Η ιντερφερόνη είναι γενετικά τροποποιημένη. Ιντερφερόνες, φύση, μέθοδοι παραγωγής και χρήσης. Βλάβη από μύκητες μούχλας

Οι ιντερφερόνες είναι μόρια πρωτεΐνης με μοριακό βάρος από 15.000 έως 21.000 daltons που παράγονται και εκκρίνονται από τα κύτταρα ως απόκριση σε ιογενή μόλυνση ή άλλα παθογόνα.

Οι ιντερφερόνες (IFNs) είναι μια ομάδα αυτογενών γλυκοπρωτεϊνών, ο εμβιομηχανικός μηχανισμός δράσης των οποίων σχετίζεται με ταυτόχρονη αντιική δράση - ενεργοποίηση κυτταρικών γονιδίων, ως αποτέλεσμα της οποίας συντίθενται πρωτεΐνες που αναστέλλουν τη σύνθεση του ιικού DNA (RNA) και έχουν ανοσοτροποποιητικό αποτέλεσμα - η ικανότητα ενίσχυσης της έκφρασης αντιγόνων στις κυτταρικές μεμβράνες και αύξησης της δραστηριότητας των κυτταροτοξικών Τ κυττάρων και των φυσικών φονικών κυττάρων.

Οι IFN χωρίζονται σε δύο τύπους. Ο πρώτος τύπος, ο οποίος δρα ως αναστολείς της ιικής αναπαραγωγής και έχει κυρίως αντιϊκή δράση, περιλαμβάνει 22 διαφορετικούς υποτύπους IFN-α και έναν υποτύπο IFN-β. Ο δεύτερος τύπος, ο οποίος εμφανίζει ανοσοτροποποιητική δράση, περιλαμβάνει την IFN-γ.

Υπάρχουν τρεις ανοσολογικά διακριτές κατηγορίες IFN: IFN-α, IFN-β, IFN-γ.

Οι φυσικώς απαντώμενες IFN περιλαμβάνουν λεμφοβλαστοειδές και λευκοκυτταρικό IFN (IFN-α), που συντίθενται από αντίστοιχα διεγερμένα ανθρώπινα μονοκύτταρα και Β λεμφοκύτταρα, τα οποία στη συνέχεια εκχυλίζονται και καθαρίζονται. IFN ινοβλάστης (IFN-β), που λαμβάνεται από καλλιέργεια ανθρώπινων ινοβλαστών, και IFN Τ-λεμφοκυττάρων (IFN-γ).

Οι τεχνητά συντιθέμενες IFN περιλαμβάνουν την ανασυνδυασμένη ΙΡΝ-α, η οποία είναι ένας υψηλά καθαρισμένος απλός υποτύπος της IFN-α που παράγεται χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένη μοριακή τεχνολογία.

Υπάρχουν γνωστές μέθοδοι για τη λήψη ανθρώπινης ιντερφερόνης λευκοκυττάρων από λευκοκύτταρα αίματος ανθρώπινου δότη, που προκαλούνται από ιούς και άλλους επαγωγείς.

Το κύριο μειονέκτημα αυτών των μεθόδων για την παραγωγή ιντερφερονών είναι η πιθανότητα μόλυνσης του τελικού προϊόντος με ανθρώπινους ιούς, όπως ο ιός της ηπατίτιδας Β και C, ο ιός της ανοσοανεπάρκειας κ.λπ.

Επί του παρόντος, η μέθοδος παραγωγής ιντερφερόνης με μικροβιολογική σύνθεση έχει αναγνωριστεί ως πιο υποσχόμενη, γεγονός που καθιστά δυνατή την απόκτηση του προϊόντος-στόχου με σημαντικά υψηλότερη απόδοση από σχετικά φθηνές πρώτες ύλες. Οι προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται εδώ καθιστούν δυνατή τη δημιουργία παραλλαγών ενός δομικού γονιδίου που είναι βέλτιστες για βακτηριακή έκφραση, καθώς και ρυθμιστικών στοιχείων που ελέγχουν την έκφρασή του.

Διάφορα σχέδια στελεχών Pichia pastoris, Pseudomonas putida και Escherichia coli χρησιμοποιούνται ως μικροοργανισμοί πηγής.

Το μειονέκτημα της χρήσης του P. pastoris ως παραγωγού ιντερφερόνης είναι οι εξαιρετικά δύσκολες συνθήκες ζύμωσης αυτού του τύπου ζύμης και η ανάγκη αυστηρής διατήρησης της συγκέντρωσης του επαγωγέα, ιδιαίτερα της μεθανόλης, κατά τη διάρκεια της διαδικασίας βιοσύνθεσης.

Το μειονέκτημα της χρήσης Ps. putida είναι η πολυπλοκότητα της διαδικασίας ζύμωσης σε χαμηλό επίπεδο έκφρασης (10 mg ιντερφερόνης ανά 1 λίτρο μέσου καλλιέργειας). Πιο παραγωγική είναι η χρήση στελεχών Escherichia coli.

Είναι γνωστός ένας μεγάλος αριθμός πλασμιδίων και στελεχών E. coli που δημιουργήθηκαν με βάση τους και εκφράζουν ιντερφερόνη: στελέχη E. coli ATCC 31633 και 31644 με πλασμίδια Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 ή Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli στέλεχος pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli στέλεχος pINF-F-Pa (AU 1312962), στέλεχος E. Coli SG 20050 με πλασμίδιο p28FNV. Bioorganic chemistry, 1987, τ. 13, αρ. 9, σελ. 1186-1193), στέλεχος E. Coli SG 20050 με πλασμίδιο pINF14 (SU 1703691), Ε. coli SG 20050 στέλεχος RU1604 με ρ. κ.λπ. Το μειονέκτημα των τεχνολογιών που βασίζονται στη χρήση αυτών των στελεχών είναι η αστάθειά τους, καθώς και το ανεπαρκές επίπεδο έκφρασης ιντερφερόνης.

Μαζί με τα χαρακτηριστικά των στελεχών που χρησιμοποιούνται, η αποτελεσματικότητα της διαδικασίας εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την τεχνολογία που χρησιμοποιείται για την απομόνωση και τον καθαρισμό της ιντερφερόνης.

