Ito ay isang serological reaksyon kung saan ang mga tiyak na antiviral antibodies, na nakikipag-ugnayan sa virus (antigen), neutralisahin ito at inaalis ito ng kakayahang pagsamahin ang mga pulang selula ng dugo, ibig sabihin, pagbawalan ang reaksyon ng hemagglutination. Ang mataas na pagtitiyak ng hemagglutination inhibition reaction (HAI) ay nagpapahintulot na magamit ito upang matukoy ang uri at maging ang uri ng mga virus na nakita sa panahon ng pagsusuri sa HRA.
Pag-set up ng isang reaksyon. Ang 0.25 ml ng antiviral serum sa sunud-sunod na dalawang beses na dilution mula 1:10 hanggang 1:2560 ay halo-halong may pantay na dami ng materyal na naglalaman ng virus, na natunaw ng 4 na beses na mas mababa kaysa sa titer na itinatag sa RGA. Ang halo ay inalog at inilagay sa isang termostat sa loob ng 30 minuto, pagkatapos ay idinagdag ang 0.5 ml ng isang 1-2% na suspensyon ng mga pulang selula ng dugo.
Ang reaksyon ay sinamahan ng tatlong mga kontrol (Talahanayan 17).
Talahanayan 17. Mga kontrol sa reaksyon ng pagsugpo sa hematglutination
Ang mga resulta ay naitala pagkatapos ng paulit-ulit na pagpapapisa ng itlog sa isang termostat sa loob ng 30 o 45 minuto sa temperatura ng silid. Kung ang eksperimento ay natupad nang tama, ang isang "button" ay dapat mabuo sa kontrol ng serum at erythrocytes - walang kadahilanan na agglutinating erythrocytes; sa kontrol ng antigen, isang "payong" ang nabuo - ang virus ay nagdulot ng aglutinasyon ng mga pulang selula ng dugo.
Sa isang eksperimento, kung ang serum ay homologous sa virus na pinag-aaralan, isang "button" ang nabuo - ang serum ay na-neutralize ang virus. Ang titer ng serum ay ang pinakamataas na pagbabanto nito kung saan naantala ang hemagglutination.
Hindi direktang reaksyon ng hemagglutination
Ang indirect (passive) hemagglutination reaction (IRHA) ay batay sa katotohanan na ang mga pulang selula ng dugo, kung ang isang natutunaw na antigen ay na-adsorbed sa kanilang ibabaw, ay nakakakuha ng kakayahang mag-aglutinate kapag nakikipag-ugnayan sa mga antibodies sa adsorbed antigen. Ang diagram ng RNGA ay ipinapakita sa Fig. 34. Ang RNGA ay malawakang ginagamit sa pagsusuri ng ilang mga impeksiyon.
kanin. 34. Scheme ng passive hemagglutination reaction (RPHA). A - pagkuha ng erythrocyte diagnosticum: B - RPGA: 1 - erythrocyte: 2 - antigen na pinag-aaralan; 3 - erythrocyte diagnosticum; 4 - antibody sa antigen na pinag-aaralan: 5 - agglutinate
Pag-set up ng isang reaksyon. Ang test serum ay pinainit sa loob ng 30 minuto sa 56° C, diluted na sunud-sunod sa isang ratio na 1:10 - 1:1280 at ibinuhos sa 0.25 ml sa mga test tube o balon, kung saan 2 patak ng erythrocyte diagnosticum (erythrocytes na may antigen adsorbed sa kanila. ) ay pagkatapos ay idinagdag.
Mga kontrol: isang suspensyon ng erythrocyte diagnosticum na may kilalang immune serum; suspensyon ng diagnosticum na may normal na suwero; isang suspensyon ng mga normal na pulang selula ng dugo na may test serum. Sa unang kontrol, dapat mangyari ang agglutination, sa pangalawa at pangatlo hindi ito dapat mangyari.
Gamit ang RIGA, maaari mong makita ang isang hindi kilalang antigen kung ang mga kilalang antibodies ay na-adsorbed sa mga pulang selula ng dugo.
Ang reaksyon ng hemagglutination ay maaaring isagawa sa dami ng 0.025 ml (micromethod) gamit ang Takachi microtitrator.
Kontrolin ang mga tanong
1. Ano ang ipinahihiwatig ng isang positibong resulta ng pagsusuri sa X-ray sa pagitan ng mga pulang selula ng dugo at ng materyal na sinusuri para sa pagkakaroon ng virus?
2. Magaganap ba ang agglutination ng mga pulang selula ng dugo kung ang isang virus at ang kaukulang serum nito ay idinagdag sa kanila? Ano ang pangalan ng reaksyon na nagpapakita ng hindi pangkaraniwang bagay na ito?
Mag-ehersisyo
Isaalang-alang at irehistro ang resulta ng RIGA.
Reaksyon ng ulan
Sa reaksyon ng precipitation, ang isang tiyak na immune complex ay namuo, na binubuo ng isang natutunaw na antigen (lysate, extract, hapten) at isang tiyak na antibody sa pagkakaroon ng mga electrolytes.
