Metode relaksacije zasnivaju se na principu da uz brzi vanjski utjecaj na sistem (promjena temperature, tlaka, itd.), vrijeme koje je sistemu potrebno da postigne novu ravnotežu (ili stacionarno stanje) zavisi od brzine hemikalije. reakcija (a ponekad i na brzinu difuzije reagensa .
Razmotrimo najjednostavniju reakciju kompleksiranja aktivnog centra enzima s ligandom
Na početku je sistem u ravnoteži, koju karakteriše konstanta ravnoteže K 0 =K(T 0) i, shodno tome, ravnotežne koncentracije 
,
,
. Pretpostavimo da se temperatura u sistemu naglo mijenja T->T 0 +T. To dovodi do promjene konstante ravnoteže K->K 0 +K, što je određeno relacijom
(2.50)
gdje je H– standardna promjena entalpije. Nakon toga, sistem prelazi u novo ravnotežno stanje:
(2.51)
(2.52)
Jednačina (2.51) je nelinearna. Pretpostavimo da je odstupanje od ravnoteže malo i tada
a jednadžba (2.51) se transformira u linearnu diferencijalnu jednačinu:
Rješenje ove diferencijalne jednadžbe je:
Magnituda
(2.54)
zove se vrijeme opuštanja.
2.5. Utjecaj temperature i pH na brzinu enzimskih reakcija
Uticaj ovih faktora na brzinu elementarne hemijske reakcije razmatran je u prvom poglavlju. Posebnost je da su enzimske reakcije složene višestepene reakcije (sastoje se od mnogo elementarnih reakcija). Osim toga, stanje molekula enzima u otopini karakterizira skup konformera koji se reverzibilno transformiraju jedan u drugi. Konformacijski prijelazi molekula su u velikoj mjeri određeni temperaturom i pH otopine.
2.6. Inhibicija enzimskih reakcija
Tvari koje inhibiraju katalitičku aktivnost enzima nazivaju se inhibitori . Postoje dvije glavne klase inhibitora - reverzibilan
(2.55)
(pesticidi, sarin, soman, aspirin, itd.)
I nepovratan (inaktivatori )
(2.55)
(ugljični monoksid, jon cijanida, analgin, itd.)
2.7. Inaktivacija enzima
Molekuli biopolimera (enzimi) su termodinamički nestabilni i, po pravilu, vremenom mijenjaju svoju strukturu i svojstva. U većini slučajeva, proces inaktivacije se može opisati kao prijelaz između dva stanja aktivnog enzima. E a i neaktivan E i :
(2.56) Kinetika procesa opisana je odgovarajućom diferencijalnom jednačinom
(2.57)
i karakteriše ga vremenska konstanta
(2.58)
Proces inaktivacije enzima može imati različitu fizičko-hemijsku prirodu. Najčešća je termička denaturacija, koja predstavlja značajno restrukturiranje makromolekule, promjenu tercijarne i djelimično sekundarne strukture.
Za potrebe inaktivacije može se koristiti kavitacijski ultrazvuk, radioaktivno zračenje itd.
Promjena pH također može dovesti do denaturacije enzima. Pri svakoj pH vrijednosti, protein je karakteriziran odgovarajućom raspodjelom naboja (jonogene grupe). Pri vrlo niskom ili vrlo visokom pH, raspodjela naboja može značajno polarizirati molekulu, dovesti do pojave izomera i nepovratno ga uskladiti s uništavanjem strukture aktivnog centra. Na primjer:
Denaturacija enzima je uzrokovana denaturirajuća sredstva, uništavajući sekundarnu strukturu proteina (na primjer, ureu), kao i oksidativne procese koji uključuju kisik.
Prilikom proučavanja takvih procesa, važne informacije se dobijaju relaksacionim metodama. U pravilu, konformacijske promjene su praćene promjenama u okruženju aromatičnih aminokiselina - tirozina i triptofana (opseg apsorpcije zračenja na 290 nm). To se manifestira u promjenama spektra apsorpcije i fluorescencije.
Reverzibilne konformacijske promjene obično se javljaju u vremenu od 0,1-100 ms, a ireverzibilne - 1-1000 minuta.
Primjer 1. Najjednostavnija kinetička shema inaktivacije s konformerskom ravnotežom:
(2.59)
Kinetika procesa je opisana jednim karakterističnim vremenom
(2.60)
Primjer 2. Oba konformera su podložna deaktivaciji:
(2.61)
(2.62)
Primjer 3. Općenitiji slučaj za sistem koji uključuje n konformeri:
Enzimi često formiraju dimere u rastvoru, a stabilniji su u dimernom obliku. Tada se posmatra mehanizam disocijativne inaktivacije :
(2.65)
Sljedeća shema odražava moguće mehanizme inaktivacije tokom reakcije (monomolekularna inaktivacija slobodnog oblika enzima, monomolekularna inaktivacija kompleksa enzim-supstrat, bimolekularna inaktivacija enzima supstratom, bimolekularna inaktivacija enzima produktom) :
(2.66)
Diskriminacija mehanizama inaktivacije i određivanje kinetičkih karakteristika reakcije obično se provode na nekoliko metoda:
analizirati ovisnost prinosa proizvoda od koncentracije enzima;
uspostavljanje veze između stepena konverzije supstrata i stepena inaktivacije enzima;
izvođenje reakcije pri niskim stupnjevima konverzije supstrata i niskim koncentracijama enzima;
izvođenje reakcije pri visokim koncentracijama enzima;
preinkubacija enzima sa komponentama reakcije;
korištenje integralnih jednadžbi reakcija.
dr.sc.
