Ang mga interferon ay mga molekula ng protina na may molekular na timbang na 15,000 hanggang 21,000 dalton na ginawa at itinago ng mga selula bilang tugon sa isang impeksyon sa viral o iba pang mga pathogen.
Interferon (IFN) - isang pangkat ng mga autogenous glycoproteins, ang biomekanismo ng pagkilos na nauugnay sa isang sabay-sabay na antiviral effect - pag-activate ng mga cellular genes, na nagreresulta sa synthesis ng mga protina na pumipigil sa synthesis ng viral DNA (RNA) at may immunomodulatory. epekto - ang kakayahang pahusayin ang pagpapahayag ng mga antigens sa mga lamad ng cell at pataasin ang aktibidad ng mga cytotoxic T cells at natural killer cells.
Ang mga IFN ay inuri sa dalawang uri. Ang unang uri, na gumaganap bilang mga inhibitor ng viral replication at may nakararami na antiviral effect, ay may kasamang 22 iba't ibang subtype ng IFN-α at isang subtype ng IFN-β. Ang pangalawang uri, na nagpapakita ng aktibidad ng immunomodulatory, ay kinabibilangan ng IFN-γ.
Mayroong tatlong immunologically natatanging klase ng IFN: IFN-α, IFN-β, IFN-γ.
Ang natural na nagaganap na IFN ay kinabibilangan ng lymphoblastoid at leukocyte IFN (IFN-α), ayon sa pagkakasunod-sunod ng synthesized na mga monocyte ng tao at B-lymphocytes, na pagkatapos ay kinukuha at dinadalisay; fibroblastic IFN (IFN-β) na nagmula sa kultura ng fibroblast ng tao; at T-lymphocytic IFN (IFN-γ).
Kasama sa artificially synthesized IFN ang recombinant na IFN-α, na isang napaka-purified na solong subtype ng IFN-α na nakuha ng recombinant molecular technology.
Mga kilalang pamamaraan para sa paggawa ng interferon ng leukocyte ng tao mula sa mga leukocyte ng tao na dulot ng mga virus at iba pang inducers.
Ang pangunahing kawalan ng mga pamamaraang ito para sa paggawa ng mga interferon ay ang posibilidad ng kontaminasyon ng panghuling produkto sa mga virus ng tao, tulad ng hepatitis B at C virus, immunodeficiency virus, atbp.
Sa kasalukuyan, ang paraan ng pagkuha ng interferon sa pamamagitan ng microbiological synthesis ay kinikilala bilang mas promising, na ginagawang posible na makuha ang target na produkto na may mas mataas na ani mula sa isang medyo murang hilaw na materyal. Ang mga diskarte na ginamit sa kasong ito ay ginagawang posible na lumikha ng mga variant ng structural gene na pinakamainam para sa pagpapahayag ng bacterial, pati na rin ang mga elemento ng regulasyon na kumokontrol sa pagpapahayag nito.
Ang iba't ibang disenyo ng Pichia pastoris, Pseudomonas putida at Escherichia coli strains ay ginagamit bilang mga paunang mikroorganismo.
Ang kawalan ng paggamit ng P. pastoris bilang isang tagagawa ng interferon ay ang napakahirap na kondisyon ng pagbuburo para sa ganitong uri ng lebadura, ang pangangailangan na mahigpit na mapanatili ang konsentrasyon ng inducer, sa partikular na methanol, sa panahon ng biosynthesis.
Ang kawalan ng paggamit ng mga strain ng Ps. putida ay ang pagiging kumplikado ng proseso ng pagbuburo sa mababang antas ng pagpapahayag (10 mg ng interferon bawat 1 litro ng medium ng kultura). Mas produktibo ang paggamit ng mga strain ng Escherichia coli.
Ang isang malaking bilang ng mga plasmids at interferon-expressing E. coli strains ay kilala: E. coli strains ATCC 31633 at 31644 na may plasmids Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 o Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35 - AHL6 (SU 1764515), E. coli strain pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli strain pINF-F-Pa (AU 1312962), E. coli strain SG 20050 na may p280/21FN plasmid (Kravchenko V.V. et al. chemistry, 1987, vol. 13, No. 9, p. 1186-1193), E. coli SG 20050 strain na may pINF14 plasmid (SU 1703691), E. coli SG 20050 strain na may pINF16 plasmid (RU 2054041) at iba pa. Ang kawalan ng mga teknolohiya batay sa paggamit ng mga strain na ito ay ang kanilang kawalang-tatag, pati na rin ang isang hindi sapat na antas ng interferon expression.
Kasama ang mga katangian ng mga strain na ginamit, ang kahusayan ng proseso ay higit na nakasalalay sa teknolohiyang ginamit para sa paghihiwalay at paglilinis ng interferon.
Isang kilalang paraan para sa paggawa ng interferon, na kinabibilangan ng paglilinang ng mga cell Ps. putida, biomass destruction, polyethyleneimine treatment, ammonium sulphate fractionation, hydrophobic chromatography sa phenylsilochrome C-80, pH fractionation ng lysate, konsentrasyon at diafiltration nito, ion-exchange chromatography sa DE-52 cellulose, pH gradient elution, chromatography ng chromatography nagreresultang eluent sa CM cellulose -52, konsentrasyon sa pamamagitan ng pagpasa sa isang filter cassette at gel filtration sa Sephadex G-100 (SU 1640996). Ang kawalan ng pamamaraang ito, bilang karagdagan sa kumplikadong multi-stage fermentation, ay ang multi-stage na proseso sa pagkuha ng huling produkto.
Mayroon ding kilala na paraan para sa paggawa ng interferon, na kinabibilangan ng paglilinang ng E. coli SG 20050/pIF16 strain sa LB broth sa mga flasks sa isang thermostated shaker, pagse-centrifuge ng biomass, paghuhugas nito ng buffer solution at pag-sonicate para sirain ang mga cell. Ang resultang lysate ay centrifuged, hugasan ng 3 M urea sa buffer, dissolved sa guanidine chloride sa buffer, sonicated, centrifuged, oxidative sulfitolysis, dialysis laban sa 8 M urea, renaturation, at final two-stage chromatography sa CM-52 cellulose at Sephadex G -50 ( RU 2054041).
Ang mga disadvantages ng pamamaraang ito ay ang relatibong mababang produktibidad ng mga pangunahing yugto ng proseso ng paghihiwalay at paglilinis. Sa partikular, nalalapat ito sa pagproseso ng ultrasonic ng produkto, dialysis at oxidative sulfitolysis, na humahantong sa kawalang-tatag sa ani ng interferon, pati na rin ang imposibilidad ng paggamit ng pamamaraang ito para sa pang-industriyang produksyon ng interferon.
Bilang ang pinakamalapit na analogue (prototype), ang isang paraan para sa pagkuha ng interferon ng leukocyte ng tao ay maaaring ipahiwatig, na binubuo sa paglilinang ng isang recombinant E. coli strain, pagyeyelo ng nagresultang biomass sa isang temperatura na hindi hihigit sa -70 ° C, lasaw, pagsira sa mga selula ng microorganism na may lysozyme, pag-alis ng DNA at RNA sa pamamagitan ng pagpapasok sa DNase lysate at pagdalisay ng nakahiwalay na insoluble form ng interferon sa pamamagitan ng paghuhugas gamit ang buffer solution na may mga detergent, pagtunaw ng precipitate ng interferon sa solusyon ng guanidine hydrochloride, renaturation at one-stage purification sa pamamagitan ng ion -magpalitan ng chromatography. Bilang isang producer, ang E. coli SS5 strain na nakuha gamit ang recombinant pSS5 plasmid na naglalaman ng tatlong promoter: Plac, Pt7 at Ptrp, at ang alpha-interferon gene na may ipinakilala na mga pagpapalit ng nucleotide ay ginagamit.
Ang pagpapahayag ng interferon ng E. coli SS5 strain na naglalaman ng plasmid na ito ay kinokontrol ng tatlong promoter: Plac, Pt7 at Ptrp. Ang antas ng pagpapahayag ng interferon ay humigit-kumulang 800 mg bawat 1 litro ng suspensyon ng cell.
Ang kawalan ng pamamaraang ito ay ang mababang manufacturability ng paggamit ng enzymatic na pagkasira ng mga cell, DNA at RNA ng microorganism at isang yugto ng chromatographic purification ng interferon. Nagdudulot ito ng kawalang-tatag ng proseso ng paghihiwalay ng interferon, humahantong sa pagbaba sa kalidad nito at nililimitahan ang posibilidad ng paggamit ng pamamaraan sa itaas para sa pang-industriyang produksyon ng interferon.
Ang mga disadvantages ng plasmid na ito at ang strain batay dito ay ang paggamit sa plasmid ng isang malakas na unregulated T7 phage promoter sa E. coli BL21 (DE3) strain, kung saan ang T7 RNA polymerase gene ay nasa ilalim ng lac operon promoter at kung saan laging "daloy". Dahil dito, ang synthesis ng interferon ay patuloy na nangyayari sa cell, na humahantong sa dissociation ng plasmid at isang pagbawas sa viability ng mga cell ng strain, at bilang isang resulta, isang pagbawas sa ani ng interferon.
Para makakuha ng malaking halaga ng IFN, ginagamit ang anim na araw na single-layer culture ng chick embryo cells o cultured human blood leukocytes na infected ng isang partikular na uri ng virus. Sa madaling salita, upang makakuha ng IFN, isang partikular na virus-cell system ang nilikha.
Ang gene na responsable para sa biosynthesis ng IFN ay nahiwalay sa isang selula ng tao. Ang exogenous human IFN ay nakuha gamit ang recombinant DNA technology. Ang pamamaraan para sa paghihiwalay ng cDNA ng mga IFN ay ang mga sumusunod:
1) ang mRNA ay nakahiwalay mula sa mga leukocytes ng tao, ito ay fractionated sa pamamagitan ng laki, ang reverse transcription ay isinasagawa, at ito ay ipinasok sa site ng binagong plasmid.
2) Ang resultang produkto ay binago sa E. coli; ang mga resultang clone ay nahahati sa mga grupo na natukoy.
3) Ang bawat pangkat ng mga clone ay na-hybrid sa IFN - mRNA.
4) Mula sa mga nagresultang hybrid na naglalaman ng cDNA at xRNA, ang mRNA ay nakahiwalay, ito ay isinalin sa sistema ng synthesis ng protina.
5) Tukuyin ang interferon antiviral na aktibidad ng bawat halo na nagreresulta mula sa pagsasalin. Ang mga pangkat na nagpakita ng aktibidad ng interferon ay naglalaman ng cDNA clone na na-hybrid sa IFN - mRNA; muling tukuyin ang isang clone na naglalaman ng buong IFN - human cDNA.
2. Mga mekanismo ng pagkilos ng mga interferon
Ang mga IFN ay nagpapakita ng ilang uri ng aktibidad bilang mga lymphokines at immunomodulators. Ang Type I IFNs, na pangunahing kumikilos bilang mga inhibitor ng viral replication sa cell, ay napagtanto ang kanilang epekto sa pamamagitan ng pagpapasigla sa paggawa ng mga cellular enzymes ng ribosomes ng mga host cell, na pumipigil sa paggawa ng mga virus, nakakagambala sa pagsasalin ng viral mRNA at ang synthesis ng mga viral protein.
Ang IFN ay ginawa ng karamihan sa mga species ng hayop, ngunit ang pagpapakita ng kanilang aktibidad ay partikular sa species, i.e. kumikilos lamang sila sa mga species ng hayop kung saan sila ginawa.
Ang IFN ay nagiging sanhi ng induction ng tatlong enzymes:
protina kinase, na nakakagambala sa paunang yugto ng pagbuo ng isang peptide chain;
oligoisoadenylate synthetase, na nagpapagana ng RNase, na sumisira sa viral RNA;
phosphodiesterase, na sumisira sa mga terminal nucleotides ng tRNA, na humahantong sa isang paglabag sa peptide elongation.
Isinasaalang-alang ang antiviral at immunomodulating effect ng IFN, ang NPO Biomed ay iminungkahi at matagumpay na nasubok ang mga suppositories na may IFNn1 at probiotics sa paggamot ng dysbacteriosis ng viral at bacterial etiology, candidiasis; sa gynecological practice para sa paggamot ng endometritis, colpitis, vaginitis at gynecological herpes.
3. Therapeutic application ng human INF
Mayroong dalawang henerasyon ng mga paghahanda ng interferon. Ang unang henerasyon ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang natural na pinagmulan, kung saan ito ay nakuha mula sa dugo ng mga donor. Ang dry human leukocyte interferon ay nakuha mula dito, na ginagamit para sa paglanghap at instillation sa mga daanan ng ilong. Gumagawa din sila ng interferon sa mga suppositories, purified concentrated dry interferon at Leukinferon.
Ang pamamaraang ito ng pagkuha ng mga paghahanda batay sa interferon ay medyo mahal at hindi naa-access, samakatuwid, sa pagtatapos ng ika-20 siglo, ang mga paghahanda ng pangalawang henerasyon na interferon ay nilikha gamit ang genetic engineering.
Kaya, posible na bumuo ng mga gamot na Viferon, Interal at iba pa na naglalaman ng recombinant human interferon alfa-
Dahil sa kanilang mga natatanging katangian, ang mga paghahanda ng interferon ay ginagamit sa paggamot at pag-iwas sa lahat ng mga sakit sa paghinga, karamihan sa mga kanser, at para sa paggamot ng maraming mga sakit na viral at trangkaso. Ang mga paghahanda ng interferon ay malawakang ginagamit sa paggamot ng hepatitis B at C: nililimitahan ng interferon ang pag-unlad ng virus, pinipigilan ang paglitaw ng cirrhosis at inaalis ang kamatayan.
Ang ilang paghahanda ng interferon ay may mga side effect, tulad ng mga pantal sa balat, allergy, at mga sakit ng hematopoietic system.
Sa matagal na paggamit ng interferon, ang mga antibodies sa interferon ay ginawa sa katawan, na ginagawang hindi nito kayang labanan ang mga virus. Ang dahilan para sa mga phenomena na ito ay nakasalalay sa pagkakaroon ng albumin sa mga paghahanda batay sa interferon.
Ang albumin ay nakukuha mula sa dugo, kaya may panganib (kahit minimal) ng impeksyon sa hepatitis at iba pang mga sakit na nakukuha sa pamamagitan ng dugo.
|
Pangalan ng gamot |
Subtype INF |
Paano makakuha |
epekto ng pharmacological |
Mga pahiwatig para sa paggamit |
||||
|
Interferon |
Biosynthesis sa kultura ng donor blood leukocytes sa ilalim ng impluwensya ng mga virus |
Antiviral, immunomodulatory, antiproliferative |
Mga sakit sa viral, leukemia, malignant melanoma, kanser sa bato, carcinoid syndrome |
|||||
|
Interlock |
Biosynthesis sa kultura ng donor blood leukocytes sa ilalim ng impluwensya ng paramycoviruses |
Pinipigilan ang aktibidad ng isang bilang ng mga virus |
Mga sakit na viral sa mata, hepatitis |
Recombinant |
Ang antiviral, immunomodulatory, ay pumipigil sa paglaganap ng isang malawak na hanay ng mga selula ng tumor |
Epithelial form ng talamak at paulit-ulit na impeksyon sa mata ng viral; mga sakit sa oncological |
||
|
Interferon alfa-2a |
Recombinant. Protein na naglalaman ng 165 amino acids |
Antiviral, aktibidad ng antitumor |
Leukemic reticuloendotheliosis, Kaposi's sarcoma, kanser sa bato, kanser sa pantog, melanoma, herpes zoster |
|||||
|
Reaferon |
Ang recombinant IFN na ginawa ng bacterial strain ng Pseudomonas, sa genetic apparatus kung saan ipinasok ang human leukocyte IFNα2 gene. Kapareho ng leukocyte ng tao IFN α2. |
Viral, mga sakit sa tumor |
||||||
|
Interferon alpha - n1 |
Highly purified human INF |
Antiviral |
Talamak na aktibong nakakahawang hepatitis B |
|||||
|
Inreferon beta |
Superproduction ng mga fibroblast ng tao sa pamamagitan ng isang stimulator sa pagkakaroon ng mga inhibitor ng mga metabolic na proseso |
Antiviral, immunomodulatory, aktibidad na antitumor |
Mga talamak na impeksyon sa viral sa ophthalmology, gynecology at urology, dermatology, hepatology, oncology |
|||||
|
Interferon gamma |
Recombinant |
Antiviral, immunomodulatory, aktibidad na antitumor |
Mga malalang sakit na granulomatous |
1. www.antibiotic.ru/ab/brviri.shtml
2. www.interferon.su/php/content.php?id=71
3. www.pharmvestnik.ru
4. Pansamantalang pharmacopoeial na artikulo 42U-23/60-439-97. Interferon human recombinant alpha-two.
5. Gavrikov A.V. Pag-optimize ng biotechnological na produksyon ng mga sangkap ng recombinant human interferon - M., 2003,
6. Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology / B. Glick, J. Pasternak. - M., Mir, 2002.