Ang maulap na singsing o precipitate na nabuo bilang resulta ng reaksyong ito ay tinatawag na precipitate. Ang reaksyong ito ay higit na naiiba sa reaksyon ng aglutinasyon sa laki ng mga partikulo ng antigen.
Ang reaksyon ng pag-ulan ay karaniwang ginagamit upang matukoy ang antigen sa pagsusuri ng isang bilang ng mga impeksiyon (anthrax, meningitis, atbp.); sa forensic medicine - upang matukoy ang mga species ng dugo, tamud, atbp.; sa sanitary at hygienic studies - kapag nagtatatag ng falsification ng mga produkto; sa tulong nito, natutukoy ang phylogenetic na relasyon ng mga hayop at halaman. Para sa reaksyon na kailangan mo:
1. Antibodies (precipitin) - immune serum na may mataas na titer ng antibodies (hindi mas mababa sa 1:100,000). Ang titer ng precipitating serum ay tinutukoy ng pinakamataas na pagbabanto ng antigen kung saan ito tumutugon. Ang serum ay kadalasang ginagamit na undiluted o sa isang dilution na 1:5 - 1:10.
2. Antigen - dissolved substances ng protina o lipoid polysaccharide nature (full antigens at haptens).
3. Isotonic solution.
Ang mga pangunahing pamamaraan para sa pagsasagawa ng reaksyon ng pag-ulan ay: reaksyon ng pag-ulan ng singsing at reaksyon ng pag-ulan sa agar (gel).
Pansin! Ang lahat ng mga sangkap na kasangkot sa reaksyon ng pag-ulan ay dapat na ganap na transparent.
Reaksyon ng pag-ulan ng singsing. Gamit ang isang Pasteur pipette, magdagdag ng 0.2-0.3 ml (5-6 patak) ng serum sa precipitation tube (hindi dapat makuha ang serum sa mga dingding ng tubo). Ang antigen sa parehong dami ay maingat na nilalagay sa serum, na ibinubuhos ito ng manipis na Pasteur pipette sa dingding ng test tube. Ang test tube ay pinananatili sa isang hilig na posisyon. Kapag maayos na naka-layer, dapat mayroong malinaw na hangganan sa pagitan ng serum at ng antigen. Maingat, upang hindi paghaluin ang likido, ilagay ang test tube sa isang stand. Kung ang reaksyon ay positibo, ang isang maulap na "singsing" ay nabuo sa interface ng antigen at antibody - isang precipitate (tingnan ang Fig. 48).
Ang reaksyon ay sinamahan ng isang bilang ng mga kontrol (Talahanayan 18). Ang pagkakasunud-sunod ng pagdaragdag ng mga sangkap ng reaksyon sa test tube ay napakahalaga. Hindi mo maaaring i-layer ang serum sa antigen (sa control - sa isang isotonic solution), dahil mas malaki ang relative density ng serum, lulubog ito sa ilalim ng test tube, at ang hangganan sa pagitan ng mga likido ay hindi mabubunyag.
Talahanayan 18. Scheme para sa pag-set up ng ring precipitation reaction
Tandaan. + pagkakaroon ng isang "singsing"; - kawalan ng "singsing".
Ang mga resulta ay naitala pagkatapos ng 5-30 minuto, sa ilang mga kaso pagkatapos ng isang oras, gaya ng nakasanayan na nagsisimula sa mga kontrol. Ang "singsing" sa 2nd test tube ay nagpapahiwatig ng kakayahan ng immune serum na pumasok sa isang partikular na reaksyon na may kaukulang antigen. Dapat ay walang "singsing" sa 3-5 test tubes - walang mga antibodies at antigens na naaayon sa bawat isa. Ang isang "singsing" sa 1st tube - isang positibong resulta ng reaksyon - ay nagpapahiwatig na ang test antigen ay tumutugma sa kinuha na immune serum, ang kawalan ng isang "singsing" (isang "singsing" lamang sa 2nd tube) ay nagpapahiwatig ng kanilang hindi pagkakapare-pareho - isang negatibo resulta ng reaksyon.
Reaksyon ng pag-ulan sa agar (gel). Ang kakaiba ng reaksyon ay ang pakikipag-ugnayan ng antigen at antibody ay nangyayari sa isang siksik na daluyan, ibig sabihin, sa isang gel. Ang resultang precipitate ay nagbibigay ng malabo na guhit sa kapal ng daluyan. Ang kawalan ng banda ay nagpapahiwatig ng pagkakaiba sa pagitan ng mga bahagi ng reaksyon. Ang reaksyong ito ay malawakang ginagamit sa biomedical na pananaliksik, lalo na sa pag-aaral ng pagbuo ng toxin sa causative agent ng dipterya.