Kuznjecova Ekaterina Igorevna Mehanizmi inaktivacije enzima
1. Promjena primarne strukture:
1.1. Puknuće polipeptidnog lanca:
Teška stanja (produženo ključanje u HCl) –
hidroliza do pojedinačnih aminokiselina.
Kada se zagrije na 100 °C (pH 7-8), hidroliza
peptidne veze su beznačajne.
Najosjetljiviji na
visokotemperaturna hidroliza su
peptidne veze formirane ostacima
asparaginska kiselina.
Proteaze (bakterijska kontaminacija, autoliza). Rješenje:
inaktivirani enzimi. 1.2.Oksidacija funkcionalnih grupa enzima
SH grupe fragmenata cisteina i indola
triptofan, na povišenim temperaturama, može
oksidiraju (sulfoksi-cistein spojevi
(SOH, SO2H) i nastaju proizvodi
otvaranje indolnog prstena triptofana. Rješenje:
Ponovo aktivirajte restorativnim sredstvima
agensi, posebno tioli niske molekularne težine
(na primjer, cistein ili ditiotreitol).
Uzrok: Tioli i drugi smanjeni
jedinjenja sumpora, na primer Na2SO3, Na2S2O3.
Proizvod za smanjenje disulfidne veze
(S-S) je:
1) tiol oblik (protein-SH)
2) miješani disulfid tiolnog oblika proteina s
reagens za redukciju, na primjer
protein–S–SO3). 1.3. Raskid disulfidnih veza
Alkalna hidroliza cisteina →dehidroalanin →
Zbog svojih nukleofilnih svojstava
stupa u interakciju sa NH2 grupama lizina i SHcisteina → lizinoalanin i lantionin.
Za potpuno uništenje svih S–S veza, potrebni su prilično strogi uslovi (0,1–1 M alkalije,
100 °C).
Međutim, uništavanje najreaktivnijih
S–S veze se mogu pojaviti u prilično mekim
uslovi - na primjer, na temperaturama od 60-80 ° C i
blago alkalne pH vrijednosti.
Treba uzeti u obzir kada se koriste enzimi u
kao aditivi za deterdžente. Rješenje:
Dodavanje tiola u medijum će dovesti do
cijepanje miješanog disulfida i
naknadno formiranje ispravne S–S veze 1.4. Hemijska modifikacija katalitičkih SH grupa.
Kationi teških metala (Hg, Pb i Cu)
vežu se za SH grupe aktivnog mjesta
enzim
↓
Formiranje odgovarajućih merkaptida
↓
Enzim je inaktiviran
10.
1.5. Fosforilacija proteina in vivo.Pod uticajem fosforilaze i fosfataze,
sadržan u polupročišćenom enzimskom
droge u obliku nečistoća
↓
Fosforna kiselina se vezuje za OH grupe
serin i treonin.
↓
Konformacijske promjene proteina
molekula
↓
inaktivacija enzima.
11.
Rješenje:U literaturi praktički nema primjera
sretno sa reaktivacijom na ovaj način
inaktivirani enzimi.
12.
1.6. Deaminacija ostataka asparagina.Na temperaturama (oko 100 °C) i pH (oko
4.0–5.0) dolazi do deaminacije ostataka
asparagin.
↓
inaktivacija enzima.
13.
Rješenje:U literaturi praktički nema primjera
sretno sa reaktivacijom na ovaj način
inaktivirani enzimi.
14.
1.7. Radijacijska inaktivacija enzimaγ-zračenje i UV svjetlo
Utječu na funkcionalne grupe
enzimi, peptidne veze i SH grupe
ostaci cisteina.
15.
2. AgregacijaPosmatrano na povišenim temperaturama, at
ekstremne pH vrednosti, u prisustvu
nekih hemijskih jedinjenja.
Što je veća koncentracija, to brže ide
agregacija.
Hidrofobne interakcije i vodonik
vezama, moguće je stvaranje disulfidnih veza
mostovi između pojedinačnih proteina
molekule
16.
Rješenje:Potrebno je uništiti intermolekularne
kovalentni i nekovalentni kontakti c
korištenjem koncentriranih otopina
urea i gvanidin hlorid, ekstremno
pH vrednosti.
Ako agregacija enzima rezultira stvaranjem
međumolekularni S-S mostovi se dodaju mediju
relativno niske koncentracije
(μmol/L) reagensi koji sadrže tiol (npr.
cistein ili ditiotreitol).
U takvim koncentracijama, intramolekularno
S–S veze u proteinu obično nisu pogođene.
17.
3. Površinska inaktivacija enzimatenzija
Površinski napon na interfejsu
između vazduha i čiste vode je 80
din/cm.
Pjenjenje uzrokuje denaturaciju
enzime adsorbovane na interfejsu
faze
18.
Rješenje:Dodavanje surfaktanta smanjuje površinu
napetost do 1 din/cm.
19.
4. Sorpcija proteina na zidovima reakcijeplovilo
Sorpcija zbog nekovalentnih interakcija
dovodi do smanjenja koncentracije enzima u
rješenje.
Mora se uzeti u obzir prilikom rada sa
razblaženih proteinskih rastvora
(koncentracija 10-8-10-10 mol/l).
Pod uticajem denaturirajućih faktora
sposobnost proteina da se adsorbuju na zidovima
reakciona posuda se može povećati.
20.
Rješenje:Desorpcija enzima sa zidova reakcije
brod se postiže uništavanjem
nespecifične interakcije između
proteini i centri za sorpciju na površini
plovilo.
Mogu se koristiti ekstremne pH vrijednosti
koncentrirani rastvori uree ili
gvanidin hlorid.
21.
