Metode relaksacije temelje se na načelu da kod brzog vanjskog utjecaja na sustav (promjena temperature, tlaka itd.) vrijeme koje je sustavu potrebno da postigne novu ravnotežu (ili stacionarno stanje) ovisi o brzini kemikalije. reakciju (a ponekad i na brzinu difuzije reagensa).
Razmotrimo najjednostavniju reakciju kompleksiranja aktivnog centra enzima s ligandom
U početku je sustav u ravnoteži koju karakterizira konstanta ravnoteže K 0 =K(T 0) i, sukladno tome, ravnotežne koncentracije 
,
,
. Pretpostavimo da se temperatura u sustavu naglo mijenja T->T 0 +T. To dovodi do promjene konstante ravnoteže K->K 0 +K, što je određeno relacijom
(2.50)
gdje je H– standardna promjena entalpije. Nakon toga sustav prelazi u novo ravnotežno stanje:
(2.51)
(2.52)
Jednadžba (2.51) je nelinearna. Uzmimo da je odstupanje od ravnoteže malo i tada
a jednadžba (2.51) se transformira u linearnu diferencijalnu jednadžbu:
Rješenje ove diferencijalne jednadžbe je:
Veličina
(2.54)
naziva vrijeme opuštanja.
2.5. Utjecaj temperature i pH na brzinu enzimskih reakcija
O utjecaju ovih čimbenika na brzinu elementarne kemijske reakcije raspravljalo se u 1. poglavlju. Posebnost je u tome što su enzimske reakcije složene višestupanjske reakcije (sastoje se od mnogih elementarnih reakcija). Osim toga, stanje molekula enzima u otopini karakterizira skup konformera koji reverzibilno prelaze jedan u drugi. Konformacijski prijelazi molekule u velikoj su mjeri određeni temperaturom i pH otopine.
2.6. Inhibicija enzimskih reakcija
Tvari koje inhibiraju katalitičku aktivnost enzima nazivaju se inhibitori . Postoje dvije glavne klase inhibitora - reverzibilan
(2.55)
(pesticidi, sarin, soman, aspirin itd.)
I nepovratan (inaktivatore )
(2.55)
(ugljični monoksid, cijanidni ion, analgin itd.)
2.7. Inaktivacija enzima
Biopolimerne molekule (enzimi) su termodinamički nestabilne i u pravilu mijenjaju svoju strukturu i svojstva tijekom vremena. U većini slučajeva, proces inaktivacije može se opisati kao prijelaz između dva stanja enzima koji je aktivan. E a i neaktivan E ja :
(2.56) Kinetika procesa opisuje se odgovarajućom diferencijalnom jednadžbom
(2.57)
a karakteriziran je vremenskom konstantom
(2.58)
Proces inaktivacije enzima može imati različitu fizikalno-kemijsku prirodu. Najčešća je toplinska denaturacija, a to je značajno restrukturiranje makromolekule, promjena tercijarne i djelomično sekundarne strukture.
U svrhu inaktivacije može se koristiti kavitacijski ultrazvuk, radioaktivno zračenje itd.
Promjena pH također može dovesti do denaturacije enzima. Pri svakoj pH vrijednosti protein karakterizira odgovarajuća raspodjela naboja (ionogene skupine). Pri vrlo niskom ili vrlo visokom pH, raspodjela naboja može značajno polarizirati molekulu, dovesti do pojave izomera i nepovratno je uskladiti s razaranjem strukture aktivnog centra. Na primjer:
Denaturaciju enzima uzrokuje sredstva za denaturaciju, uništavajući sekundarnu strukturu proteina (na primjer, ureu), kao i oksidativne procese koji uključuju kisik.
Pri proučavanju takvih procesa važne informacije dobivaju se metodama relaksacije. U pravilu, konformacijske promjene prate promjene u okruženju aromatskih aminokiselina - tirozina i triptofana (traka apsorpcije zračenja na 290 nm). To se očituje u promjenama u spektru apsorpcije i fluorescencije.
Reverzibilne konformacijske promjene obično se događaju u vremenu od 0,1-100 ms, a nepovratne - 1-1000 minuta.
Primjer 1. Najjednostavnija kinetička shema inaktivacije s konformerskom ravnotežom:
(2.59)
Kinetika procesa opisuje se jednim karakterističnim vremenom
(2.60)
Primjer 2. Oba konformera podliježu inaktivaciji:
(2.61)
(2.62)
Primjer 3. Općenitiji slučaj za sustav koji uključuje n konformeri:
Enzimi često stvaraju dimere u otopini, a stabilniji su u dimernom obliku. Zatim se promatra disocijativni mehanizam inaktivacije :
(2.65)
Sljedeća shema odražava moguće mehanizme inaktivacije tijekom reakcije (monomolekularna inaktivacija slobodnog oblika enzima, monomolekularna inaktivacija kompleksa enzim-supstrat, bimolekularna inaktivacija enzima supstratom, bimolekularna inaktivacija enzima produktom) :
(2.66)
Razlikovanje mehanizama inaktivacije i određivanje kinetičkih karakteristika reakcije obično se provodi pomoću nekoliko metoda:
analiza ovisnosti prinosa proizvoda o koncentraciji enzima;
uspostavljanje odnosa između stupnja konverzije supstrata i stupnja inaktivacije enzima;
izvođenje reakcije pri niskim stupnjevima konverzije supstrata i niskim koncentracijama enzima;
izvođenje reakcije pri visokim koncentracijama enzima;
predinkubacija enzima s komponentama reakcije;
korištenje integralnih jednadžbi reakcije.
dr.sc.