Kontrolin ang mga tanong
1. Ano ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng agglutination at precipitation reactions?
2. Bakit hindi maaaring gamitin ang maulap na sangkap sa reaksyon ng pag-ulan?
Mag-ehersisyo
1. I-set up ang ring precipitation reaction at i-sketch ang resulta.
2. Pag-aralan ang likas na katangian ng pakikipag-ugnayan ng antigen sa antibody sa reaksyon ng precipitation sa agar, i-sketch ang resulta (kumuha ng isang tasa mula sa iyong guro).
Maraming mga virus ang may kakayahang pagsama-samahin ang mga pulang selula ng dugo ng mahigpit na tinukoy na mga species ng mga mammal at ibon. Kaya, pinagsasama-sama ng mga virus ng trangkaso at beke ang mga erythrocyte ng mga manok, guinea pig, at mga tao, at ang mga adenovirus ay nagsasama-sama ng mga erythrocyte ng mga daga at daga. Kaugnay nito, upang makita ang mga ito sa materyal ng mga pasyente o kultura ng mga cell, embryo at hayop, reaksyon ng hematglutination(RGA). Upang gawin ito, ang dobleng pagtaas ng mga dilution ng mga materyales at likido na naglalaman ng virus ay inihanda sa mga balon ng mga plato, pagdaragdag sa kanila ng mga suspensyon ng mga erythrocytes NaCl na hugasan ng isotonic solution. Upang makontrol ang kusang pagsasama-sama, ang mga pulang selula ng dugo ay hinahalo sa pantay na dami ng isotonic NaCl solution. Ang mga mixtures ay incubated sa isang thermostat sa 37°C o sa room temperature.
Ang mga resulta ng pagsusuri sa X-ray ay isinasaalang-alang sa pamamagitan ng likas na katangian ng erythrocyte agglutination pagkatapos ng 30-60 minuto, kapag sila ay karaniwang ganap na nauuna sa kontrol. Ang isang positibong reaksyon ay ipinahiwatig ng mga plus. “++++” – sediment sa anyo ng “umbrella”, “+++” – sediment na may lumens, “++” – sediment na may malalaking lumens, “+” – flocculent sediment na napapalibutan ng zone ng crumpled erythrocytes , at "–" - ang parehong malinaw na tinukoy na sediment ng mga erythrocytes sa anyo ng isang "button" tulad ng sa control
Dahil partikular sa grupo, hindi ginagawang posible ng RGA na matukoy ang mga species ng mga virus. Nakikilala sila gamit mga reaksyon ng pagsugpo sa hematglutination(RTGA). Upang i-set up ito, ginagamit ang kilalang immune antiviral sera, na diluted sa dalawang beses na pagbaba ng mga konsentrasyon sa isang isotonic sodium chloride solution at ibinuhos sa mga balon. Ang isang pantay na dami ng likidong naglalaman ng virus ay idinagdag sa bawat pagbabanto. Ang kontrol ay isang suspensyon ng virus sa isang isotonic sodium chloride solution. Ang mga plato na may pinaghalong serum at virus ay pinananatili sa isang termostat sa loob ng 30 minuto o sa temperatura ng silid sa loob ng 2 oras, pagkatapos ay isang suspensyon ng mga pulang selula ng dugo ay idinagdag sa bawat isa sa kanila. Pagkatapos ng 30 minuto, ang titer ng virus-neutralizing serum (i.e., ang pinakamataas na pagbabanto nito), na nagdulot ng pagkaantala sa erythrocyte agglutination, ay natutukoy.
Ginagamit ang RTGA sa serological diagnosis ng mga sakit na viral, sa partikular na mga impeksyon sa trangkaso at adenoviral. Mas mainam na gamitin ito sa parehong paraan tulad ng RN, na may mga ipinares na serum. Ang isang apat na beses na pagtaas sa titer ng antibody sa pangalawang serum ay nagpapatunay sa presumptive diagnosis
5 Reaksyon ng neutralisasyon ng virus. Ang reaksyong ito ay ginagamit upang makilala ang mga virus. Upang gawin ito, ang isang tiyak na antiviral serum ay idinagdag sa materyal ng pagsubok na naglalaman ng hindi kilalang virus. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog, ang halo na ito ay itinuturok sa alinman sa isang chick embryo, isang laboratoryo na hayop, o isang cell culture. Ang pinakakaraniwang reaksyon ay ang neutralisasyon ng mga virus sa cell culture. Narito ang isang tagapagpahiwatig ay idinagdag sa medium ng kultura. Kung ang mga antibodies ay tumutugma sa virus (i-neutralize ito), kung gayon ang kultura ng cell ay bubuo nang normal. Sa kasong ito, ang mga acidic na produkto ng cellular metabolism ay inilabas, ang pH ng daluyan ay bumababa, at ang tagapagpahiwatig ay nagbabago ng kulay nito. Sa kontrol, mabilis na sinisira ng virus ang kultura ng cell, ang pH ay hindi nagbabago, at ang kulay ng medium ay nananatiling pareho.