Υπάρχει μια γνωστή μέθοδος για την παραγωγή ιντερφερόνης, η οποία περιλαμβάνει την καλλιέργεια κυττάρων Ps. putida, καταστροφή βιομάζας, επεξεργασία με πολυαιθυλενιμίνη, κλασματοποίηση με θειικό αμμώνιο, υδρόφοβη χρωματογραφία σε φαινυλοσιλόχρωμα C-80, κλασμάτωση pH του λύματος, συγκέντρωση και διαδιήθηση, χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων σε διαβάθμιση DE-52 κυτταρίνης, e-52, e-gradient κυτταρίνης, χρωματογραφία ανταλλαγής του προκύπτοντος υγρού έκλουσης σε κυτταρίνη SM-52, συμπύκνωση με διέλευση μέσω κασέτας φίλτρου και διήθηση γέλης σε Sephadex G-100 (SU 1640996). Το μειονέκτημα αυτής της μεθόδου, εκτός από τη σύνθετη ζύμωση πολλών σταδίων, είναι η πολυσταδιακή διαδικασία για την απόκτηση του τελικού προϊόντος.

Υπάρχει επίσης μια γνωστή μέθοδος για την παραγωγή ιντερφερόνης, η οποία περιλαμβάνει καλλιέργεια του στελέχους E. coli SG 20050/pIF16 σε ζωμό LB σε φιάλες σε θερμοστάτη αναδευτήρα, φυγοκέντρηση της βιομάζας, έκπλυση με ρυθμιστικό διάλυμα και επεξεργασία με υπερήχους για την καταστροφή των κυττάρων. Το προϊόν λύσης που προκύπτει φυγοκεντρείται, πλένεται με διάλυμα ουρίας 3Μ σε ρυθμιστικό διάλυμα, διαλύεται σε διάλυμα χλωριούχου γουανιδίνης σε ρυθμιστικό διάλυμα, υποβάλλεται σε επεξεργασία με υπερήχους, φυγοκεντρείται, οξειδωτική σουλφιτόλυση, αιμοκάθαρση έναντι 8 Μ ουρίας, επαναδιάταξη και τελική ανάλυση δύο σταδίων σε C-M- 52 κυτταρίνη και Sephadex G-50 (RU 2054041).

Τα μειονεκτήματα αυτής της μεθόδου είναι η σχετικά χαμηλή παραγωγικότητά της στα κύρια στάδια της διαδικασίας απομόνωσης και καθαρισμού. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για την υπερηχητική επεξεργασία του προϊόντος, την αιμοκάθαρση και την οξειδωτική σουλφιτόλυση, η οποία οδηγεί σε αστάθεια στην απόδοση της ιντερφερόνης, καθώς και στην αδυναμία χρήσης αυτής της μεθόδου για τη βιομηχανική παραγωγή ιντερφερόνης.

Ως το πλησιέστερο ανάλογο (πρωτότυπο), μπορεί να υποδειχθεί μια μέθοδος για τη λήψη ανθρώπινης ιντερφερόνης λευκοκυττάρων, η οποία συνίσταται στην καλλιέργεια ενός ανασυνδυασμένου στελέχους E. coli, στην κατάψυξη της βιομάζας που προκύπτει σε θερμοκρασία που δεν υπερβαίνει τους -70°C, στην απόψυξη, στην καταστροφή των κυττάρων μικροοργανισμών με λυσοζύμη, απομάκρυνση DNA και RNA με εισαγωγή στο προϊόν λύσης DNAse και καθαρισμό της απομονωμένης αδιάλυτης μορφής ιντερφερόνης με πλύσιμο με ρυθμιστικό διάλυμα με απορρυπαντικά, διάλυση του ιζήματος ιντερφερόνης σε διάλυμα υδροχλωρικής γουανιδίνης, επαναδιάταξη και καθαρισμό ενός σταδίου με χρωματογραφία ανταλλαγής. Το στέλεχος Ε. coli SS5 που ελήφθη χρησιμοποιώντας το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pSS5 που περιέχει τρεις προαγωγείς: Plac, Pt7 και Ptrp, και το γονίδιο άλφα-ιντερφερόνης με εισαγόμενες νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις χρησιμοποιείται ως παραγωγός.

Η έκφραση της ιντερφερόνης από το στέλεχος Ε. coli SS5 που περιέχει αυτό το πλασμίδιο ελέγχεται από τρεις προαγωγείς: Plac, Pt7 και Ptrp. Το επίπεδο έκφρασης ιντερφερόνης είναι περίπου 800 mg ανά 1 λίτρο κυτταρικού εναιωρήματος.

Το μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι η χαμηλή τεχνολογική απόδοση της χρήσης ενζυματικής καταστροφής κυττάρων, DNA και RNA του μικροοργανισμού και ο χρωματογραφικός καθαρισμός της ιντερφερόνης σε ένα στάδιο. Αυτό προκαλεί αστάθεια στη διαδικασία απελευθέρωσης ιντερφερόνης, οδηγεί σε μείωση της ποιότητάς της και περιορίζει τη δυνατότητα χρήσης του παραπάνω σχήματος για τη βιομηχανική παραγωγή ιντερφερόνης.

Τα μειονεκτήματα αυτού του πλασμιδίου και του στελέχους που βασίζεται σε αυτό είναι η χρήση στο πλασμίδιο ενός ισχυρού μη ρυθμισμένου προαγωγέα του φάγου Τ7 στο στέλεχος BL21 (DE3) E. coli, στο οποίο το γονίδιο Τ7 RNA πολυμεράσης βρίσκεται κάτω από τον προαγωγέα το οπερόνιο λακ και που πάντα «ρέει». Κατά συνέπεια, η σύνθεση ιντερφερόνης λαμβάνει χώρα συνεχώς στο κύτταρο, η οποία οδηγεί σε διάσπαση του πλασμιδίου και μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων του στελέχους, και ως αποτέλεσμα, μείωση της απόδοσης ιντερφερόνης.