5. Disocijacija oligomernih proteina upodjedinice
Uzrokuju: urea, deterdženti, kiseline ili
grijanje.
Voditi do:
konformacijske promjene pojedinca
podjedinice;
agregacija podjedinica;
disocijacija kofaktora od aktivnih centara;
modifikacije funkcionalnih grupa koje
oligomerni proteini su zaštićeni od
kontakt sa rastvaračem.
22.
6. Desorpcija kofaktora iz aktivnog mjestaenzim
Uzroci: zagrijavanje, efekti heliranja, dijaliza
Ako je praćena disocijacijom kofaktora
značajne konformacijske pomake ili
hemijska modifikacija bitnih
funkcionalne grupe → enzim
je nepovratno inaktiviran.
Ako nije značajno
promjene u konformaciji proteina, a zatim dodavanje
u okruženju viška kofaktora dovodi do
reaktivacija enzima.
23.
Regeneracija kofaktoraMetode regeneracije:
Enzimski (metode koje koriste konjugirane supstrate ili enzime)
Neenzimski (hemijski i
elektrohemijski pristupi)
24.
Enzimska metodaU sistem se unose prevelike količine.
konjugirani supstrat istog enzima:
Primjer: kada djeluje alkohol dehidrogenaza
NADH se konzumira.
25.
Enzimska metoda1. Upotreba konjugiranih supstrata.
Nedostatak:
koriste se visoke koncentracije
konjugovani supstrat, od ravnoteže
reakcije su uvelike pomaknute u stranu
stvaranje alkohola;
komplikuje proceduru za identifikaciju glavnog
produkt iz reakcione smjese.
26.
Enzimska metoda2. Upotreba uparene
enzimske reakcije
Enzim 2 se dodatno uvodi u sistem,
čije je funkcionisanje osigurano
regeneracija koenzima.
Enzimi koji se koriste u sistemu moraju imati
različite specifičnosti supstrata
27.
Neenzimske metode1. Hemijske metode.
Natrijum ditionit i neke
piridinijeve soli:
+ Niska cijena.
- može inhibirati određene enzime.
Flavin koenzimi
28.
Neenzimske metode2. Elektrohemijske metode.
Direktna elektrohemijska redukcija ili
oksidacija.
“-” pojavljivanje tokom procesa regeneracije
enzimski neaktivni oblici koenzima,
na primjer, kao rezultat njegove dimerizacije.
29. STABILIZACIJA ENZIMA U BIOTEHNOLOŠKIM SISTEMIMA
30.
Problemi nastali tokom upotrebeenzimi u biotehnološkim procesima:
1. Povišene temperature
2. Ekstremne pH vrijednosti
3. Visoke koncentracije organskog
rastvarača ili tenzida.
4. Nemogućnost ponovne upotrebe
enzim.
5. Poteškoće u odvajanju enzima od
proizvod.
31.
Osnovni pristupi stabilizacijienzimi:
1. Dodavanje stabilizirajućih supstanci mediju,
u kojoj se enzim pohranjuje ili provodi
enzimska reakcija.
2. Hemijska modifikacija enzima.
3. Imobilizacija enzima.
32.
1. Supstrati ili njihovi analozi:
Kompleks enzim-supstrat je često više
stabilniji od slobodnog enzima.
Primjer: Laktat dehidrogenaza u prisustvu
laktat je toplinski stabilniji.
33.
Stabilizacija enzima pomoću:2. Organski rastvarači:
Polihidrični alkoholi stabiliziraju neke
enzima povećanjem stabilnosti
intramolekularne proteinske vodonične veze.
Primjer: kimotripsin u prisustvu 50-90%
glicerol je otporniji na proteolizu
34.
Stabilizacija enzima pomoću:3. Soleil:
Pri niskim koncentracijama soli (<0,1M) катионы
Posebno mogu Ca2+, Zn2+, Mn2+, Fe2+ itd
stupaju u interakciju s metaloproteinima.
Neki od njih su kofaktori.
Ca2+ je sposoban za stabilizaciju tercijarnog
struktura brojnih proteina zbog formiranja
jonske veze sa dve različite
aminokiselinskih ostataka.
Primjer: α-amilaza (iz bacillus caldolyticus)
Ca2+ značajno povećava temperaturu
održivost.
35.
36.
Hemijska modifikacija enzima1. Enzim postaje stabilniji
konformacija.
2. Uvođenje novih funkcionalnih grupa u protein
dovodi do stvaranja dodatnih
stabilizacija vodikovih veza ili soli
mostovi.
3. Kada koristite nepolarna jedinjenja
hidrofobne interakcije su pojačane.
4. Modifikacija hidrofobnih površina
proteina hidrofilnim spojevima smanjuje
područje nepovoljnog kontakta s vanjskim
nepolarnih ostataka sa vodom.
Primjer: glutaraldehid
37.
Imobilizacija enzima omogućava:Povećajte stabilnost enzima (toplota,
autoliza, izlaganje agresivnom okruženju, itd.)
1. Ponovo upotrebite enzim
2. Odvojite enzim od reagensa i proizvoda
reakcije.
3. Prekinite reakciju u pravom trenutku.
38.
Imobilizirani enzimi su lijekovienzimi čiji su molekuli povezani
nosač, zadržavajući u potpunosti ili
dijelom njegova katalitička svojstva.
Metode imobilizacije:
1. Hemijski
2. Fizički
39.
Metode imobilizacije:Mogu se koristiti sljedeći mediji:
1) Organski materijali:
1.1) prirodni (polisaharidi, proteini, lipidi)
1.2) sintetički polimerni nosači
2) Neorganski materijali (matrice na
na bazi silika gela, gline, keramike, prirodni
minerali itd.)