Kuznjecova Ekaterina Igorevna Mehanizmi inaktivacije enzima
1. Promjena primarne strukture:
1.1. Pucanje polipeptidnog lanca:
Teški uvjeti (dugotrajno ključanje u HCl) –
hidrolizom do pojedinačnih aminokiselina.
Kad se zagrije na 100 °C (pH 7-8), hidroliza
peptidne veze su beznačajne.
Najosjetljiviji na
hidroliza na visokoj temperaturi su
peptidne veze koje tvore ostaci
asparaginska kiselina.
Proteaze (bakterijska kontaminacija, autoliza). Riješenje:
inaktivirani enzimi. 1.2.Oksidacija funkcionalnih skupina enzima
SH skupine fragmenata cisteina i indola
triptofan, na povišenim temperaturama, može
oksidiraju (sulfoksi-cisteinski spojevi
(SOH, SO2H) i nastaju produkti
otvaranje indolnog prstena triptofana. Riješenje:
Ponovno aktivirajte restorativnim sredstvima
agense, posebno tiole niske molekularne težine
(na primjer, cistein ili ditiotreitol).
Uzrokovano: Tioli i drugi smanjeni
spojevi sumpora, na primjer Na2SO3, Na2S2O3.
Produkt redukcije disulfidne veze
(S-S) je:
1) tiolni oblik (protein–SH)
2) miješani disulfid tiolnog oblika proteina sa
redukcijski reagens, na primjer
protein–S–SO3). 1.3. Cijepanje disulfidnih veza
Alkalna hidroliza cisteina→dehidroalanina→
Zbog svojih nukleofilnih svojstava
stupa u interakciju s NH2 skupinama lizina i SHcisteina → lizinoalanina i lantionina.
Za potpuno uništenje svih S–S veza potrebni su prilično strogi uvjeti (0,1–1 M lužine,
100 °C).
Međutim, uništavanje je najreaktivnije
S–S veze mogu se pojaviti u prilično mekim
uvjetima - na primjer, na temperaturama od 60–80 ° C i
blago alkalne pH vrijednosti.
Treba uzeti u obzir kada se koriste enzimi u
kao dodaci deterdžentima. Riješenje:
Dodatak tiola u medij će dovesti do
cijepanje miješanog disulfida i
naknadno stvaranje ispravne S–S veze 1.4. Kemijska modifikacija katalitičkih SH skupina.
Kationi teških metala (Hg, Pb i Cu)
vežu se za SH skupine aktivnog mjesta
enzim
↓
Stvaranje odgovarajućih merkaptida
↓
Enzim je inaktiviran
10.
1.5. Fosforilacija proteina in vivo.Pod utjecajem fosforilaze i fosfataze,
sadržano u polupročišćenom enzimskom
lijekovi u obliku nečistoća
↓
Fosforna kiselina veže se za OH skupine
serin i treonin.
↓
Konformacijske promjene proteina
molekula
↓
inaktivacija enzima.
11.
Riješenje:Primjera u literaturi praktički nema
sretno s reaktivacijom na ovaj način
inaktivirani enzimi.
12.
1.6. Deaminacija ostataka asparagina.Na temperaturama (oko 100 °C) i pH (oko
4,0–5,0) dolazi do deaminacije ostataka
asparagin.
↓
inaktivacija enzima.
13.
Riješenje:Primjera u literaturi praktički nema
sretno s reaktivacijom na ovaj način
inaktivirani enzimi.
14.
1.7. Inaktivacija enzima zračenjemγ-zračenje i UV svjetlo
Utječu na funkcionalne skupine
enzimi, peptidne veze i SH skupine
cisteinskih ostataka.
15.
2. AgregacijaPromatrano na povišenim temperaturama, na
ekstremne pH vrijednosti, u prisustvu
neki kemijski spojevi.
Što je veća koncentracija, to brže ide
agregacija.
Hidrofobne interakcije i vodik
veze, moguća je tvorba disulfidnih veza
mostovi između pojedinih proteina
molekule
16.
Riješenje:Potrebno je uništiti intermolekularne
kovalentni i nekovalentni kontakti c
pomoću koncentriranih otopina
urea i gvanidin klorid, ekstremno
pH vrijednosti.
Ako agregacija enzima rezultira stvaranjem
mediju se dodaju međumolekularni S-S mostovi
relativno niske koncentracije
(μmol/L) reagensi koji sadrže tiol (npr.
cistein ili ditiotreitol).
U takvim koncentracijama, intramolekularni
S–S veze u proteinu obično nisu pogođene.
17.
3. Površinska inaktivacija enzimanapetost
Površinska napetost na granici
između zraka i čiste vode je 80
din/cm.
Pjenjenje uzrokuje denaturaciju
enzimi adsorbirani na granici
fazama
18.
Riješenje:Dodavanje surfaktanta smanjuje površinu
napetost do 1 din/cm.
19.
4. Sorpcija proteina na stijenkama reakcijeBrod
Sorpcija uslijed nekovalentnih interakcija
dovodi do smanjenja koncentracije enzima u
riješenje.
Mora se uzeti u obzir pri radu s
razrijeđene otopine proteina
(koncentracija 10-8–10-10 mol/l).
Pod utjecajem denaturirajućih čimbenika
sposobnost proteina da se adsorbuju na stijenke
reakcijska posuda se može povećati.
20.
Riješenje:Desorpcija enzima sa stijenki reakcije
posuda se postiže kroz destrukciju
nespecifične interakcije između
proteina i sorpcijskih centara na površini
Brod.
Mogu se koristiti ekstremne pH vrijednosti
koncentrirane otopine uree ili
gvanidin klorid.