Για τη λήψη μεγάλων ποσοτήτων IFN, χρησιμοποιούνται εξαήμερες μονοστιβαδικές καλλιέργειες κυττάρων εμβρύου κοτόπουλου ή καλλιεργημένων λευκοκυττάρων ανθρώπινου αίματος που έχουν μολυνθεί με συγκεκριμένο τύπο ιού. Με άλλα λόγια, για να ληφθεί IFN, δημιουργείται ένα συγκεκριμένο σύστημα ιού-κυττάρου.

Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για τη βιοσύνθεση της IFN απομονώθηκε από ένα ανθρώπινο κύτταρο. Η εξωγενής ανθρώπινη IFN παράγεται χρησιμοποιώντας τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA. Η διαδικασία για την απομόνωση του cDNA της IFN είναι η εξής:

1) Το mRNA απομονώνεται από ανθρώπινα λευκοκύτταρα, κλασματοποιείται κατά μέγεθος, μεταγράφεται αντίστροφα και εισάγεται στη θέση ενός τροποποιημένου πλασμιδίου.

2) Το προκύπτον προϊόν χρησιμοποιείται για τον μετασχηματισμό του E. coli. οι κλώνοι που προκύπτουν χωρίζονται σε ομάδες που αναγνωρίζονται.

3) Κάθε ομάδα κλώνων υβριδοποιείται με IFN - mRNA.

4) Από τα προκύπτοντα υβρίδια που περιέχουν cDNA και chRNA, το mRNA απομονώνεται και μεταφράζεται στο σύστημα πρωτεϊνοσύνθεσης.

5) Προσδιορίστε την αντιική δράση της ιντερφερόνης κάθε μείγματος που λαμβάνεται ως αποτέλεσμα της μετάφρασης. Οι ομάδες που έδειξαν δράση ιντερφερόνης περιέχουν έναν κλώνο με cDNA υβριδοποιημένο με IFN - mRNA. επαναπροσδιορίζεται ένας κλώνος που περιέχει πλήρους μήκους ανθρώπινο cDNA IFN.

2. Μηχανισμοί δράσης ιντερφερονών

Οι IFN εμφανίζουν ορισμένες δραστηριότητες ως λεμφοκίνες και ανοσοτροποποιητές. Οι IFN τύπου Ι, οι οποίες δρουν κυρίως ως αναστολείς της ιικής αναπαραγωγής στο κύτταρο, ασκούν την επίδρασή τους διεγείροντας την παραγωγή κυτταρικών ενζύμων από τα ριβοσώματα των κυττάρων-ξενιστών, τα οποία αναστέλλουν την παραγωγή ιών, διαταράσσοντας τη μετάφραση του ιικού mRNA και τη σύνθεση του ιικές πρωτεΐνες.

Οι IFN παράγονται από τα περισσότερα ζωικά είδη, αλλά η εκδήλωση της δραστηριότητάς τους είναι συγκεκριμένη για το είδος, δηλ. δρουν μόνο στα είδη ζώων στα οποία παράγονται.

Οι IFN προκαλούν την επαγωγή τριών ενζύμων:

πρωτεϊνική κινάση, η οποία διαταράσσει το αρχικό στάδιο κατασκευής της πεπτιδικής αλυσίδας.

ολιγοϊσοαδενυλική συνθετάση, η οποία ενεργοποιεί την RNase, η οποία καταστρέφει το ιικό RNA.

φωσφοδιεστεράση, η οποία καταστρέφει τα τελικά νουκλεοτίδια του tRNA, γεγονός που οδηγεί σε διακοπή της επιμήκυνσης του πεπτιδίου.

Λαμβάνοντας υπόψη τις αντιικές και ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις της IFN, η NPO Biomed έχει προτείνει και έχει δοκιμάσει επιτυχώς υπόθετα με IFNan1 και προβιοτικά για τη θεραπεία της δυσβακτηρίωσης ιικής και βακτηριακής αιτιολογίας, καντιντίασης. στη γυναικολογική πρακτική για τη θεραπεία της ενδομητρίτιδας, της κολπίτιδας, της κολπίτιδας και του γυναικολογικού έρπητα.

3. Θεραπευτική χρήση ανθρώπινης INF

Υπάρχουν δύο γενιές φαρμάκων ιντερφερόνης. Η πρώτη γενιά χαρακτηρίζεται από φυσική προέλευση, στην οποία λαμβάνεται από το αίμα των δωρητών. Από αυτήν λαμβάνεται ξηρή ιντερφερόνη ανθρώπινου λευκοκυττάρου, η οποία χρησιμοποιείται για εισπνοή και ενστάλαξη στις ρινικές διόδους. Παράγουν επίσης ιντερφερόνη σε υπόθετα, καθαρή συμπυκνωμένη ιντερφερόνη σε ξηρή μορφή και λευκινφερόνη.

Αυτή η μέθοδος παραγωγής φαρμάκων με βάση την ιντερφερόνη είναι αρκετά ακριβή και απρόσιτη, έτσι στα τέλη του 20ου αιώνα δημιουργήθηκαν φάρμακα ιντερφερόνης δεύτερης γενιάς με τη χρήση γενετικής μηχανικής.

Έτσι, ήταν δυνατό να αναπτυχθούν φάρμακα Viferon, Interal και άλλα που περιέχουν ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ιντερφερόνη άλφα

Λόγω των μοναδικών ιδιοτήτων τους, τα παρασκευάσματα ιντερφερόνης χρησιμοποιούνται στη θεραπεία και την πρόληψη όλων των αναπνευστικών ασθενειών, των περισσότερων καρκίνων, καθώς και για τη θεραπεία πολλών ιογενών ασθενειών και της γρίπης. Τα σκευάσματα ιντερφερόνης χρησιμοποιούνται ευρέως στη θεραπεία της ηπατίτιδας Β και C: η ιντερφερόνη περιορίζει την ανάπτυξη του ιού, αποτρέπει την εμφάνιση κίρρωσης και εξαλείφει τον θάνατο.

Ορισμένα φάρμακα ιντερφερόνης έχουν παρενέργειες, όπως δερματικά εξανθήματα, αλλεργίες και ασθένειες του αιμοποιητικού συστήματος.

