mga pangunahing aspeto ng modernong pamamaraan para sa pag-diagnose ng namamana na mga sakit ng tao - ang paraan ng reaksyon ng polymerase chain, ang materyal na pang-edukasyon ay inangkop sa mga teknolohiyang pang-edukasyon, na isinasaalang-alang ang mga detalye ng pagsasanay sa 3-4 na kurso ng mga medikal at pediatric na faculties.

Mga Reviewer: Pinuno ng Department of Medical Genetics, Institusyon ng Edukasyon ng Estado ng Mas Mataas na Propesyonal na Edukasyon

"Novosibirsk State Medical University ng Federal Agency for Health and Social Development", Doctor of Medical Sciences, Propesor;

Pagtitiklop ng DNA

Ang object ng pag-aaral ng paraang ito ay Deoxyribonucleic acid (DNA). Ang DNA ay isang unibersal na tagapagdala ng genetic na impormasyon sa lahat ng mga organismo na umiiral sa Earth (maliban sa mga microorganism na naglalaman ng RNA). Ang DNA ay isang double strand na pinaikot sa isang helix. Ang bawat strand ay binubuo ng mga nucleotide na konektado sa serye. Ang mga strand ng DNA ay may kabaligtaran na direksyon: ang 5'-end ng isang strand ay tumutugma sa 3'-end ng pangalawang strand. Ang natatanging katangian ng DNA ay ang kakayahan nitong i-duplicate ang sarili nito. Ang prosesong ito ay tinatawag na pagtitiklop. Ang pagtitiklop ng molekula ng DNA ay nangyayari sa panahon ng sintetikong interphase. Ang bawat isa sa dalawang kadena ng molekula ng "magulang" ay nagsisilbing template para sa "anak na babae". Pagkatapos ng pagtitiklop, ang bagong synthesize na molekula ng DNA ay naglalaman ng isang "maternal" strand, at ang pangalawa - isang "anak na babae", na bagong synthesize (semi-conservative na paraan). Para sa synthesis ng template ng isang bagong molekula ng DNA, kinakailangan na ang lumang molekula ay ma-despiralize at maiunat. Nagsisimula ang pagtitiklop sa ilang mga lokasyon sa molekula ng DNA. Ang seksyon ng isang molekula ng DNA mula sa simula ng isang pagtitiklop hanggang sa simula ng isa pa ay tinatawag replika.

Ang simula ng pagtitiklop ay isinaaktibo mga panimulang aklat(mga buto), na binubuo ng 100-200 base pairs. Ang DNA helicase enzyme ay nag-unwind at naghihiwalay sa parent DNA helix sa dalawang strands, kung saan, ayon sa prinsipyo ng complementarity, kasama ang partisipasyon ng DNA polymerase enzyme, ang "anak" na mga strand ng DNA ay binuo. Upang simulan ng enzyme ang trabaho nito, kinakailangan ang pagkakaroon ng panimulang bloke - isang maliit na paunang double-stranded na fragment. Ang panimulang bloke ay nabuo kapag ang panimulang aklat ay nakikipag-ugnayan sa komplementaryong rehiyon ng kaukulang strand ng magulang na DNA. Sa bawat replicon, ang DNA polymerase ay maaaring gumalaw kasama ang "ina" strand sa isang direksyon lamang (5`=>3`).

Sa nangungunang strand, habang ang replicon ay nag-unwind, ang isang "anak na babae" na strand ay unti-unting lumalaki. Sa lagging strand, nag-synthesize din ang daughter strand sa direksyon (5`=>3`), ngunit sa magkahiwalay na mga fragment habang nag-unwind ang replicon.

Kaya, ang attachment ng mga pantulong na nucleotides ng "anak na babae" na mga hibla ay napupunta sa magkasalungat na direksyon (antiparallel). Ang pagtitiklop sa lahat ng mga replika ay nangyayari nang sabay-sabay. Ang mga fragment at mga bahagi ng "anak na babae" na mga hibla na na-synthesize sa iba't ibang mga replicon ay pinagsasama sa isang solong strand ng isang enzyme ligase. Ang pagtitiklop ay nailalarawan sa pamamagitan ng semi-conservation, anti-parallelism at discontinuity. Ang buong genome ng isang cell ay ginagaya nang isang beses sa bawat yugto ng panahon na tumutugma sa isang mitotic cycle. Bilang resulta ng proseso ng pagtitiklop, dalawang molekula ng DNA ang nabuo mula sa isang molekula ng DNA, kung saan ang isang strand ay mula sa molekula ng magulang na DNA, at ang pangalawa, ang anak na babae, ay bagong synthesize (Fig. 1).

kanin. 1. Diagram ng pagtitiklop ng molekula ng DNA.

Kaya, kasama ang ikot ng pagtitiklop ng DNA tatlong pangunahing yugto:

1. unwinding ng DNA helix at divergence ng strands (denaturation);

2. attachment ng mga panimulang aklat;

3. pagkumpleto ng kadena ng thread ng bata.

Prinsipyo ng pamamaraan ng PCR

Ang pagtitiklop ng DNA ang naging batayan ng PCR. Sa PCR, ang mga prosesong nakalista sa itaas ay isinasagawa sa isang test tube sa isang cyclic mode. Ang paglipat mula sa isang yugto ng reaksyon patungo sa isa pa ay nakamit sa pamamagitan ng pagbabago ng temperatura ng pinaghalong incubation. Kapag ang solusyon ay pinainit sa 93-95°C, nangyayari ang DNA denaturation. Upang magpatuloy sa susunod na hakbang - ang pagdaragdag o "pagsusubo" ng mga panimulang aklat - ang pinaghalong incubation ay pinalamig sa 50-65°C. Susunod, ang halo ay pinainit sa 70-72 ° C - ang pinakamabuting kalagayan na operasyon ng taq-DNA polymerase - sa yugtong ito, ang isang bagong DNA strand ay nakumpleto. Pagkatapos ay umuulit muli ang ikot. Sa ibang salita Ang paraan ng PCR ay isang maramihang pagtaas sa bilang ng mga kopya (pagpapalakas) isang partikular na seksyon ng DNA na na-catalyze ng enzyme DNA polymerase.

Ang extension ng anak na babae na mga hibla ng DNA ay dapat mangyari nang sabay-sabay sa parehong mga hibla ng maternal DNA, kaya ang pagtitiklop ng pangalawang strand ay nangangailangan din ng sarili nitong panimulang aklat. Kaya, dalawang panimulang aklat ang ipinakilala sa pinaghalong reaksyon: isa para sa "+" -chain, ang pangalawa para sa "-"-chain. Ang pagkakaroon ng pagsali sa magkasalungat na mga hibla ng molekula ng DNA, nililimitahan ng mga panimulang aklat ang kanilang sarili sa bahaging iyon, na kung saan ay paulit-ulit na madodoble o mapapalaki. Ang haba ng naturang fragment, na tinatawag na amplicon, ay karaniwang ilang daang nucleotides.