7. State Pharmacopoeia ng USSR. XI ed., isyu 1.- P. 175.
8. Rehistro ng Estado ng mga Gamot / Ed. A.V. Katlinsky at iba pa - M., 2002.
9. Naroditsky B.S. Molecular biotechnology ng interferon. // koleksyon ng pang-agham at praktikal na kumperensya "Interferon - 50 taon". - M., 2007, pp. 17-23
10. Mga Batayan ng pharmaceutical biotechnology: Textbook / T.P. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Mikhalev. - Rostov-on-Don.: Phoenix; Tomsk: NTL Publishing House, 2006.
11. Frolov A.F., Vovk A.D., Dyadyun S.T. Kahusayan ng recombinant alpha-two-interferon sa viral hepatitis B//Medikal na negosyo.- Kyiv, 1990.- No. 9.- P. 105–108.
Paggamit: biotechnology, medikal na industriya. Ang kakanyahan ng imbensyon: bumuo ng isang recombinant plasmid pSV69, kabilang ang isang DNA fragment na nag-encode ng isang pasimula ng human immune interferon; ang linya ng cell ng COS-7 ay binago sa nagresultang recombinant vector, ang mga nabagong selula ay pinili, na nilinang sa ilalim ng mga kondisyon na nagsisiguro sa akumulasyon ng target na produkto, at ang mature na anyo ng interferon ay nakahiwalay nang walang N-terminal na Cys-Tyr- Cys (des-Cus-Tyr-Cysinterferon). 8 may sakit.
SUBSTANCE: ang pag-imbento ay nauugnay sa recombinant na teknolohiya ng DNA, sa mga paraan at pamamaraan para sa paggamit ng naturang teknolohiya sa pagtuklas ng sequence ng DNA at ang pagkakasunud-sunod ng amino acid na tinutukoy nito para sa immune interferon ng tao, ang paggawa nito, pati na rin sa iba't ibang mga produkto na nakuha at kanilang paggamit. . Higit na partikular, ang kasalukuyang imbensyon ay nauugnay sa paghihiwalay at pagkakakilanlan ng mga sequence ng DNA na naka-encode ng human immune interferon, at sa pagbuo ng isang recombinant expression vector na naglalaman ng mga DNA sequence na ito na gumagana na naka-link sa mga sequence ng promoter, at sa pagpapatupad ng expression na may mga nakuhang vectors. . Sa isa pang aspeto, ang kasalukuyang imbensyon ay nauugnay sa mga sistema ng kultura ng host, tulad ng iba't ibang mga microorganism at vertebrate cell culture, na binago ng mga expression vectors at sa gayon ay naglalayong sa pagpapahayag ng mga naunang nabanggit na mga pagkakasunud-sunod ng DNA. Sa isa pang aspeto, ang kasalukuyang imbensyon ay nagbibigay ng mga paraan at pamamaraan para sa pag-convert ng mga naturang produkto sa pagtatapos ng pagpapahayag sa mga bagong entidad tulad ng mga komposisyon ng parmasyutiko na kapaki-pakinabang sa paggamot at pag-iwas sa mga tao. Sa ginustong mga embodiment, ang kasalukuyang imbensyon ay nagbibigay ng mga tiyak na expression vectors na may mga pagkakasunod-sunod na ang immune interferon ng tao ay ginawa at inilabas mula sa mga host cell sa mature na anyo. Bilang karagdagan, ang kasalukuyang imbensyon ay nauugnay sa iba't ibang mga proseso na ginagamit upang makakuha ng mga naturang DNA sequence, expression vectors, host culture system at mga huling produkto at ang kanilang mga derivatives, pati na rin ang mga partikular at nauugnay na kondisyon. Ang kasalukuyang imbensyon ay nagmula sa bahagi mula sa pagtuklas ng isang DNA sequence at isang itinatag na amino acid sequence na naka-encode ng human immune interferon. Bilang karagdagan, ang kasalukuyang imbensyon ay nagbibigay ng sequence information para sa 3' at 5' side sequence ng human immune interferon gene, na nagpapadali sa in vitro binding nito sa expression vectors. Sa partikular, natukoy ang isang 5'-DNA segment na nag-encode ng isang iminungkahing endogenous signal polypeptide na agad na nauuna sa sequence ng amino acid ng putative mature human immune interferon. interferon gamit ang recombinant DNA technology, na nagbigay, naman, ng posibilidad na matukoy ang biochemical properties at bioactivity nito. Ang mga publikasyon at iba pang materyales na ginamit upang i-highlight ang background ng imbensyon, at sa ilang mga kaso upang magbigay ng karagdagang mga detalye tungkol sa aplikasyon nito, ay isinama sa pamamagitan ng sanggunian, para sa kaginhawahan, ay binibilang sa teksto sa ibaba at naaangkop na matatagpuan sa nakalakip na bibliograpiya. Background ng imbensyon
A. Human immune interferon
Ang mga interferon ng tao ay maaaring uriin sa tatlong grupo batay sa iba't ibang antigenicity at biological at biochemical properties. Ang unang grupo ay ang pamilya ng mga leukocyte interferon (α-interferon, Le IF o IFN-), na kadalasang ginagawa ng mga kaukulang selula ng dugo ng tao sa ilalim ng impluwensya ng mga virus. Ang mga interferon na ito ay nakuha sa microbiologically at ang kanilang biological na aktibidad ay natagpuan (1, 2, 3). Ang kanilang mga biological na katangian ay nagpasiya ng kanilang klinikal na paggamit bilang mga therapeutic agent sa paggamot ng mga impeksyon sa viral at mga malignant na kondisyon (4). Sa pangalawang grupo ay ang human fibroblast interferon (α-interferon, FIF o IFN-), na kadalasang ginawa ng mga fibroblast sa ilalim ng pagkilos ng mga virus, na nakuha rin ng microbiology at natagpuang nagpapakita ng malawak na hanay ng mga biological na aktibidad ( 5). Ipinapahiwatig din ng mga klinikal na pagsubok ang potensyal na therapeutic value nito. Ang mga leukocyte at fibroblast interferon ay may napakamarkahang pagkakapareho sa kanilang mga biological na katangian, sa kabila ng katotohanan na ang antas ng homology sa antas ng amino acid ay medyo mababa. Bilang karagdagan, ang parehong grupo ng mga interferon ay naglalaman ng mula 165 hanggang 166 na amino acid at mga acidic na matatag na protina. Ang human immune interferon (α-interferon, IIF o IFN-) na siyang paksa ng kasalukuyang imbensyon, sa kaibahan ng α- at α-interferon, ay pH 2 labile, na pangunahing ginawa ng mitogenic induction ng mga lymphocytes, at ito rin. medyo naiiba sa mga katangian ng antigenic. Hanggang kamakailan lamang, ang immune interferon ng tao ay maaari lamang makuha sa napakaliit na halaga, na, siyempre, ay naging mahirap na makilala ito. Ang isang mas mataas ngunit bahagyang clearance ng human immune interferon ay naiulat kamakailan (6). Ang tambalang ito ay naiulat na nakuha mula sa mga kultura ng mga lymphocytes na pinasigla ng isang kumbinasyon ng phytohemagglutinin at phorbol ester at nadalisay ng sunud-sunod na chromatographic separations. Ang pamamaraang ito ay nagresulta sa isang produkto na may molecular weight na 58,000. Ang immune interferon ng tao ay ginawa sa napakababang antas sa pamamagitan ng pagsasalin ng mRNA sa mga oscytes na nagpapakita ng mga katangian ng aktibidad ng interferon interferon ng tao sa immune, at inaasahan na ang immune interferon cDNA ay maaaring ma-synthesize at ma-clone (7). Ang dami ng immune interferon na nakuha sa ngayon ay malinaw na hindi sapat upang magsagawa ng walang alinlangan na mga eksperimento upang makilala at matukoy ang mga biological na katangian ng purified component. Gayunpaman, ang mga pag-aaral sa vitro na isinagawa gamit ang mga krudo na paghahanda, pati na rin ang mga eksperimento sa vivo na may mga paghahanda ng interferon ng daga, ay nagmungkahi na ang pangunahing pag-andar ng immune interferon ay maaaring ang isang immunoregulatory agent (8 at 9). Ang immune interferon ay may hindi lamang antiviral at anticellular na aktibidad na karaniwan sa lahat ng interferon ng tao, ngunit mayroon ding potentiating effect sa mga aktibidad na ito - at -interferon (10). Bilang karagdagan, ang antiproliferative na epekto ng α-interferon sa mga selula ng tumor sa vitro ay iniulat na humigit-kumulang 10-100 beses na mas malaki kaysa sa iba pang mga klase ng interferon (8, 11, 12). Ang resulta na ito kasama ang binibigkas nitong immunoregulatory na papel (8 at 9) ay nagmumungkahi ng isang mas malinaw na aktibidad na antitumor para sa IFN-γ kaysa para sa FN-γ at IFN-γ. Sa katunayan, sa mga eksperimento sa vivo kasama ang mga daga at daga, ang mga paghahanda ng IFN ay nagpapakita ng kapansin-pansing higit na kahusayan sa mga virally stimulated interferon sa mga tuntunin ng aktibidad na antitumor laban sa osteogenic sarcoma (13). Ang lahat ng mga pag-aaral na ito bago ang kasalukuyang imbensyon ay kailangang isagawa sa mabigat na kontaminadong paghahanda dahil sa kanilang napakababang kakayahang magamit. Gayunpaman, malinaw nilang kinumpirma ang napakahalagang biological function ng immune interferon. Ang immune interferon ay hindi lamang isang pangunahing aktibidad na antiviral, ngunit malamang na isang malakas na aktibidad ng immunoregulatory at antitumor, na malinaw na tumutukoy dito bilang isang potensyal na promising klinikal na bagay. Malinaw na ang paggamit ng teknolohiyang recombinant DNA ang magiging pinakamabisang paraan para makuha ang kinakailangang malaking halaga ng human immune interferon. Kasama man o hindi ang mga sangkap na nakuha sa gayon ay ang glycosylation, na kung saan ay itinuturing na isang katangian ng natural, materyal na hinango ng tao, malamang na magpapakita sila ng mga bioactivity na tumutukoy sa kanilang klinikal na utility sa paggamot ng isang malawak na hanay ng mga viral na sakit, neoplasms, at depression. -sapilitan kondisyon.immunity. B. Recombinant DNA technology
Ang teknolohiya ng recombinant DNA ay lumago na. Nagagawa ng mga molekular na biologist na muling pagsamahin ang iba't ibang mga pagkakasunud-sunod ng DNA, na lumilikha ng mga bagong uri ng DNA na may kakayahang gumawa ng malaking halaga ng mga produktong exogenous na protina sa mga nabagong mikrobyo. Karaniwan, ang mga paraan at pamamaraan para sa in vitro na pagbubuklod ng iba't ibang mga fragment ng DNA na may mapurol o "malagkit" na mga dulo ay binuo, sa kanilang tulong, ang mga potensyal na expression vectors na angkop para sa pagbabago ng mga partikular na microorganism ay nakuha, sa gayon ay kinokontrol ang naka-target na synthesis ng nais na exogenous. mga produkto. Gayunpaman, para sa mga indibidwal na produkto, ang landas na ito ay nananatiling medyo mahirap, at ang agham ay hindi pa umabot sa yugto kung saan masisiguro ang tagumpay. Ang plasmid, isang non-chromosomal loop ng double-stranded DNA na matatagpuan sa bacteria at iba pang microbes, at madalas sa maraming kopya bawat cell, ay nananatiling staple ng recombinant DNA technology. Ang impormasyong naka-encode sa DNA ng plasmid ay kinabibilangan ng impormasyong kinakailangan para sa pagpaparami ng plasmid sa mga cell ng anak na babae (ibig sabihin, ang pinagmulan ng pagtitiklop) at karaniwan ay isa o higit pang mga katangian ng pagpili ng phenotypic, tulad ng antibiotic resistance para sa bacteria, na nagpapahintulot sa mga clone ng ang host cell na naglalaman ng nais na plasmid na makilala at mas mainam na lumaki sa isang pumipili na daluyan. Ang utility ng mga plasmid ay nakasalalay sa katotohanan na ang mga ito ay maaaring partikular na ma-cleaved ng isa o isa pang restriction endonuclease o "restriction enzyme", na ang bawat isa ay kinikilala ang ibang bahagi ng DNA ng plasmid. Pagkatapos nito, ang mga heterologous na gene o mga fragment ng gene ay maaaring isama sa plasmid sa pamamagitan ng pagtatapos sa cleavage site o sa muling hugis ng mga dulo na katabi ng cleavage site. Ito ay kung paano nakuha ang tinatawag na replicable expression vectors. Ang DNA recombination ay nagaganap sa labas ng cell, gayunpaman, ang nagreresultang "recombinant" replicable expression vector o plasmid ay maaaring ipasok sa mga cell sa pamamagitan ng isang paraan na kilala bilang transformation upang makabuo ng malaking dami ng recombinant vectors sa pamamagitan ng pagpapalaki ng transformant. Bukod dito, kung ang gene ay maayos na nakatuon sa paggalang sa rehiyon ng plasmid na nagdidirekta ng transkripsyon at pagsasalin ng coding DNA, ang resultang expression vector ay maaaring magamit upang aktwal na makuha ang pagkakasunud-sunod ng polypeptide na naka-encode ng ipinasok na gene, i.e. para sa isang proseso na tinatawag na expression. Ang pagpapahayag ay sinisimulan sa isang rehiyon na kilala bilang tagataguyod, na kinikilala at nakatali ng RNA polymerase. Sa panahon ng transkripsyon na yugto ng pagpapahayag, ang DNA ay nagbubukas, na binubuksan ito bilang isang kemikal na template para sa na-trigger na synthesis ng messenger RNA mula sa pagkakasunud-sunod ng DNA. Ang messenger RNA, naman, ay isinalin sa isang polypeptide na may sequence ng amino acid na naka-encode ng mRNA. Ang bawat amino acid ay naka-encode ng isang nucleotide triplet o "codon", na magkakasamang bumubuo ng isang "structural gene", iyon ay, ang bahaging iyon na nagko-code para sa amino acid sequence ng ipinahayag na polypeptide na produkto. Ang pagsasalin ay sinisimulan ng isang "pagsisimula" na senyales (karaniwan ay ATG, na nagiging AUG sa natanggap na messenger RNA). Ang tinatawag na "stop" - ang mga codon ay tumutukoy sa pagtatapos ng pagsasalin at, nang naaayon, ang pagdaragdag ng mga sumusunod na unit ng amino acid. Ang target na produkto ay maaaring makuha sa pamamagitan ng pag-lysing ng host cell, kung kinakailangan, at paghihiwalay ng produkto mula sa iba pang mga protina sa pamamagitan ng naaangkop na mga pamamaraan ng paglilinis. Sa pagsasagawa, ang paggamit ng teknolohiyang recombinant DNA ay maaaring magbigay para sa pagpapahayag ng ganap na heterologous polypeptides (tinatawag na