Με τη μακροχρόνια χρήση της ιντερφερόνης, το σώμα παράγει αντισώματα κατά της ιντερφερόνης, γεγονός που τον καθιστά ανίκανο να καταπολεμήσει τους ιούς. Ο λόγος για αυτά τα φαινόμενα έγκειται στην παρουσία λευκωματίνης σε παρασκευάσματα με βάση την ιντερφερόνη.

Η λευκωματίνη λαμβάνεται από το αίμα, επομένως υπάρχει κίνδυνος (αν και ελάχιστος) να προσβληθείτε από ηπατίτιδα και άλλες αιματογενείς ασθένειες.

Όνομα φαρμάκου	Υποτύπος INF	Τρόπος λήψης	φαρμακολογική επίδραση	Ενδείξεις χρήσης
Ιντερφερόνη		Βιοσύνθεση σε καλλιεργημένα λευκοκύτταρα αίματος δότη υπό την επίδραση ιών	Αντιιικό, ανοσοτροποποιητικό, αντιπολλαπλασιαστικό	Ιογενείς ασθένειες, λευχαιμία, κακοήθη μελάνωμα, καρκίνος των νεφρών, καρκινοειδές σύνδρομο
Αλληλοσυνδέομαι		Βιοσύνθεση σε καλλιεργημένα λευκοκύτταρα αίματος δότη υπό την επίδραση παραμυκοϊών	Καταστέλλει τη δραστηριότητα ενός αριθμού ιών	Ιογενείς οφθαλμικές παθήσεις, ηπατίτιδα		Ανασυνδυασμένο	Αντιιικό, ανοσοτροποποιητικό, αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό ενός ευρέος φάσματος κυττάρων όγκου	Επιθηλιακή μορφή οξείας και υποτροπιάζουσας ιογενούς οφθαλμικής λοίμωξης. ογκολογικά νοσήματα
Ιντερφερόνη άλφα-2α		Ανασυνδυασμένο. Πρωτεΐνη που περιέχει 165 αμινοξέα	Αντιική, αντικαρκινική δράση	Λευχαιμική δικτυοενδοθηλίωση, σάρκωμα Kaposi, καρκίνος νεφρού, καρκίνος ουροδόχου κύστης, μελάνωμα, έρπης ζωστήρας
Ρεφερόν		Ανασυνδυασμένος INF που παράγεται από ένα βακτηριακό στέλεχος ψευδομονάδας, η γενετική συσκευή του οποίου περιέχει το γονίδιο IFN α2 του ανθρώπινου λευκοκυττάρου. Πανομοιότυπο με το ανθρώπινο λευκοκύτταρο IFN α2.		Ιογενείς, ογκολογικές ασθένειες
Ιντερφερόνη άλφα – n1		Υψηλά καθαρισμένο ανθρώπινο INF	Αντιικό	Χρόνια ενεργή λοιμώδης ηπατίτιδα Β
Ινρεφερόνη βήτα		Υπερπαραγωγή ανθρώπινων ινοβλαστών από διεγέρτη παρουσία μεταβολικών αναστολέων	Αντιική, ανοσοτροποποιητική, αντικαρκινική δράση	Χρόνιες ιογενείς λοιμώξεις στην οφθαλμολογία, γυναικολογία και ουρολογία, δερματολογία, ηπατολογία, ογκολογία
Ιντερφερόνη γάμμα		Ανασυνδυασμένο	Αντιική, ανοσοτροποποιητική, αντικαρκινική δράση	Χρόνια κοκκιωματώδη νοσήματα

1. www.antibiotic.ru/ab/brviri.shtml

2. www.interferon.su/php/content.php?id=71

3. www.pharmvestnik.ru

4. Προσωρινό άρθρο φαρμακοποιίας 42U-23/60-439-97. Ιντερφερόνη ανθρώπινη ανασυνδυασμένη άλφα-δύο.

5. Gavrikov A.V. Βελτιστοποίηση της βιοτεχνολογικής παραγωγής ανασυνδυασμένων ουσιών ανθρώπινης ιντερφερόνης - Μ., 2003,

6. Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology / B. Glick, J. Pasternak. – Μ., Μιρ, 2002.

7. Κρατική Φαρμακοποιία της ΕΣΣΔ. XI έκδ., τεύχος 1.- Σελ. 175.

8. Κρατικό μητρώο φαρμάκων / Εκδ. A.V. Katlinsky και άλλοι - Μ., 2002.

9. Naroditsky B.S. Μοριακή βιοτεχνολογία ιντερφερονών. // συλλογή επιστημονικού και πρακτικού συνεδρίου «Ιντερφερόνη – 50 ετών». – Μ., 2007, σσ. 17-23

10. Βασικές αρχές φαρμακευτικής βιοτεχνολογίας: Διδακτικό βιβλίο / Τ.Π. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Μιχάλεβα. – Ροστόφ-ον-Ντον: Φοίνιξ; Tomsk: NTL Publishing House, 2006.

11. Frolov A.F., Vovk A.D., Dyadyun S.T. και άλλα Η αποτελεσματικότητα της ανασυνδυασμένης άλφα-δύο-ιντερφερόνης στην ιογενή ηπατίτιδα Β // Ιατρικές Υποθέσεις - Κίεβο, 1990. - Αρ. 9. - Σ. 105-108.

Χρήση: βιοτεχνολογία, ιατρική βιομηχανία. Η ουσία της εφεύρεσης: κατασκευάζεται ένα ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pSV69, που περιλαμβάνει ένα θραύσμα DNA που κωδικοποιεί τον πρόδρομο της ανθρώπινης ανοσοϊντερφερόνης. μετασχηματίστε την κυτταρική σειρά COS-7 με τον προκύπτοντα ανασυνδυασμένο φορέα, επιλέξτε μετασχηματισμένα κύτταρα, τα οποία καλλιεργούνται υπό συνθήκες που διασφαλίζουν τη συσσώρευση του προϊόντος στόχου και απομονώστε την ώριμη μορφή ιντερφερόνης χωρίς το Ν-τελικό Cys-Tyr-Cys (des- Cys-Tyr-Cysinterferon). 8 άρρωστος.