Mga hakbang sa PCR

Kasama sa bawat cycle ng amplification ang 3 yugto na nagaganap sa iba't ibang kondisyon ng temperatura (Larawan 2).

· Stage 1: denaturation ng DNA . Dumadaloy ito sa 93-95° sa loob ng 30-40 segundo.

· Stage 2: panimulang pagsusubo . Ang panimulang attachment ay nangyayari bilang pantulong sa kaukulang mga pagkakasunud-sunod sa kabaligtaran ng mga hibla ng DNA sa mga hangganan ng isang partikular na site. Ang bawat pares ng mga panimulang aklat ay may sariling temperatura ng pagsusubo, ang mga halaga nito ay nasa hanay na 50-65°C. Oras ng pagsusubo 20-60 seg.

· Stage 3: extension ng DNA chain. Ang komplementaryong extension ng DNA chain ay nangyayari mula sa 5" dulo hanggang 3" na dulo ng chain sa magkasalungat na direksyon, simula sa mga primer attachment site. Ang materyal para sa synthesis ng mga bagong DNA strands ay mga deoxyribonucleoside triphosphate na idinagdag sa solusyon. Ang proseso ng synthesis ay na-catalyzed ng enzyme taq-polymerase at nagaganap sa temperatura na 70-72°C. Oras ng synthesis - 20-40 seg.

Ang bagong DNA strands na nabuo sa unang amplification cycle ay nagsisilbing template para sa ikalawang amplification cycle, kung saan nabuo ang isang partikular na amplicon DNA fragment (Fig. 3). Sa kasunod na mga cycle ng amplification, ang mga amplicon ay nagsisilbing template para sa synthesis ng mga bagong chain.

Kaya, ang mga amplicon ay nag-iipon sa solusyon ayon sa formula 2", kung saan ang n ay ang bilang ng mga cycle ng amplification. Samakatuwid, kahit na isang double-stranded na molekula ng DNA lamang ang unang naroroon sa paunang solusyon, humigit-kumulang 108 mga molekula ng amplicon ang naipon sa solusyon pagkatapos ng 30-40 na mga siklo. Ang halagang ito ay sapat para sa maaasahang visual na pagtuklas ng fragment ng gel na ito ng agarose.

Ang proseso ng amplification ay isinasagawa sa isang espesyal na programmable thermostat ( nagbibisikleta), na, ayon sa isang ibinigay na programa, ay awtomatikong nagbabago ng mga temperatura ayon sa bilang ng mga cycle ng amplification.

Ang mga sumusunod na sangkap ay kinakailangan para sa amplification:

· template ng DNA(DNA o bahagi nito na naglalaman ng nais na tiyak na fragment);

· Mga panimulang aklat(synthetic oligonucleotides (20-30 nucleotide pares) na pantulong sa mga sequence ng DNA sa mga hangganan ng partikular na fragment na tinutukoy). Ang pagpili ng isang partikular na fragment at ang pagpili ng mga panimulang aklat ay may malaking papel sa pagtitiyak ng amplification, na nakakaapekto sa kalidad ng pagsusuri.

· Isang pinaghalong deoxynucleotide triphosphate (dNTPs)(isang pinaghalong apat na dNTP, na siyang materyal para sa synthesis ng mga bagong komplementaryong DNA strands sa katumbas na konsentrasyon na 200-500 microns)

· EnzymeTaq- polymerase(thermotable DNA polymerase, na pinapagana ang pagpapahaba ng mga primer na chain sa pamamagitan ng sunud-sunod na pagdaragdag ng mga base ng nucleotide sa lumalaking chain ng synthesized DNA, 2-3 mm).

· solusyon sa buffer(reaction medium na naglalaman ng mga Mg2+ ions na kinakailangan para mapanatili ang aktibidad ng enzyme, PH 6.8-7.8).

Upang matukoy ang mga partikular na rehiyon ng genome ng mga RNA virus, ang isang kopya ng DNA ay unang nakuha mula sa isang template ng RNA gamit ang isang reverse transcription (RT) na reaksyon na na-catalyze ng enzyme reverse transcriptase (reverse transcriptase).

kanin. 2. Pagpapalakas (1st cycle).

kanin. 3. Pagpapalakas (2nd cycle).

Pangunahing Aplikasyon ng PCR

klinikal na gamot:

o diagnosis ng mga impeksyon,

o pagtuklas ng mga mutasyon, kabilang ang pagsusuri ng mga namamana na sakit,

o genotyping, kabilang ang HLA genotyping,

o mga teknolohiyang cellular

ekolohiya (bilang isang paraan upang masubaybayan ang estado at kalidad ng mga bagay at pagkain sa kapaligiran)

kahulugan ng mga transgenic na organismo (GMOs)

Personal na pagkakakilanlan, paternity, forensics

pangkalahatan at partikular na biology,

Mga pangunahing prinsipyo

organisasyon ng mga diagnostic na laboratoryo

Ang trabaho sa laboratoryo ng PCR ay isinasagawa alinsunod sa "Mga Panuntunan para sa disenyo, kaligtasan, pang-industriya na kalinisan, rehimeng anti-epidemya at personal na kalinisan kapag nagtatrabaho sa mga laboratoryo (mga departamento, departamento) ng mga sanitary at epidemiological na institusyon ng sistema ng pangangalagang pangkalusugan.

Kontaminasyon ng mga sample ng DNA

Ang pagsasagawa ng mga diagnostic ng PCR ay nauugnay sa isang problema na sanhi ng mataas na sensitivity ng pamamaraan - ang posibilidad karumihan. Kung ang mga bakas na dami ng positibong DNA ay pumasok sa reaction tube (mga partikular na produkto ng amplification ng DNA - mga amplicon; pamantayan ng DNA na ginamit bilang positibong kontrol; positibong DNA ng isang klinikal na sample) ay humahantong sa pagpapalaki ng isang partikular na fragment ng DNA sa panahon ng PCR at, bilang resulta, sa paglitaw ng mga maling positibong resulta.

Sa kurso ng trabaho, maaari kang magkita dalawang uri ng kontaminasyon:

1. cross contamination mula sa sample hanggang sa sample (sa panahon ng pagproseso ng mga klinikal na sample o kapag hinuhukay ang reaction mixture), na humahantong sa paglitaw ng mga sporadic false positive na resulta;

2. kontaminasyon ng produkto ng amplification(amplicons), na pinakamahalaga, dahil sa panahon ng proseso ng PCR, ang mga amplicon ay nag-iipon sa napakalaking dami at mainam na mga produkto para sa reamplification.