21.
5. Disocijacija oligomernih proteina upodjedinice
Uzrokovano: Urea, deterdženti, kiseline ili
grijanje.
Vodi do:
konformacijske promjene pojedinca
podjedinice;
agregacija podjedinica;
disocijacija kofaktora od aktivnih centara;
modifikacije funkcionalnih skupina koje
oligomerni protein je zaštićen od
kontakt s otapalom.
22.
6. Desorpcija kofaktora s aktivnog mjestaenzim
Uzroci: zagrijavanje, kelatni učinci, dijaliza
Ako je popraćena disocijacija kofaktora
značajni konformacijski pomaci ili
kemijska modifikacija važnih
funkcionalne skupine → enzim
je nepovratno inaktiviran.
Ako nema značajnog
promjene u konformaciji proteina, zatim dodavanjem
u okruženju viška kofaktora dovodi do
reaktivacija enzima.
23.
Regeneracija kofaktoraMetode regeneracije:
Enzimske (metode koje koriste konjugirane supstrate ili enzime)
Neenzimski (kemijski i
elektrokemijski pristupi)
24.
Enzimska metodaU sustav se unose prekomjerne količine.
konjugirani supstrat istog enzima:
Primjer: kada djeluje alkoholna dehidrogenaza
NADH se troši.
25.
Enzimska metoda1. Upotreba konjugiranih supstrata.
Hendikep:
koriste se visoke koncentracije
konjugirani supstrat, budući da je ravnoteža
reakcije su jako pomaknute u stranu
stvaranje alkohola;
komplicira postupak identifikacije glavnog
produkt iz reakcijske smjese.
26.
Enzimska metoda2. Korištenje u paru
enzimske reakcije
Enzim 2 se dodatno uvodi u sustav,
čije je funkcioniranje osigurano
regeneracija koenzima.
Enzimi koji se koriste u sustavu moraju imati
različita specifičnost supstrata
27.
Neenzimske metode1. Kemijske metode.
Natrijev ditionit i neki
piridinijeve soli:
+ Niska cijena.
- može inhibirati određene enzime.
Flavinski koenzimi
28.
Neenzimske metode2. Elektrokemijske metode.
Izravna elektrokemijska redukcija odn
oksidacija.
Pojava “-” tijekom procesa regeneracije
enzimski neaktivni oblici koenzima,
primjerice kao rezultat njegove dimerizacije.
29. STABILIZACIJA ENZIMA U BIOTEHNOLOŠKIM SUSTAVIMA
30.
Problemi koji su se pojavili tijekom korištenjaenzimi u biotehnološkim procesima:
1. Povišene temperature
2. Ekstremne pH vrijednosti
3. Visoke koncentracije organskih
otapala ili površinski aktivne tvari.
4. Nemogućnost ponovne uporabe
enzim.
5. Poteškoće u odvajanju enzima od
proizvod.
31.
Osnovni pristupi stabilizacijienzimi:
1. Dodavanje stabilizirajućih tvari u medij,
u kojem se enzim skladišti ili izvodi
enzimska reakcija.
2. Kemijska modifikacija enzima.
3. Imobilizacija enzima.
32.
1. Supstrati ili njihovi analozi:
Kompleks enzim-supstrat često je više
stabilniji od slobodnog enzima.
Primjer: Laktat dehidrogenaza u prisutnosti
laktat je toplinski stabilniji.
33.
Stabilizacija enzima pomoću:2. Organska otapala:
Polihidrični alkoholi stabiliziraju neke
enzima povećanjem stabilnosti
intramolekulske proteinske vodikove veze.
Primjer: Kimotripsin u prisutnosti 50–90%
glicerol je otporniji na proteolizu
34.
Stabilizacija enzima pomoću:3. Soleil:
Pri niskim koncentracijama soli (<0,1M) катионы
Ca2+, Zn2+, Mn2+, Fe2+ itd. mogu posebno
komuniciraju s metaloproteinima.
Neki od njih su kofaktori.
Ca2+ je sposoban stabilizirati tercijarni
struktura niza proteina zbog nastajanja
ionske veze s dvije različite
aminokiselinskih ostataka.
Primjer: α-amilaza (iz bacillus caldolyticus)
Ca2+ značajno povećava toplinsku
održivost.
35.
36.
Kemijska modifikacija enzima1. Enzim poprima stabilniji
konformacija.
2. Uvođenje novih funkcionalnih skupina u protein
dovodi do stvaranja dodatnih
stabilizirajuće vodikove veze ili sol
mostovi.
3. Pri uporabi nepolarnih spojeva
hidrofobne interakcije su pojačane.
4. Modifikacija hidrofobnih površina
proteina hidrofilnim spojevima smanjuje
područje nepovoljnog kontakta vanjskih
nepolarni ostaci s vodom.
Primjer: glutaraldehid
37.
Imobilizacija enzima omogućuje:Povećati stabilnost enzima (toplina,
autoliza, izloženost agresivnim sredinama itd.)
1. Ponovno upotrijebite enzim
2. Odvojite enzim od reagensa i proizvoda
reakcije.
3. Prekinite reakciju u pravom trenutku.
38.
Imobilizirani enzimi su lijekovienzima čije su molekule povezane s
nosač, uz zadržavanje potpuno odn
dijelom njegova katalitička svojstva.
Metode imobilizacije:
1. Kemijski
2. Tjelesni
39.
Metode imobilizacije:Mogu se koristiti sljedeći mediji:
1)Organski materijali:
1.1) prirodni (polisaharidi, proteini, lipidi)
1.2) sintetski polimerni nosači
2) Anorganski materijali (matrice na
na bazi silika gela, glina, keramika, prirodno
minerali, itd.)