Ang hemagglutination delay (inhibition) reaction (RDHA, HRI) ay malawakang ginagamit sa pagsasanay kapwa para sa pagtukoy at pagtukoy ng titer ng antibodies sa serum ng dugo ng mga may sakit at nabakunahang hayop, at para sa pagtukoy ng mga nakahiwalay na virus mula sa kilalang serum. Ang serological reaction na ito ay maaaring gawin lamang sa mga virus na may hemagglutinating properties.
Ang agglutination ng mga erythrocytes sa panahon ng mga impeksyon sa viral ay napansin bilang isang resulta ng direktang pakikipag-ugnayan ng virus sa ibabaw ng mga erythrocytes (hemagglutination reaction - HRA). Direktang nangyayari ang RHA sa pinaghalong hemagglutinating virus na may mga pulang selula ng dugo. Maaaring ma-neutralize ang RHA kung, bago makipag-ugnayan sa mga erythrocytes, ang isang tiyak na immune serum ay idinagdag sa hemagglutinating virus (reaksyon ng pagsugpo, pagkaantala ng hemagglutination - RHA, RHA).
Ang RGA at RTGA ay unang iminungkahi para sa pagtuklas ng influenza virus at titration ng anti-influenza antibodies. Di-nagtagal, lumitaw ang mga ulat sa aktibidad ng hemagglutinating ng mga virus ng vaccinia, false fowl fever, beke, bulutong, mouse pneumonia, tigdas, arbo-, adeno- at parainfluenza na mga virus, pati na rin ang mga bituka na virus. Pinagsasama-sama ng mga myxovirus ang mga erythrocyte ng maraming species ng mga hayop at ibon, mga virus ng bulutong at mga bakuna - mga erythrocytes ng mga tandang, mga arbovirus at virus ng tigdas - mga erythrocytes ng mga unggoy at gansa, karamihan sa mga virus ng bituka na hindi polio - mga erythrocyte ng tao.
Ang reaksyon ng hemagglutination ay nakikita sa anyo ng mga pulang natuklap ("payong") - isang positibong reaksyon. Sa kasong ito, ang red blood cell sediment ay isang negatibong reaksyon.
Ang reaksyon ng pagsugpo sa hemagglutination ay nakikita sa anyo ng isang sediment ng erythrocytes ("button") - isang positibong reaksyon. Sa kasong ito, ang agglutination flakes ay isang negatibong reaksyon.
Pagpapasiya ng bacterial sensitivity sa antibiotics gamit ang indicator disc method.
Ang chemotherapy at chemoprophylaxis ay mahalaga sa paggamot at pag-iwas sa mga nakakahawang sakit, ang pagiging epektibo nito ay higit na nakasalalay sa sensitivity ng mga microorganism sa mga antimicrobial na gamot. Kabilang sa mga chemotherapeutic agent na ginagamit upang gamutin ang mga pasyente na may purulent-septic na impeksiyon, ang mga antibiotic ay sumasakop sa nangungunang lugar.
Upang matukoy ang pagiging sensitibo ng mga nakahiwalay na microorganism sa mga antibiotic, malawakang ginagamit ang paraan ng pagsasabog ng disk. Ang kulturang pinag-aaralan ay sinuspinde sa isang sterile saline solution para maghanda ng 1 bilyong suspensyon ayon sa turbidity standard. Ang isang bacterial suspension (1 ml) ay ibinubuhos gamit ang isang sterile pipette sa ibabaw ng isang siksik na nutrient medium sa isang Petri dish at ibinahagi nang pantay-pantay gamit ang isang spatula. Ang labis na likido ay tinanggal gamit ang isang pipette. Ang spatula at mga pipette ay inilalagay sa isang baso na may solusyon sa disinfectant. Ang mga papel na disc na naglalaman ng ilang partikular na dosis ng iba't ibang antibiotic ay inilalagay sa inoculated surface na may sterile tweezer sa pantay na distansya mula sa isa't isa at 2 cm mula sa gilid ng tasa. Ang mga pananim ay incubated sa 37°C hanggang sa susunod na araw. Ang diameter ng mga zone ng pag-iwas sa paglago ng pinag-aralan na kultura ng bakterya ay ginagamit upang hatulan ang pagiging sensitibo nito sa mga antibiotics. Upang makakuha ng maaasahang mga resulta, kinakailangan na gumamit ng karaniwang mga disk at nutrient media, para sa kontrol kung aling mga reference strain ng mga nauugnay na microorganism ang ginagamit. Ang disk method ay hindi nagbibigay ng maaasahang data kapag tinutukoy ang sensitivity ng mga microorganism sa polypeptide antibiotics na hindi maganda ang diffuse sa agar (halimbawa, polymyxin, ristomycin).
Paglago ng staphylococcus sa yolk-salt agar.