Ang bakas na kontaminasyon ng amplicon ng mga pinggan, mga awtomatikong pipette at kagamitan sa laboratoryo, sa ibabaw ng mga talahanayan ng laboratoryo, o maging sa ibabaw ng balat ng mga manggagawa sa laboratoryo ay humahantong sa paglitaw ng mga sistematikong maling positibong resulta. Ang pagtukoy sa pinagmulan ng kontaminasyon ay maaaring napakahirap at nangangailangan ng malaking pamumuhunan ng oras at pera. Ang karanasan na naipon hanggang sa kasalukuyan sa gawain ng mga laboratoryo gamit ang paraan ng PCR para sa mga diagnostic ay nagpapahintulot sa amin na bumalangkas ng mga pangunahing kinakailangan para sa organisasyon ng naturang mga laboratoryo at ang pagsasagawa ng mga pagsusuri mismo. Ang pagsunod sa mga kinakailangang ito ay nag-aalis ng posibilidad ng kontaminasyon at makakuha ng mga maling positibong resulta.

Mga yugto ng pagsusuri sa PCR

Hiwalay sa heograpiya, inilalagay ang mga ito sa magkakahiwalay na silid (Larawan 4.5):

· Pre-PCR room, kung saan ang pagproseso ng mga klinikal na sample, pagkuha ng DNA, paghahanda ng pinaghalong reaksyon para sa PCR at PCR ay isinasagawa (kung ang mga kondisyon ay magagamit, ang huling dalawang hakbang ay inirerekomenda din na isagawa sa isang karagdagang hiwalay na silid). Sa mga silid na ito ay ipinagbabawal na isagawa ang lahat ng iba pang mga uri ng trabaho sa mga pinag-aralan na ahente, ang mga diagnostic ng PCR na kung saan ay isinasagawa sa laboratoryo na ito.

· Post-PCR room, kung saan ang pagtuklas ng mga produkto ng amplification ay isinasagawa. Maaaring gumamit ng iba pang paraan ng pagtuklas sa kuwartong ito. Ito ay kanais-nais na hanapin ang silid para sa pagtuklas ng mga produkto ng amplification hangga't maaari mula sa mga silid na pre-PCR.

Ang mga working room ay nilagyan ng mga ultraviolet lamp na may maximum na radiation sa rehiyon na 260 nm (type DB-60) sa rate na 2.5 W bawat 1 m3. Ang mga lamp ay matatagpuan upang ang mga ibabaw ng work table, kagamitan at materyales kung saan ang operator ay nakikipag-ugnayan sa panahon ng pagsusuri ng PCR ay nalantad sa direktang radiation. Ang pag-iilaw ay isinasagawa sa loob ng 1 oras bago magsimula ang trabaho at sa loob ng 1 oras pagkatapos ng pagtatapos ng trabaho.

Ang mga doktor sa laboratoryo ay nagtatrabaho sa mga espesyal na damit sa laboratoryo, na pinapalitan kapag lumilipat mula sa isang silid patungo sa isa pa, at sa mga disposable na guwantes. Ang pagproseso ng mga damit mula sa iba't ibang mga silid ay isinasagawa nang hiwalay. Ang iba't ibang empleyado ay nagtatrabaho sa iba't ibang yugto ng pagsusuri ng PCR.

Para sa trabaho, ang mga hiwalay na hanay ng mga dispenser, plastik at mga kagamitang babasagin, kagamitan sa laboratoryo, gown at guwantes ay ginagamit, na idinisenyo para sa iba't ibang yugto ng pagsusuri at hindi portable mula sa isang silid patungo sa isa pa. Ang mga kagamitan, materyales at imbentaryo sa bawat kuwarto ay may label nang naaayon.

Ang lahat ng mga yugto ng trabaho ay isinasagawa lamang sa paggamit ng mga disposable consumable: mga tip para sa mga awtomatikong pipette, test tube, guwantes, atbp. Siguraduhing baguhin ang mga tip kapag lumilipat mula sa sample patungo sa sample. Kinakailangang gumamit ng mga tip na may filter ng aerosol barrier upang maiwasan ang pagpasok ng mga microdroplet ng solusyon sa pipette. Ang mga ginamit na test tube at tip ay itinatapon sa mga espesyal na lalagyan o lalagyan na naglalaman ng disinfectant solution. Ang mga klinikal na sample ay nakaimbak nang hiwalay sa mga reagents.

Para sa pagproseso at paglilinis ng lugar ng trabaho, ang bawat kuwarto ay may cotton-gauze swab (mga napkin), sipit, disinfectant at inactivating solution.

Sa diagnostic laboratoryo ng PCR, hindi kasama ang gawaing nauugnay sa paggawa (pag-clone) at paghihiwalay ng mga recombinant na plasmid na naglalaman ng mga pagkakasunud-sunod ng DNA o mga fragment ng gene ng mga pathogen na na-diagnose sa laboratoryo na ito.

Koleksyon ng mga klinikal na materyal

Ang pinag-aralan na materyal para sa PCR ay maaaring mga scrapings ng epithelial cells, dugo, plasma, serum, pleural at cerebrospinal fluid, ihi, plema, mucus at iba pang biological secretions, biopsy specimens.

Ang sampling ng materyal ay isinasagawa sa mga kondisyon ng silid ng paggamot ng kaukulang profile. Pagkatapos ng sampling, ang mga sample ay dapat dalhin sa PCR diagnostic laboratory sa lalong madaling panahon.

Ang sampling ay dapat isagawa gamit ang sterile, mas mainam na disposable, mga instrumento lamang sa disposable sterile plastic tubes o glass tubes, pre-treated para sa isang oras na may chromium mixture, lubusan na hugasan ng distilled water at calcined sa isang oven sa temperatura na 150 ° C sa loob ng 1 oras.

Detection zone (ibang palapag o ibang gusali).

kanin. 4. PCR laboratory device na may detection sa pamamagitan ng electrophoresis.

Detection zone (iba't ibang palapag o gusali)

kanin. 5. PCR laboratory device na may fluorescent detection (quantitative analysis).

kanin. 6. Kwarto ng pagkuha ng DNA. Ang ipinapakita ay isang tabletop box na may bactericidal lamp.

kanin. 7. silid ng amplification.

kanin. 8. Detection room.

kanin. 9. Mga sample ng dugo para sa mga diagnostic ng DNA ng mga namamana na sakit.

Imbakan at transportasyon ng mga sample

Para sa pagsusuri ng mga namamana na sakit, ang mga sample ng dugo ay naka-imbak sa mga espesyal na form ng papel o sa mga epindorf (plastic test tubes) sa isang frozen na estado sa loob ng mahabang panahon (Larawan 9).

Para sa pagsusuri ng mga nakakahawang sakit, ang mga sample ay pinananatili sa temperatura ng silid nang hindi hihigit sa 2 oras. Kung kinakailangan ng mas mahabang pag-iimbak, ang mga sample ay maaaring ilagay sa refrigerator sa temperatura na 2-8°C para sa isang panahon na hindi hihigit sa 24 na oras. Ang mas mahabang imbakan (hanggang 2 linggo) ay katanggap-tanggap kapag nagyelo sa freezer sa temperatura na minus 20°C. Ang paulit-ulit na pagyeyelo-pagtunaw ng mga sample ay hindi pinapayagan.