40.
1) adsorpcija enzima na nerastvorljivom nosaču
kao rezultat elektrostatičkog, hidrofobnog,
van der Waals i druge interakcije;
;
strukture;
4) Priključak na dvofazni sistem.
41.
Metode fizičke imobilizacije:Postiže se kontaktom vodenog rastvora
enzim sa nosačem.
42.
Metode fizičke imobilizacije:1) adsorpcija enzima na nerastvorljivom nosaču
Faktori koji utiču na adsorpciju:
1. Specifična površina i poroznost nosača
2. pH vrijednost (na nejonskim izmjenjivačima maksimalna adsorpcija
na izoelektričnoj tački proteina)
3. Jonska snaga rastvora (povećanje jonske snage -
desorpcija enzima, ali ponekad i suprotna situacija
"soljenje")
4. Koncentracija enzima.
5. Temperatura (s jedne strane denaturacija, s druge strane
još jedna ubrzana difuzija)
43.
Metode fizičke imobilizacije:1) adsorpcija enzima na nerastvorljivom nosaču
Prednosti:
2) Dostupnost medija
Nedostaci:
1) Nedovoljna čvrstoća vezivanja
2) Mnogi mediji su biorazgradivi
44.
Metode fizičke imobilizacije:2) uključivanje enzima u polupropusni
kapsula, u polupropusnoj membrani
45.
Metode fizičke imobilizacije:2) uključivanje enzima u polupropusni
kapsula, u polupropusnoj membrani
Prednosti:
1) Relativna jednostavnost tehnike
2) Zaštita od mikroorganizama
3) Nema ograničenja difuzije (od
Odnos površine i površine je visok i
debljina membrane je mala)
Nedostaci:
1) Biorazgradivo
2) Nije primjenjivo za visoku molekularnu težinu
46.
Metode fizičke imobilizacije:3) mehaničko uključivanje enzima u gel
strukture
Enzim je uključen u trodimenzionalnu mrežu
polimernih lanaca koji formiraju gel.
47.
Metode fizičke imobilizacije:3) mehaničko uključivanje enzima u gel
strukture
Treba uzeti u obzir:
1. Korespondencija veličine pora s veličinom enzima.
2. Priroda matrice (pošto ona stvara
mikrookruženje za enzim, možda
stvoriti pH različit od pH otopine i
povećavaju afinitet supstrata prema matrici, što
povećava brzinu enzimske reakcije)
48.
Metode fizičke imobilizacije:3) mehaničko uključivanje enzima u gel
strukture
Prednosti:
1) Relativna jednostavnost tehnike
2) Povećana mehanička, hemijska i
termička otpornost matrica.
3) Enzim je stabilizovan
4) Enzim je zaštićen od bakterija
oštećenja
Nedostaci:
1) Nije primjenjivo za visoku molekularnu težinu
49.
Metode fizičke imobilizacije:4) Priključak na dvofazni sistem
Enzim je rastvorljiv samo u jednoj od faza, i
proizvod - drugom
Omogućava vam rad u visokoj molekularnoj težini
podloge.
50.
Metode hemijske imobilizacije:Formiranje kovalentnih veza između
enzim i nosač.
Prednosti:
1) Visoka čvrstoća konjugata
2) Stabilnost enzima se može povećati
51.
Prilikom imobilizacije enzima neophodno jeispuniti sljedeće uslove:
1. Aktivne grupe matrice ne bi trebale
blokiraju katalitički centar enzima.
2. Imobilizacija ne bi trebala dovesti do gubitka
aktivnost enzima.
52.
Veoma obećavajuća je upotreba ukao imobilizirani biokatalizatori
ćelije.
Jer može se izbjeći:
1) skupi koraci izolacije i prečišćavanja
enzimi
2) potreba za njihovom naknadnom stabilizacijom
53.
ThermozymsStabilan u uslovima visoke temperature,
visoke koncentracije soli i ekstremne
pH vrednosti.
Hipertermofilni mikroorganizmi
pronađen među arhejama i bakterijama, živi
na temperaturama od 80-100 °C.
54.
Mehanizmi odgovorni za termičku stabilnostenzimi u termozimima:
Između mezofilnog i termofilnog
enzimske verzije - visok stepen homologije
sekvence i strukture.
Dakle, sekvence termostabilnih
dehidrogenaze iz Pyrococcus i Thermotoga na 35 i
55% identično
sekvence mezofilne dehidrogenaze
iz Clostridium.
55.
Otkriveno je da dehidrogenaza iz Pyrococcusfuriosus (Tm == 105 °C) sadrži 35 izoleucina,
dok dehidrogenaze iz Thermotoga
maritima (Tm = 95 °C) i Clostridium symbiosum (Tm
= 55 °C) samo 21 i 20 izoleucina
respektivno.
Enzimi stabilni na toplinu sadrže manje
glicin: Cs dehidrogenaza sadrži 48 ostataka
glicin i dehidrogenaze samo iz Tm i Pf
39 i 34 glicina, respektivno.
Više izoleucina a manje glicina.
56.
Povećana termička stabilnost korelira sa:1) sa povećanjem rigidnosti strukture proteina
smanjenjem sadržaja ostataka
glicin,
2) sa poboljšanjem hidrofobnih kontakata u jezgru
dehidrogenaza iz Pf kao rezultat zamjene valinom
izoleucin. (Kao rezultat web-directed
mutageneza koja dovodi do zamjene izoleucina
mutanti termostabilnosti valina
smanjen).
57.