40.
1) adsorpcija enzima na netopljivom nosaču
kao rezultat elektrostatičkog, hidrofobnog,
van der Waals i druge interakcije;
;
strukture;
4) Priključak na dvofazni sustav.
41.
Metode fizičke imobilizacije:Postiže se kontaktom vodene otopine
enzim s nosačem.
42.
Metode fizičke imobilizacije:1) adsorpcija enzima na netopljivom nosaču
Čimbenici koji utječu na adsorpciju:
1. Specifična površina i poroznost nosača
2. pH vrijednost (na neionskim izmjenjivačima maksimalna adsorpcija
u izoelektričnoj točki proteina)
3. Ionska jakost otopine (povećanje ionske jakosti –
desorpcija enzima, ali ponekad i suprotna situacija
“isoljivanje”)
4. Koncentracija enzima.
5. Temperatura (s jedne strane denaturacija, s druge
druga ubrzana difuzija)
43.
Metode fizičke imobilizacije:1) adsorpcija enzima na netopljivom nosaču
Prednosti:
2) Dostupnost medija
Mane:
1) Nedovoljna čvrstoća lijepljenja
2) Mnogi mediji su biorazgradivi
44.
Metode fizičke imobilizacije:2) uključivanje enzima u polupropusnu
kapsula, u polupropusnoj membrani
45.
Metode fizičke imobilizacije:2) uključivanje enzima u polupropusnu
kapsula, u polupropusnoj membrani
Prednosti:
1) Relativna jednostavnost tehnike
2) Zaštita od mikroorganizama
3) Ne postoje ograničenja difuzije (budući da
Omjer površine i površine je visok i
debljina membrane je mala)
Mane:
1) Biorazgradivo
2) Nije primjenjivo za velike molekularne težine
46.
Metode fizičke imobilizacije:3) mehaničko uključivanje enzima u gel
strukture
Enzim je uključen u trodimenzionalnu mrežu
polimerni lanci koji tvore gel.
47.
Metode fizičke imobilizacije:3) mehaničko uključivanje enzima u gel
strukture
Treba uzeti u obzir:
1. Podudarnost veličine pora s veličinom enzima.
2. Priroda matrice (budući da stvara
mikrookruženje za enzim, možda
stvoriti pH različit od pH otopine i
povećati afinitet supstrata za matricu, što
povećava brzinu enzimske reakcije)
48.
Metode fizičke imobilizacije:3) mehaničko uključivanje enzima u gel
strukture
Prednosti:
1) Relativna jednostavnost tehnike
2) Povećana mehanička, kemijska i
toplinska otpornost matrica.
3) Enzim je stabiliziran
4) Enzim je zaštićen od bakterija
šteta
Mane:
1) Nije primjenjivo za velike molekularne težine
49.
Metode fizičke imobilizacije:4) Priključak na dvofazni sustav
Enzim je topiv samo u jednoj od faza, i
proizvod - drugome
Omogućuje vam rad u visokoj molekularnoj težini
podloge.
50.
Metode kemijske imobilizacije:Stvaranje kovalentnih veza između
enzim i nosač.
Prednosti:
1) Visoka čvrstoća konjugata
2) Stabilnost enzima može se povećati
51.
Kod imobilizacije enzima potrebno jeu skladu sa sljedećim uvjetima:
1. Aktivne skupine matrice ne bi trebale
blokiraju katalitički centar enzima.
2. Imobilizacija ne smije dovesti do gubitka
aktivnost enzima.
52.
Vrlo obećavajuće je korištenje ukao imobilizirani biokatalizatori
Stanice.
Jer može se izbjeći:
1) skupi koraci izolacije i pročišćavanja
enzima
2) potreba za njihovom naknadnom stabilizacijom
53.
TermozimiStabilan u uvjetima visoke temperature,
visoke koncentracije soli i ekstremne
pH vrijednosti.
Hipertermofilni mikroorganizmi
nalazi među arhejama i bakterijama, žive
na temperaturama od 80-100 °C.
54.
Mehanizmi odgovorni za toplinsku stabilnostenzimi u termozimima:
Između mezofilnih i termofilnih
inačice enzima – visok stupanj homologije
sekvence i strukture.
Dakle, sekvence termostabilnih
dehidrogenaze iz Pyrococcus i Thermotoga na 35 i
55% odnosno identično
sekvence mezofilne dehidrogenaze
od Clostridium.
55.
Otkriveno je da dehidrogenaza iz Pyrococcusfuriosus (Tm == 105 °C) sadrži 35 izoleucina,
dok dehidrogenaze iz Thermotoga
maritima (Tm = 95 °C) i Clostridium symbiosum (Tm
= 55 °C) samo 21 i 20 izoleucini
odnosno.
Toplinski stabilni enzimi sadrže manje
glicin: Cs dehidrogenaza sadrži 48 ostataka
glicin, a dehidrogenaze samo iz Tm i Pf
39 odnosno 34 glicina.
Više izoleucina, a manje glicina.
56.
Povećana toplinska stabilnost korelira:1) s povećanjem krutosti proteinske strukture
smanjenjem sadržaja rezidua
glicin,
2) s poboljšanjem hidrofobnih kontakata u jezgri
dehidrogenaze iz Pf kao rezultat zamjene valinom
izoleucin. (Kao rezultat usmjerenosti na web mjesto
mutageneza koja dovodi do zamjene izoleucina
valin termostabilni mutanti
smanjen).
57.