Kung ang PCR diagnostic laboratory at ang procedure room para sa sampling ay teritoryal na pinaghihiwalay, ang mga sample ay dapat dalhin sa mga thermoses o thermal container bilang pagsunod sa mga patakaran para sa pag-iimbak ng mga sample at ang mga patakaran para sa pagdadala ng mga nakakahawang materyales.

Pagkuha ng DNA mula sa mga sample

Ang paraan ng solid-phase sorption, na binubuo sa pagdaragdag ng isang lysing agent na naglalaman ng solusyon ng guanidine, sorption ng DNA sa isang sorbent, paulit-ulit na paghuhugas at resorption ng DNA na may buffer solution, ay naging laganap. Sa kaso ng serum, plasma o buong pagpoproseso ng dugo, karaniwang ginagamit ang paraan ng phenolic extraction. Ang pamamaraan ay nagsasangkot ng deproteinization na may phenol/chloroform na sinusundan ng precipitation ng DNA (o RNA) na may ethanol o isopropanol. Ang pagproseso ay isinasagawa sa microcentrifuge test tubes ng uri ng Eppendor P na may dami na 1.5 ml. Ang oras ng pagproseso ay 1.5-2 na oras (Larawan 10).

kanin. 10. Paghihiwalay ng DNA.

Pagsasagawa ng PCR

Ang isang tiyak na halaga ng sample mula sa naprosesong klinikal na sample ay inililipat sa isang espesyal na microcentrifuge tube ng uri ng Eppendorf na may volume na 0.2 o 0.5 ml. Ang amplification mixture na binubuo ng tubig, PCR buffer, dNTP solution, primer solution at Taq polymerase solution ay idinagdag sa parehong tubo (idinagdag sa pinaghalong huli). Bilang panuntunan, ang volume ng vapor µ ng reaksyon sa pag-iwas sa reaksyon ng langis ay 25µl. amplification.Ang mga tubo ay inililipat sa isang programmable thermostat (heat cycler), kung saan ang amplification ay isinasagawa sa awtomatikong mode ayon sa isang ibinigay na programa (Fig. 11).

kanin. labing-isa. amplifier" Thermocycler ».

Ang oras ng reaksyon, depende sa ibinigay na programa, ay 2-3 oras. Kaayon ng mga eksperimentong sample, ang mga control sample ay inilalagay: ang positibong kontrol ay kinabibilangan ng lahat ng mga bahagi ng reaksyon, ngunit sa halip na ang materyal ng klinikal na sample, isang control DNA na paghahanda ng gene na pinag-aaralan ang ipinakilala. Kasama sa negatibong kontrol ang lahat ng bahagi ng reaksyon, ngunit sa halip na ang klinikal na materyal o paghahanda ng DNA, isang naaangkop na dami ng deionized na tubig o isang katas na hindi naglalaman ng pinag-aralan na DNA ay idinagdag. Ang isang negatibong kontrol ay kinakailangan upang suriin ang mga bahagi ng reaksyon para sa kawalan ng DNA sa mga ito dahil sa kontaminasyon at upang ibukod ang mga maling positibong resulta.

Pagpaparehistro ng mga resulta

Ang amplified specific DNA fragment ay nakita ng agarose gel electrophoresis sa pagkakaroon ng ethidium bromide. Ang ethidium bromide ay bumubuo ng isang matatag na interstitial compound na may mga fragment ng DNA, na lumilitaw bilang mga makinang na banda kapag ang gel ay na-irradiated ng UV radiation na may wavelength na 290-330 nm. Depende sa laki ng mga resultang PCR amplicons, isang gel na naglalaman ng 1.5% hanggang 2.5% agarose ay ginagamit. Upang maghanda ng agarose gel, ang isang halo ng agarose, buffer, at tubig ay natunaw sa isang microwave oven o sa isang paliguan ng tubig, at isang solusyon ng ethidium bromide ay idinagdag. Pinalamig sa 50-60 ° C, ang halo ay ibinuhos sa amag na may isang layer na 4-6 mm ang kapal, at gamit ang mga espesyal na suklay, ang mga bulsa ay ginawa sa gel para sa paglalapat ng sample. Ang mga suklay ay nakatakda upang sa pagitan ng ilalim ng mga balon at ang base ng gel ay nananatiling isang layer ng agarose 0.5-1 mm. Matapos ang gel ay solidified, isang amplificate ay inilapat sa mga pockets sa isang halaga ng 5-15 μl. Inirerekomenda na magsagawa ng electrophoresis ng isang pinaghalong mga marker ng haba ng fragment ng DNA na kahanay sa mga kontrol at eksperimentong sample. Karaniwan, ang naturang halo ay naglalaman ng sampung mga fragment ng DNA na 100, 200, 300, atbp. mahabang mga pares ng base.

Ang pagse-set up ng naturang sample ay nagbibigay-daan sa iyong i-verify ang haba ng mga amplicon sa control at mga eksperimentong sample. Ang gel na may inilapat na sample ay inilipat sa isang electrophoresis chamber na puno ng isang buffer, ang kamara ay konektado sa isang pinagmumulan ng kapangyarihan at ang electrophoretic separation ng mga produkto ng amplification ay isinasagawa sa loob ng 30-45 minuto sa lakas ng electric field na 10-15 V / cm. Sa kasong ito, ang harap ng pangulay, na bahagi ng pinaghalong reaksyon, ay dapat pumasa ng hindi bababa sa 3 cm.

Pagkatapos ng pagtatapos ng electrophoresis, ang gel ay inilipat sa transilluminator glass at tiningnan sa ultraviolet light. Para sa dokumentasyon, ang gel ay nakuhanan ng larawan sa Mikrat 300 film o naitala gamit ang isang video system na nakakonekta sa isang computer.

Ang mga control sample ay sinusuri muna. Sa electrophoretic lane na naaayon sa positibong kontrol, dapat na naroroon ang isang orange na luminous band. Ang electrophoretic mobility nito ay dapat tumugma sa haba ng amplicon na tinukoy sa mga tagubilin.

Sa electrophoretic track na naaayon sa negatibong kontrol, ang naturang banda ay dapat na wala. Ang pagkakaroon ng naturang banda sa negatibong kontrol ay nagpapahiwatig ng kontaminasyon - kontaminasyon ng mga reagents na ginamit sa pinag-aralan na DNA o amplicon. Ang mga sample ng pagsubok ay sinusuri sa pamamagitan ng presensya sa kani-kanilang linya ng isang banda na matatagpuan sa parehong antas ng banda sa positibong control sample. Ang intensity ng band glow ay tumutugma sa dami ng DNA sa ilalim ng pag-aaral sa sample, na nagbibigay-daan para sa isang semi-quantitative na pagtatasa ng PCR. Karaniwan ang mga positibong resulta ay sinusuri sa isang sukat na apat na puntos. Kung ang glow ng banda sa sample na pang-eksperimento ay napakahina, kung gayon ang isang sample ay dapat na muling ayusin (Larawan 12).

kanin. 12. Electrophoresis sa agarose gel.