direktang pagpapahayag) o, bilang kahalili, heterologous polypeptides na nakakabit sa isang rehiyon ng amino acid sequence ng isang homologous polypeptide. Sa huling kaso, ang target na bioactive na produkto minsan ay nananatiling hindi aktibo sa homologous-heterologous polypeptide fusion hanggang sa ito ay mahati sa extracellular na kapaligiran (tingnan ang GB Published 2007676A at American Scientist 68, 664 (1980). C. Cell Culture Technology Ang sining ng cell culture o tissue culture upang pag-aralan ang genetics at physiology ng mga cell ay mahusay na binuo. Ang mga device at pamamaraan ay kilala sa pagpapanatili ng mga permanenteng linya ng cell na nakuha ng isang serye ng mga paglilipat mula sa mga nakahiwalay na normal na mga cell. Para sa paggamit sa pananaliksik, ang mga naturang cell line ay pinananatili sa solidong suporta sa isang likidong daluyan o lumaki sa Suspensyon na naglalaman ng mga pansuportang sustansya Ang pagkuha ng mas malalaking batch ng mga paghahanda ay nababawasan lamang sa mga problemang mekanikal Ang mas detalyadong paglalarawan ng background ng imbensyon ay matatagpuan sa Microbiology and Edition, Harpes and Row Reblishers, Inc., Hagerstown, Maryland (1973), lalo na sa pahina 1122 , ff Scientific American 245, 66 ff (1981), na ang bawat isa ay isinama dito sa pamamagitan ng sanggunian. Ang kasalukuyang imbensyon ay batay sa pagtuklas na ang teknolohiyang recombinant na DNA ay maaaring matagumpay na magamit upang makakuha ng immune interferon ng tao, mas mabuti sa direktang anyo at sa dami na sapat upang simulan at magsagawa ng mga pagsubok sa hayop at klinikal, na kinakailangan bago pumasok sa merkado. Ang produktong ito ay angkop para sa paggamit sa lahat ng anyo nito sa pag-iwas at paggamot ng mga impeksyon sa viral, malignancies, at mga kondisyon na may pinigilan o may sira na immune system. Kasama sa mga variant nito ang iba't ibang mga oligomeric na anyo, na maaaring kabilang ang glycosylation. Ang produktong ito ay nakukuha sa muling inayos na genetically transformed microorganism o sa transformed cell culture system. Gaya ng pagkakagamit dito, ang terminong "transformant cell" ay tumutukoy sa isang cell kung saan ang DNA ay ipinakilala, sinabi na ang DNA ay produkto ng exogenous DNA recombination, at sa progeny ng anumang naturang cell na nagpapanatili ng DNA na ipinakilala. Kaya, posible na ngayong makakuha at ihiwalay ang immune interferon ng tao nang mas mahusay kaysa sa dati. Ang isa sa mga mahahalagang salik ng kasalukuyang imbensyon, sa pinakagusto nitong embodiment, ay ang kakayahang genetically target ang isang microorganism o cell culture upang makabuo ng human immune interferon sa sapat na halaga upang ihiwalay ang mga mature na host cell. Kasama sa kasalukuyang imbensyon ang human immune interferon kaya nakuha, paraan at pamamaraan para sa paghahanda nito. Dagdag pa, ang kasalukuyang imbensyon ay nakadirekta sa mga maaaring kopyahin na mga vector ng expression ng DNA na nag-iimbak ng mga pagkakasunud-sunod ng gene na naka-encode ng immune interferon ng tao sa isang expressionable form. Ang kasalukuyang imbensyon ay nakadirekta din sa mga microbial strain o mga cell culture na binago gamit ang expression na vectors na inilarawan sa itaas, at sa microbial o cell culture ng naturang transformed strains o kultura na may kakayahang gumawa ng human immune interferon. Sa isa pang aspeto, ang kasalukuyang imbensyon ay nakadirekta sa iba't ibang proseso na kapaki-pakinabang para sa pagkuha ng nasabing immune interferon gene sequence, DNA expression vectors, microbial strains at cell culture, at mga partikular na variant nito. Bilang karagdagan, ang kasalukuyang imbensyon ay nakadirekta sa pagkuha ng mga kultura ng pagbuburo ng mga microorganism na ito at mga kultura ng cell. Ang kasalukuyang imbensyon ay nakadirekta din sa paggawa ng immune interferon ng tao bilang isang produkto ng direktang pagpapahayag ng isang mature na anyo na itinago ng mga host cell. Ang advance na ito ay maaaring gumamit ng gene na nag-e-encode ng isang mature na human immune interferon sequence kasama ang isang 5' flanking DNA na nag-encode ng signal polypeptide. Ang signal polypeptide ay pinaniniwalaang nagsisilbing maghatid ng molekula sa host cell wall, kung saan ito ay pinuputol sa panahon ng mature na tao. proseso ng pagtatago. Ginagawang posible ng variant na ito na ihiwalay at linisin ang target na mature na immune interferon nang hindi gumagamit ng pagsasama ng isang pamamaraan na idinisenyo upang alisin ang intracellular host protein contaminants o cell debris. Gaya ng pagkakagamit dito, ang ibig sabihin ng "mature human immune interferon" ay isang microbial o cell culture na produkto ng human immune interferon na hindi naglalaman ng signal peptide o prepeptide sequence na kinakailangang kasama ng pagsasalin ng human immune interferon mRNA. Ang unang recombinant na human immune interferon na inihanda alinsunod sa kasalukuyang imbensyon ay mayroong methionine bilang unang amino acid nito (kinakatawan sa pamamagitan ng pagpasok ng isang ATG start signal codon bago ang structural gene) o, kung ang methionine ay intra- o extracellularly cleaved, ay may normal na Ang unang amino acid ay cysteine. Ang mature na human immune interferon ay maaari ding ihanda bilang isang conjugate na may isang protina maliban sa normal na signal polypeptide, at isang conjugate na maaaring partikular na ma-cleaved intracellularly o extracellularly (tingnan ang UK Patent Publication N 2007676A). Sa wakas, ang may sapat na gulang na immune interferon ng tao ay maaaring makuha sa pamamagitan ng direktang pagpapahayag nang hindi na kailangang iwaksi ang anumang labis na polypeptides. Ito ay lalong mahalaga sa mga kaso kung saan ang host ay hindi maalis o hindi epektibong maalis ang signal peptide at ang expression vector ay nilayon upang ipahayag ang mature na interferon ng tao kasama ang signal peptide nito. Ang mature na human immune interferon na nakuha sa gayon ay ibinukod at dinadalisay sa isang antas na angkop para gamitin sa paggamot ng mga viral disease, malignancies, at immunosuppressed o deficient na mga kondisyon. Ang human immune interferon ay nakuha bilang mga sumusunod. 1. Ang mga tisyu ng tao, tulad ng spleen tissue ng tao o peripheral blood lymphocytes, ay nilagyan ng mitogens upang pasiglahin ang paggawa ng immune interferon. 2. Ang cell pellet mula sa naturang cell culture ay nakuha sa pagkakaroon ng ribonuclease inhibitor upang i-target ang lahat ng cytoplasmic RNA. 3. Ang kabuuang messenger RNA (mRNA) ay ibinukod sa isang oligo-dT na column sa polyadenylated form. Ang RNA na ito ay laki ng fractionated gamit ang isang sucrose density gradient at urea acid gel electrophoresis. 4. Ang katumbas na RNA (12S hanggang 18S) ay na-convert sa katumbas na single-stranded complementary DNA (mDNA), kung saan nakuha ang double-stranded cDNA. Pagkatapos ng poly-dC extension, ipinasok ito sa vector upang ang plasmid ay may isa o higit pang mga phenotypic marker. 5. Ang mga vector na nakuha ay ginamit upang ibahin ang anyo ng mga bacterial cell upang makakuha ng colony library. Ang mga radiolabeled cDNA na nakuha mula sa parehong sapilitan at hindi sapilitan na mga RNA na nakahiwalay tulad ng inilarawan sa itaas ay ginamit upang magkahiwalay na makilala ang mga duplicate na library ng kolonya. Ang labis na cDNA ay tinanggal at ang mga kolonya ay nalantad sa X-ray film upang makilala ang mga sapilitan na cDNA clone. 6. Ang kaukulang plasmid DNA ay nahiwalay mula sa sapilitan na cDNA clone at ang base sequence nito ay natukoy. 7. Ang sequenced DNA ay inihanda sa vitro para sa pagsasama sa isang naaangkop na expression vector na ginamit upang ibahin ang anyo ng isang angkop na host cell, na siya namang pinapayagang lumaki sa kultura at ipahayag ang naka-target na human immune interferon. 8. Sa ilang mga host cell system, kapag isinama sa isang expression vector upang maipahayag kasama ng isang signal peptide, ang mature na anyo ng human immune interferon ay itinatago sa medium ng kultura ng cell, na nagpapadali sa mga paraan ng paghihiwalay at paglilinis. Paglalarawan ng mga ginustong embodiments ng imbensyon. A. Cell culture system/cell culture vectors. Ang pagpapalaganap ng mga selulang vertebrate sa kultura (kultura ng tissue) ay naging isang karaniwang pamamaraan sa mga nakaraang taon (tingnan ang Tissue Culture Academic Riess Kruse at Paterson ends, 1973). Sa kasong ito, ang COS - 7 na linya ng monkey kidney fibroblast ay ginamit bilang host para sa produksyon ng immune interferon (25a). Gayunpaman, ang mga eksperimento na inilarawan nang detalyado dito ay maaaring isagawa sa anumang linya ng cell na may kakayahang kopyahin at ipahayag ang isang katugmang vector, tulad ng mga linya ng cell ng W138, BHK, 3T3, CHO, VERO at HeLa. Bilang karagdagan, ang expression na vector ay kailangang magkaroon ng pinagmulan ng pagtitiklop at isang promoter sa itaas ng agos ng gene na ipapakita, kasama ang mga kinakailangang ribosome binding site, RNA splicing site, polyadenylation site, at transcription terminator pati na rin. Bagama't ang mahahalagang elementong ito ng SV40 ay ginamit dito, dapat itong maunawaan na ang imbensyon, habang inilarawan dito sa mga tuntunin ng ginustong embodiment nito, ay hindi dapat ituring bilang limitado sa mga pagkakasunud-sunod na ito. Kaya, halimbawa, maaaring gamitin ang iba pang mga viral replication source (hal., Polyoma, Adeno, VSV, BPV, atbp.). ) mga vector, pati na rin ang mga cellular na mapagkukunan ng pagtitiklop ng DNA na maaaring gumana sa isang hindi pinagsamang estado. B. Pagpapahayag sa mammalian cell culture. Ang diskarte para sa synthesis ng immune interferon sa mammalian cell culture ay batay sa pagbuo ng isang vector na may kakayahang parehong autonomous replication at expression ng isang dayuhang gene sa ilalim ng kontrol ng isang heterologous transcriptional fragment. Ang pagtitiklop ng vector na ito sa tissue culture ay pinagsama sa pamamagitan ng pagpapasigla ng isang DNA replication initiator (nagmula sa SV 40 virus) at pagpapasigla ng isang accessory function (T antigen) sa pamamagitan ng pagpapakilala ng vector sa isang cell line na endogenously na nagpapahayag ng antigen na ito (23 at 29). ). Ang huli na tagataguyod ng SV 40 virus ay nauuna sa istrukturang gene para sa interferon at nagbibigay ng transkripsyon ng gene. Ang vector na ginamit upang makakuha ng expression ay binubuo ng mga pBR 322 na pagkakasunud-sunod, na nagbibigay ng isang marker na angkop para sa pagpili sa E. coli (ampicillin resistant) pati na rin ang isang DNA replication initiator. Ang mga pagkakasunud-sunod na ito ay nakuha mula sa plasmid pML - 1 (28) at kumakatawan sa rehiyon na naglalaman ng mga site ng paghihigpit ng ECo RI at Bam HI. Ang SV 40 initiator ay nakuha mula sa isang 342 bp PVu II-Hind III na fragment kasama ang rehiyong ito (30 at 31) (na ang parehong mga dulo ay na-convert sa mga dulo ng Eco RI). Ang mga pagkakasunud-sunod na ito, bilang karagdagan sa naglalaman ng viral initiator ng DNA replication, ay nag-encode ng isang promoter para sa parehong maaga at huli na mga yunit ng transkripsyon, ang oryentasyon ng site ng pagsisimula mula sa SV-40 ay tulad na ang promoter para sa huli na yunit ng transkripsyon ay nakaposisyon sa proximal sa ang gene, encoding interferon. Sa FIG. Ang 1 ay nagpapakita ng gradient sucrose centrifugation ng poly(A) + RNA mula sa stimulated peripheral blood lymphocytes. Mayroong dalawang maxima ng aktibidad ng interferon (ipinapakita ng may kulay na mga parihaba) na may sukat na 12S at 16S. Ang lokasyon ng mga rRNA marker (naka-centrifuged nang nakapag-iisa) ay may label sa itaas ng uptake contour. Sa FIG. 2 ay nagpapakita ng electrophoresis ng poly(A) + RNA stimulated PBL sa acid-urea-agarose. Isang maximum na aktibidad lamang ang sinusunod, na lumilipat kasama ng 18S RNA. Ang posisyon ng mga ribosomal RNA marker na na-electrophorese sa katabing lane at ipinakita ng ethidium bromide staining ay may label sa itaas ng balangkas ng aktibidad. Sa FIG. 3 ay nagpapakita ng mga pattern ng hybridization ng 96 na kolonya na may sapilitan at hindi sapilitan na 32 P na may label na cDNA probes. Ang 96 na indibidwal na mga transformant ay lumaki sa isang microtiter plate, ang replica ay inilagay sa dalawang nitrocellulose membranes, at pagkatapos ay ang mga filter ay na-hybridize na may 32 P-cDNA sample na nakuha alinman mula sa sapilitan mRNAs (tuktok) o mula sa mga mRNA na nakahiwalay mula sa mga hindi sapilitan na kultura ng pBL ( non-induced, ibaba). ). Ang mga filter ay hinugasan upang alisin ang mga unhybridized na RNA at pagkatapos ay nalantad sa x-ray film. Ang serye ng mga filter na ito ay kumakatawan sa 86 na naturang serye (8300 independiyenteng kolonya). Ang isang halimbawa ng isang induced clone ay isang may label na H12. Fig. Ang 4 ay isang restriction map ng clone 69 cDNA insert. Ang cDNA insert ay nauugnay sa mga PstI site (mga tuldok sa magkabilang dulo) at oligo-dC-dG tails (straight lines). Ang bilang at laki ng mga fragment na nakuha sa pamamagitan ng restriction nuclease digestion ay tinutukoy ng 6% acrylamide gel electrophoresis. Ang mga posisyon ng mga plot ay nakumpirma sa pamamagitan ng pagkakasunud-sunod (kinakatawan sa Fig. 5). Ang rehiyon ng coding ng pinakamalaking bukas na frame ng pagbasa ay bilugan, ang may kulay na rehiyon ay kumakatawan sa 20 nalalabi na sequence ng signal peptide, habang ang may tuldok na rehiyon ay kumakatawan sa mature na sequence ng IEN (46 amino acids); Ang 5" dulo ng mRNA ay nasa kaliwa at ang 3" na dulo ay nasa kanan. Sa FIG. 5 ay nagpapakita ng nucleotide sequence ng p69 cDNA insert. Ang "deduced" amino acid sequence ng pinakamahabang bukas na rehiyon ng pagbabasa ay ipinapakita din. Ang putative signal sequence ay kinakatawan ng mga nalalabi na may label na S1 hanggang S20. Sa FIG. 6 ay isang diagram ng pSV69 plasmid na ginamit upang ipahayag ang IFN-γ sa mga selula ng unggoy. Fig. Inilalarawan ng 7 ang Southern hybridization ng 8 iba't ibang Eco RI digested human genomic DNAs na na-hybrid sa isang 600 bp 32 P-label na DdeI fragment. mula sa p69 cDNA insert. Dalawang fragment ng Eco RI ang malinaw na na-hybrid sa probe sa bawat sample ng DNA. Sa FIG. 8 ay nagpapakita ng Southern hybridization ng genomic DNA ng tao na hinukay na may 6 na magkakaibang restriction endonucleases na na-hybrid sa isang 32 P-labeled na probe mula sa p69. A. Pinagmulan ng IFN-mRNA