Mehanizmi stabilizacije:minimiziranje dostupnog hidrofobnog područja
površina proteina;
optimizacija pakiranja atoma proteina
molekule (minimizirajući omjer
površina/volumen);
optimizacija raspodjele naboja (postignuta
zahvaljujući eliminaciji odbojnih
interakcije, kao i kao rezultat organizacije
interakcije između naboja u svojstvenu
neto)
Smanjenje broja depresija
58.
Primjena enzima iz ekstremofilaSuvremene tehnologije molekularne biologije
a genetski inženjering omogućuje:
1) dobiti dovoljne količine enzima iz
ekstremofili za njihovo naknadno
analizu i praktičnu primjenu.
2) kloniranje i ekspresija ovih enzima u
mezofilni organizmi.
59.
Škrob se koristi za proizvodnju šećera.
Prvo se proces provodi na (95–105 °C) i pri vrijednostima
pH 6–6,5.
U sljedećoj fazi temperatura pada na 60°C i
pH=4,5.
Primjena termostabilnih enzima (αamilaza, glukoamilaza, ksiloza izomeraza),
izolirani od hipertermofila omogućit će:
1) provesti proces u jednoj fazi i istovremeno
istim uvjetima
2) napustiti skupe ionske izmjenjivače
60.
Primjena enzima iz ekstremofila:Najtermostabilnije α-amilaze bile su
pronađen u arheji Pyrococcus woesei,
Pyrococcus furiosus, Desulfurococcus mucosus,
Pyrodictium abyssi i Staphylothermus
marinus. Geni amilaze iz Pyrococcus sp. bili
kloniran i eksprimiran u E.coli i Bacillus
subtilis.
61.
Primjena enzima iz ekstremofila:Proteolitički enzimi
Serinske alkalne proteinaze su široko rasprostranjene
koriste se kao dodaci deterdžentima
sredstva.
Proteinaze iz ekstremofila zadržavaju
rodnost na visokim temperaturama, in
prisutnost visokih koncentracija deterdženata i
druga sredstva za denaturaciju. pirokok,
Thermococcus, Staphylothermus, Desulfurococcus i
Sulfolobus. Maksimalna aktivnost ovih
enzimi se razvijaju pri temperaturama
od 90 do 110 °C i pH vrijednosti od 2 do 10
62.
Primjena enzima iz ekstremofila:DNA polimeraze
Koriste se termostabilne DNA polimeraze
u PCR-u i imaju važnu ulogu u genetičkom inženjeringu.
Termostabilne polimeraze pronađene su u
hipertermofili Pyrococcus furiosus i Pyrococcus
litoralis, kao i kod termofila Thermus aquaticus.
Količina enzima prisutna u tkivima u bilo kojem trenutku određena je relativnim brzinama njegove sinteze i razgradnje, kao i koncentracijama različitih vrsta inhibitora i aktivatora. U pravilu, razgradnja enzima i smanjenje njihove količine u mediju odvija se polagano. Inhibicija i aktivacija enzima može se izvesti vrlo brzo - unutar nekoliko sekundi.
Postoje mnoge metode za određivanje i izražavanje aktivnosti pojedinih enzima. To je zbog raznolikosti enzima, prisutnosti i upotrebe različitih supstrata za određivanje njihove aktivnosti.
Međunarodna biokemijska unija predložila je sljedeću definiciju enzimske jedinice: " Jedinica bilo kojeg enzima smatra se količinom koja katalizira pretvorbu jednog mikromola supstrata po minuti pod danim standardnim uvjetima ». Broj mikromola bit će jednak broju standardnih jedinica . Međunarodna komisija predložila je, ako je moguće, da se aktivnost enzima odredi na 30 °C i pri pH vrijednostima i koncentracijama supstrata optimalnim za enzimsku aktivnost.
Su česti svojstva enzima istjecati od njihove proteinske prirode . Enzimi termolabilni, njihova aktivnost ovisi o pH i vlažnosti , u kojem posluju, kao i iz utjecaj aktivatora i inhibitora .
Kada temperatura poraste do određenih granica, aktivnost enzima se povećava. Kada se postigne optimalna temperatura za enzim, njegova katalitička aktivnost je najveća. Optimalna temperatura za mnoge enzime je najčešće u unutar 40 do 50 °C (optimalna za biljne enzime je 50 - 60 ° C, a za enzime životinjskog podrijetla - 40 - 50 ° C). Međutim, optimalna temperatura nije strogo konstantna i ovisi o mnogo razloga, a posebice o trajanju grijanja. Što dulje djeluje enzim, optimalna temperatura treba biti niža. .
U temperaturnom rasponu od 0 do 50 °C, s povećanjem ili smanjenjem temperature za svakih 10 °C, aktivnost enzima se povećava odnosno smanjuje za 1,4-2 puta. Daljnjim zagrijavanjem aktivnost enzima opada, i na 80 – 100 °C enzimi obično potpuno gube svoja katalitička svojstva zbog denaturacije proteina .
Temperatura inaktivacije (gubitak aktivnosti) različita je za različite enzime. Tako se inaktivacija enzima amilaze u otopini događa na 70 °C, saharaze - na 59, tripsina i pepsina - na 65 °C. U suhom stanju, enzimi mogu tolerirati zagrijavanje do viših temperatura. Ali na vrlo visokim temperaturama, deaktivacija enzima se događa trenutno. Pasterizacija, sterilizacija, blanširanje i prokuhavanje uništavaju enzime .
Nakon toplinske inaktivacije, neki enzimi obnavljaju svoju katalitičku aktivnost. Primjer je peroksidaza, koja čak i zagrijavanjem od 60 s do 150 °C ne gubi potpuno svoja katalitička svojstva. Stoga se peroksidaza smatra najtermostabilnijim enzimom.