Mga aplikasyon ng PCR para sadiagnostic ng point mutations at gene polymorphism

Ang isa sa mga nangungunang lugar ng aplikasyon ng PCR sa praktikal na pangangalagang pangkalusugan ay ang diagnosis ng point mutations at gene polymorphism. . May mga direkta at hindi direktang pamamaraan ng mga diagnostic ng DNA. Sa mga sitwasyong iyon kung saan kilala ang isang gene, ang pinsala nito ay humahantong sa pag-unlad ng isang namamana na sakit, ang pinsalang ito ay maaaring makita ng mga molecular genetic na pamamaraan. Ang ganitong mga pamamaraan ay tinatawag na direkta. Gamit ang mga direktang pamamaraan, ang mga kaguluhan sa pangunahing pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng DNA (mutation at kanilang mga uri) ay nakita. Ang mga direktang pamamaraan ay nailalarawan sa pamamagitan ng katumpakan na umaabot sa halos 100%.

Gayunpaman, sa pagsasagawa, ang mga pamamaraang ito ay maaaring ilapat sa ilalim ng ilang mga kundisyon.:

na may kilalang cytogenetic localization ng gene na responsable para sa pagbuo ng isang namamana na sakit;

Ang gene ng sakit ay dapat na ma-clone at malaman ang pagkakasunud-sunod ng nucleotide nito.

Ang layunin ng direktang pagsusuri ng DNA ay upang matukoy ang mga mutant alleles.

Kaya, sa mga sitwasyong iyon kung saan alam kung anong uri ng pinsala sa DNA ang humahantong sa isang namamana na sakit, ang DNA fragment na naglalaman ng pinsala ay direktang sinusuri, ibig sabihin, ang direktang paraan ng mga diagnostic ng DNA ay ginagamit.

Gayunpaman, hanggang ngayon, ang mga gene ng maraming mga sakit ay hindi na-map, ang kanilang exon-intron na organisasyon ay hindi kilala, at maraming mga namamana na sakit ay nailalarawan sa pamamagitan ng binibigkas na genetic heterogeneity, na hindi pinapayagan ang buong paggamit ng mga direktang pamamaraan ng diagnostic ng DNA. Samakatuwid, sa mga kaso kung saan ang lokalisasyon ng pinsala ay hindi alam, ang isang iba't ibang mga diskarte ay ginagamit, na nauugnay sa pag-aaral ng paligid ng gene na responsable para sa sakit sa gene, kasama ang pagsusuri ng pamilya, iyon ay, ang mga hindi direktang pamamaraan ng molecular genetic diagnosis ng mga namamana na sakit ay ginagamit.

Maaaring gamitin ang iba't ibang paraan upang makita ang mga mutasyon ng punto at maliliit na pagtanggal, ngunit lahat ng mga ito ay batay sa paggamit ng paraan ng PCR. Ang reaksyong ito ay nagpapahintulot sa iyo na paulit-ulit na i-multiply ang nucleotide sequence ng DNA, at pagkatapos ay maghanap ng mga mutasyon. Ang mga pamamaraan para sa paghahanap ng mga fragment ng DNA na nagdadala ng mga mutasyon ay batay sa isang paghahambing na pagsusuri ng mutant at normal na DNA nucleotide sequence.

Pagsusuri ng mga produkto ng PCR

sa proseso ng direktang diagnostic ng DNA

Ito ay nagsasangkot ng pag-aaral ng mga partikular na katangian ng pinalakas na rehiyon ng gene. Kaya, sa mga sakit na sanhi ng pagpapalawak ng mga pag-uulit ng trinucleotide, ang mga produkto ng amplification ay naiiba sa kanilang haba (na sumasalamin sa ibang bilang ng mga triplet sa pinag-aralan na rehiyon ng gene) at, bilang isang resulta, sa kanilang bilis ng paggalaw sa gel. Dahil dito, ang isang malinaw na electrophoretic na paghihiwalay ng mga normal at mutant alleles at isang tumpak na pagpapasiya ng pathologically elongated fragment, i.e. DNA diagnosis ng sakit (Fig. 13), ay nakamit.

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

kanin. 14. Diagnosis ng isang pagtanggal GAG sa gene DYT 1 sa mga pasyente na may dopa-independent dystonia (polyacrylamide gel electrophoresis). Mga track 2,3,6 - may sakit; lane 1,4,5 - kontrol. Ang manipis na arrow ay nagpapahiwatig ng normal na allele, ang naka-bold na arrow ay nagpapahiwatig ng mutant na mas maikling allele (pagtanggal ng tatlong nucleotides).

Kung ang rehiyon ng DNA na pinag-aaralan ay ganap na kasama sa isang pinalawig na pagtanggal, kung gayon ang PCR amplification ng DNA mula sa tinanggal na allele na ito ay hindi isasagawa dahil sa kakulangan ng mga lugar para sa primer hybridization. Sa kasong ito, ang isang homozygous na pagtanggal ay masuri batay sa kumpletong kawalan ng produkto ng PCR ng reaksyon (imposible ang synthesis ng DNA mula sa parehong mga kopya ng gene). Sa isang heterozygous na pagtanggal, posibleng makita ang isang produkto ng PCR na na-synthesize mula sa isang normal (ligtas) na allele, gayunpaman, para sa maaasahang diagnosis ng naturang mutation, kinakailangan na gumamit ng mas sopistikadong mga pamamaraan ng visualization ng DNA na nagbibigay-daan sa pagtantya ng dosis ng panghuling produkto ng PCR.

Para makita ang mga point mutations (madalas na mga pagpapalit ng nucleotide) sa ilang partikular na mga site, ang PCR method ay ginagamit kasabay ng iba pang paraan ng molecular genetic analysis. Kung ang lokasyon at likas na katangian ng iminungkahing point mutation ay tiyak na nalalaman, kung gayon para sa may layuning pagtuklas ng naturang mutation, restriction endonucleases (mga paghihigpit) ay mga espesyal na cellular enzyme na nakahiwalay sa iba't ibang strain ng bacteria.

Kinikilala ng mga enzyme na ito ang mga tiyak na pagkakasunud-sunod ng nucleotide mula apat hanggang sampung nucleotide ang haba. Pagkatapos ay isinasagawa nila ang paghihigpit (lat. (pagputol) ng mga sequence na ito bilang bahagi ng isang double-stranded na molekula ng DNA. Kinikilala at pinuputol ng bawat restriction enzyme sa isang nakapirming lugar ang isang mahigpit na tinukoy, tiyak na pagkakasunud-sunod ng nucleotide - restriction site (site ng pagkilala).

Sa mga kaso kung saan binabago ng isang point mutation ang natural na lugar ng pagkilala para sa isang partikular na restriction enzyme, hindi magagawa ng enzyme na i-cleave ang mutant na PCR-amplified fragment. Sa ilang mga kaso, ang mutation ay humahantong sa paglitaw ng isang bagong site ng pagkilala para sa isang partikular na restriction enzyme, na wala sa pamantayan.