Mehanizmi stabilizacije:minimiziranje raspoložive hidrofobne površine
površina proteina;
optimizacija pakovanja proteinskih atoma
molekula (minimiziranje omjera
površina/volumen);
optimizacija distribucije naboja (postignuta
zahvaljujući eliminaciji odbojnih
interakcije, kao i kao rezultat organizacije
interakcije između naboja u svojevrsni
mreža)
Smanjenje broja depresija
58.
Primjena enzima iz ekstremofilaSavremene tehnologije molekularne biologije
i genetski inženjering omogućava:
1) dobiti dovoljne količine enzima iz
ekstremofili za njihovo kasnije
analizu i praktičnu primjenu.
2) kloniranje i ekspresija ovih enzima u
mezofilni organizmi.
59.
Škrob se koristi za proizvodnju šećera.
Prvo, proces se izvodi na (95–105 °C) i na vrijednostima
pH 6–6,5.
U sljedećoj fazi, temperatura pada na 60°C i
pH=4,5.
Upotreba termostabilnih enzima (αamilaza, glukoamilaza, ksiloza izomeraza),
izolirano od hipertermofila omogućit će:
1) izvršiti proces u jednoj fazi i istovremeno
istim uslovima
2) napustiti skupe jonske izmjenjivače
60.
Primjena enzima iz ekstremofila:Najtermostabilnije su bile α-amilaze
pronađen u arheji Pyrococcus woesei,
Pyrococcus furiosus, Desulfurococcus mucosus,
Pyrodictium abyssi i Staphylothermus
marinus. Geni amilaze iz Pyrococcus sp. bili
klonirani i eksprimirani u E.coli i Bacillus
subtilis.
61.
Primjena enzima iz ekstremofila:Proteolitički enzimi
Serin alkalne proteinaze su široko rasprostranjene
koriste se kao aditivi za deterdžente
znači.
Proteinaze iz ekstremofila se zadržavaju
nativnost na visokim temperaturama, u
prisustvo visokih koncentracija deterdženata i
druga denaturirajuća sredstva. pirokok,
Thermococcus, Staphylothermus, Desulfurococcus i
Sulfolobus. Maksimalna aktivnost ovih
enzimi se razvijaju na temperaturama
od 90 do 110 °C i pH vrijednosti od 2 do 10
62.
Primjena enzima iz ekstremofila:DNK polimeraze
Koriste se termostabilne DNK polimeraze
u PCR i igraju važnu ulogu u genetskom inženjeringu.
Termostabilne polimeraze su pronađene u
hipertermofili Pyrococcus furiosus i Pyrococcus
litoralis, kao i kod termofila Thermus aquaticus.
Količina enzima prisutna u tkivima u bilo kojem trenutku određena je relativnim stopama njegove sinteze i razgradnje, kao i koncentracijama različitih tipova inhibitora i aktivatora. U pravilu, razgradnja enzima i smanjenje njihove količine u mediju se odvija sporo. Inhibicija i aktivacija enzima može se izvršiti prilično brzo - u roku od nekoliko sekundi.
Postoji mnogo metoda za određivanje i izražavanje aktivnosti pojedinih enzima. To je zbog raznolikosti enzima, prisutnosti i upotrebe različitih supstrata za određivanje njihove aktivnosti.
Međunarodna biohemijska unija predložila je sljedeću definiciju enzimske jedinice: " Jedinicom bilo kojeg enzima smatra se količina koja katalizira konverziju jednog mikromola supstrata u minuti pod datim standardnim uvjetima ». Broj mikromola bit će jednak broju standardnih jedinica . Međunarodna komisija je predložila, ako je moguće, da se aktivnost enzima odredi na 30 °C i pri pH vrijednostima i koncentracijama supstrata optimalnim za enzimsku aktivnost.
Uobičajeni su svojstva enzima istjecati iz njihove proteinske prirode . Enzimi termolabilni, njihova aktivnost ovisi o pH i vlažnosti , u kojoj posluju, kao i od uticaj aktivatora i inhibitora .
Kada temperatura poraste do određenih granica, povećava se aktivnost enzima. Kada se postigne optimalna temperatura za enzim, njegova katalitička aktivnost je najveća. Optimalna temperatura za mnoge enzime najčešće je u unutar 40 do 50 °C (optimalna za biljne enzime je 50 - 60°C, a za enzime životinjskog porijekla - 40 - 50°C). Međutim, optimalna temperatura nije striktno konstantna i ovisi o mnogim razlozima, a posebno o trajanju grijanja. Što je dulje djelovanje enzima, optimalna temperatura bi trebala biti niža. .
U temperaturnom rasponu od 0 do 50 °C, s povećanjem ili smanjenjem temperature za svakih 10 °C, aktivnost enzima se povećava ili smanjuje, respektivno, za 1,4-2 puta. Daljnjim zagrijavanjem, aktivnost enzima se smanjuje, i na 80 – 100 °C enzimi obično potpuno gube svoja katalitička svojstva zbog denaturacije proteina .
Temperatura inaktivacije (gubitak aktivnosti) je različita za različite enzime. Tako se inaktivacija enzima amilaze u otopini događa na 70 °C, saharaze - na 59, tripsina i pepsina - na 65 °C. U suhom stanju, enzimi mogu tolerirati zagrijavanje do viših temperatura. Ali na vrlo visokim temperaturama, inaktivacija enzima se događa trenutno. Pasterizacija, sterilizacija, blanširanje i kuhanje uništavaju enzime .
Nakon termičke inaktivacije, neki enzimi obnavljaju svoju katalitičku aktivnost. Primjer je peroksidaza, koja čak i kada se zagrijava 60 s na 150 °C, ne gubi u potpunosti svoja katalitička svojstva. Stoga se peroksidaza smatra najtermostabilnijim enzimom.