Upang maghanda ng 20% yolk-salt agar, magdagdag ng 20 ml ng isang suspensyon ng yolk ng itlog ng manok sa isang sterile physiological solution sa 100 ml ng natunaw at pinalamig sa 60 0 C meat-peptone agar (pH = 7.2) na may 10% sodium chloride. Sa yolk-salt agar, ang lecithovitellase activity (LecA) (ang kakayahang sirain ang egg yolk lecithovitellin) ng mga nasubok na microorganism ay nakita. Ang resulta ay tinasa pagkatapos ng 24 na oras ng pagpapapisa ng itlog sa isang termostat sa 37 0 C sa pamamagitan ng pagbuo ng maulap na sona na may bahaghari na halo sa paligid ng mga kolonya. Isinasaalang-alang sa masasalamin na liwanag
Ang mga patuloy na katangian ng mga microorganism ay antilysozyme activity (ALA).
Ang ALA ay isang secretory persistence factor. Ang ALA ay pinag-aaralan gamit ang pamamaraan ng O.V. Bukharin et al. (1984). Upang gawin ito, ang iba't ibang mga dosis ng egg lysozyme (mula 1 hanggang 5 μg) ay idinagdag sa 1.5% nutrient agar at ibinuhos sa mga pagkaing Petri. Matapos tumigas ang daluyan, ang isang patak ng 1 bilyong suspensyon ng pang-araw-araw na agar na kultura ng mikroorganismo na pinag-aaralan ay inilalapat sa pinatuyong ibabaw. Ang mga pinggan ay incubated sa isang thermostat sa 37 0 C sa loob ng 24 na oras, pagkatapos kung saan ang mga lumaki na kolonya ay ginagamot ng chloroform vapor sa loob ng 20 minuto, pagkatapos ay isang layer ng 0.7% nutrient agar ay nilagyan ng 0.1 ml ng 1 bilyong suspensyon ng araw-araw na agar. kultura ng Micrococcus luteus (lysodeikticus) ATSS 15307 (GISC na pinangalanang Tarasevich) na sensitibo sa lytic action ng lysozyme. Ang mga resulta ay naitala pagkatapos ng 24 na oras ng pagpapapisa ng itlog sa isang termostat batay sa pagkakaroon ng micrococcus growth zone sa paligid ng mga strain na iyon na neutralisahin ang egg lysozyme na idinagdag sa agar layer. Ang aktibidad ng antilysozyme ay ipinahayag sa μg ng lysozyme na hindi aktibo sa daluyan.
Ang mga kolonya ng ALA+ at ALA- strain ng mga microorganism ay makikita sa plate na ito. Sa itaas ng mga kolonya ng mga strain ng ALA+ mayroong paglago ng micrococcus sa anyo ng mga maliliit na dilaw na kolonya.
Aktibidad ng Lysozyme.
Lysozyme – isang thermostable na protina, isang enzyme, na sumisira sa cell wall ng nakararami na gram-positive bacteria sa pamamagitan ng pagsira sa β-glycosidic bonds sa pagitan ng mga amino sugar ng peptidoglycan, na nagtataguyod ng pagbuo ng mga protoplast kasama ng kanilang kasunod na lysis. Nakapaloob sa lahat ng tissue fluid, leukocytes, macrophage at iba pang phagocytic cells. Ang lysozyme ay pangunahing ginawa ng mga selula ng monocyte/macrophage series. Pinahuhusay ng Lysozyme ang aktibidad ng antibacterial ng antigen (microbe)-antibody-complement complex, na nagtataguyod ng lysis ng peptidoglycan ng bacterial cell wall. Bilang karagdagan sa mga hayop, mayroong mga halaman at microbial lysozymes.
Ang microbial lysozyme ay isa sa mga kadahilanan ng kolonisasyon. Aktibidad ng Lysozyme (LA) tinutukoy sa pamamagitan ng paghahasik ng microorganism culture na pinag-aaralan sa isang nutrient medium na naglalaman ng 1 bilyong suspensyon ng araw-araw na agar culture ng Micrococcus luteus (lysodeikticus) ATCC 15307 (GISC na pinangalanang Tarasevich). Ang resulta ay tinasa pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog sa 37 0 C sa loob ng 24 na oras sa zone ng lysis sa kapal ng daluyan ng indicator micrococcus strain sa paligid ng pinag-aralan na mga kolonya.
Pamamaraan ng immunoenzyme
Ang Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ay isang laboratory immunological na pamamaraan para sa qualitative o quantitative determination ng iba't ibang compound, macromolecules, virus, atbp., na batay sa isang partikular na antigen-antibody reaction. Ang pagkakakilanlan ng nabuo na kumplikado ay isinasagawa gamit ang enzyme bilang isang label para sa pag-record ng signal.
Ang ELISA ay lumitaw noong kalagitnaan ng 60s at orihinal na binuo bilang isang paraan para sa pagtukoy ng antigen sa isang histological specimen, pati na rin para sa pag-visualize ng mga linya ng pag-ulan sa immunodiffusion at immunoelectrophoresis na mga pagsubok, at pagkatapos ay nagsimulang gamitin para sa quantitative determination ng antigens at antibodies sa mga biyolohikal na likido. Nakibahagi sina E. Engvall at R. Pählman sa pagbuo ng pamamaraan, gayundin, nang nakapag-iisa, sina W. Van Weeman at R. Schurs.