Na temperaturama ispod 0 °C, katalitička aktivnost enzima naglo opada, ali se i dalje održava čak i kada se hrana zamrzne.
Reakcija okoline ima značajan utjecaj na katalitičku aktivnost enzima. Enzimi pod utjecajem pH okoline mijenjaju svoju topljivost, osmotski tlak, viskoznost i druga svojstva. Vjeruje se da promjene enzimske aktivnosti ovisno o pH okoliša povezane su s promjenama ionizacija enzimi, supstrat ili kompleks enzim-supstrat .
Enzimi pokazuju optimalnu aktivnost samo unutar određenih pH granica koje su im svojstvene.. Dakle, pepsin, koji se oslobađa u visoko kiselu okolinu želuca, ima optimum djelovanja pri pH 1,5 i 2,5. Istovremeno, proteaze, koje izlučuje gušterača u dvanaesnik, imaju optimalnu aktivnost u alkalnoj pH zoni, a optimalno djelovanje tripsina je u pH rasponu od 8-9. Pri pH vrijednosti iznad ili ispod optimalne, aktivnost enzima opada .
Većina enzima najaktivnija je u neutralnim, blago alkalnim ili blago kiselim sredinama. Kako se pH vrijednost pomiče s optimalne na kiselu ili alkalnu, aktivnost enzima se smanjuje.
Aktivatori i inhibitori(paralizatori) enzima mogu prema tome ojačati ili oslabiti pa čak i zaustaviti njihovu aktivnost. Aktivatori enzimi su metalni ioni: Na + , K + , Rb + , Mg 2+ , Ca 2+ , Cu 2+ , Fe 2+ i spojevi koji sadrže sulfhidrilne skupine: SH, HCN, H 2 S . Prisutnost navedenih metala ili spojeva u otopini u određenoj koncentraciji pridonosi ispoljavanju pune aktivnosti nekih enzima.
Svi enzimi su osjetljivi na inhibiciju zbog denaturacije ili razaranja proteina enzima.
Suština djelovanja inhibitora u većini slučajeva je u tome da se oni spajaju s aktivnim skupinama ili aktivnim centrima molekule enzima. razlikovati opći i specifični inhibitori . DO opći inhibitori koji inhibiraju djelovanje svih enzima , uključiti soli teških metala (olovo, srebro, živa), trikloroctena kiselina i tanin . Često je inhibicija ili prestanak djelovanja enzima pod utjecajem teških metala reverzibilan, a ako se u medij dodaju tvari koje tvore spojeve s tim metalima, aktivnost enzima se obnavlja.
Specifični inhibitori djeluju samo na određene enzime. Dakle, cijanovodična kiselina djeluje samo na oksidativne enzime koji sadrže željezo ili bakar u aktivnom središtu. Cijanovodična kiselina spaja se s metalima, a enzim gubi aktivnost.
U živoj stanici regulacija djelovanja enzima provodi se ne samo uz pomoć specifičnih aktivatora i inhibitora, već i vezanjem enzima na različite koloidne strukture protoplazme. Ovo vezanje enzima dovodi do gubitka njihove aktivnosti. Oslobađanje enzima iz spoja ponovno obnavlja njegovu katalitičku aktivnost.
Enzimi inaktiviraju se pri vrlo visokim pritiscima . Međutim, nakon što se pritisak ukloni, enzimi obnavljaju svoju katalitičku aktivnost.
Djelovanje enzima je u suhoj hrani jako usporeno, ali ne prestaje u potpunosti. Rezultati aktivnosti enzima mogu se očitovati u promjenama kvalitete proizvoda - njegovom tamnjenju, pogoršanju arome, okusa, konzistencije itd.
Brzina većine enzimskih reakcija proporcionalna je koncentraciji enzima, barem u najranijim fazama. Izvan početnih faza, brzina enzimskih reakcija se smanjuje.
Enzim tvori kompleks sa supstratom, koji disocira na slobodni enzim i konačni produkt reakcije:
gdje je E enzim; S – podloga; ES – kompleks enzim-supstrat; P – finalni proizvod.
Količina supstrata je vrlo velika u usporedbi s količinom enzima, pa stoga koncentracija supstrata uvelike utječe na brzinu enzimskih reakcija. Ako je supstrat sadržan u značajnom višku, tada je količina stvorenog proizvoda proporcionalna vremenu. Kako se koncentracija supstrata smanjuje, količina konačnog produkta (P) nastalog u jedinici vremena se smanjuje.
Prisutnost enzima u otopini prosuđuje se po njegovom djelovanju. Dakle, prisutnost amilaze u slini može se procijeniti sposobnošću sline da saharificira škrob, prisutnost želučanog pepsina - njegovom sposobnošću da dovoljnom brzinom otopi bjelanjak ili fibrin.
Regulacijom aktivnosti enzima stvaranjem odgovarajućeg reakcijskog okruženja možete kontrolirati brzinu reakcija koje kataliziraju, kao i aktivnost enzima sadržanih u prehrambenim proizvodima, što vam omogućuje provođenje mjera za skladištenje žitarica, krumpira , voća i povrća, proizvodnja niza proizvoda (vino, čaj, itd.).
Nomenklatura i klasifikacija enzima
U početnom razdoblju razvoja proučavanja enzima, oni su dobivali nazive bez specifičnog sustava, na temelju slučajnih karakteristika, naziva supstrata ili tipa katalizirane reakcije. Dakle, enzim pepsin je dobio ime od grčke riječi "pepsis" - probavljam, papain - iz soka biljke papaje, bogatog enzimom. Dešavalo se da pojedini autori istom enzimu daju različita imena.