Η εφεύρεση σχετίζεται με τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA, μέσα και μεθόδους χρήσης μιας τέτοιας τεχνολογίας για την αποκάλυψη της αλληλουχίας DNA και της αλληλουχίας αμινοξέων που προσδιορίζεται από αυτήν για την ανθρώπινη ανοσοϊντερφερόνη, την παραγωγή της, καθώς και τα διάφορα προϊόντα που λαμβάνονται και τη χρήση τους. Πιο συγκεκριμένα, η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται με την απομόνωση και την ταυτοποίηση αλληλουχιών DNA που κωδικοποιούν την ανθρώπινη ανοσοιντερφερόνη και την κατασκευή ενός ανασυνδυασμένου φορέα έκφρασης που περιέχει αυτές τις αλληλουχίες DNA λειτουργικά συνδεδεμένες με αλληλουχίες προαγωγέα, και την υλοποίηση της έκφρασης με τους φορείς που λαμβάνονται με αυτόν τον τρόπο. Σε μια άλλη άποψη, η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται με συστήματα καλλιέργειας ξενιστών, όπως διάφορους μικροοργανισμούς και κυτταροκαλλιέργειες σπονδυλωτών, που μετασχηματίζονται με φορείς έκφρασης και κατευθύνονται έτσι για να εκφράσουν τις προαναφερθείσες αλληλουχίες DNA. Σε ακόμη άλλη άποψη, η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται με μέσα και μεθόδους για τη μετατροπή των τελικών προϊόντων μιας τέτοιας έκφρασης σε νέες οντότητες, όπως φαρμακευτικές συνθέσεις χρήσιμες για τη θεραπεία και την πρόληψη των ανθρώπων. Σε προτιμώμενες πραγματοποιήσεις, η παρούσα εφεύρεση παρέχει συγκεκριμένους φορείς έκφρασης που έχουν αλληλουχίες τέτοιες ώστε η ανθρώπινη ανοσοϊντερφερόνη να παράγεται και να απελευθερώνεται από τα κύτταρα ξενιστές σε ώριμη μορφή. Επιπλέον, η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται με διάφορες διαδικασίες που χρησιμοποιούνται για τη λήψη τέτοιων αλληλουχιών DNA, φορέων έκφρασης, συστημάτων καλλιέργειας ξενιστή και τελικών προϊόντων και παραγώγων αυτών, καθώς και ειδικών και σχετικών συνθηκών. Η παρούσα εφεύρεση προκύπτει εν μέρει από την ανακάλυψη της αλληλουχίας DNA και της καθορισμένης αλληλουχίας αμινοξέων που κωδικοποιεί την ανθρώπινη ανοσοϊντερφερόνη. Επιπλέον, η παρούσα εφεύρεση παρέχει πληροφορίες αλληλουχίας στις πλευρικές αλληλουχίες 3" και 5" του γονιδίου της ανθρώπινης ανοσολογικής ιντερφερόνης, που διευκολύνει τη σύνδεσή του in vitro σε φορείς έκφρασης. Συγκεκριμένα, εντοπίστηκε ένα τμήμα DNA 5" που κωδικοποιεί το προτεινόμενο ενδογενές πολυπεπτίδιο σήματος, το οποίο προηγείται αμέσως της αλληλουχίας αμινοξέων της υποτιθέμενης ώριμης ανθρώπινης ανοσοποιητικής ιντερφερόνης. Αυτές οι ανακαλύψεις διευκολύνουν την ανάπτυξη μέσων και μεθόδων για τη λήψη, χρησιμοποιώντας τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA, επαρκή ποσότητα ανθρώπινης ανοσοποιητικής ιντερφερόνης, η οποία εξασφάλισε, με τη σειρά της, τη δυνατότητα προσδιορισμού των βιοχημικών ιδιοτήτων και της βιοδραστηριότητάς της. Οι δημοσιεύσεις και άλλα υλικά που χρησιμοποιούνται για να φωτίσουν το φόντο της εφεύρεσης και σε ορισμένες περιπτώσεις για να τονίσουν πρόσθετες λεπτομέρειες σχετικά με την εφαρμογή της, ενσωματώνονται με παραπομπή, αριθμούνται για ευκολία στο παρακάτω κείμενο και διατάσσονται ανάλογα στη συνοδευτική βιβλιογραφία. ΥΠΟΒΑΘΡΟ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ

Α. Ανθρώπινη ανοσολογική ιντερφερόνη

Οι ανθρώπινες ιντερφερόνες μπορούν να ταξινομηθούν σε τρεις ομάδες ανάλογα με τη διαφορετική αντιγονικότητα και τις βιολογικές και βιοχημικές τους ιδιότητες. Η πρώτη ομάδα αποτελείται από την οικογένεια των ιντερφερονών λευκοκυττάρων (α-ιντερφερόνη, Le IF ή IFN-), οι οποίες παράγονται συνήθως κυρίως από τα αντίστοιχα ανθρώπινα αιμοσφαίρια υπό την επίδραση ιών. Αυτές οι ιντερφερόνες ελήφθησαν μικροβιολογικά και ανακαλύφθηκε η βιολογική τους δράση (1, 2, 3). Οι βιολογικές τους ιδιότητες έχουν καθορίσει τη χρήση τους στις κλινικές ως θεραπευτικοί παράγοντες για τη θεραπεία ιογενών λοιμώξεων και κακοήθων καταστάσεων (4). Στη δεύτερη ομάδα είναι η ανθρώπινη ιντερφερόνη ινοβλαστών (- ιντερφερόνη, FIF ή IFN-), που παράγεται τυπικά από ινοβλάστες υπό την επίδραση ιών, η οποία έχει επίσης παραχθεί μικροβιολογικά και έχει βρεθεί ότι παρουσιάζει ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δραστηριοτήτων (5). Οι κλινικές δοκιμές υποδεικνύουν επίσης την πιθανή θεραπευτική του αξία. Οι ιντερφερόνες λευκοκυττάρων και ινοβλαστών έχουν πολύ έντονες ομοιότητες στις βιολογικές τους ιδιότητες, παρά το γεγονός ότι ο βαθμός ομολογίας σε επίπεδο αμινοξέων είναι σχετικά χαμηλός. Επιπλέον, και οι δύο ομάδες ιντερφερονών περιέχουν από 165 έως 166 αμινοξέα και είναι όξινες σταθερές πρωτεΐνες. Η ανθρώπινη ανοσοποιητική ιντερφερόνη (--ιντερφερόνη, IIF ή IFN-), η οποία είναι το αντικείμενο της παρούσας εφεύρεσης σε αντίθεση με τις - και - ιντερφερόνες, είναι ασταθής σε pH 2, παράγεται κυρίως από μιτογόνο επαγωγή λεμφοκυττάρων και είναι επίσης εντελώς διαφορετική σε αντιγονικές ιδιότητες. Μέχρι πρόσφατα, η ανθρώπινη ανοσοποιητική ιντερφερόνη μπορούσε να ληφθεί μόνο σε πολύ μικρές ποσότητες, γεγονός που καθιστούσε φυσικά δύσκολο τον χαρακτηρισμό της. Πολύ υψηλότερος, αλλά ακόμη μερικός, καθαρισμός της ανθρώπινης ανοσοποιητικής ιντερφερόνης έχει πρόσφατα αναφερθεί (6). Αυτή η ένωση αναφέρθηκε ότι ελήφθη από καλλιέργειες λεμφοκυττάρων που διεγέρθηκαν με συνδυασμό φυτοαιμοσυγκολλητίνης και εστέρα φορβόλης και καθαρίστηκε με σειριακούς χρωματογραφικούς διαχωρισμούς. Αυτή η διαδικασία οδήγησε σε ένα προϊόν με μοριακό βάρος 58.000. Ανθρώπινη ανοσοϊντερφερόνη παρήχθη σε πολύ μικρές ποσότητες με μετάφραση του mRNA σε οστρακοειδή που εμφανίζουν τα χαρακτηριστικά δραστηριότητας ιντερφερόνης της ανθρώπινης ανοσοιντερφερόνης, και ελπίζαμε ότι το cDNA ανοσοποιητικής ιντερφερόνης θα μπορούσε να συντεθεί και κλωνοποιημένο (7). Η ποσότητα της ανοσοποιητικής ιντερφερόνης που ελήφθη μέχρι τώρα είναι σαφώς ανεπαρκής για τη διεξαγωγή αναμφισβήτητων πειραμάτων για τον χαρακτηρισμό και τον προσδιορισμό των βιολογικών ιδιοτήτων του καθαρισμένου συστατικού. Ωστόσο, in vitro μελέτες που διεξήχθησαν με ακατέργαστα παρασκευάσματα, καθώς και πειράματα in vivo με παρασκευάσματα ιντερφερόνης επίμυων, πρότειναν ότι η κύρια λειτουργία της ανοσολογικής ιντερφερόνης μπορεί να είναι αυτή ενός ανοσορυθμιστικού παράγοντα (8 και 9). Η ιντερφερόνη του ανοσοποιητικού δεν έχει μόνο αντιική και αντικυτταρική δράση, κοινή σε όλες τις ανθρώπινες ιντερφερόνες, αλλά και ενισχυτική επίδραση σε αυτές τις δραστηριότητες - και - ιντερφερόνες (10). Επιπλέον, η αντιπολλαπλασιαστική δράση της α-ιντερφερόνης σε κύτταρα όγκου in vitro αναφέρεται ότι είναι περίπου 10-100 φορές μεγαλύτερη από αυτή άλλων κατηγοριών ιντερφερονών (8, 11, 12). Αυτό το αποτέλεσμα, μαζί με τον ισχυρό ανοσορυθμιστικό του ρόλο (8 και 9), υποδηλώνει πολύ μεγαλύτερη αντικαρκινική ικανότητα για την IFN-γ από ότι για την FN-γ και την IFN-γ. Πράγματι, σε πειράματα in vivo με ποντίκια και αρουραίους, τα φάρμακα IFN-α επιδεικνύουν αξιοσημείωτη υπεροχή έναντι των διεγερμένων από τον ιό ιντερφερόνες όσον αφορά την αντικαρκινική δράση κατά του οστεοσαρκώματος (13). Όλες αυτές οι μελέτες πριν από την παρούσα εφεύρεση έπρεπε να πραγματοποιηθούν σε σημαντικά μολυσμένα παρασκευάσματα λόγω της εξαιρετικά χαμηλής διαθεσιμότητάς τους. Ωστόσο, επιβεβαίωσαν ξεκάθαρα τις πολύ σημαντικές βιολογικές λειτουργίες της ανοσολογικής ιντερφερόνης. Η ανοσολογική ιντερφερόνη δεν έχει μόνο πρωτογενή αντιική δράση, αλλά επίσης πιθανή ισχυρή ανοσορυθμιστική και αντικαρκινική δράση, γεγονός που την προσδιορίζει σαφώς ως έναν δυνητικά πολλά υποσχόμενο κλινικό στόχο. Ήταν σαφές ότι η χρήση της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA θα ήταν ο πιο αποτελεσματικός τρόπος για να ληφθούν οι μεγάλες ποσότητες ανθρώπινης ανοσοποιητικής ιντερφερόνης που απαιτούνται. Είτε οι ουσίες που παράγονται με αυτόν τον τρόπο περιλαμβάνουν είτε όχι γλυκοζυλίωση, η οποία θεωρείται χαρακτηριστικό του φυσικού υλικού που προέρχεται από τον άνθρωπο, είναι πιθανό να εμφανίζουν βιοδραστικότητα που θα τις καθιστούσε κατάλληλες για κλινική χρήση στη θεραπεία ενός ευρέος φάσματος ιογενών ασθενειών, νεοπλασμάτων και κατασταλμένες καταστάσεις, ανοσία. Β. Τεχνολογία Ανασυνδυασμένου DNA