Ang pamamaraan ay batay sa tiyak na pagbubuklod ng isang antibody sa isang antigen, na may isa sa mga sangkap na pinagsama sa isang enzyme; bilang isang resulta ng reaksyon sa kaukulang chromogenic substrate, isang may kulay na produkto ay nabuo, ang halaga nito ay maaaring matukoy spectrophotometrically .
Ang pagtuklas ng posibilidad ng immobilizing antigen at antibody sa iba't ibang mga carrier habang pinapanatili ang kanilang aktibidad na nagbubuklod ay naging posible upang mapalawak ang paggamit ng ELISA sa iba't ibang larangan ng biology at medisina.
Ang paglitaw ng mga monoclonal antibodies ay nag-ambag sa karagdagang pag-unlad ng ELISA, na naging posible upang madagdagan ang sensitivity, specificity at reproducibility ng mga resulta.
Sa teorya, ang ELISA ay batay sa data mula sa modernong immunochemistry at chemical enzymology, kaalaman sa mga batas ng physicochemical ng reaksyon ng antigen-antibody, pati na rin sa mga pangunahing prinsipyo ng analytical chemistry. Ang sensitivity ng ELISA at ang oras na kinakailangan ay tinutukoy ng maraming pangunahing mga kadahilanan: ang kinetic at thermodynamic na mga katangian ng reaksyon ng antigen-antibody, ang ratio ng mga reagents, ang aktibidad ng enzyme at ang paglutas ng mga pamamaraan ng pagtuklas nito. Sa pangkalahatan, ang reaksyon ng antigen-antibody ay maaaring ilarawan sa pamamagitan ng isang simpleng pamamaraan: +[AG]↔[ATAG]
Ang iba't ibang mga bagay ng pag-aaral mula sa mga low-molecular compound hanggang sa mga virus at bakterya, pati na rin ang isang hindi karaniwang malawak na hanay ng mga gawain na nauugnay sa iba't ibang mga kondisyon para sa paggamit ng ELISA, ay tumutukoy sa pagbuo ng isang napakalaking bilang ng mga variant ng pamamaraang ito.
Ang anumang bersyon ng ELISA ay naglalaman ng 3 mandatoryong yugto:
1. ang yugto ng pagkilala sa test compound ng isang antibody na tiyak dito, na humahantong sa pagbuo ng isang immune complex;
2. ang yugto ng pagbuo ng koneksyon ng conjugate sa immune complex o may mga libreng binding site;
3. yugto ng pag-convert ng label ng enzyme sa isang naitala na signal.
Ang pangunahing diagram ng isang enzyme immunoassay para sa pag-detect ng AT ay ang mga sumusunod. Kilalang AG (virus, protina) - ang diagnosticum ay naayos sa solid phase. Ang serum ng paksa na may hindi kilalang antibodies ay idinagdag dito. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog at paghuhugas, ang mga antibodies na partikular dito ay mananatili sa antigen, kung mayroon man sa serum ng paksa. Upang makita ang AG-AT complex, ang rabbit antiglobulin serum na may label na enzyme (AGS-F) ay idinagdag dito. Upang makuha ang serum na ito, ang isang kuneho ay nabakunahan ng human globulin. Ang serum na nakuha mula sa isang kuneho ay may label na may ilang enzyme, halimbawa, malunggay peroxidase. Kung ang test serum ay naglalaman ng mga antibodies sa antigens (diagnosticum), sila ay magsisilbing antigen para sa antiglobulin serum. Pagkatapos ng pangalawang paghuhugas, ang nagreresultang complex na AG+AT+AGS-F ay maaaring makita sa pamamagitan ng pagdaragdag ng substrate para sa enzyme (hydrogen peroxide) at isang indicator para sa mga produkto ng substrate cleavage (chromogen para sa reactive oxygen species). Ang isang pagbabago sa kulay ng tagapagpahiwatig ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng nais na mga antibodies sa suwero ng paksa.
Kitta-Tarozzi Miyerkules.
Masustansyang sabaw na may glucose at mga piraso ng sariwang organo ng hayop. Ang glucose at mga piraso ng organ ay may kakayahang magpababa. Ang daluyan ay natatakpan ng isang layer ng sterile na langis sa itaas, na hindi pinapayagan ang oxygen mula sa hangin papunta sa daluyan. Bilang isang resulta, ang mga kondisyon ay nilikha para sa paglilinang ng mga anaerobic microorganism.