Sa parehong mga sitwasyon, ang mutant at normal na mga produkto ng PCR na ginagamot sa napiling restriction enzyme ay magbibigay ng mga fragment ng paghihigpit ng iba't ibang haba, na madaling matukoy ng electrophoresis (Fig. 15).

Kaya, kung kinakailangan upang mabilis na makita ang anumang partikular na mutation ng punto, ang gawain ay nabawasan sa paghahanap para sa kaukulang restriction enzyme, ang site ng pagkilala na kung saan ay naisalokal sa site ng nababagabag na pagkakasunud-sunod ng nucleotide. Ang paggamot sa mga produkto ng PCR na may ganitong restriction enzyme ay magbibigay-daan sa madaling pagkita ng kaibahan ng mga normal at mutant alleles. Ang pagsusuri sa paghihigpit ay lubos na nagpapasimple sa pagtuklas ng mga kilalang point mutations at kasalukuyang malawakang ginagamit para sa direktang pagsusuri ng DNA ng mga namamana na sakit.

huling yugto molecular genetic analysis ng mutations ay ang pagpapasiya ng pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng pinag-aralan na fragment ng DNA (sequencing), na kung saan ay inihambing sa pamantayan at ang panghuling genetic diagnosis ay nabuo. Salamat sa mga pagsulong sa molecular genetics, ang mga pamamaraan ng diagnostic ng DNA ay binuo na ngayon para sa higit sa 400 namamana na sakit.

kanin. 15. Detection ng isang point mutation gamit ang restriction analysis: A - amplifiable na rehiyon ng gene na naglalaman ng restriction siteAGCTpara sa restriction endonucleaseAlu ako. MutationG→ Abinabago ang nucleotide sequence na ito, na nagreresulta sa restriction enzymeAluihinarangan; B - electropherogram ng mga produkto ng paghihigpit: lane 1 - homozygosity para sa normal na allele; lane 2, homozygosity para sa mutation; lane 3 - heterozygous state (normal allele + mutation).

Ang diagnosis ng mga namamana na sakit batay sa direktang pagsusuri ng mga mutant alleles sa mga pasyente, mga miyembro ng kanilang pamilya o ipinapalagay na mga heterozygous carrier ng pathological mutations ay angkop para sa pre-symptomatic at prenatal diagnosis, na maaaring magamit sa pinakamaagang yugto ng pag-unlad ng pangsanggol, bago lumitaw ang anumang klinikal o biochemical na sintomas ng sakit.

Anuman ang paraan ng pag-detect ng mutation, ang tumpak na molecular characterization ng bawat mutation ay maaari lamang makuha sa pamamagitan ng direktang sequencing. Upang i-automate ang prosesong ito, sa mga nakaraang taon, ang mga espesyal na aparato ay malawakang ginagamit - mga sequencer, na ginagawang posible upang makabuluhang mapabilis ang proseso ng pagbabasa ng impormasyon ng DNA.

Ang paraan para sa isang mas malawak na aplikasyon ng molecular biological research sa mga clinical diagnostic laboratories ay binuksan sa pamamagitan ng pagpapabilis ng analytical na proseso sa pamamagitan ng pagsasagawa ng lahat ng mga pamamaraan sa isang continuum, nang walang sample transfer, na lumilikha ng mga kondisyon upang maiwasan ang kontaminasyon sa panahon ng parallel testing ng isang bilang ng mga analytes at may layunin na pagpaparehistro ng mga resulta sa bawat cycle.

Pangunahing pagbabago ng paraan ng PCR

Ginagamit upang mabilis na mag-scan at maghanap ng mga kilalang gene mutations.

Multiplex (multiprimer) PCR

Ang pamamaraang ito ay batay sa sabay-sabay na pagpapalakas ng ilang mga exon ng pinag-aralan na gene sa isang reaksyon. Nagbibigay-daan ito sa matipid na mabilis na pag-screen ng pinakamadalas na mutasyon. Halimbawa, upang mabilis na ma-diagnose ang pagdadala ng mga pagtanggal sa dystrophin gene sa mga pasyente na may progresibong Duchenne/Becker muscular dystrophy, ang sabay-sabay na pagpapalakas ng hanay ng mga pinaka-madalas na mutating exon ng gene na ito ay ginaganap. Dahil ang mga sakit na ito ay minana sa isang X-linked recessive type at nauugnay sa pinsala sa nag-iisang X chromosome sa mga lalaki, sa kaso ng isang pinalawig na pagtanggal, ang electrophoresis ng mga produkto ng reaksyon ay magbubunyag ng kawalan ng isa o higit pang mga fragment ng DNA (exons), na maaaring magsilbing isang molekular na kumpirmasyon ng diagnosis. Bilang karagdagan, sa pamamagitan ng pagpili ng mga partikular na rehiyon ng gene para sa PCR amplification, posible ang isang medyo tumpak na pagtatasa ng kabuuang haba ng pagtanggal at mga gene break point (hanggang sa exon).

Ang pinagsamang paggamit ng ilang multiplex na reaksyon ay ginagawang posible na masuri ang hanggang 98% ng lahat ng mga pagtanggal na nangyayari sa mga pasyenteng may progresibong Duchenne/Becker muscular dystrophy. Ito ay humigit-kumulang 60% ng kabuuang bilang ng mga kilalang mutasyon sa dystrophin gene at nagpapahiwatig ng napakataas na kahusayan ng pamamaraang ito ng screening para sa DNA diagnosis ng dystrophinopathy (Fig. 16).

kanin. 16. Direktang DNA diagnosis ng Duchenne muscular dystrophy gamit ang multiplex PCR (agarose gel electrophoresis). Sa bawat isa sa mga sinuri na indibidwal, apat na exon ng dystrophin gene ang sabay-sabay na pinalaki (exons 17, 19, 44, at 45; ipinapahiwatig ng mga arrow ang kaukulang mga produkto ng amplification). Lane 1 - control, lane 2-5 - mga pasyente na may Duchenne muscular dystrophy na may iba't ibang mga pagtanggal ng dystrophin gene (lane 2 at 5 - pagtanggal ng exon 45, lane 3 - pagtanggal ng exon 44, lane 4 - pagtanggal ng exon 17 at 19).

Allele-specific na amplification

Ang pamamaraan ay batay sa paggamit ng dalawang independiyenteng pares ng mga panimulang aklat para sa isang partikular na rehiyon ng gene: ang isang panimulang aklat sa parehong mga pares ay karaniwan, at ang pangalawang panimulang aklat sa bawat pares ay may iba't ibang istraktura at komplementaryo sa alinman sa isang normal o mutant na pagkakasunud-sunod ng DNA. Bilang resulta ng naturang reaksyon sa solusyon, ang dalawang uri ng mga produkto ng PCR ay maaaring sabay na ma-synthesize - normal at mutant. Bukod dito, ginagawang posible ng disenyo ng mga panimulang aklat na malinaw na makilala ang pagkakaiba ng normal at mutant na mga produkto ng amplification sa pamamagitan ng kanilang laki ng molekular. Ang pamamaraang ito ay napakalinaw at nagbibigay-daan sa iyo upang i-verify ang parehong homo- at heterozygous na karwahe ng mutant allele.