Η τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA έχει ωριμάσει. Οι μοριακοί βιολόγοι μπορούν πολύ εύκολα να ανασυνδυάσουν διαφορετικές αλληλουχίες DNA, δημιουργώντας νέους τύπους DNA που μπορούν να παράγουν σημαντικές ποσότητες εξωγενών πρωτεϊνικών προϊόντων σε μετασχηματισμένα μικρόβια. Βασικά, έχουν αναπτυχθεί μέσα και μέθοδοι για in vitro δέσμευση διαφόρων θραυσμάτων DNA με αμβλεία ή «κολλώδη» άκρα· με τη βοήθειά τους, λαμβάνονται πιθανοί φορείς έκφρασης κατάλληλοι για τον μετασχηματισμό συγκεκριμένων μικροοργανισμών, ρυθμίζοντας έτσι τη στοχευμένη σύνθεση του επιθυμητού εξωγενούς προϊόντα. Ωστόσο, για μεμονωμένα προϊόντα αυτή η διαδρομή παραμένει αρκετά δύσκολη και η επιστήμη δεν έχει φτάσει ακόμη στο στάδιο στο οποίο μπορεί να είναι εγγυημένη η επιτυχία. Το πλασμίδιο, ένας μη χρωμοσωμικός βρόχος δίκλωνου DNA που βρίσκεται σε βακτήρια και άλλα μικρόβια, και συχνά σε πολλαπλά αντίγραφα ανά κύτταρο, παραμένει το βασικό στοιχείο της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA. Οι πληροφορίες που κωδικοποιούνται στο DNA του πλασμιδίου περιλαμβάνουν πληροφορίες απαραίτητες για την αναπαραγωγή του πλασμιδίου στα θυγατρικά κύτταρα (δηλαδή την αρχή της αντιγραφής) και συνήθως ένα ή περισσότερα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά επιλογής, όπως αντίσταση στα αντιβιοτικά για βακτήρια, που επιτρέπει τους κλώνους του κυττάρου ξενιστή που περιέχει το πλασμίδιο στόχου ενδιαφέροντος, αναγνωρίζονται και αναπτύσσονται κατά προτίμηση σε εκλεκτικά μέσα. Το όφελος των πλασμιδίων έγκειται στο γεγονός ότι μπορούν να αφομοιωθούν ειδικά από τη μία ή την άλλη περιοριστική ενδονουκλεάση ή «ένζυμο περιορισμού», καθένα από τα οποία αναγνωρίζει διαφορετικά τμήματα του πλασμιδικού DNA. Ετερόλογα γονίδια ή θραύσματα γονιδίου μπορούν στη συνέχεια να ενσωματωθούν στο πλασμίδιο ενώνοντας τα άκρα με τη θέση διάσπασης ή με ανακατασκευασμένα άκρα δίπλα στη θέση διάσπασης. Αυτός είναι ο τρόπος με τον οποίο λαμβάνονται οι λεγόμενοι αναπαραγόμενοι φορείς έκφρασης. Ο ανασυνδυασμός DNA λαμβάνει χώρα έξω από το κύτταρο, αλλά ο προκύπτων "ανασυνδυασμένος" αναπαραγόμενος φορέας έκφρασης ή πλασμίδιο μπορεί να εισαχθεί στα κύτταρα με τρόπο γνωστό ως μετασχηματισμός, παράγοντας μεγάλες ποσότητες ανασυνδυασμένων φορέων ως αποτέλεσμα της ανάπτυξης του μετασχηματισμένου προϊόντος. Επιπλέον, εάν το γονίδιο είναι κατάλληλα προσανατολισμένο σε σχέση με την περιοχή του πλασμιδίου που ελέγχει τη μεταγραφή και τη μετάφραση του κωδικοποιούντος DNA, ο προκύπτων φορέας έκφρασης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να παράγει πραγματικά την πολυπεπτιδική αλληλουχία που κωδικοποιείται από το εισαγόμενο γονίδιο, δηλ. για μια διαδικασία που ονομάζεται έκφραση. Η έκφραση ξεκινά σε μια περιοχή γνωστή ως προαγωγέας, η οποία αναγνωρίζεται και δεσμεύεται από την RNA πολυμεράση. Κατά τη διάρκεια της μεταγραφικής φάσης της έκφρασης, το DNA ξετυλίγεται, εκθέτοντας το ως χημικό πρότυπο για την έναρξη της σύνθεσης αγγελιαφόρου RNA από την αλληλουχία DNA. Το αγγελιοφόρο RNA, με τη σειρά του, μεταφράζεται σε ένα πολυπεπτίδιο με την αλληλουχία αμινοξέων να κωδικοποιείται από το mRNA. Κάθε αμινοξύ κωδικοποιείται από μια τριπλέτα νουκλεοτιδίων ή «κωδόνιο», τα οποία μαζί αποτελούν το «δομικό γονίδιο», δηλαδή το τμήμα που κωδικοποιεί την αλληλουχία αμινοξέων του εκφραζόμενου πολυπεπτιδικού προϊόντος. Η μετάφραση ξεκινά με ένα σήμα «έναρξης» (συνήθως ATG, το οποίο γίνεται AUG στο προκύπτον αγγελιοφόρο RNA). Τα λεγόμενα κωδικόνια «stop» καθορίζουν το τέλος της μετάφρασης και, κατά συνέπεια, την προσθήκη των ακόλουθων μονάδων αμινοξέων. Το προϊόν στόχος μπορεί να ληφθεί με λύση, εάν είναι απαραίτητο, του κυττάρου ξενιστή και διαχωρισμό του προϊόντος από τις υπόλοιπες πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας κατάλληλες μεθόδους καθαρισμού. Στην πράξη, η χρήση τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA μπορεί να παρέχει έκφραση εντελώς ετερόλογων πολυπεπτιδίων (αποκαλούμενη άμεση έκφραση) ή, εναλλακτικά, ετερόλογων πολυπεπτιδίων συνδεδεμένων σε ένα τμήμα της αλληλουχίας αμινοξέων ενός ομόλογου πολυπεπτιδίου. Στην τελευταία περίπτωση, το βιοδραστικό προϊόν στόχος μερικές φορές παραμένει αδρανές στο ομόλογο-ετερόλογο πολυπεπτίδιο σύντηξης έως ότου διασπαστεί στο εξωκυτταρικό περιβάλλον (βλ. Ευρεσιτεχνία Η.