Ang mga peripheral blood lymphocytes (PBL) ay nakuha mula sa mga donor ng tao gamit ang leukophoresis. Ang mga PBL ay higit na nalinis sa pamamagitan ng gradient centrifugation sa ficoll-heparin at pagkatapos ay nilinang sa isang konsentrasyon na 510 6 na mga cell/ml sa RPMI 164 na may 1% L-glutamine, 25 mM HEPS at 1% penicillin-streptomycin (Gibco Jrand gsland, Ny). Ang mga cell na ito ay naudyok na gumawa ng IFN-γ na may mitogenic staphylococcal enterotoxin B (N μg/ml) at nilinang sa loob ng 34-48 na oras sa 37°C sa 5% CO. Ang Deacetyl thymosin -- (0.1 μg/ml) ay idinagdag sa kultura ng PBL upang mapataas ang kamag-anak na ani ng aktibidad ng IFN-α. B. Paghihiwalay ng messenger RNA. Ang kabuuang RNA mula sa mga kultura ng PBL ay mahalagang nakuha tulad ng iniulat ni Bergen, S.L. et al. (33). Ang mga cell ay nahiwalay sa pamamagitan ng centrifugation at pagkatapos ay muling sinuspinde sa 10 mM NaCl, 10 mM TrCS-HCl (pH 7.5), 1.5 mM MgCl 2 at 10 mM ribonucleoside-vanadyl complex. Ang mga cell ay lysed sa pamamagitan ng pagdaragdag ng NP-40 (1% na panghuling konsentrasyon) at ang nuclei ay nahiwalay sa pamamagitan ng centrifugation. Ang supernatant ay naglalaman ng kabuuang RNA, na higit na nadalisay ng maraming mga pagkuha na may phenol at chloroform. Ang aqueous phase ay dinala sa 0.2 M NaCl, at pagkatapos ang lahat ng RNA ay kinubkob sa pamamagitan ng pagdaragdag ng dalawang volume ng ethanol. Ang RNA ng mga non-induced (non-stimulated) na kultura ay nahiwalay sa parehong paraan. Ang Oligo-dT cellulose chromatography ay ginamit upang linisin ang mRNA mula sa iba pang mga uri ng RNA (34). Ang karaniwang mga ani mula sa 1-2 L ng kulturang PBL ay 5-10 mg kabuuang RNA at 50-200 μg poly(A) + RNA. C. fractionation ng laki ng mRNA. Dalawang pamamaraan ang ginamit upang i-fractionate ang mga paghahanda ng mRNA. Ang mga pamamaraan na ito ay ginamit nang nakapag-iisa (sa halip na magkasama) at ang bawat isa ay nagresulta sa isang makabuluhang pagpapayaman ng IFN-mRNA. Ang mRNA ay na-fractionate gamit ang sucrose gradient centrifugation sa pagkakaroon ng formamide denaturant. Ang mga gradient mula 5 hanggang 25% sucrose sa 70% formamide (32) ay na-centrifuge sa 154,000g para sa 19 h sa 20°C. Ang mga sequential fractions (0.5 ml) ay pagkatapos ay ihiwalay mula sa tuktok ng gradient, pinaulanan ng ethanol, at pagkatapos ay mga aliquot ay na-injected sa Xenopus laevis cells para sa pagsasalin ng mRNA (35). Pagkatapos ng 24 na oras sa temperatura ng silid, ang incubation medium ay nasubok para sa aktibidad na antiviral gamit ang karaniwang cytopathic effect inhibition method gamit ang Vesicular Stomatitis virus (Indiana strain) o Eucepholomycarditis virus sa WISH cells (human amnion) gaya ng inilarawan ni Stewart (36), maliban doon. ang mga sample ay natupok ng mga cell sa loob ng 24 h (sa halip na 4) bago ang impeksyon sa virus. Alinsunod dito, dalawang peak ng aktibidad ang naobserbahan para sa RNA na na-fractionated sa isang sucrose gradient (FIG. 1). Isang peak na sedimented na may kalkuladong laki na 12S at naglalaman ng 100-400 U/ml ng antiviral na aktibidad (kumpara sa IFN-γ standard) bawat µg ng injected RNA. Ang iba pang peak ng aktibidad ay 16S sedimented at naglalaman ng halos kalahati ng aktibidad ng mas mabagal na sedimented peak. Ang bawat isa sa mga taluktok ng aktibidad na ito ay lumilitaw na nauugnay sa IFN-γ, dahil walang aktibidad na naobserbahan para sa parehong mga fraction na nasubok sa isang bovine cell line (MDBK) na hindi protektado ng tao na IFN-γ. Ang parehong aktibidad ng IFN-.alpha. at IFN-.alpha. ay maaaring madaling matukoy sa pamamagitan ng pagsusuri sa MDVA (5). Ang fractionation ng mRNA (260 μg) ay isinagawa din ng electrophoresis sa pamamagitan ng acid-urea agarose gels. Ang malapot na agarose gel (37 at 38) ay binubuo ng 1.75% agarose. 0.025 M sodium citrate, pH 3.8 at 6 M urea. Ang electrophoresis ay isinasagawa sa loob ng 7 oras sa 25 mA at 4 ° C. Pagkatapos ay pinutol ang gel gamit ang isang talim ng labaha. Ang mga indibidwal na hiwa ay natunaw sa 70° C. at pagkatapos ay kinuha ng dalawang beses na may phenol at isang beses na may chloroform. Ang mga fraction ay pinaulanan ng ethanol, sunud-sunod na sinuri para sa nilalaman ng IFN-α mRNA sa pamamagitan ng pagpapakilala sa Xenopus laevis socita at pagkatapos ay isinagawa ang pagsusuri sa antiviral. Para sa mga sample ng gel-fractionated, isang peak ng aktibidad lamang ang naobserbahan (FIG. 2). Ang peak na ito ay inilabas kasama ng 18S at may aktibidad na 600 units/ml bawat microgram ng injected RNA. Mukhang partikular din ang aktibidad na ito para sa IFN-.gamma. dahil hindi nito pinoprotektahan ang mga MDVA cell. Ang pagkakaiba sa laki na naobserbahan sa mga sucrose gradients (12S at 16S) at acid-urea gels (18S) ay maaaring ipaliwanag sa pamamagitan ng katotohanan na ang mga independiyenteng pamamaraan ng fractionation na ito ay isinagawa sa ilalim ng iba't ibang mga kondisyon ng kumpletong denaturation. E. Pagkuha ng colony library,
Naglalaman ng pagkakasunod-sunod na IFN-. 3 mg ng gel-fractionated mRNA ay ginamit upang maghanda ng double-stranded cDNA ayon sa mga karaniwang pamamaraan (26 at 39)); Ang cDNA ay laki ng fractionated sa isang 6% polyacrylamide gel. Ang mga fraction ng dalawang laki ay electroeluted, 800 - 1500 p. (138 ng) at > 1500 bp (204 ng). Ang mga bahagi ng 35 ng ng bawat laki ng cDNA ay pinalawak ng mga deoxy C na nalalabi gamit ang terminal deoxynucleotide transferase (40) at na-annealed na may 300 ng ng plasmid pBK 322 (41), na kung saan ay katulad na naka-ligated sa mga deoxy residues sa Pst I site (40). Ang bawat renatured mixture ay binago sa E. coli K12 strain 294. Humigit-kumulang 8000 transformants na may cDNA 800-1500 bp ang nakuha. at 400 cDNA transformants > 1500 bp E. Paghihiwalay mula sa aklatan ng mga kolonya,
sapilitan cDNA. Ang mga nagresultang kolonya ay hiwalay na inoculated sa mga balon ng microtiter plate na naglalaman ng LB (58) + 5 µg/ml tetracycline at iniimbak sa -20 o C pagkatapos idagdag ang IGMSO sa 7%. Dalawang kopya ng library ng kolonya ang lumaki sa mga filter ng nitrocellulose at ang DNA mula sa bawat kolonya ay naayos sa filter gamit ang pamamaraang Gruushtein-Hogness (42). Ang 32P na may label na cDNA probes ay inihanda gamit ang gel fractionated 18S mRNAs mula sa sapilitan at hindi sapilitan na mga kultura ng PBL. Bilang mga panimulang aklat ay ginamit ang oligo-d T 12-18; ang mga kondisyon ng reaksyon na inilarawan dati (I) ay ginamit. Mga filter na naglalaman ng 8000 mga transformant na may laki ng cDNA na 600-1500 bp. at 400 mga transformant na may sukat ng cDNA na higit sa 1500 bp. hybridized na may 2010 6 cpm induced 30 P-cDNA. Ang isang duplicate na set ng filter ay na-hybrid sa 2010 6 cpm ng non-induced 32P cDNA. Ang hybridization ay isinagawa para sa 16 h gamit ang mga kondisyon na inilarawan ni Fritsch et al (43). Ang mga filter ay lubusang hinugasan (43) at pagkatapos ay nalantad sa Kodak XR-5 X-ray film gamit ang Du Pont Lightning-Plus. tumitindi ang mga screen sa loob ng 16-48 na oras. Ang hybridization pattern para sa bawat kolonya ay inihambing sa dalawang sample. Humigit-kumulang 40% ng mga kolonya ay malinaw na na-hybrid sa parehong mga probe, habang humigit-kumulang 50% ng mga kolonya ay hindi nag-hybrid sa alinman sa probe (tingnan ang Fig. 3). 124 na mga kolonya ang kitang-kitang na-hybrid sa indibidwal na probe, ngunit hindi napapansin o napakahina sa non-induced probe. Ang mga kolonya ay indibidwal na inoculated sa mga balon ng microtiter plates, lumaki at inilipat sa nitrocellulose filter, at pagkatapos ay hybridized na may parehong dalawang sample tulad ng inilarawan sa itaas. Ang plasmid DNA na nakahiwalay mula sa bawat isa sa mga kolonya sa mabilis na paraan (44) ay nakatali din sa mga filter ng nitrocellulose at na-hybrid (45) sa mga stimulated na probes. Ang DNA mula sa 22 kolonya na na-hybridize lamang sa mga induction probes ay tinawag na "induced" na mga kolonya. F. Mga katangian ng sapilitan na mga kolonya. Ang plasmid DNA ay nakuha mula sa 5 sapilitan na mga kolonya (46) at ginamit upang makilala ang insert cDNA. Ang pag-label ng paghihigpit ng limang sapilitan na plasmids (p67, p68, p69, p70 at p71) ay nagpakita na apat sa kanila ay may katulad na mga mapa ng paghihigpit. Ang apat na plasmids na ito (p67, p69, p71 at p72) ay may apat na rehiyon ng Dde, 2 Hinf 1 na rehiyon at isang Rsa 1 na rehiyon sa insert ng cDNA. Ang ikalimang plasmid (p68) ay naglalaman ng normal na Dde 1 fragment at lumilitaw na isang maikling cDNA clone ng iba pang apat. Ang homology na iminungkahi ng restriction nuclease mapping ay nakumpirma ng hybridization. Ang isang 32 P-label na DNA probe (47) ay inihanda mula sa isang 600 bp DdeI fragment. p67 plasmids at ginamit para sa hybridization (42) kasama ang natitirang mga sapilitan na kolonya. Lahat ng limang restriction nuclease mapped colonies cross-hybridized gamit ang probe na ito, gayundin ang 17 iba pang kolonya sa 124 na na-screen. Ang haba ng pagsingit ng cDNA sa bawat isa sa mga cross hybridizing plasmids na ito ay tinutukoy ng PstI digestion at gel electrophoresis. Ang clone na may pinakamahabang cDNA insert ay lumilitaw na clone 69 na may laki ng insert na 1200-1400 bp. Ginamit ang DNA na ito sa lahat ng karagdagang eksperimento, ang mapa ng paghihigpit nito ay ipinapakita sa FIG. 4. Ang p69 cDNA insert ay ipinakita bilang isang IFN-cDNA ng mga produktong nabuo sa tatlong independiyenteng sistema ng pagpapahayag na nagpakita ng aktibidad na antiviral, gaya ng inilarawan sa mas detalyadong infra. G. Sequential p69 cDNA insertion analysis. Ang kumpletong pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng plasmid p69 cDNA insert ay natukoy sa pamamagitan ng dideoxynucleotide termination (48) pagkatapos ng subcloning ng mga fragment sa M 13 vector m 7 (49) at sa pamamagitan ng kemikal na pamamaraan ng Maxam at Gilbert (52). Ang pinakamahabang open reading frame code para sa 166 amino acid na protina na ipinapakita sa FIG. 5. Ang unang residue ay nag-encode sa unang methionine codon na kasama sa 5' dulo ng cDNA. Ang unang 20 residue sa amino terminal ay malamang na nagsisilbing signal sequence para sa pagtatago ng natitirang 146 amino acids. Bilang karagdagan, apat na amino acids na natagpuan sa putative cleavage sequence (ser-leu-glu-cys) ay kapareho ng apat na residues na natagpuan sa cleavage point ng ilang leukocyte interferon (LeIF B, C, D, F at H (2)). Ang naka-encode na mature na amino acid pagkakasunud-sunod ng 146 amino acids (mula rito ay tinutukoy bilang "recombinant human immunointerferon") ay may molekular na timbang na 17140. Mayroong dalawang potensyal na posisyon ng glycosylation (50) sa naka-encode na pagkakasunud-sunod ng protina, mga amino acid 28 hanggang 30 (asn-gly-thr) at amino acids 100 hanggang 102 (asn-tyr-ser) Ang pagkakaroon ng mga posisyong ito ay pare-pareho sa naobserbahang glycosylation ng tao IFN-γ (6 at 51). Bilang karagdagan, ang tanging dalawang cysteine residues (posisyon 1 at 3) ay masyadong malapit sa sterically upang bumuo ng isang disulfide bridge, na naaayon sa naobserbahang katatagan ng IFN-α sa pagkakaroon ng mga ahente ng pagbabawas tulad ng IFN-β-mercaptoethanol (51). ). Ang deduced mature amino acid sequence ay karaniwang basic, na mayroong kabuuang 30 lysine, arginine at histidine residues at kabuuang 19 aspartic at glutamic acid residues. Ang istraktura ng IFN-γ mRNA na tinutukoy mula sa pagkakasunud-sunod ng DNA ng p69 plasmid ay kapansin-pansing naiiba sa IFN-(1,2) o IFN-(5) mRNA. Kaya, ang coding region para sa IFN-γ ay mas maikli, bagama't ang 5' na hindi naisasalin at 3'-hindi naisalin na mga rehiyon ay mas mahaba kaysa sa IFN-FN- at IFN-α. H. Structure ng coding sequence ng IFN-.alpha. gene. Ang istraktura ng gene encoding IFN-γ ay nasuri sa pamamagitan ng hybridization. Sa pamamaraang ito (54), 5 µg ng mataas na molekular na timbang ng DNA ng tao (inihanda