Paraan para sa pagbabagong nakadirekta sa site ng amplified DNA

Ang pamamaraan ay batay sa paggamit sa PCR ng tinatawag na mismatch primer (hindi ganap na komplementaryo sa template), na naiiba sa template DNA sequence ng isang nucleotide. Bilang isang resulta ng pagsasama ng tinukoy na panimulang aklat sa komposisyon ng mutant na produkto ng PCR, isang artipisyal na nilikha na site ng paghihigpit para sa isa sa mga endonucleases ng paghihigpit ay nabuo sa loob nito, na nagpapahintulot sa direktang pagsusuri ng DNA ng isang tiyak na kilalang mutation gamit ang pagsusuri sa paghihigpit. Ang paglikha ng naturang artipisyal na lugar ng paghihigpit ay maaaring kailanganin kung ang paghahanap ay hindi nagbubunyag ng pagkakaroon ng isang kilala at naa-access na enzyme, ang "natural" na lugar ng paghihigpit na apektado bilang isang resulta ng paglitaw ng pinag-aralan na mutation sa molekula ng DNA.

Reverse transcriptase PCR method (RT- PCR)

Ang pamamaraang ito ay ginagamit sa mga kaso kung saan ito ay mas maginhawa upang gamitin ang hindi genomic DNA bilang isang bagay ng pag-aaral, ngunit isang mas compact at informationally "saturated" cDNA nakuha pagkatapos ng naaangkop na pagproseso ng mga sample ng tissue, halimbawa, biopsy materyal o cell linya ng lymphocytes, fibroblasts, atbp Ang isang mahalagang kondisyon dito ay ang expression (hindi bababa sa minimal) ng nais na gene sa tissue na pinag-aaralan.

Sa unang yugto, ang reverse transcription ng mRNA ay isinasagawa, at ang nagresultang mga molekula ng cDNA ay nagsisilbing isang template para sa PCR. Kasunod nito, ang kritikal na rehiyon ng cDNA na pinalaki sa sapat na dami ay sumasailalim sa pagkakasunud-sunod at iba pang mga pamamaraan ng screening ng mutation, direktang pag-aaral ng electrophoretic (detection ng mga pagtanggal, pagpasok, atbp.) o pagsasama sa isang expression system upang makakuha ng isang produkto ng protina at ang direktang pagsusuri nito.

Ang pamamaraang ito ay lalong epektibo para sa pagtuklas ng mga mutasyon na humahantong sa synthesis ng isang "pinutol" na protina (walang katuturang mga mutasyon, splicing mutations, malalaking pagtanggal) - ang tinatawag na PTT analysis (Protein Truncation Test). Karaniwang ginagamit ang pagsusuri ng PTT kapag sinusuri ang mga pinahabang multi-exon na gene, gaya ng gene para sa Duchenne/Becker muscular dystrophy, ataxia-telangiectasia, o neurofibromatosis type 1.

real time na PCR(Real-Time na PCR)

Taun-taon, sa praktikal na pangangalagang pangkalusugan, ang real-time na PCR ay nagiging isang lalong popular na paraan ng diagnostic. Ang pangunahing tampok nito ay ang pagsubaybay at pagsusuri ng dami ng akumulasyon ng mga produktong polymerase chain reaction at awtomatikong pagpaparehistro at interpretasyon ng mga resulta. Ang pamamaraang ito ay hindi nangangailangan ng isang hakbang sa electrophoresis, na binabawasan ang mga kinakailangan para sa isang laboratoryo ng PCR. Salamat sa mga pagtitipid sa espasyo ng produksyon, pagbaba ng bilang ng mga tauhan at ang pangangailangan para sa dami ng DNA/RNA, ang pamamaraang ito ay matagumpay na ginamit nitong mga nakaraang taon sa pinakamalaking sanitary epidemic, diagnostic at research center sa mga binuo na bansa sa mundo, na pinapalitan ang PCR sa kasalukuyang ("classic") na format nito.

Ang real-time na PCR ay gumagamit ng fluorescently na may label na oligonucleotide probes upang makita ang DNA sa panahon ng amplification. Ang real-time na PCR ay nagbibigay-daan sa isang kumpletong pagsusuri ng isang sample sa loob ng 20-60 minuto at ayon sa teorya ay may kakayahang makakita ng kahit isang molekula ng DNA o RNA sa isang sample.

kanin. 17. PCR sa totoong oras.

Ang real-time na PCR ay gumagamit ng TaqMan system para direktang kontrolin ang PCR kinetics sa panahon ng amplification gamit ang resonant fluorescence quenching. Para sa pagtuklas, ginagamit ang isang probe na may dalang fluorophore at isang quencher na pandagdag sa gitnang bahagi ng amplified fragment. Kapag ang fluorophore at quencher ay nakatali sa oligonucleotide probe, maliit na halaga lamang ng fluorescent emission ang sinusunod. Sa panahon ng proseso ng amplification, dahil sa aktibidad ng 5'-exonuclease ng Taq polymerase, ang fluorescent label ay pumasa sa solusyon, na inilabas mula sa paligid ng quencher, at bumubuo ng isang fluorescent signal na tumataas sa real time sa proporsyon sa akumulasyon ng amplificate (Fig. 17).

Mga pangunahing bentahe ng PCR-Real-Time kaysa sa PCR na may gel electrophoresis:

Ang buong pamamaraan ay nagaganap sa isang test tube;

· Ang pamamaraan ay tumatagal ng 1 oras;

Sapat na 1-2 working room;

Kasama ng isang husay na pagtatasa ng resulta, nagiging posible na mabilang ito (halimbawa, kapag nagrereseta ng antiviral therapy para sa AIDS o viral hepatitis, kinakailangang malaman ang viral load, i.e. ang dami ng virus sa bawat 1 yunit, na nagbibigay ng real-time na PCR);

· Kapansin-pansing binabawasan ang panganib ng kontaminasyon.

Konklusyon

Ang pamamaraan ng PCR ay isa sa mga pinakakaraniwang pamamaraan ng molekular na biological na pananaliksik. Ang pamamaraang ito ay dapat gamitin nang makabuluhan ng mga clinician, at ang isang doktor na nagpasyang gumamit ng PCR sa kanyang trabaho ay dapat magkaroon ng ilang kaalaman tungkol sa mga tampok at kakayahan ng pamamaraang ito. Pangalawa, dapat mayroong malapit na feedback sa pagitan ng clinician at ng PCR laboratory, na kinakailangan para sa pagsusuri ng mga kumplikadong kaso at pagbuo ng tamang diskarte sa diagnostic. Pangatlo, ang pagsusuri sa PCR ay hindi isang panlunas sa pagsusuri (pangunahin sa mga nakakahawang sakit) at hindi pinapalitan ang mga umiiral na pamamaraan ng pananaliksik, ngunit pinupunan lamang ang mga ito. At higit sa lahat, hindi mapapalitan ng PCR ang intuwisyon at analytical na pag-iisip na dapat magkaroon ng isang doktor na umaasa sa tagumpay.