U vezi s naglim razvojem znanosti o enzimima - fermentologije, 1961. godine stalni odbor za enzime pri Međunarodnoj biokemijskoj uniji izradio je suvremenu nomenklaturu i klasifikaciju enzima. U skladu s tom klasifikacijom naziv enzima sastavljen je od kemijskog naziva supstrata i naziva reakcije koju enzim provodi. Na latinski naziv korijena supstrata na koji enzim djeluje (saharoza - saharoza), ili na naziv procesa koji katalizira ovaj enzim (hidroliza - hidrolaze), dodan završetak"aza". Uz nove nazive za mnoge enzime, sačuvani su i stari koji su se čvrsto ustalili u znanstvenoj literaturi (pepsin, tripsin, papain itd.).
Prema suvremenoj klasifikaciji, svi enzimi se dijele na šest klase: oksidoreduktaze; transferaze; hidrolaze; liaze; izomeraze; ligaze (sintetaze) . Klasifikacija enzima temelji se na prirodi njihova djelovanja.
Svaki razred je podijeljen na podrazrede, a svaki podrazred podijeljen je na skupine.
Oksidoreduktaze
To su enzimi koji kataliziraju redoks reakcije koji se javljaju u živim organizmima. Reakcije oksidacije tvari u organizmima uvijek su popraćene reakcijama redukcije. Oksidoreduktaze se dijele na 14 podrazreda (najopsežnija klasa enzima).
Oksidacija se javlja kao proces uklanjanja vodika (elektrona) iz supstrata, a redukcija kao dodavanje vodikovih atoma (elektrona) akceptoru. Ova reakcija može se shematski prikazati na sljedeći način:
AN 2 + B = A + VN 2,
gdje je AN2 tvar koja predaje svoj vodik i naziva se donor; B je tvar koja oduzima vodik i naziva se akceptor.
Različite tvari mogu biti podvrgnute oksidaciji - ugljikohidrati, masti, proteini, aminokiseline, vitamini itd.
Ulogu oksidoreduktaza u živim tkivima obavljaju opsežne skupine dehidrogenaze I oksidaze , koji se nazivaju ovisno o supstratu koji oksidiraju. Tako se enzim koji dehidrira jabučnu kiselinu naziva malat dehidrogenaza, enzim koji dehidrira etilni alkohol naziva se alkohol dehidrogenaza, itd.
U klasi oksidoreduktaza glavne su dehidrogenaze koje provode reakciju dehidrogenacije. Sve dehidrogenaze dijele se u dvije skupine : anaerobne i aerobne, koje se nazivaju oksidaze .
Anaerobne dehidrogenaze su specifični enzimi koji kataliziraju apstrakcija vodika od određenih kemikalija i prenoseći ga na druge enzime – prijenosnike vodika. Ove dehidrogenaze su dvokomponentni enzimi kod kojih se koenzim lako odvaja od proteinskog dijela. Kao koenzim Anaerobne dehidrogenaze mogu sadržavati dvije tvari - nikotin amid adenin nukleotid ( IZNAD ) ili nikotin amid adelin nukleotid fosfat ( NADP ). Obje ove tvari imaju izuzetno visoka reaktivna redoks svojstva.
Postoje mnoge poznate anaerobne dehidrogenaze koje kataliziraju oksidaciju raznih organskih spojeva. Tako laktat dehidrogenaza katalizira oksidaciju mliječne kiseline u pirogrožđanu kiselinu, izocitrat dehidrogenaza - oksidaciju izocitrične kiseline u oksalno-jantarnu kiselinu.
Grupi aerobne dehidrogenaze (oksidaze) uključuju enzime koji sadrže kao koenzim uključeno vitamin B 2 , (riboflavin ), stoga se takvi enzimi nazivaju flavin . Flavinski enzimi sposobni su ukloniti vodik iz tvari koja se oksidira i prenijeti ga na druge spojeve ili kisik iz zraka:
2H 2 O 2 → 2H 2 O + O 2.
Uzimajući vodik iz tvari koja se oksidira i prenoseći ga na kisik zraka, oksidaza može stvoriti vodu ili vodikov peroksid (H 2 O ili H 2 O 2). Ova skupina enzima uključuje polifenol oksidazu, askorbat oksidazu i glukozo oksidazu.
Polifenol oksidaza je aerobna dehidrogenaza za koju Akceptor vodika je plin kisik .
Djeluje na o-difenole, polifenole, tanine i tirozin. Polifenol oksidaza je široko rasprostranjena u gljivama i višim biljkama, posebno u listovima zelenog čaja. Djelovanjem polifenol oksidaze objašnjava se tamnjenje prerezanog mesa voća i povrća, krumpira, kao i tamnjenje svježih listova čaja pri motanju. Polifenol oksidaza ima važnu ulogu kao intermedijer u disanju biljaka.
Enzim peroksidaza zajedno s polifenol oksidazom i citokrom oksidazom aktivno sudjeluje u procesima disanja biljaka i obrambenim reakcijama biljaka od biljnih patogenih mikroorganizama.
Aktivna skupina peroksidaze sadrži željezo . Pomoću enzima peroksidaze zbog vodikovog peroksida i nekih drugih organskih peroksida dolazi do oksidacije organskih spojeva. Peroksidaza tvori složeni organski spoj, uslijed čega se peroksid aktivira i stječe sposobnost da djeluje kao akceptor vodika:
Mnogi organski spojevi reagiraju s atmosferskim kisikom i tvore perokside. Posebno lako nastaju peroksidi kada atmosferskim kisikom oksidiraju spojevi s nezasićenim vezama: karotenoidi, nezasićene masne kiseline i neki ugljikovodici.