ayon sa pamamaraan 55) ay hinuhukay hanggang sa makumpleto na may iba't ibang restriction endonucleases, electrophoresed sa isang 1.0% agarose gel (56) at inilipat sa isang nitrocellulose filter (54) . Ang isang 32 P-label na sample ng DNA ay inihanda (47) mula sa isang 600 bp DdeI fragment. p69 cDNA insert at hybridized (43) na may DNA filter spot. Ang 10 7 cpm na mga sample ay na-hybrid sa loob ng 16 na oras at pagkatapos ay hugasan tulad ng inilarawan (43). Walong genomic DNA sample mula sa iba't ibang (tao) na mga donor ang natunaw sa Eco RI at na-hybrid gamit ang p69 32 P-labeled probe. Gaya ng ipinapakita sa FIG. 7, mayroong dalawang malinaw na signal ng hybridization na may sukat na 8.8 m.b. at 2.0 m. p. O., na itinatag sa pamamagitan ng paghahambing ng mga mobility sa Hind III na hinukay na β-DNA. Ito ay maaaring resulta ng alinman sa dalawang IFN-γ gene o isang gene na na-cleaved sa Eco RI site. Dahil ang p69 cDNA ay hindi naglalaman ng mga site ng Eco RI, upang ipaliwanag ang presensya nito sa gene, ang isa ay kailangang mag-assume ng isang intermediate sequence (intron) na may panloob na Eco RI site. Upang makilala ang pagitan ng dalawang posibilidad na ito, isa pang Southern hybridization ang isinagawa gamit ang parehong probe at limang iba pang endonuclease digest ng parehong DNA ng tao (FIG. 8). Dalawang hybridizable na mga fragment ng DNA ang naobserbahan para sa iba pang mga endonuclease digestion, PUII - 6.7 kb. at 4.0 at Hinc II (2.5 kb at 2.2 kb). Gayunpaman, ang iba pang tatlong pattern ng endonuclease digestion ay nagbibigay lamang ng isang hybridizing na fragment ng DNA: Hind III (9.0 kb), Bdl II (11.5 kb), at BamHI (9.5 kb). (mas mababa sa 9.0 kbp) na nasa parehong fragment ng Hihd III. Iminumungkahi ng resulta na ito na isang homologous IFN-γ gene lamang (kumpara sa maraming IFN-γ related genes) ang naroroon sa genomic DNA ng tao at ang gene na ito ay pinaghihiwalay ng isa o higit pang mga intron na naglalaman ng Eco RI, PVU II at Hind II na mga site. Ang mungkahing ito ay kinumpirma ng hybridization ng 32 P-labeled (47) fragment na nagmula sa 3'-untranslated cDNA region mula sa p69 (130 bp Dde I fragment mula sa posisyon 860 hanggang sa posisyon 990 sa Fig. 5) na may Eco RI digest ng tao genomic DNA Tanging isang 2.0 kb Eco RI fragment ang nag-hybrid sa probe na ito, na nagpapahiwatig na ang fragment na ito ay naglalaman ng 3' hindi na-translate na mga sequence, habang isang 3.8 kb. Ang Eco RI fragment ay naglalaman ng 5" sequence. Ang istruktura ng IFN- gene (isang gene na may hindi bababa sa isang intron) ay malaki ang pagkakaiba sa IFN- (maraming genes (2) na walang introns (56)) o IFN- (isang gene na walang introns (57 )) J. Ang pagtatayo ng cell culture vector pSV69 A 342 bp Hind III-PVU III fragment na naglalaman ng SV 40 initiator ay na-convert sa isang fragment na nakatali sa isang Eco R I restriction site. Ang Hind III site ay na-convert sa pamamagitan ng pagdaragdag ng synthetic oligomer (5d AGCTGAATTC) at Ang site ng PVU II ay na-convert sa pamamagitan ng blunt-end fusion sa isang Eco RI site, na dinagdagan ng polymerase I (Klenow fragment). Ang nagresultang Eco RI fragment ay ipinasok sa Eco RI site ng pML- (28). Ang amp R gene ay higit pang binago sa pamamagitan ng pagtanggal sa Eco R I site na pinakamalapit sa amp R pML-1 gene (27). Ang 1023 bp HpaI-BglII fragment ay nahiwalay sa naka-clone na HBV DNA (60), at ang HpaI site ng hepatitis B virus ( HBV) ay na-convert sa isang Eco RI site na may synthetic oligomer (5'dGGGAATTCGC). Ang Eco RI-Bgl II fragment na ito ay direktang na-clone sa Eco RI - BamH I na mga site ng plasmid na inilarawan dati at nagdadala ng SV 40 initiator. matapos ang conversion ng PstI sa Eco R I ay nagtatapos. Ang mga clone na iyon ay nahiwalay kung saan nauna ang SV 40 late promoter sa gene ng IFN-.gamma. Ang nagresultang plasmid pSV69 (Larawan 6) ay ipinakilala sa tissue culture cells (29), sa partikular na COS-7 cells, gamit ang DEAE-dextran method (61), binago upang ang paglipat sa presensya ng DEAE-dextran ay dinala. out para sa 8 h. Ang cell medium ay pinapalitan tuwing 2-3 araw. Ang 200 μl ay kinuha araw-araw para sa interferon bioassay. Ang mga karaniwang ani ay 50-100 U/ml sa mga sample na sinuri tatlo o apat na araw pagkatapos ng paglipat. Ang pagsusuri ay nagpakita na ang expression na produkto ay kulang sa cys-tyr-cys-N-terminal na bahagi ng recombinant human immunointerferon (cf. Fig. 5), na nagpapahiwatig na ang signal peptide cleavage phenomenon ay dumaan sa cys-GLN bond (amino acids. 3 at 4 sa fig. 5) at ang mature na polypeptite ay aktwal na binubuo ng 143 amino acids (ges-cys-Tyr-cys-immune interferon). J. Bahagyang paglilinis ng recombinant na ges-cys-Tyr-cys-immune interferon ng tao. Upang makakuha ng malaking halaga ng interferon ng tao na IFN-γ na itinago ng mga selula ng unggoy, ang mga sariwang monolayer ng COS-7 na mga cell sa sampung 10 cm na mga plato ay inilipat na may kabuuang 30 µg pDL 1 3 sa 110 ml DEAE-dextran (200 µg/ml DEAE dextran 500,000 MW; 0 .05 M tris pH 7.5 sa DMEM). Pagkatapos ng 16 na oras sa 37 ° C., ang mga plato ay hugasan nang dalawang beses gamit ang DMEM. 15 ml sariwang DMEM na pupunan ng 10% f.b.s., 2 mM glutamine, 50 µg/ml penicillin G at 50 mg/ml streptomycin ay idinagdag sa bawat plato. Ang medium ay pinalitan ng serum-free DMEM. Ang sariwa, walang serum na daluyan ay idinagdag araw-araw. Ang nakolektang daluyan ay pinananatili sa 4° C. hanggang magamit para sa pagsusuri o itali sa CPG. Ang mga fraction na nakolekta 3 at 4 na araw pagkatapos ng paglipat ay natagpuan na nagpapanatili ng halos lahat ng aktibidad. 0.5 g ng CPG (Electonucleonics CPG 350 controlled porous glass 120/200 bag size) ay idinagdag sa 100 ml ng cell supernatant at ang nagresultang timpla ay hinalo sa loob ng 3 oras sa 4°C. papunta sa column at hugasan ng lubusan gamit ang buffer 20 mm NaPO 4 , 1M NaCl, 0.1% -mercaptoethanol, pH 7.2. Ang aktibidad ay pagkatapos ay na-eluted na may parehong buffer na naglalaman ng 30% ethylene glycol na sinusundan ng eluting sa itaas na buffer na naglalaman ng 50% ethylene glycol. Halos lahat ng aktibidad ay nauugnay sa CPG. 75% ng eluted na aktibidad ay natagpuan sa mga fraction na eluted na may 30% ethylene glycol. Ang mga fraction na ito ay nakolekta at natunaw ng 20 mM NaPO 4 1M NaCl, pH 7.2 hanggang sa isang pangwakas na konsentrasyon ng 10% ethylene glycol at direktang na-load sa isang 10 ml Con A Sepharose column (Pharmacia). Pagkatapos ng masusing paghuhugas ng 20 mM NaPO 4 - 1 M NaCl, pH 7.2, ang mga aktibidad ay na-eluted na may 20 mM NaPO 4 - 1 M NaCl - 0.2 M -methyl-D-mannozide. Ang isang makabuluhang halaga ng aktibidad (55%) ay hindi nauugnay sa lectin na ito, 45% ng aktibidad ay pinahiran ng α-methyl-D-mannoside. K. Mga komposisyong parmasyutiko. Ang mga compound ng kasalukuyang imbensyon ay maaaring buuin ayon sa mga kilalang pamamaraan sa mga komposisyon na katanggap-tanggap sa parmasyutiko kung saan ang interferon ng immune ng tao ay pinagsama sa admixture sa isang carrier na katanggap-tanggap sa parmasyutiko. Ang mga angkop na carrier at komposisyon nito ay inilalarawan sa Pharmaceutical Science ng Pemington, na isinama sa pamamagitan ng sanggunian. Ang mga naturang komposisyon ay dapat maglaman ng epektibong dami ng interferon protein alinsunod sa kasalukuyang imbensyon kasama ng isang angkop na dami ng carrier upang magbigay ng pharmaceutically acceptable na komposisyon na angkop para sa epektibong pangangasiwa sa isang pasyente. pangangasiwa ng parenteral. Ang human immune interferon ng kasalukuyang imbensyon ay maaaring ibigay sa parenteral sa isang pasyente na nangangailangan ng antitumor o antiviral na paggamot, gayundin sa mga nasa isang immunosuppressed na estado. Ang mga dosis at dalas ng pangangasiwa ay maaaring katulad ng mga karaniwang ginagamit sa mga klinikal na pagsubok sa iba pang interferon ng tao; iyon ay, mga (1-10)10 6 na yunit araw-araw, at sa kaso ng mga materyales na may kadalisayan na higit sa 1%, tila hanggang 5010 6 na yunit. purong interferon na angkop para sa parenteral administration. Ang mga ampoule ay mas mainam na nakaimbak sa malamig (-20 o C) bago gamitin. Data ng bioresearch. 1. Mga katangian ng aktibidad na antiviral. Upang neutralisahin ang mga antibodies, ang mga sample ay diluted, kung kinakailangan, sa isang konsentrasyon ng 500 - 1000 units/ml sa pamamagitan ng pagdaragdag ng PBS - BSA. Ang pantay na dami ng sample ay inilublob sa loob ng 2-12 oras sa 4° C. na may serye ng mga dilution ng rabbit anti-human leukocytes, fibroblast, o immune interferon antiserum. Anti-IFN- at natanggap mula sa National Institute of Allergic and Infectious Diseases. Inihanda ang Anti-IFN-γ gamit ang tunay na IFN-γ (5-20% pure) na nalinis mula sa stimulated peripheral blood lymphocytes. Ang mga sample ay na-centrifuge sa loob ng 3 minuto sa 1200 xg 3 minuto bago ang pagsubok. Upang subukan ang pH 2 - katatagan, ang mga sample ay nababagay sa pH 2 sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 1N. HCl, incubated para sa 2-12 h sa 4 o C at neutralized sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 1 n. NaOH bago ang pag-aaral. Para sa pagsusuri sa sensitivity ng sodium dodecyl sulfate (SDS), ang mga sample ay na-incubate na may katumbas na dami ng 0.2% SDS sa loob ng 2-12 oras sa 4°C kaagad bago ang pagsusuri. Mga katangian ng IFN-y na nakuha sa COS - 7 mga cell ang ibinigay sa talahanayan. Mga mapagkukunan ng impormasyon. 1. Goeddel et al., Kalikasan 287, 411 (1930). 2. Goeddel et al., Kalikasan 290.20(1981). 3. Yelverton et al., Nucleic Aceds Research 9.731 (1981). 4. Gutterman et al., Annals of Int. Med. 93, 399 (1980). 5. Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980). 6. Yip et al., Proc. Natl. Acad. sci. (USA) 78, 1601 (1981). 7. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. sci. (USA) 78, 3469 (1981). 8. Bloom, Kalikasan 289, 593 (1980). 9. Sonnenfeld et al., Cellular Immunol. 40, 285 (1978). 10. Fleishmann et al., Infection and Immunity 26, 248 (1979). 11. Blalock et al., Cellular Immunology 49, 390 (1980). 12. Rudin et al., Proc. Natl. Acad. sci. (USA) 77, 5928 (1980). 13. Crane et al., J. Natl. Cancer Inst. 61, 871 (1978). 14 Stinchcomb et al. , Kalikasan 282, 39 (1979). 15. Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979). 16. Tschumper el al.,. Gene 10, 157 (1980). 17. Mortimer et al., Microbiological Reviews 44, 519 (198). 18. Miozzari et al., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978). 19. Jones, Genetics 85, 23 (1977). 20. Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980). 21. Hess et al., J. Adv. Enzyme Regul. 7, 149 (1968). 22. Holland et al Biochemistry 17, 4900 (1978). 23. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. sci. (USA) 77, 4504 (1980). 24. Ang Molecular Biology of Yeast (Ago 11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 25. Chambon, Ann. Sinabi ni Rev. Biochemistry, 44, 613 (1975). 25a. Gluzman, Cell 23. 175 (1981). 26. Goeddel et al., Kalikasan 281, 544 (1979). 27. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977). 28. Lusky et al., Kalikasan 293, 79 (1981). 29 Gluzman et al. , Cold Spring Harbor Symp. dami. Biol. 44, 293 (1980). 30. Fiers et al., Kalikasan 273, 113 (1978). 31. Reddy et al., Science 200, 494 (1978). 32 Boedtker et al. , Prog. sa Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 19, 253 (1976). 33. Berger et al., Biochemistry 18, 5143 (1979). 34. Aviv et al., Proc. Natl. Acad. sci. USA 69, 1408 (1972). 35. Gurdon et al., J. Molec. Biol. 80, 539 (1975). 36 Stewart, Ang Interferon System. Springer, New Fork, p. 13-26 (1979). 37. Lehrach et al., Biochemistry 16, 4743 (1977). 38. Lynch et al., Virology 98, 251 (1979). 39. Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978). 40. Chang et al., Kalikasan 275, 617 (1978). 41. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977). 42. Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. sci. U.S.A. 72, 3961 (1975). 43. Fritsch et al., Cell 19, 959 (1980). 44. Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979). 45. Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7, 1541 (1979). 46. Clewel et al., Biochemistry 9, 4428 (1970). 47. Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442, 324 (1976). 48. Smith, Mga Pamamaraan Enzymol. 61, 560 (1980). 49. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981). 50. Winzler, Hormonal Proteins and Peptides (ed. Li) Academic Press, New York, p. 1 (1973). 51 Mathan et al., Kalikasan 292, 842 (1981). 52. Maxam et al., Mga Paraan sa Enzymol. 65, 490 (1980). 53 Crea et al., Proc. Natl. Acad. sci. (USA) 75, 5765 (1978). 54. Timog, J. Molec. Biol. 98, 503 (1975). 55. Blin et al., Nucleic Acids Res. 3, 2303 (1976). 56. Lawn et al., Science 212, 1159 (1981). 57. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 1045 (1981). 58. Miller, Mga Eksperimento sa Molecular Genetics, p. 431-3 Cold Spring Harbor Lab. , Cold Spring Harbor, New York (1972). 59. Beggs, Kalikasan 275, 104 (1978). 60. Valenzuela et al., Animal Virus Genetics (ed. Fields, Jaenisch and Fox) p. 57, Academic Press, New York (1980). 61. McCuthan et al., J. Natl. Cancer Inst. 41, 351 (1968).