Na temperaturama ispod 0 °C, katalitička aktivnost enzima naglo opada, ali se i dalje održava čak i kada je hrana zamrznuta.
Reakcija okoline ima značajan uticaj na katalitičku aktivnost enzima. Enzimi pod uticajem pH okoline menjaju svoju rastvorljivost, osmotski pritisak, viskoznost i druga svojstva. Vjeruje se da promjene enzimske aktivnosti u zavisnosti od pH okoline povezane su s promjenama jonizacija enzimi, supstrat ili kompleks enzim-supstrat .
Enzimi pokazuju optimalnu aktivnost samo unutar određenih pH granica koje su im inherentne.. Dakle, pepsin, koji se oslobađa u visoko kiselu sredinu želuca, ima optimalnu aktivnost pri pH 1,5 i 2,5. Istovremeno, proteaze, koje pankreas izlučuje u duodenum, imaju optimalnu aktivnost u alkalnoj pH zoni, a optimalno djelovanje tripsina leži u pH rasponu od 8-9. Pri pH vrijednosti iznad ili ispod optimalne, aktivnost enzima se smanjuje .
Većina enzima je najaktivnija u neutralnom, blago alkalnom ili blago kiselom okruženju. Kako se pH vrijednost pomjera sa optimalne na kiselu ili alkalnu, aktivnost enzima se smanjuje.
Aktivatori i inhibitori(paralizatori) enzima mogu shodno tome ojačati ili oslabiti, pa čak i zaustaviti njihovu aktivnost. Aktivatori enzimi su joni metala: Na + , K + , Rb + , Mg 2+ , Ca 2+ , Cu 2+ , Fe 2+ i jedinjenja koja sadrže sulfhidrilne grupe: SH, HCN, H 2 S . Prisustvo navedenih metala ili spojeva u otopini u određenoj koncentraciji doprinosi ispoljavanju pune aktivnosti nekih enzima.
Svi enzimi su podložni inhibiciji zbog denaturacije ili uništenja enzimskog proteina.
Suština djelovanja inhibitora u većini slučajeva je da se kombinuju s aktivnim grupama ili aktivnim centrima molekula enzima. Razlikovati opšti i specifični inhibitori . TO opšti inhibitori koji inhibiraju djelovanje svih enzima , uključiti soli teških metala (olovo, srebro, živa), trihlorosirćetne kiseline i tanina . Često je inhibicija ili prestanak djelovanja enzima pod utjecajem teških metala reverzibilan, a ako se u mediju dodaju tvari koje stvaraju spojeve s ovim metalima, aktivnost enzima se obnavlja.
Specifični inhibitori djeluju samo na određene enzime. Dakle, cijanovodonična kiselina djeluje samo na oksidativne enzime koji sadrže željezo ili bakar u aktivnom centru. Cijanovodonična kiselina se spaja s metalima, a enzim gubi aktivnost.
U živoj ćeliji regulacija djelovanja enzima se provodi ne samo uz pomoć specifičnih aktivatora i inhibitora, već i vezivanjem enzima na različite koloidne strukture protoplazme. Ovo vezivanje enzima dovodi do njihovog gubitka aktivnosti. Oslobađanje enzima iz spoja ponovo vraća njegovu katalitičku aktivnost.
Enzimi inaktiviran pri veoma visokim pritiscima . Međutim, nakon što se pritisak ukloni, enzimi obnavljaju svoju katalitičku aktivnost.
Djelovanje enzima je jako usporeno u suhoj hrani, ali ne prestaje u potpunosti. Rezultati aktivnosti enzima mogu se očitovati u promjenama u kvaliteti proizvoda - njegovom potamnjenju, pogoršanju arome, okusa, konzistencije itd.
Brzina većine enzimskih reakcija proporcionalna je koncentraciji enzima, barem u najranijim fazama. Iza početnih faza, brzina enzimskih reakcija se smanjuje.
Enzim stvara kompleks sa supstratom, koji se disocira na slobodni enzim i konačni produkt reakcije:
gdje je E enzim; S – podloga; ES – kompleks enzim-supstrat; P – finalni proizvod.
Količina supstrata je veoma velika u odnosu na količinu enzima, pa stoga koncentracija supstrata u velikoj meri utiče na brzinu enzimskih reakcija. Ako je supstrat sadržan u značajnom višku, tada je količina nastalog proizvoda proporcionalna vremenu. Kako se koncentracija supstrata smanjuje, količina konačnog proizvoda (P) formiranog u jedinici vremena se smanjuje.
Prisustvo enzima u otopini se procjenjuje po njegovom djelovanju. Dakle, prisustvo amilaze u pljuvački može se suditi po sposobnosti pljuvačke da saharifikuje skrob, prisustvo želudačnog pepsina - po njegovoj sposobnosti da dovoljnom brzinom rastvori bjelanjak jajeta ili fibrin.
Regulacijom aktivnosti enzima stvaranjem odgovarajućeg reakcionog okruženja možete kontrolisati brzinu reakcija koje katalizuju, kao i aktivnost enzima sadržanih u prehrambenim proizvodima, što vam omogućava da sprovodite mere za skladištenje žitarica, krompira. , voće i povrće, proizvodnju niza proizvoda (vina, čajeva, itd.).
Nomenklatura i klasifikacija enzima
U početnom periodu razvoja proučavanja enzima, dobijali su nazive bez specifičnog sistema, na osnovu slučajnih karakteristika, naziva supstrata ili tipa reakcije koja se katalizira. Dakle, enzim pepsin je dobio ime po grčkoj riječi "pepsis" - varim, papain - iz soka biljke papaje, bogatog enzimom. Dešavalo se da pojedini autori daju različita imena istom enzimu.