Maraming mga virus ang may kakayahang pagsama-samahin ang mga pulang selula ng dugo ng mahigpit na tinukoy na mga species ng mga mammal at ibon. Kaya, ang mga virus ng trangkaso at beke ay pinagsasama-sama ang mga erythrocyte ng mga manok, guinea pig, at mga tao, at ang mga adenovirus ay nagsasama-sama ng mga erythrocyte ng mga daga at daga. Kaugnay nito, upang makita ang mga ito sa materyal ng mga pasyente o kultura ng mga cell, embryo at hayop, reaksyon ng hematglutination(RGA). Upang gawin ito, ang dobleng pagtaas ng mga dilution ng mga materyales at likido na naglalaman ng virus ay inihanda sa mga balon ng mga plato, pagdaragdag sa kanila ng mga suspensyon ng mga erythrocytes NaCl na hugasan ng isotonic solution. Upang makontrol ang kusang pagsasama-sama, ang mga pulang selula ng dugo ay hinahalo sa pantay na dami ng isotonic NaCl solution. Ang mga mixtures ay incubated sa isang thermostat sa 37°C o sa room temperature.
Ang mga resulta ng pagsusuri sa X-ray ay isinasaalang-alang sa pamamagitan ng likas na katangian ng erythrocyte agglutination pagkatapos ng 30-60 minuto, kapag sila ay karaniwang ganap na nauuna sa kontrol. Ang isang positibong reaksyon ay ipinahiwatig ng mga plus. “++++” – sediment sa anyo ng “umbrella”, “+++” – sediment na may lumens, “++” – sediment na may malalaking lumens, “+” – flocculent sediment na napapalibutan ng zone ng crumpled erythrocytes , at "–" - ang parehong malinaw na tinukoy na sediment ng mga erythrocytes sa anyo ng isang "button" tulad ng sa control
Dahil partikular sa grupo, hindi ginagawang posible ng RGA na matukoy ang mga species ng mga virus. Nakikilala sila gamit mga reaksyon ng pagsugpo sa hematglutination(RTGA). Upang i-set up ito, ginagamit ang kilalang immune antiviral sera, na diluted sa dalawang beses na pagbaba ng mga konsentrasyon sa isang isotonic sodium chloride solution at ibinuhos sa mga balon. Ang isang pantay na dami ng likidong naglalaman ng virus ay idinagdag sa bawat pagbabanto. Ang kontrol ay isang suspensyon ng virus sa isang isotonic sodium chloride solution. Ang mga plato na may pinaghalong serum at virus ay pinananatili sa isang termostat sa loob ng 30 minuto o sa temperatura ng silid sa loob ng 2 oras, pagkatapos ay isang suspensyon ng mga pulang selula ng dugo ay idinagdag sa bawat isa sa kanila. Pagkatapos ng 30 minuto, ang titer ng virus-neutralizing serum (i.e., ang pinakamataas na pagbabanto nito), na nagdulot ng pagkaantala sa erythrocyte agglutination, ay natutukoy.
Ginagamit ang RTGA sa serological diagnosis ng mga sakit na viral, sa partikular na mga impeksyon sa trangkaso at adenoviral. Mas mainam na gamitin ito sa parehong paraan tulad ng RN, na may mga ipinares na serum. Ang isang apat na beses na pagtaas sa titer ng antibody sa pangalawang serum ay nagpapatunay sa presumptive diagnosis
Reaksyon ng neutralisasyon.
Napakahirap na kilalanin ang isang virus sa pamamagitan ng likas na katangian ng pagkilos nito sa isang monolayer ng kultura ng cell, na sinisira o nagiging sanhi ng iba't ibang uri ng mga pagbabago sa istruktura sa kanila, at samakatuwid ay gumagamit sila ng pagtatanghal. mga reaksyon ng neutralisasyon(RN) ng mga virus na may kilalang virus-neutralizing sera. Para sa layuning ito, ang virus na nakuha mula sa pasyente ay naipon sa cell culture at ang iba't ibang dilution nito ay hinaluan ng undiluted antiviral serum o, sa kabaligtaran, ang isang pare-parehong dosis ng virus ay idinagdag sa iba't ibang mga dilution ng immune serum. Ang mga mixtures ay incubated sa isang thermostat. Pagkatapos nito, ang pinaghalong virus at serum ay ginagamit upang makahawa sa isang cell culture at ang neutralizing power ng mga antibodies nito ay hinuhusgahan ng kawalan ng cytopathic effect sa mga cell. Ang pinaghalong mga virus at serum ay maaaring makahawa sa mga embryo ng manok o mga sensitibong hayop. Sa ganitong mga kaso, ang aktibidad ng neutralizing ng mga antibodies ay natutukoy sa pamamagitan ng pagpigil sa pagbuo ng mga pathological na pagbabago sa chorioallantoic membrane; neutralisasyon ng viral hemagglutinins sa mga embryonic fluid, pag-aalis ng nakamamatay na epekto ng virus sa mga hayop
Katulad nito, sa tulong ng RN, ang mga virus na nakahiwalay sa materyal ng mga pasyente sa panahon ng impeksyon ng mga embryo ng manok at hayop ay natukoy. Sa ganitong mga kaso, ang mga embryonic fluid na naglalaman ng virus at mga suspensyon ng mga apektadong organo ng hayop ay idinaragdag sa virus-neutralizing sera. Pagkatapos ng isang tiyak na oras ng pagpapapisa ng itlog, ang mga kultura ng cell, mga embryo ng manok at mga hayop ay nahawaan ng mga pinaghalong.