CLAIM
Isang paraan para sa paggawa ng human immune interferon, na kinabibilangan ng paglinang ng linya ng selula ng hayop, pag-isolate at paglilinis ng target na produkto, na nailalarawan sa na ang COS-7 cell line na binago sa pSVj69 recombinant plasmid DNA ay nilinang at des-Cys-Tyr-Cys-interferon ay nakahiwalay.10267 0
Biosynthesis ng somatotropin at iba pang mga hormone ng tao
Ang human growth hormone, o somatotropin, ay na-synthesize sa utak ng tao sa anterior pituitary gland. Ito ay unang nahiwalay mula sa cadaveric na materyal at nalinis noong 1963. Sa kakulangan ng growth hormone, ang pituitary dwarfism ay bubuo, ang saklaw nito ay tinatayang nasa 7 hanggang 10 kaso bawat milyong tao.Ang hormone ay partikular sa species, ibig sabihin, hindi tulad ng insulin, ang mga hormone sa paglaki ng hayop ay walang aktibidad sa katawan ng tao. Samakatuwid, ang tanging lunas para sa pituitary dwarfism ay pituitary hormone, na nakahiwalay sa mga bangkay. Ipinakita ng mga pag-aaral na sa intramuscular injection ng somatotropin sa mga dosis na 10 mg bawat 1 kg ng timbang ng katawan sa loob ng isang taon, tatlong iniksyon bawat linggo ay nagbibigay ng pagtaas sa paglago ng mga 8-18 cm bawat taon.
Ang mga batang may sakit na apat hanggang limang taong gulang, na may patuloy na paggamot, ay nahuli sa paglaki kasama ng kanilang mga kapantay hanggang sa pagdadalaga (14-16 taon). Kung isasaalang-alang natin ang katotohanan na ang 4-6 mg ng somatotropin ay maaaring makuha mula sa isang bangkay, pagkatapos ay mauunawaan natin na ang paggamot sa sakit na ito na may natural na somatotropin ay ganap na walang pag-asa. Bilang karagdagan sa kakulangan ng gamot, may iba pang mga problema na nauugnay sa heterogeneity ng hormone na nakahiwalay sa cadaveric material.
Nagkaroon din ng panganib na ang pituitary material ay nahawaan ng dahan-dahang pagbuo ng mga virus. Ang ganitong mga virus ay may hindi pangkaraniwang mahabang panahon ng pagpapapisa ng itlog, kaya ang mga bata na nakatanggap ng gamot ay nangangailangan ng maraming taon ng pangangasiwa ng medisina.
Ang hormone ng paglago ng tao, na na-synthesize sa mga espesyal na idinisenyong bacterial cell, ay may malinaw na mga pakinabang: ito ay magagamit sa maraming dami, ang mga paghahanda nito ay biochemically purong at libre mula sa viral contamination.
Ang biosynthesis ng somatotropin (binubuo ng 191 residue ng amino acid) ng mga espesyal na idinisenyong bakterya batay sa Escherichia coli ay isinagawa ng Genentech. Dahil sa panahon ng synthesis ng DNA para sa mRNA, ang isang gene ay nakuha na nag-encode ng isang somatotropin precursor na hindi nahati sa bacterial cell upang bumuo ng isang aktibong hormone, nagpatuloy kami sa mga sumusunod: sa unang yugto, isang double-stranded DNA na kopya ng mRNA ay na-clone at, sa pamamagitan ng digestion na may restriction endonucleases, nakuha ang isang sequence na nag-encode sa buong sequence ng amino acid ng hormone, maliban sa unang 23 amino acid. Pagkatapos ay nag-clone ng isang sintetikong polynucleotide na naaayon sa mga amino acid mula 1 hanggang 23. Susunod, ang dalawang mga fragment ay pinagsama at "nakatuon" sa isang E. coli plasmid, pagkatapos nito ang mga bacterial cell ay nagsimulang synthesize ang hormone na ito.
Noong 1980, natapos ang mga klinikal na pagsubok ng gamot at toxicity test, at sinimulan ang mga mass experiment sa mga batang malapit sa edad hanggang sa pagdadalaga. Ang mga resulta ay nakapagpapatibay, at mula noong 1982 ang synthetic growth hormone ay nagsimulang gawin sa isang pang-industriyang sukat.
Ang isa pang hormone, β-endorphin, isang 31-amino acid brain opiate, ay na-synthesize sa genetically engineered E. coli cells. Noong 1980, matagumpay na na-clone ng Australian scientist na si Shine at ng American scientists na sina Fettes, Lan, at Baxter ang DNA encoding β-endorphin sa E. ooli cells at nakuha ang polypeptide na ito bilang fusion protein na may enzyme β-galactosidase. Sa unang yugto, na-clone nila ang isang fragment ng DNA na nakuha bilang resulta ng reverse transcription ng mRNA encoding β-endorphin, at pagkatapos ay ipinasok ito sa E .coli plasmid sa likod ng β-galactosidase gene, habang kumukuha ng hybrid na protina na binubuo ng β- galactosidase at - endorphin; karagdagang, β-galactosidase ay enzymatically cleaved, pagkuha ng biologically aktibong β-endorphin.
Pagkuha ng mga interferon
Ang isa pang kahanga-hangang tagumpay ng genetic engineering ay ang synthesis ng interferon.Ang Interferon ay unang nakuha noong 1957 sa National Institute for Medical Research malapit sa London. Ito ay isang protina na inilalabas sa napakababang halaga ng mga selula ng hayop at tao kapag ang mga virus ay pumasok sa katawan at naglalayong labanan ang mga ito. Ang mga unang pag-aaral ay nagsiwalat ng mataas na biological na aktibidad ng interferon sa paggamot ng influenza, hepatitis at kahit na kanser (pinipigilan ang pagpaparami ng mga abnormal na selula).
Ang interferon, tulad ng somatotropin, ay may pagtitiyak ng mga species: ang mga interferon ng hayop ay hindi aktibo sa katawan ng tao at kahit na tinatanggihan nito.
Ang katawan ng tao ay gumagawa ng ilang uri ng interferon: leukocyte (a), fibroblast (P) at immune (y) (T-lymphocytic).
Ang mga natural na interferon ay nakuha mula sa dugo ng tao na may napakababang ani: noong 1978, sa Central Health Laboratory sa Helsinki (sa oras na iyon ang pinuno ng mundo sa paggawa ng leukocyte interferon), 0.1 g ng purong interferon ay nakuha mula sa 50 libong litro ng dugo.
Ang proseso ng pagkuha ng mga interferon ay karaniwang pareho para sa lahat ng uri ng mga selula na lumaki sa mga kultura at bumubuo ng interferon. Ang mga selula ng dugo ay nahawahan ng Sendai virus at pagkatapos ng 24 na oras ay na-filter sa isang supercentrifuge. Ang supernatant ay naglalaman ng isang krudo na paghahanda ng interferon, na sumailalim sa chromatographic purification.
Ang halaga ng gamot ay napakataas - 400 g ng interferon ay nagkakahalaga ng 2.2 bilyong dolyar. Gayunpaman, ang pangako ng paggamit nito sa parmasyutiko (kabilang ang laban sa apat na uri ng kanser) ay naging dahilan upang maghanap ng mga bagong paraan upang makuha ito, pangunahin sa tulong ng genetic engineering.
Noong Enero 1980, ang interferon ng tao ay nakuha sa genetically engineered E. coli cells. Ang unang kahirapan sa mga pamamaraang ito ay ang interferon mRNA ay mahirap makuha kahit na sa mga leukocytes na pinasigla ng impeksyon sa virus, at ang mga ani ay napakababa: 1-2 interferon molecule bawat bacterial cell ang iniulat.
Noong 1981, nagawa ng kumpanyang Genentech na magdisenyo ng recombinant DNA encoding y-interferon at ipakilala ito sa genome ng bacteria, yeast, at maging mammalian cells, at naging may kakayahang mag-synthesize ng interferon na may mataas na ani - 1 litro ng yeast cell culture na naglalaman 1 milyong yunit ng interferon (isang yunit ng interferon ay tumutugma sa ganoong halaga na nagpoprotekta sa 50% ng mga selula sa kultura mula sa impeksyon sa virus). Ang proseso ay isinagawa bilang mga sumusunod: ang mga mananaliksik ay naghiwalay ng pinaghalong mRNA molecule mula sa mga lymphocytes ng tao, nakakuha ng mga molekula ng kaukulang mga kopya ng DNA, at ipinakilala ang mga ito sa E. coli cells. Susunod, napili ang mga bakterya na gumagawa ng interferon.
Pagkuha ng mga immunogenic na paghahanda at bakuna
Ang isa pang lugar ng aplikasyon ng genetic engineering ay nauugnay sa paggawa ng mga bagong epektibo, ligtas at murang mga bakuna.Ang mga bakuna ay isa sa mga pinakamahalagang tagumpay ng medisina, at ang paggamit ng mga ito ay napakabisa rin mula sa isang pang-ekonomiyang punto ng view. Sa mga nagdaang taon, ang pagbuo ng mga bakuna ay nakatanggap ng espesyal na pansin. Ito ay dahil sa katotohanan na sa ngayon ay hindi pa posible na makakuha ng lubos na epektibong mga bakuna upang maiwasan ang maraming karaniwan o mapanganib na mga nakakahawang sakit.
Ang pagtaas ng interes sa mga bakuna ay lumitaw pagkatapos na maitatag ang papel ng mga pathogenic microorganism sa pag-unlad ng mga sakit na iyon na hindi dating itinuturing na nakakahawa. Halimbawa, gastritis, gastric at duodenal ulcers, malignant neoplasms ng atay (hepatitis B at C virus).
Samakatuwid, sa huling 10-15 taon, ang mga pamahalaan ng maraming mga bansa ay nagsimulang gumawa ng mga hakbang na naglalayong masinsinang pag-unlad at paggawa ng panimula ng mga bagong bakuna.
Ang mga bakunang ginagamit ngayon ay maaaring nahahati sa mga sumusunod na uri, depende sa mga paraan ng kanilang paghahanda:
- mga live attenuated na bakuna;
- mga inactivated na bakuna;
- mga bakuna na naglalaman ng mga purified na bahagi ng mga microorganism (protina o polysaccharides);
- mga recombinant na bakuna na naglalaman ng mga bahagi ng mga microorganism na nakuha ng genetic engineering
Ginagamit din ang teknolohiya ng recombinant DNA upang lumikha ng bagong uri ng mga live attenuated na bakuna, na nakakamit ng attenuation sa pamamagitan ng direktang mutation ng mga gene na naka-encode sa mga virulent na protina ng pathogen. Ginagamit din ang parehong teknolohiya upang makagawa ng mga live na recombinant na bakuna sa pamamagitan ng pagpasok ng mga gene na nag-encode ng mga immunogenic na protina sa mga live na non-pathogenic na virus o bacteria (vectors) na ini-inject sa mga tao.
Ang prinsipyo ng paggamit ng mga bakuna sa DNA ay ang isang molekula ng DNA na naglalaman ng mga gene na naka-encode ng mga immunogenic na protina ng isang pathogenic microorganism ay ipinapasok sa katawan ng pasyente. Ang mga bakuna sa DNA ay tinatawag na gene o genetic.
Upang makakuha ng mga bakuna sa DNA, isang gene na naka-encode sa paggawa ng isang immunogenic na protina ng isang microorganism ay ipinasok sa isang bacterial plasmid. Bilang karagdagan sa gene na nag-encode sa pagbabakuna ng protina, ang mga genetic na elemento ay ipinasok sa plasmid na kinakailangan para sa pagpapahayag ("pagbukas") ng gene na ito sa mga eukaryotic na selula, kabilang ang mga tao, upang matiyak ang synthesis ng protina. Ang ganitong plasmid ay ipinakilala sa isang kultura ng mga bacterial cell upang makakuha ng isang malaking bilang ng mga kopya.
Pagkatapos ang plasmid DNA ay ihiwalay mula sa bakterya, pinadalisay mula sa iba pang mga molekula ng DNA at mga dumi. Ang purified DNA molecule ay nagsisilbing bakuna. Ang pagpapakilala ng isang bakuna sa DNA ay nagsisiguro sa synthesis ng mga dayuhang protina ng mga selula ng nabakunahang organismo, na humahantong sa kasunod na pag-unlad ng kaligtasan sa sakit laban sa kaukulang pathogen. Kasabay nito, ang mga plasmid na naglalaman ng kaukulang gene ay hindi sumasama sa DNA ng mga chromosome ng tao.
Ang mga bakuna sa DNA ay nag-aalok ng ilang mga pakinabang kaysa sa mga karaniwang bakuna:
- mag-ambag sa paggawa ng mga antibodies sa katutubong molekula ng mga viral protein;
- mag-ambag sa paggawa ng cytotoxic T-lymphocytes;
- maaaring piliing makaapekto sa iba't ibang subpopulasyon ng T-lymphocytes;
- mag-ambag sa pagbuo ng pangmatagalang kaligtasan sa sakit;
- alisin ang panganib ng impeksyon.
L.V. Timoshchenko, M.V. Chubik
Ang interferon ay isa sa mga mahalagang proteksiyon na protina ng immune system. Natuklasan ito kapag pinag-aaralan ang interference ng mga virus, ibig sabihin, ang phenomenon kapag ang mga hayop o cell culture na nahawaan ng isang virus ay naging insensitive sa impeksyon ng isa pang virus. Ito ay lumabas na ang pagkagambala ay dahil sa nagresultang protina, na may proteksiyon na antiviral property. Ang protina na ito ay pinangalanang interferon.
Ang Interferon ay isang pamilya ng mga glycoprotein na protina na na-synthesize ng mga selula ng immune system at connective tissue. Depende sa kung aling mga cell ang nag-synthesize ng interferon, mayroong tatlong uri: α, β at γ-interferon.
Ang alpha-interferon ay ginawa ng mga leukocytes at ito ay tinatawag na leukocyte; Ang beta-interferon ay tinatawag na fibroblastic, dahil ito ay synthesize ng fibroblasts - connective tissue cells, at ang gamma-interferon ay tinatawag na immune, dahil ito ay ginawa ng activated T-lymphocytes, macrophage, natural killers, i.e., immune cells.
Ang interferon ay patuloy na na-synthesize sa katawan, at ang konsentrasyon nito sa dugo ay pinananatili sa humigit-kumulang 2 IU / ml (1 internasyonal na yunit - ME ay ang halaga ng interferon na nagpoprotekta sa kultura ng cell mula sa 1 CPD50 ng virus). Ang produksyon ng interferon ay tumataas nang husto kapag nahawaan ng mga virus, gayundin kapag nalantad sa mga interferon inducers, tulad ng RNA, DNA, mga kumplikadong polimer. Ang ganitong mga interferon inducers ay tinatawag na interferonogens.
Bilang karagdagan sa antiviral effect, ang interferon ay may proteksyon sa antitumor, dahil inaantala nito ang paglaganap (pagpaparami) ng mga selula ng tumor, pati na rin ang aktibidad ng immunomodulatory, pagpapasigla ng phagocytosis, natural na mga pumatay, pag-regulate ng pagbuo ng antibody ng mga selulang B, pag-activate ng pagpapahayag ng pangunahing histocompatibility. kumplikado.
Ang mekanismo ng pagkilos ng interferon ay kumplikado. Ang interferon ay hindi direktang kumikilos sa virus sa labas ng cell, ngunit nagbubuklod sa mga espesyal na receptor ng cell at nakakaapekto sa proseso ng pagpaparami ng virus sa loob ng cell sa yugto ng synthesis ng protina.
Ang paggamit ng interferon. Ang pagkilos ng interferon ay mas epektibo, mas maaga itong nagsisimulang ma-synthesize o pumasok sa katawan mula sa labas. Samakatuwid, ito ay ginagamit para sa prophylactic na layunin sa maraming mga impeksyon sa viral, tulad ng trangkaso, pati na rin para sa mga layuning panterapeutika sa mga talamak na impeksyon sa viral, tulad ng parenteral hepatitis (B, C, D), herpes, multiple sclerosis, atbp. Interferon ay nagbibigay ng positibo nagreresulta sa paggamot ng mga malignant na tumor at mga sakit na nauugnay sa immunodeficiencies.