U vezi sa naglim razvojem nauke o enzimima - fermentologije, 1961. godine stalni komitet za enzime pri Međunarodnoj biohemijskoj uniji razvio je modernu nomenklaturu i klasifikaciju enzima. U skladu sa ovom klasifikacijom, naziv enzima je sastavljen od hemijskog naziva supstrata i naziva reakcije koju je enzim izvršio. Na latinski naziv korijena supstrata na koji enzim djeluje (saharoza - saharoza), ili prema nazivu procesa koji katalizuje ovaj enzim (hidroliza - hidrolaze), dodan završetak"aza". Uz nove nazive za mnoge enzime, sačuvani su stari koji su se čvrsto ustalili u naučnoj literaturi (pepsin, tripsin, papain itd.).
Prema modernoj klasifikaciji, svi enzimi se dijele na šest casovi: oksidoreduktaze; transferaze; hidrolaze; lyases; izomeraze; ligaze (sintetaze) . Klasifikacija enzima temelji se na prirodi njihovog djelovanja.
Svaka klasa je podijeljena na podklase, a svaka potklasa je podijeljena u grupe.
Oksidoreduktaze
To su enzimi koji katalizuju redoks reakcije koji se javljaju u živim organizmima. Reakcije oksidacije tvari u organizmima uvijek su praćene reakcijama redukcije. Oksidoreduktaze se dijele na 14 podklasa (najobimnija klasa enzima).
Oksidacija se javlja kao proces uklanjanja vodonika (elektrona) iz supstrata, a redukcija se javlja kao dodavanje atoma vodika (elektrona) akceptoru. Ova reakcija se može shematski prikazati na sljedeći način:
AN 2 + B = A + VN 2,
gdje je AN 2 supstanca koja donira svoj vodonik i naziva se donor; B je supstanca koja oduzima vodonik i naziva se akceptor.
Različite tvari mogu biti podvrgnute oksidaciji - ugljikohidrati, masti, proteini, aminokiseline, vitamini itd.
Ulogu oksidoreduktaza u živim tkivima obavljaju ekstenzivne grupe dehidrogenaze I oksidaze , koji se nazivaju ovisno o supstratu koji oksidiraju. Tako se enzim koji dehidrira jabučnu kiselinu naziva malat dehidrogenaza, enzim koji dehidrira etil alkohol naziva se alkohol dehidrogenaza itd.
U klasi oksidoreduktaza glavne su dehidrogenaze koje provode reakciju dehidrogenacije. Sve dehidrogenaze se dijele u dvije grupe : anaerobne i aerobne, koje se nazivaju oksidaze .
Anaerobne dehidrogenaze su specifični enzimi koji katalizuju apstrakcija vodonika od određenih hemikalija i prenoseći ih na druge enzime – nosače vodonika. Ove dehidrogenaze su dvokomponentni enzimi u kojima se koenzim lako odvaja od proteinskog dijela. Kao koenzim Anaerobne dehidrogenaze mogu sadržavati dvije supstance - nikotin amid adenin nukleotid ( IZNAD ) ili nikotin amid adelin nukleotid fosfat ( NADP ). Obje ove supstance imaju izuzetno visoka reaktivna redoks svojstva.
Postoje mnoge poznate anaerobne dehidrogenaze koje kataliziraju oksidaciju različitih organskih spojeva. Dakle, laktat dehidrogenaza katalizira oksidaciju mliječne kiseline u pirogrožđanu kiselinu, izocitrat dehidrogenaza - oksidaciju izocitratne kiseline u oksalno-jantarnu kiselinu.
Za grupu aerobne dehidrogenaze (oksidaze) uključuju enzime koji sadrže kao koenzim uključeno vitamin B 2 , (riboflavin ), stoga se takvi enzimi nazivaju flavin . Flavin enzimi su sposobni ukloniti vodik iz tvari koja se oksidira i prenijeti ga na druge spojeve ili kisik iz zraka:
2H 2 O 2 → 2H 2 O + O 2.
Uzimajući vodik iz tvari koja se oksidira i prenosi ga na kisik iz zraka, oksidaza može formirati vodu ili vodikov peroksid (H 2 O ili H 2 O 2). U ovu grupu enzima spadaju polifenol oksidaza, askorbat oksidaza i glukoza oksidaza.
Polifenol oksidaza je aerobna dehidrogenaza za koju Akceptor vodonika je gas kiseonika .
Djeluje na o-difenole, polifenole, tanine i tirozin. Polifenol oksidaza je široko rasprostranjena u gljivama i višim biljkama, posebno u listovima zelenog čaja. Djelovanje polifenol oksidaze objašnjava zatamnjenje rezanog mesa voća i povrća, krompira, kao i potamnjenje svježih listova čaja pri motanju. Polifenol oksidaza igra važnu ulogu kao intermedijer u disanju biljaka.
Enzim peroksidaza uz polifenol oksidazu i citokrom oksidazu, aktivno sudjeluje u procesima disanja biljaka i odbrambenim reakcijama biljaka od biljnih patogenih mikroorganizama.
Aktivna grupa peroksidaze sadrži gvožđe . Korištenje enzima peroksidaze zbog vodikovog peroksida i nekih drugih organskih peroksida dolazi do oksidacije organskih spojeva. Peroksidaza tvori složeno organsko jedinjenje, zbog čega se peroksid aktivira i stječe sposobnost da djeluje kao akceptor vodika:
Mnogi organski spojevi reagiraju s atmosferskim kisikom i stvaraju perokside. Peroksidi se posebno lako formiraju kada se spojevi sa nezasićenim vezama oksidiraju atmosferskim kisikom: karotenoidi, nezasićene masne kiseline i neki ugljikovodici.