Sa serodiagnosis ng mga impeksyon sa viral RN, tinutukoy ang mga antibodies sa pag-neutralize ng virus sa serum ng mga pasyente batay sa isang kilalang virus. Inilagay nila ito sa dynamics na may ipinares na sera, ang isa ay kinuha sa taas ng sakit, at ang pangalawa - pagkatapos ng 2-3 na linggo, at ang diagnosis ay nakumpirma ng isang apat na beses na pagtaas sa titer ng antibody sa huli na ito.
№ 83 Enzyme immunoassay, immunoblotting. Mekanismo, mga bahagi, aplikasyon.
Naka-link na immunosorbent assay o paraan - pagtuklas ng mga antigen gamit ang kanilang mga kaukulang antibodies na pinagsama sa isang tag na enzyme (horseradish peroxidase, beta-galactosidase o alkaline phosphatase). Pagkatapos pagsamahin ang antigen sa immune serum na may label na enzyme, ang substrate/chromogen ay idinagdag sa pinaghalong. Ang substrate ay pinuputol ng enzyme at nagbabago ang kulay ng produkto ng reaksyon - ang intensity ng kulay ay direktang proporsyonal sa bilang ng mga nakagapos na molekula ng antigen at antibody. ELISA ang ginagamit para sa pagsusuri ng mga viral, bacterial at parasitic na sakit, lalo na para sa pagsusuri ng mga impeksyon sa HIV, hepatitis B, atbp., pati na rin ang pagpapasiya ng mga hormone, enzymes, gamot at iba pang biologically active substance na nakapaloob sa test material sa menor de edad na konsentrasyon (10 10 -10 12 g/l).
Solid phase ELISA- isang variant ng pagsubok kapag ang isa sa mga bahagi ng immune reaction (antigen o antibody) ay na-sorbed sa isang solid carrier, halimbawa, sa mga balon ng polystyrene plates. Natutukoy ang mga bahagi sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mga may label na antibodies o antigens. Kung positibo ang resulta, nagbabago ang kulay ng chromogen. Sa bawat oras pagkatapos magdagdag ng isa pang sangkap, ang mga hindi nakatali na reagents ay tinanggal mula sa mga balon sa pamamagitan ng paghuhugas,
I. Kapag tinutukoy ang mga antibodies (kaliwang figure), ang blood serum ng pasyente, antiglobulin serum na may label na enzyme, at isang substrate/chromogen para sa enzyme ay sunud-sunod na idinaragdag sa mga balon ng mga plato na may sorbed antigen.
II. Kapag tinutukoy ang isang antigen (kanang figure), isang antigen ay idinagdag sa mga balon na may sorbed antibodies (halimbawa, serum ng dugo na may nais na antigen), isang diagnostic serum laban dito at pangalawang antibodies (laban sa diagnostic serum), na may label na isang enzyme. , ay idinagdag, at pagkatapos ay isang substrate/chromogen para sa enzyme.
Competitive ELISA upang makilala ang mga antigen: ang target na antigen at ang antigen na may label na enzyme ay nakikipagkumpitensya sa isa't isa upang magbigkis ng limitadong halaga ng immune serum antibodies.
Ang isa pang pagsubok ay ang Competitive ELISA para sa pagtukoy ng mga antibodies: ang ninanais na mga antibodies at mga antibodies na may label na enzyme ay nakikipagkumpitensya sa isa't isa para sa mga antigen na na-adsorb sa solid phase.
Immunoblotting- isang napaka-sensitibong paraan para sa pag-detect ng mga protina, batay sa kumbinasyon ng electrophoresis at ELISA o RIA. Ang immunoblotting ay ginagamit bilang isang diagnostic na paraan para sa impeksyon sa HIV, atbp.
Ang mga pathogen antigen ay pinaghihiwalay gamit ang polyacrylamide gel electrophoresis, pagkatapos ay inilipat mula sa gel sa activated paper o nitrocellulose membrane at binuo gamit ang ELISA. Ang mga kumpanya ay gumagawa ng gayong mga piraso na may "blots" ng mga antigens. Ang serum ng pasyente ay inilalapat sa mga pirasong ito. . Pagkatapos, pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog, hinuhugasan ang pasyente mula sa mga hindi nakatali na antibodies at inilapat ang serum laban sa mga immunoglobulin ng tao na may label na isang enzyme. . Ang complex na nabuo sa strip [antigen + patient antibody + antibody against human Ig] ay natutukoy sa pamamagitan ng pagdaragdag ng chromogenic substrate na nagbabago ng kulay sa ilalim ng pagkilos ng isang enzyme.