Ang mga interferon ay partikular sa mga species, ibig sabihin, ang interferon ng tao ay hindi gaanong epektibo para sa mga hayop at vice versa. Gayunpaman, ang pagtitiyak ng species na ito ay kamag-anak.
pagtanggap ng interferon. Ang interferon ay nakuha sa dalawang paraan: a) sa pamamagitan ng pag-infect ng mga leukocytes o lymphocytes ng tao na may ligtas na virus, bilang isang resulta kung saan ang mga nahawaang selula ay nag-synthesize ng interferon, na pagkatapos ay nakahiwalay at ang mga paghahanda ng interferon ay itinayo mula dito; b) sa pamamagitan ng genetic engineering - sa pamamagitan ng paglaki sa ilalim ng mga kondisyong pang-industriya recombinant bacterial strains na may kakayahang gumawa ng interferon. Karaniwan, ginagamit ang mga recombinant strain ng Pseudomonas, Escherichia coli na may mga interferon gene na naka-embed sa kanilang DNA. Ang interferon na nakuha sa pamamagitan ng genetic engineering ay tinatawag na recombinant. Sa ating bansa, ang recombinant interferon ay nakatanggap ng opisyal na pangalan na "Reaferon". Ang produksyon ng gamot na ito ay mas mahusay at mas mura kaysa sa leukocyte na gamot.
Ang recombinant interferon ay natagpuan ng malawak na aplikasyon sa medisina bilang isang prophylactic at therapeutic agent para sa mga impeksyon sa viral, neoplasms, at immunodeficiencies.
23. Mga kadahilanan ng tiyak na kaligtasan sa sakit sa mga sakit na viral. Ang papel ng cellular immunity sa pagprotekta sa katawan mula sa virus
Ang partikular na immune system ay may sariling sentral (bone marrow, thymus, bursa ng Fabricius sa mga ibon, atay sa mammal) at mga peripheral na organo (spleen, lymph nodes, lymphoid tissues ng gastrointestinal tract, pati na rin ang dugo at lymph, kung saan sila pumasok at patuloy na umiikot ang lahat ng immunocompetent cells).
Ang organ ng immunity ay lymphoid tissue, at ang mga pangunahing tagapagpatupad nito ay mga macrophage (pati na rin ang iba pang mga antigen-presenting cells), iba't ibang populasyon at subpopulasyon ng T- at B-lymphocytes.
Ang pangunahing target ng immune system ay mga antigens, ang karamihan sa mga ito ay isang likas na protina.
Ang mga lymphocyte ay kinakatawan ng dalawang malalaking populasyon - B - at T-cells, na responsable para sa tiyak na pagkilala ng mga antigens. Ang pagkakaroon ng bumangon mula sa isang karaniwang pinagmulan, ang tinatawag na stem cell, at sumailalim sa naaangkop na pagkakaiba-iba sa mga sentral na organo ng immune system, ang T- at B-lymphocytes ay nakakakuha ng immunocompetence, pumapasok sa daluyan ng dugo at patuloy na nagpapalipat-lipat sa buong katawan, na kumikilos bilang nito. epektibong tagapagtanggol.
Nagbibigay ang T-lymphocytes ng cellular na uri ng immune response, at ang B-lymphocytes ay nagbibigay ng humoral na uri ng immune response.
Ang pagkita ng kaibhan ng T lymphocyte progenitors sa immunocompetent cells ("pag-aaral") ay nangyayari sa thymus sa ilalim ng impluwensya ng humoral factor na itinago ng thymus; pagkahinog ng B-lymphocytes - sa mga ibon sa bursa, sa mga mammal, una sa fetal liver, at pagkatapos ng kapanganakan sa bone marrow.
Ang mga mature na B- at T-lymphocytes ay nakakakuha ng kakayahang makilala ang mga dayuhang antigens. Iniiwan nila ang bone marrow at thymus at kino-colonize ang spleen, lymph nodes, at iba pang koleksyon ng mga lymph cell. Ang karamihan ng T- at B-lymphocytes ay umiikot sa dugo at lymph. Tinitiyak ng patuloy na sirkulasyon na ito na ang pinakamaraming nauugnay na lymphocyte hangga't maaari ay nakikipag-ugnayan sa antigen (virus).
Ang bawat B cell ay genetically programmed upang makagawa ng mga antibodies sa isang partikular na antigen. Sa pagharap at pagkilala sa antigen na ito, ang mga selulang B ay dumarami at naiba sa mga aktibong selula ng plasma na naglalabas ng mga antibodies sa antigen na ito. Ang iba pang bahagi ng B-lymphocytes, na lumipas sa 2-3 cycle ng paghahati, ay nagiging mga memory cell na walang kakayahang gumawa ng mga antibodies. Maaari silang mabuhay ng maraming buwan at kahit na mga taon nang hindi naghahati, na nagpapalipat-lipat sa pagitan ng dugo at pangalawang lymphoid organ. Mabilis nilang nakikilala ang antigen kapag ito ay pumasok muli sa katawan, pagkatapos nito ang mga selula ng memorya ay nakakuha ng kakayahang hatiin at maging mga selula ng plasma - nagtatago ng mga antibodies.
Sa parehong paraan, ang mga cell ng memorya ay nabuo mula sa T-lymphocytes. Ito ay matatawag na "reserba" ng mga immunocompetent na selula.
Tinutukoy ng mga cell ng memorya ang tagal ng nakuha na kaligtasan sa sakit. Sa paulit-ulit na pakikipag-ugnay sa antigen na ito, mabilis silang nagiging mga effector cell. Kasabay nito, ang mga cell ng memory B ay nagbibigay ng synthesis ng mga antibodies sa mas maikling panahon, sa mas malaking dami at higit sa lahat IgG. Ito ay itinatag na may mga T-helper na tumutukoy sa paglipat ng mga klase ng immunoglobulin.
Mayroong dalawang mga opsyon para sa pagpapalabas ng immune response sa anyo ng antibody biosynthesis:
pangunahing tugon - pagkatapos ng unang pagpupulong ng katawan na may anti - 1 pagtulog;
pangalawang tugon - sa paulit-ulit na pakikipag-ugnay sa antigen, pagkatapos ng 2-3 linggo.
Nag-iiba sila sa mga sumusunod na tagapagpahiwatig: ang tagal ng latent period; ang rate ng pagtaas sa antibody titer, ang kabuuang halaga ng synthesized antibodies; ang pagkakasunud-sunod ng synthesis ng mga immunoglobulin ng iba't ibang klase. Ang mga mekanismo ng cellular ng pangunahin at pangalawang immune response ay magkakaiba din.
Sa panahon ng pangunahing immune response, ang mga sumusunod ay nabanggit: ang biosynthesis ng mga antibodies pagkatapos ng latent period ay tumatagal ng 3-3 araw; ang rate ng synthesis ng antibody ay medyo mababa; ang titer ng antibody ay hindi umabot sa pinakamataas na halaga; IgM ay synthesize muna, pagkatapos ay IgG, at mamaya IgA at IgE. Ang pangalawang tugon ng immune ay nailalarawan sa pamamagitan ng: nakatagong panahon - sa loob ng ilang oras; ang rate ng synthesis ng antibody ay logarithmic; ang titer ng antibody ay umabot sa pinakamataas na halaga; Ang IgG ay na-synthesize kaagad.
Ang pangalawang tugon ng immune ay pinapamagitan ng mga selula ng immune memory.
Ang mga selulang T ay may ilang mga populasyon na may iba't ibang mga pag-andar. Ang ilan ay nakikipag-ugnayan sa mga selulang B, na tumutulong sa kanila na dumami, maging mature at bumuo ng mga antibodies, at i-activate din ang mga macrophage - helper T cells (Tx); pinipigilan ng iba ang mga tugon ng immune - mga suppressor T cells (Tc); ang ikatlong populasyon ng mga T-cell ay nagsasagawa ng pagkasira ng mga selula ng katawan na nahawaan ng mga virus o iba pang mga ahente. Ang ganitong uri ng aktibidad ay tinatawag na cytotoxicity, at ang mga cell mismo ay tinatawag na cytotoxic T-cells (Tc) o T-killers (TK).
Dahil ang mga helper T cells at suppressor T cells ay kumikilos bilang mga regulator ng immune response, ang dalawang uri ng T lymphocytes na ito ay tinutukoy bilang regulator T cells.
Ang mga macrophage ay isang mahalagang salik sa antiviral immunity. Hindi lamang nila sinisira ang mga dayuhang antigen, ngunit nagbibigay din ng mga antigenic determinants upang maglunsad ng isang chain ng immune reactions (kasalukuyan). Ang mga antigen na hinihigop ng mga macrophage ay nahahati sa mga maikling fragment (antigenic determinants), na nagbubuklod sa mga molekula ng mga protina ng pangunahing histocompatibility complex (MCHC I, II) at dinadala sa ibabaw ng macrophage, kung saan kinikilala sila ng T-lymphocytes. (Tx, Tk) at B-lymphocytes, na humahantong sa kanilang pag-activate at pagpaparami.
Ang mga T-helper, na isinaaktibo, ay nag-synthesize ng mga kadahilanan (mga tagapamagitan) upang pasiglahin ang B- at T-lymphocytes. Ang mga aktibong T-killer ay dumarami at ang isang pool ng mga cytotoxic T-lymphocytes ay nabuo, na may kakayahang tiyakin ang pagkamatay ng mga target na cell, ibig sabihin, ang mga cell na nahawaan ng virus.
Ang pangunahing pag-aari ng lahat ng mga killer cell ay na sa ilalim ng kanilang impluwensya, ang mga mekanismo ng aloptosis (programmed cell death) ay na-trigger din sa target na cell. Ang cell lysis ay nangyayari pagkatapos ng killer detachment, na nagpapahintulot sa isang mamamatay na manguna sa maraming target na cell. Ang mga perforin at granzymes na itinago ng mga lymphocytes ay kasangkot sa proseso ng lysis. Ang Perforin, na sumasama sa lamad ng cell, ay bumubuo ng isang channel sa loob nito, kung saan ang pod ay tumagos sa cell. Ang cell ay namamaga at nagli-lyses. Ito ay pinaniniwalaan na ang mga granzymes ay nagdudulot ng induction ng apoptosis.
Ang mga activated B-lymphocytes ay dumarami at naiba-iba sa mga selula ng plasma na nagsi-synthesize at nagtatago ng mga antibodies ng naaangkop na klase (IgM, IgG, IgA, IgD, IgE).
Ang pinagsama-samang pakikipag-ugnayan ng mga macrophage, T- at B-lymphocytes kapag nakatagpo ng isang antigen ay nagbibigay ng parehong humoral at isang cellular immune response. Ang lahat ng mga anyo ng immune response ay nangangailangan ng isang coordinated na pakikipag-ugnayan ng mga pangunahing kadahilanan ng immune system: macrophage, T-, B-lymphocytes, NK-cells, ang interferon system, pandagdag, ang pangunahing histocompatibility system. Ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga ito ay isinasagawa sa tulong ng iba't ibang mga synthesized at secreted mediator.
Ang mga tagapamagitan na ginawa ng mga selula ng immune system at kasangkot sa regulasyon ng aktibidad nito ay nakatanggap ng pangkalahatang pangalan ng mga cytokine (mula sa Greek cytos - cell at kineo - set in motion). Ang mga ito ay nahahati sa mga monokine - mga tagapamagitan na ginawa ng mga monocytes at macrophage; lymphokines - mga tagapamagitan na itinago ng mga aktibong lymphocytes; mga lymphokines na kinikilala sa kemikal at nakuha sa purong anyo. Noong 1979, iminungkahi na tawagan silang mga interleukin. Ang mga ito ay itinalaga ng mga numero - 1, 2, 3, 4, 5, atbp. Ang pamilya ng mga interleukin ay napunan ng mga bagong kinatawan na nagsasagawa ng mutual na regulasyon ng immune, nervous at endocrine system. Ang lahat ng mga immunocompetent na mga cell ay nagdadala ng mga natatanging receptor sa kanilang mga lamad, sa tulong kung saan nakikilala at nakikita nila ang mga signal mula sa iba pang mga immune cell, muling itayo ang kanilang metabolismo, synthesize o inaalis ang kanilang sariling mga receptor. Dahil dito, ang lahat ng mga selula ng immune system ay gumagana bilang isang mahusay na gumaganang sistema.
24. Viral proteins, ang kanilang papel sa serodiagnosis. mga tiyak na antibodies. Pagkilala sa mga immunoglobulin.
Mga protina ng virus
Lokalisasyon ng mga protina ng viral
Ang mga protina na nauugnay sa ikot ng buhay ng virus ay nahahati sa mga protina na tinutukoy ng viral genome at mga protina ng cellular na pinagmulan. Bilang halimbawa ng mga cellular protein na matatagpuan sa komposisyon ng ilang virion, maaaring magbigay ng cytoskeletal protein - actin, at nuclear protein - histones. Ang mga protina ng cellular na pinagmulan na kasangkot sa proseso ng pagtitiklop ng virus ay tatalakayin sa seksyon sa pakikipag-ugnayan ng virus-cell.
Ayon sa lugar ng lokalisasyon, ang mga protina na tinutukoy ng viral genome ay nahahati sa dalawang grupo:
1) mga istrukturang protina- ito ay mga protina na bumubuo sa HF, sila ay itinalaga bilang VP;
2) mga non-structural na protina- ito ang mga pasimula ng structural proteins, regulatory proteins at enzymes na nagsisilbi sa proseso ng intracellular reproduction ng virus at hindi bahagi ng HF. Ang mga ito ay tinutukoy bilang mga protina ng NS (scheme).
Mga katangian ng mga viral protein
Ang komposisyon ng mga virion ay kinabibilangan ng mga protina na may iba't ibang molekular na timbang (mula 4 hanggang 100 kD), na binubuo ng isa o higit pang polypeptide chain. Ang dami ng mga protina na ito ay nag-iiba din sa bawat virus. Ang TMV nucleocapsid ay naglalaman ng isang protina. Sa iba pang mga virus, ang virion ay maaaring maglaman ng ilang dosenang protina na may iba't ibang katangian ng physicochemical. Ang mga protina na bumubuo sa capsid, nucleocapsid, at core shell ay may isang karaniwang katangian - ang kakayahang mag-ipon ng sarili.
Ang komposisyon ng HF ay maaaring magsama ng mababang molekular na timbang na mga protina na hindi kasangkot sa pagbuo ng capsid. Halimbawa, genomic na protina picornavirus at adenovirus. Ang genomic na protina ay covalently na naka-link sa nucleic acid at nakikilahok sa pagtitiklop nito.
Lokalisasyon ng mga protina ng viral
Ang mga kumplikadong protina ay kinakatawan glycoproteins(tinutukoy bilang gp) at lipoprotein. Tinutukoy ng presensya ng isang glycoprotein ang pagkakaroon ng bahagi ng carbohydrate sa virion, na maaaring katawanin ng mannose-type na oligosaccharides, galactose, N-acetylglucosamine, o neuraminic acid. Ang mga Viral glycoproteins, bilang panuntunan, ay nakalantad sa panlabas na ibabaw ng HF at nagsasagawa ng tatlong pangunahing pag-andar: tinitiyak nila ang pagbubuklod ng virion sa cell receptor (ang pag-andar ng attachment protein), may aktibidad ng pagsasanib (tiyakin ang pagsasanib ng lamad) , at tukuyin ang mga antigenic na katangian ng mga virus. Kasabay nito, ang mga viral glycoprotein ay maaari ding maging mga non-structural na protina at, na natitira sa isang mahalagang anyo sa lamad ng magaspang na endoplasmic reticulum (RER), ay gumaganap ng mga pag-andar ng mga translocase, na tinitiyak ang transportasyon ng mga sangkap na viral sa lumen nito.
Viral lipoprotein ay kinakatawan ng mga protina na acylated, bilang panuntunan, na may myristic acid. Ang mga fatty acid residues na nakakabit sa molekula ng protina ay kumikilos bilang isang lipophilic anchor.