Enzim katalaza katalizira proces cijepanja vodikovog peroksida na vodu i kisik:
Molekula katalaze, poput peroksidaze, sadrži željezo . Glavna svrha katalaze u tijelu je da uništava vodikov peroksid, koji je štetan za stanice, a nastaje tijekom disanja.
Enzim lipoksigenaza katalizira stvaranje peroksida i hidroperoksida tijekom oksidativnog kvarenja masti.
Sa stajališta učinkovitosti korištenja biokatalizatora, bilo bi izuzetno primamljivo ne samo povećati stabilnost enzima, već i naučiti kako obnoviti aktivnost enzimskih pripravaka potrošenih tijekom tehnološkog procesa.
Gotovo istovremeno s otkrićem fenomena inaktivacije enzima (početak dvadesetog stoljeća), istraživači su počeli pokušavati njihovu reaktivaciju. Do danas se nakupilo dosta pozitivnih primjera u tom smjeru. Prikladno ih je klasificirati prema razlozima koji uzrokuju inaktivaciju.
Reaktivacija agregiranih proteina. Često se može postići uništavanjem međumolekulskih nekovalentnih kontakata (hidrofobne, elektrostatske, vodikove veze). U tu svrhu koriste se isti denaturanti koji uništavaju nekovalentne interakcije u nativnim proteinima, uzrokujući njihovu reverzibilnu denaturaciju: koncentrirane otopine uree i gvanidin klorida, ekstremne pH vrijednosti itd.
Reaktivacija proteina s promijenjenom primarnom strukturom. Ako je protein izgubio aktivnost kao rezultat kemijske modifikacije funkcionalnih skupina, tada ga se može pokušati reaktivirati pomoću obrnute kemijske reakcije. Enzimi inaktivirani modifikacijom SH skupina (na primjer, oksidacijom) ponekad se mogu reaktivirati dodavanjem viška tiola male molekularne težine ili drugog redukcijskog sredstva.
Desorpcija inaktiviranih proteina sa stijenki krvnih žila. "Sorptivna inaktivacija" proteina uzrokovana je slabim nekovalentnim interakcijama (električne, hidrofobne, vodikove veze) između proteina i površine reakcijske stanice. Reaktivacija se u ovom slučaju postiže uništavanjem nespecifičnih interakcija pri ekstremnim pH vrijednostima, pod utjecajem koncentriranih otopina uree ili gvanidin klorida i drugih reagensa koji su "reverzibilni denaturanti" za većinu proteina.
Reaktivacija "nepovratno denaturiranog" proteina. Reaktivacija se može izvesti prema sljedećoj dvostupanjskoj shemi: prvo treba uništiti sve u inaktiviranom proteinu, uključujući nenativne nekovalentne interakcije, tj. protein treba prenijeti u razmotano stanje i iz tog stanja treba ga pokušati saviti u nativnu konformaciju. Dakle, u općem slučaju, problem reaktivacije bilo kojeg "nepovratno denaturiranog" enzima u biti će se svesti na rješavanje dva problema. Prvo, tražiti uvjete pod kojima se inaktivirani protein može razmotati. Za razmotavanje inaktiviranih proteina obično se koriste isti reagensi koji se mogu koristiti za pretvaranje prirodnih (neinaktiviranih) proteina u nasumično spiralno stanje. To su koncentrirane otopine reverzibilnih denaturanata (urea ili gvanidin klorid). Drugo, eksperimentalni odabir uvjeta pod kojima se nesmotani protein uspješno savija u nativnu (katalitički aktivnu) konformaciju. U tu svrhu često su korisni efektori enzimske aktivnosti (supstrati, inhibitori, kofaktori itd.), koji su ujedno i sklopivi efektori, tj. povećavaju prinos reaktivacije enzima.
Regeneracija kofaktora (koenzima)
Kategorija kofaktora uključuje koenzime, prostetske skupine i metalne ione. S tehnološkog gledišta, regeneracija koenzima je od najvećeg interesa. Koenzimi su organski spojevi niske molekulske mase koji igraju ulogu dodatnog supstrata u funkcioniranju mnogih enzima.
Kod primjene sustava imobiliziranih enzima s koenzimima potrebno je riješiti dva problema: stvarnu regeneraciju koenzima i njegovo zadržavanje u reakcijskom sustavu. Potonje se obično postiže kovalentnom imobilizacijom koenzima na polimernim nosačima. Razvijeno je nekoliko pristupa za regeneraciju, čija se bit odražava u sljedećem dijagramu:
Prema ovoj shemi, koenzim koji se mijenja u reakciji u kojoj sudjeluje jedan od enzima, zahvaljujući sustavu konjugiranih reakcija, regenerira, tj. vraća u prvobitno stanje. Ovisno o vrsti konjugirane reakcije, sve metode regeneracije koenzima mogu se podijeliti u dvije skupine: enzimske i neenzimske. Enzimske metode uključuju metode regeneracije pomoću konjugiranih supstrata ili konjugiranih enzima. Neenzimski putovi se mogu podijeliti na kemijske i elektrokemijske putove.
Sustav regeneracije ATP-a je kontinuirani proces pretvaranja ADP u ATP, u kojem enzimi koji fosforiliraju difosfat djeluju kao katalizatori, koristeći spojeve koji sadrže fosfat (acetil fosfat, kreatin fosfat, arginin fosfat itd.) kao donore fosfata.