P . S . Molecular-biological researches - pagbabago ng mga reference point ng diagnostics at treatment. Ang paggamit ng mga molecular biological na pamamaraan ay nauugnay sa pag-asam ng isang radikal na pagbabago sa diin sa mga diagnostic ng laboratoryo. Maaari tayong makipag-usap hindi lamang tungkol sa napapanahong impormasyon, ngunit tungkol sa paunang resibo nito. Kung ngayon ang mga pag-aaral sa laboratoryo sa karamihan ng mga kaso ay isinasagawa na sa isang advanced na sakit at pinasimulan ang paggamot, kung gayon ang molecular biological na impormasyon sa laboratoryo ay inaasahang gagawing posible upang makilala ang pagkahilig ng isang tao sa ilang mga uri ng patolohiya at ang antas ng pagiging sensitibo sa ilang mga gamot, na magbibigay-daan sa pagpapatunay ng predictive, preventive at personalized na kalikasan ng gamot sa hinaharap.

PAGBABAGO NG DIAGNOSIS AT MGA POKUS SA PAGGAgamot

HEREDITARY DISEASES

Ngayon Sa hinaharap

Diagnosis Genetic na pasaporte

8. Ilang working room ang kailangan para sa isang PCR laboratory na may fluorescence detection (quantitative analysis, Real-Time PCR)?

9. Ano ang detection?

10. Anong mga pamamaraan ng diagnostic ng DNA ang nakikilala?

11. Aling enzyme ang gumagana batay sa PCR?

12. Bakit kailangang ihiwalay ang detection zone sa iba pang work zone?

13. Ano ang restriction site?

14. Ano ang pagkakaiba sa pagitan ng direktang paraan ng pagsusuri ng DNA at hindi direktang paraan?

15. Ano ang sequencing?

16. Ano ang multiplex PCR?

17. Anong mga uri ng mutasyon ang tinutukoy ng PCR?

18. Ano ang kontaminasyon?

19. Ano ang kakanyahan ng paraan ng pagpapalakas ng allele-specific?

20. Mga kondisyon ng imbakan para sa PCR material?

21. Anong device ang ginagamit para sa amplification?

22. Ano ang paraan ng reverse transcriptase PCR (RT-PCR)?

23. Ano ang materyal para sa PCR diagnostics?

24. Ilista ang mga uri ng kontaminasyon?

Mga pagsusulit para sa sariling pag-aaral

1. Restriction endonucleases:

a) mga enzyme na "sinisira" ang DNA sa mga partikular na lugar;

b) mga enzyme na nagtatahi ng mga break sa molekula ng DNA;

c) mga enzyme na nagbibigay ng mga compound na nagsasagawa ng pag-aayos ng DNA.

2. Pagpapalakas ng gene:

3. Alin sa mga pamamaraan ng molecular genetics ang ginagamit upang masuri ang mga sakit na dulot ng mutant gene ng isang kilalang sequence?

a) ang paggamit ng isang partikular na restrictase;

b) direktang pagtuklas gamit ang mga tiyak na molekular na probe;

c) pagtatasa ng pamilya ng pamamahagi ng normal na paghihigpit fragment haba polymorphism.

4. DNA sequencing:

a) pagkakakilanlan ng sequence ng base ng DNA;

b) paulit-ulit na pag-uulit ng anumang bahagi ng DNA;

c) paghihiwalay ng isang fragment ng DNA na naglalaman ng pinag-aralan na gene.

5. Maaaring makuha ang mga sample ng DNA gamit ang :

b) chorionic villi;

c) amniotic fluid;

d) mga selula ng amniotic fluid;

e) mga biopsy ng balat, kalamnan, atay,

e) lahat ay tama, maliban sa puntong "c",

g) lahat ay tama, maliban sa puntong "d",

h) Lahat ng nasa itaas ay tama.

6. Aling mga mutasyon ang nasuri ng PCR?

a) genomic;

b) chromosomal;

c) gene (punto).

7. Ang panimulang aklat ay:

a) isang pantulong na seksyon ng DNA;

b) isang sintetikong oligonucleotide na may label na (radioactively o fluorescently) sequence na komplementaryo sa isang mutant o normal na gene;

c) isang oligonucleotide na kumikilos bilang isang "binhi" at nagpapasimula ng synthesis ng isang polynucleotide chain sa isang DNA o RNA template.

8. Sino ang bumuo ng prinsipyo ng pamamaraan ng PCR?

b) K. Mullis

9. Ginagamit ba ang paraan ng PCR upang masuri ang pagpapalawak ng mga pag-uulit ng trinucleotide (dynamic na uri ng mutasyon)?

10. Sa anong mga lugar ginagamit ang PCR?

a) klinikal na gamot;

b) kahulugan ng mga transgenic na organismo (GMOs)

c) pagkakakilanlan ng tao, pagtatatag ng paternity, criminalistics

d) lahat ng nabanggit

d) wala sa itaas.

Mga halimbawang sagot: 1 - a; 2 - b; 3 - b; 4 - a; 5 - e; 6 - sa; 7 - sa; 8 - b; 9 – a, 10 – d.

Pangunahing

1. Bochkov genetics. Moscow. GEOTAR, 2002.

Dagdag

1., Bakharev at ang paggamot ng mga congenital at hereditary na sakit sa mga bata. - Moscow, 2004.

2. Mga diagnostic ng DNA at pagpapayo sa genetic na medikal. - Moscow, 2004.

3. Ginter genetics. - Moscow, 2003.

4. Gorbunov batayan ng medikal na genetika. - St. Petersburg: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molecular clinical diagnostics. – Mundo, 1999.

6. Menshikov - biological research sa clinical laboratory diagnostics: ang mga posibilidad ng problema (lectures). Mga diagnostic ng klinikal na laboratoryo, No. 3, 2006.

7. Kornienko ng gawain ng laboratoryo ng PCR sa panahon ng in-line na pagsusuri ng biological na materyal. Mga diagnostic ng klinikal na laboratoryo, No. 10, 2006.

8. Organisasyon ng gawain ng laboratoryo ng PCR. Mga tagubilin sa pamamaraan. MU 1.3.1794-03. Punong Sanitary Doctor ng Russian Federation, 2003.

9. Erlich H. A. PCR na teknolohiya. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Real time quantitative PCR. Genome Res. - No. 6, 1996.

PANGUNAHING PRINSIPYO NG PARAAN

POLYMERASE CHAIN ​​REACTION

Manual na pamamaraan para sa ekstrakurikular na gawain ng mga mag-aaral ng 3-4 na kurso sa mga espesyalidad ng pangkalahatang medisina (060101) at pediatrics (060103).

SEI HPE "Krasnoyarsk State Medical Academy ng Federal Agency for Health and Social Development"

Russia, Krasnoyarsk,