Viral mga protina ng enzyme maaaring bahagi ng viral particle o mga non-structural na protina at lumilitaw sa cell pagkatapos ng pagpapahayag ng viral genome. Ang pinaka-enzymatically equipped ay ang variola virus virion, na mayroong halos kumpletong hanay ng mga enzyme na kailangan para sa independiyenteng intracellular replication ng virus. Kasabay nito, ang maliliit, simpleng organisadong isometric na mga virus na may positibong RNA genome ay maaaring walang anumang enzyme sa virion.
Ang mga aktibong aktibong protina ng mga virus ay pangunahing kinakatawan ng nucleic acid metabolism enzymes na nagbibigay ng mga kumplikadong mekanismo para sa pagtitiklop/transkripsyon ng viral genome; mga enzyme na nagsasagawa ng post-translational na pagproseso at pagbabago ng mga protina, at mga enzyme na kasangkot sa pagtagos ng mga virion sa host cell.
Ang unang pangkat ng mga enzyme ay ang pinakamarami at kabilang ang parehong mga analogue ng mga cellular enzyme at mga enzyme na partikular sa virus.
DNA na umaasa sa DNA polymerase - nagsasagawa ng DNA synthesis sa isang DNA matrix (smallpox virus).
DNA dependent RNA polymerase - nagsasagawa ng synthesis ng mRNA sa DNA matrix (smallpox virus).
RNA na umaasa sa RNA polymerase - nagsasagawa ng synthesis ng RNA sa RNA matrix. Nagsasagawa ng mga function ng transcriptase at replicase. Unang natuklasan noong 1970 ni Baltimore sa vesicular stomatitis virus. Ito ay bahagi ng mga virion o ang NS protein ng mga RNA virus.
Reverse transcriptase o revertase o RNA-dependent DNA polymerase
gumaganap ng DNA synthesis sa isang RNA template. Unang natuklasan noong 1970 sa mga retrovirus nina Temin at Mizutani.
helicase- nagsasagawa ng pag-unwinding ng double-stranded na istraktura ng DNA. Bilang karagdagan, ang mga helicase ay may nucleotide triphosphate-dependent RNA helicase activity, na kinabibilangan ng tatlong proseso: pagbubuklod ng deoxynucleotide triphosphate, hydrolysis nito, at, dahil sa enerhiya na ito, ang pag-unwinding ng double-stranded RNA.
Mga enzyme na nagpapabago ng mRNA : poly-A-polymerase - adenylates ang 3 "dulo ng RNA dahil sa enerhiya ng ATP; Cap enzyme at methyl transferase complex - catalyzes ang pagbuo ng isang cap structure sa 5" dulo.
ATP-ase, GTP-ase - isagawa ang hydrolysis ng kaukulang mga substrate ng enerhiya.
Ribonuclease H - sinisira ang RNA, na nasa duplex na may DNA. Ang pangalawang pangkat ng mga viral enzyme ay mga enzyme ng metabolismo ng protina.
Narito ipinakita namin ang ilan lamang sa mga ito:
Mga protina - mga enzyme na kasangkot sa post-translational processing ng polyproteins. Ang mga ito ay mga protina ng NS ng mga virus ng RNA;
Mga kinase ng protina - mga enzyme na nag-phosphorylate ng mga istrukturang protina ng mga virion. Natagpuan sa komposisyon ng vesicular stomatitis virus, rabies virus, alphaviruses at retroviruses.
Ang mga halimbawa ng mga enzyme na kasangkot sa pagpasok ng mga virus sa mga cell ay lysozyme bacteriophage at neuraminidase flu virus.
Sa proseso ng pagbuo ng nakuha na nakakahawang kaligtasan sa sakit, isang mahalagang papel ang nabibilang sa mga antibodies (anti - laban, katawan - isang salitang Ruso, i.e. sangkap). At kahit na ang isang dayuhang antigen ay naharang ng mga tiyak na selula ng katawan at sumasailalim sa phagocytosis, ang isang aktibong epekto sa antigen ay posible lamang sa pagkakaroon ng mga antibodies.
Ang mga antibodies ay mga tiyak na protina, mga immunoglobulin na nabuo sa katawan sa ilalim ng impluwensya ng isang antigen at may kakayahang partikular na magbigkis dito at naiiba sa mga ordinaryong globulin sa pagkakaroon ng isang aktibong sentro.
Ang mga antibodies ay isang mahalagang tiyak na salik sa depensa ng katawan laban sa mga pathogens at mga genetically alien substance at cell.
Ang mga antibodies ay nabubuo sa katawan bilang resulta ng impeksyon (natural na pagbabakuna), o pagbabakuna sa mga pinatay at nabubuhay na bakuna (artificial immunization), o pakikipag-ugnayan ng lymphoid system sa mga dayuhang selula, mga tisyu (grafts) o sa sariling mga nasirang selula na naging autoantigens.
Ang mga antibodies ay tumutukoy sa isang partikular na bahagi ng isang protina, pangunahin sa mga a-globulin, na tinutukoy bilang IgY.
Ang mga antibodies ay nahahati sa mga pangkat:
- ang una - maliliit na molekula na may pare-parehong sedimentation na 7S (a-globulins);
- ang pangalawa - malalaking molekula na may pare-parehong sedimentation na 19 S (a - globulins).
 |
Ang molekula ng antibody ay binubuo ng apat na polypeptide chain na binubuo ng mga amino acid. Dalawa sa kanila ay mabigat (mm 70,000 daltons) at dalawa ay magaan (mm 20,000 daltons). Ang magaan at mabibigat na kadena ay pinag-uugnay ng mga tulay na disulfide. Ang mga light chain ay karaniwan sa lahat ng klase at subclass. Ang mga mabibigat na kadena ay may mga katangiang katangian ng istruktura para sa bawat klase ng mga immunoglobulin.
Ang molekula ng antibody ay may mga aktibong sentro na matatagpuan sa mga dulo ng mga polypeptide chain at partikular na tumutugon sa antigen. Ang mga hindi kumpletong antibodies ay monovalent (isang antideterminant), kumpleto ay may dalawa, mas madalas na mas antideterminant.
Ang pagkakaiba sa pagitan ng mga tiyak na immunoglobulin sa istraktura ng mabibigat na kadena, sa spatial na pattern ng mga antideterminants. Ayon sa klasipikasyon ng World Health Organization (WHO), mayroong limang klase ng mga pangunahing immunoglobulin: Ang IgG ay umiikot sa dugo, bumubuo ng 80% ng lahat ng antibodies. Dumaan sa inunan. Molekular na timbang 160000. Sukat 235 x 40A o . Mahalaga bilang isang tiyak na kadahilanan ng kaligtasan sa sakit. I-neutralize ang antigen sa pamamagitan ng corpuscularization nito (precipitation, precipitation, agglutination), na nagpapadali sa phagocytosis, lysis, neutralization. Mag-ambag sa paglitaw ng mga reaksiyong alerhiya ng isang naantalang uri. Kung ikukumpara sa iba pang mga immunoglobulin, ang IgG ay medyo thermostable - maaari itong makatiis sa pag-init sa 75 o C sa loob ng 30 minuto.
Ig M - umiikot sa dugo, na bumubuo ng 5-10% ng lahat ng antibodies. Molecular weight 950000, sedimentation constant 19 S, functionally pentavalent, unang lumilitaw pagkatapos ng impeksyon o pagbabakuna ng hayop. Ang Ig M ay hindi kasangkot sa mga reaksiyong alerdyi at hindi tumatawid sa inunan. Ito ay kumikilos sa gram-positive bacteria, pinapagana ang phagocytosis. Kasama sa klase ng Ig M ang mga antibodies ng mga pangkat ng dugo ng tao - A, B, O.
Ig A, - may kasamang dalawang uri: serum at secretory. Ang Serum Ig A ay may molecular weight na 170,000, isang sedimentation constant na 7 S. Wala itong kakayahang mag-precipitate ng mga natutunaw na antigens, nakikilahok sa neutralisasyon ng mga lason, ay thermostable, ay na-synthesize sa spleen, lymph nodes at mucous membranes at pumapasok sa mga pagtatago - laway, lacrimal fluid, bronchial secret, colostrum.
Secretory Ig A (S Ig A) ay nailalarawan sa pamamagitan ng pagkakaroon ng isang structural additive component, ay isang polimer, sedimentation pare-pareho 11 S at 15 S, molekular timbang 380,000, synthesized sa mauhog lamad. Ang biological function ng S Ig A ay pangunahin sa lokal na proteksyon ng mga mucous membrane, halimbawa, sa mga sakit ng gastrointestinal tract o respiratory tract. Mayroon silang bactericidal at opsonic effect.
Ig D, - konsentrasyon ng serum na hindi hihigit sa 1%, molekular na timbang 160,000, sedimentation pare-pareho 7 S. Ang Ig D ay may aktibong aktibidad, hindi nagbubuklod sa mga tisyu. Napansin ang pagtaas ng nilalaman nito sa myeloma ng tao.
Ig E, - molekular timbang 190000, sedimentation pare-pareho 8.5 S. Ig E ay thermolabile, malakas na binds sa tissue cell, tissue basophils, tumatagal ng bahagi sa isang agarang hypersensitivity reaksyon. Ang Ig E ay gumaganap ng isang proteksiyon na papel sa mga helminthiases at protozoal na sakit, pinahuhusay ang phagocytic na aktibidad ng macrophage at eosinophils.
Ang mga antibodies ay labil sa temperatura na 70 0 C, at ang mga alkohol ay nagde-denature sa kanila. Ang aktibidad ng antibody ay nababagabag kapag ang pH ng medium, electrolytes, atbp ay nagbabago (nakapatay).
Ang lahat ng antibodies ay may aktibong sentro - isang plot area na 700 A o na 2% ng ibabaw ng antibody. Ang aktibong sentro ay binubuo ng 10-20 amino acids. Kadalasan ay naglalaman sila ng tyrosine, lysine, tryptophan. Upang positibong naka-charge ang haptens, ang mga antibodies ay may negatibong sisingilin na grupo - COOH -. Ang mga hapten na may negatibong charge ay kasama ng grupong NH 4 +.
Ang mga antibodies ay may kakayahang makilala ang isang antigen mula sa isa pa. Nakikipag-ugnayan lamang sila sa mga antigen na iyon (na may mga bihirang eksepsiyon) kung saan sila ay binuo at lumalapit sa kanila sa mga tuntunin ng spatial na istraktura. Ang kakayahang ito ng isang antibody ay tinatawag na complementarity.
Ang pagtitiyak ng isang antibody ay tinutukoy ng istrukturang kemikal, ang spatial na pattern ng mga antideterminant. Ito ay nauugnay sa pangunahing istraktura (paghahalili ng mga amino acid) ng molekula ng protina ng antibody.
Tinutukoy ng mabibigat at magaan na kadena ng mga immunoglobulin ang pagtitiyak ng aktibong site.
Kamakailan ay natuklasan na mayroong mga antibodies laban sa mga antibodies. Pinipigilan nila ang pagkilos ng mga maginoo na antibodies. Batay sa pagtuklas na ito, lumitaw ang isang bagong teorya - regulasyon ng network ng immune system ng katawan.
Ang teorya ng pagbuo ng antibody ay nakakaapekto sa isang bilang ng mga isyu mula sa iba't ibang mga kaugnay na disiplina (genetics, biochemistry, morphology, cytology, molecular biology) na kasalukuyang nakikipag-ugnayan sa immunology. Mayroong ilang mga hypotheses para sa synthesis ng mga antibodies. Nakatanggap ng pinakamalaking pagkilala ang clonal selection hypothesis ni F. Burnet. Ayon dito, mayroong higit sa 10,000 mga clone ng lymphoid at immunologically competent na mga selula sa katawan, na may kakayahang tumugon sa iba't ibang antigens o kanilang mga determinant at makagawa ng mga antibodies. Ipinapalagay na ang mga clone ng naturang mga cell ay maaaring tumugon sa kanilang sariling mga protina, bilang isang resulta kung saan sila ay nawasak. Ito ay kung paano namamatay ang mga cell na bumubuo ng mga anti-aglutinin laban sa A - antigen sa mga organismo na may blood type A at anti-B - agglutinin na may blood type B.
Kung ang isang antigen ay ipinakilala sa embryo, pagkatapos ay sa katulad na paraan sinisira nito ang kaukulang clone ng mga selula, at ang bagong panganak ay magiging mapagparaya sa antigen na ito sa buong kanyang kasunod na buhay. Ngayon ang bagong panganak ay mayroon lamang "kanyang sarili", o "banyaga" na nagmula sa labas, na kinikilala ng mga mesenchymal na selula, sa ibabaw kung saan mayroong kaukulang mga "bandila" na mga receptor - mga antideterminants. Ayon kay F. Burnet, ang isang mesenchymal cell na nakatanggap ng antigenic irritation ay nagdudulot ng populasyon ng mga daughter cell na gumagawa ng mga tiyak (naaayon sa antigen) na mga antibodies. Ang pagtitiyak ng mga antibodies ay nakasalalay sa antas ng kanilang pakikipag-ugnayan sa antigen.
Ang mga puwersa ng Coulomb at mga kaakit-akit na puwersa ng van der Waals, mga puwersa ng polar at London, ang mga interatomic covalent bond na lumabas sa pagitan ng mga ionic na grupo ay lumahok sa pagbuo ng antigen-antibody complex.
Ito ay kilala na sila ay nakikipag-ugnayan bilang buong molekula. Samakatuwid, ang isang molekula ng antigen ay nagkakaroon ng malaking bilang ng mga molekula ng antibody. Lumilikha sila ng isang layer hanggang sa 30 A o makapal. Ang antigen-antibody complex ay mapaghihiwalay habang pinapanatili ang orihinal na katangian ng mga molekula. Ang unang yugto ng koneksyon ng antibody sa antigen ay hindi tiyak, hindi nakikita, na nailalarawan sa pamamagitan ng pagsipsip ng antibody sa ibabaw ng antigen o hapten. Ito ay dumadaloy sa temperatura na 37 o C sa loob ng ilang minuto. Ang ikalawang yugto ay tiyak, nakikita, nagtatapos sa hindi pangkaraniwang bagay ng agglutination, precipitation o lysis. Ang yugtong ito ay nangangailangan ng pagkakaroon ng mga electrolyte at, sa ilang mga kaso, pandagdag.
Sa kabila ng reversibility ng proseso, ang kumplikado sa pagitan ng antigen at antibody ay gumaganap ng isang positibong papel sa proteksyon ng katawan, na nabawasan sa opsonization, neutralization, immobilization, at pinabilis na pag-aalis ng mga antigens.
Sa pamamagitan ng likas na katangian ng epekto sa antigen, ang mga antibodies ay nakikilala:
- coagulating (precipitin, agglutinins), mapadali ang phagocytosis;
- lysing (complement-fixing: bacteriolysis, cytolysis, hemolysis), sanhi ng paglusaw ng antigen;
- neutralizing (antitoxins), alisin ang antigen ng toxicity.
Ang reaksyon ng antigen-antibody ay maaaring maging kapaki-pakinabang, nakakapinsala o walang malasakit para sa organismo. Ang positibong epekto ng reaksyon ay ang pag-neutralize ng mga lason, bakterya, pinapadali ang phagocytosis, namuo ang mga protina, inaalis ang mga ito ng toxicity, lyses treponema, leptospira, mga selula ng hayop.
Ang antigen-antibody complex ay maaaring magdulot ng lagnat, cell permeability disorder, pagkalasing Hemolysis, anaphylactic shock, urticaria, hay fever, hika, autoimmune disorder, pagtanggi sa transplant, maaaring mangyari ang mga reaksiyong alerdyi
Ang immune system ay walang mga nakahandang istruktura na gumagawa ng mga antibodies at nagsasagawa ng mga immune reaction. Ang mga antibodies ay nabuo sa panahon ng immunogenesis.