Enzim katalaze katalizira proces cijepanja vodikovog peroksida u vodu i kisik:
Molekul katalaze, poput peroksidaze, sadrži gvožđe . Glavna svrha katalaze u tijelu je da uništava vodonik peroksid, štetan za stanice, nastao tokom disanja.
Enzim lipoksigenaza katalizira stvaranje peroksida i hidroperoksida tijekom oksidativnog kvarenja masti.
Sa stanovišta efikasnosti upotrebe biokatalizatora, bilo bi izuzetno primamljivo ne samo povećati stabilnost enzima, već i naučiti kako obnoviti aktivnost enzimskih preparata utrošenih u toku tehnološkog procesa.
Gotovo istovremeno sa otkrićem fenomena inaktivacije enzima (početak dvadesetog stoljeća), istraživači su počeli pokušavati da ih reaktiviraju. Do danas je prikupljeno dosta pozitivnih primjera u ovom pravcu. Pogodno ih je klasificirati prema razlozima koji uzrokuju inaktivaciju.
Reaktivacija agregiranih proteina. Često se može postići uništavanjem intermolekularnih nekovalentnih kontakata (hidrofobne, elektrostatičke, vodonične veze). U tu svrhu koriste se isti denaturanti koji uništavaju nekovalentne interakcije u nativnim proteinima, uzrokujući njihovu reverzibilnu denaturaciju: koncentrirani rastvori uree i gvanidin hlorida, ekstremne pH vrednosti itd.
Reaktivacija proteina sa promijenjenom primarnom strukturom. Ako je protein izgubio aktivnost kao rezultat kemijske modifikacije funkcionalnih grupa, onda se može pokušati reaktivirati pomoću obrnute kemijske reakcije. Enzimi inaktivirani modifikacijom SH grupa (na primjer, oksidacijom) se ponekad mogu reaktivirati dodavanjem viška tiola niske molekularne težine ili drugog redukcijskog agensa.
Desorpcija inaktiviranog proteina sa zidova krvnih sudova. “Sorptivna inaktivacija” proteina je uzrokovana slabim nekovalentnim interakcijama (električne, hidrofobne, vodikove veze) između proteina i površine reakcione ćelije. Reaktivacija se u ovom slučaju postiže uništavanjem nespecifičnih interakcija pri ekstremnim pH vrijednostima, pod utjecajem koncentriranih otopina uree ili gvanidin hlorida i drugih reagensa koji su „reverzibilni denaturanti“ za većinu proteina.
Reaktivacija "nepovratno denaturiranog" proteina. Reaktivacija se može izvesti pomoću sljedeće dvostepene sheme: prvo, sve u inaktiviranom proteinu treba biti uništeno, uključujući ne-nativne nekovalentne interakcije, tj. protein treba prevesti u nesavijeno stanje i iz tog stanja, treba pokušati da se to savije u nativnu konformaciju. Dakle, u opštem slučaju, problem reaktivacije bilo kog „ireverzibilno denaturisanog“ enzima će se u suštini svesti na rešavanje dva problema. Prvo, traženje uslova pod kojima se inaktivirani protein može razviti. Za odvijanje inaktiviranih proteina obično se koriste isti reagensi koji se mogu koristiti za pretvaranje prirodnih (neinaktiviranih) proteina u nasumično stanje kotura. To su koncentrirani rastvori reverzibilnih denaturansa (urea ili gvanidin hlorid). Drugo, eksperimentalni odabir uslova pod kojima se nesavijeni protein uspješno savija u nativnu (katalitički aktivnu) konformaciju. U tu svrhu često su korisni efektori enzimske aktivnosti (supstrati, inhibitori, kofaktori itd.), koji su ujedno i efektori savijanja, odnosno povećavaju prinos reaktivacije enzima.
Regeneracija kofaktora (koenzima)
Kategorija kofaktora uključuje koenzime, prostetičke grupe i ione metala. Sa tehnološke tačke gledišta, regeneracija koenzima je od najvećeg interesa. Koenzimi su organska jedinjenja male molekularne mase koja igraju ulogu dodatnog supstrata u funkcionisanju mnogih enzima.
Kada se koriste sistemi imobilizovanih enzima sa koenzimima, moraju se rešiti dva problema: stvarna regeneracija koenzima i njegovo zadržavanje u reakcionom sistemu. Ovo posljednje se obično postiže kovalentnom imobilizacijom koenzima na polimernim nosačima. Razvijeno je nekoliko pristupa za regeneraciju, čija se suština ogleda u sljedećem dijagramu:
Prema ovoj shemi, koenzim koji se mijenja u reakciji koja uključuje jedan od enzima, zahvaljujući sistemu konjugiranih reakcija, regeneriše se, tj. vraća u prvobitno stanje. Ovisno o vrsti konjugatne reakcije, sve metode regeneracije koenzima mogu se podijeliti u dvije grupe: enzimske i neenzimske. Enzimske metode uključuju metode regeneracije koje koriste konjugirane supstrate ili konjugirane enzime. Neenzimski putevi se mogu podijeliti na kemijske i elektrohemijske puteve.
ATP sistem regeneracije je kontinuirani proces pretvaranja ADP u ATP, u kojem enzimi koji fosforiliraju difosfat djeluju kao katalizatori, koristeći spojeve koji sadrže fosfate (acetil fosfat, kreatin fosfat, arginin fosfat itd.) kao donore fosfata.