Β. Δημοσιεύτηκε αρ. 2007676A και American Scientist 68, 664 (1980). C. Cell Culture Technology Η τέχνη της καλλιέργειας κυττάρων ή ιστών για τη μελέτη της γενετικής και της φυσιολογίας των κυττάρων είναι καλά ανεπτυγμένη. Είναι γνωστές συσκευές και μέθοδοι για τη διατήρηση μόνιμων κυτταρικών σειρών που λαμβάνονται από μια διαδοχική σειρά μεταφορών από απομονωμένα φυσιολογικά κύτταρα. Για ερευνητικές εφαρμογές, τέτοιες κυτταρικές σειρές διατηρούνται σε στερεά στηρίγματα σε υγρό μέσο ή σε εναιώρημα που περιέχει υποστηρικτικά θρεπτικά συστατικά. Η παρασκευή μεγαλύτερων παρτίδων παρασκευασμάτων περιορίζεται μόνο σε μηχανικά προβλήματα. Μια πιο λεπτομερής περιγραφή του υποβάθρου της εφεύρεσης μπορεί να βρεθεί στο Microbiology and Edition, Harpes and Row Reblishers , Inc., Hagerstown, Maryland (1973), ειδικά στη σελίδα 1122, κ.ε. Scientific American 245, 66 κ.ε. (1981), καθένα από τα οποία ενσωματώνεται εδώ με αναφορά. Η παρούσα εφεύρεση βασίζεται στην ανακάλυψη ότι η τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί επωφελώς για την παραγωγή ανθρώπινης ανοσοποιητικής ιντερφερόνης, κατά προτίμηση σε άμεση μορφή και σε ποσότητες επαρκείς για την έναρξη και τη διεξαγωγή των απαραίτητων ζώων και κλινικών δοκιμών πριν από την κυκλοφορία. Αυτό το προϊόν είναι κατάλληλο για χρήση σε όλες τις μορφές του για την πρόληψη και τη θεραπεία ιογενών λοιμώξεων, κακοηθειών και καταστάσεων με κατασταλμένο ή ελαττωματικό ανοσοποιητικό σύστημα. Οι παραλλαγές του περιλαμβάνουν διάφορες ολιγομερείς μορφές, οι οποίες μπορεί να περιλαμβάνουν γλυκοζυλίωση. Αυτό το προϊόν παράγεται σε ανασχεδιασμένους γενετικά μετασχηματισμένους μικροοργανισμούς ή μετασχηματισμένα συστήματα κυτταροκαλλιέργειας. Όπως χρησιμοποιείται εδώ, ο όρος "μετασχηματιζόμενο κύτταρο" αναφέρεται σε ένα κύτταρο στο οποίο έχει εισαχθεί DNA, όπου το εν λόγω DNA είναι το προϊόν εξωγενούς ανασυνδυασμού DNA, και ο απόγονος οποιουδήποτε τέτοιου κυττάρου που διατηρεί το DNA που έχει εισαχθεί με αυτόν τον τρόπο. Έτσι, είναι πλέον δυνατή η λήψη και η απελευθέρωση ανθρώπινης ανοσοποιητικής ιντερφερόνης πιο αποτελεσματικά από ό,τι ήταν προηγουμένως δυνατό. Ένας από τους βασικούς παράγοντες της παρούσας εφεύρεσης στην πλέον προτιμώμενη ενσωμάτωσή της είναι η ικανότητα να κατευθύνει γενετικά έναν μικροοργανισμό ή κυτταρική καλλιέργεια για να παράγει ανθρώπινη άνοση ιντερφερόνη σε επαρκείς ποσότητες για να εκκρίνεται από τα κύτταρα ξενιστές σε ώριμη μορφή. Η παρούσα εφεύρεση περιλαμβάνει την ούτως ληφθείσα ανθρώπινη ανοσολογική ιντερφερόνη, μέσα και μεθόδους για την παραγωγή της. Η παρούσα εφεύρεση περαιτέρω κατευθύνεται σε φορείς έκφρασης DNA με δυνατότητα αναπαραγωγής που αποθηκεύουν αλληλουχίες γονιδίων που κωδικοποιούν ανθρώπινη ανοσοϊντερφερόνη σε μια μορφή προσβάσιμη για έκφραση. Η παρούσα εφεύρεση απευθύνεται επίσης σε μικροβιακά στελέχη ή κυτταρικές καλλιέργειες μετασχηματισμένες με τους φορείς έκφρασης που περιγράφηκαν προηγουμένως, και σε μικροβιακές ή κυτταρικές καλλιέργειες τέτοιων μετασχηματισμένων στελεχών ή καλλιέργειες ικανές να παράγουν ανθρώπινη ανοσοϊντερφερόνη. Σε ακόμη άλλη άποψη, η παρούσα εφεύρεση απευθύνεται σε διάφορες διεργασίες χρήσιμες για την παραγωγή των εν λόγω αλληλουχιών γονιδίου άνοσης ιντερφερόνης, φορέων έκφρασης DNA, μικροβιακών στελεχών και κυτταροκαλλιεργειών και ειδικών παραλλαγών τους. Επιπλέον, η παρούσα εφεύρεση στοχεύει στη λήψη καλλιέργειες ζύμωσης αυτών των μικροοργανισμών και κυτταροκαλλιεργειών. Η παρούσα εφεύρεση απευθύνεται επίσης στην παραγωγή ανθρώπινης ανοσοποιητικής ιντερφερόνης ως προϊόντος άμεσης έκφρασης που εκκρίνεται από κύτταρα ξενιστές σε ώριμη μορφή. Αυτή η πρόοδος μπορεί να χρησιμοποιεί ένα γονίδιο που κωδικοποιεί μια ώριμη αλληλουχία ανθρώπινης ανοσοποιητικής ιντερφερόνης συν 5" πλευρικό DNA που κωδικοποιεί ένα πολυπεπτίδιο σήματος. Το πολυπεπτίδιο σήματος πιστεύεται ότι χρησιμεύει για τη μεταφορά του μορίου στο τοίχωμα του κυττάρου ξενιστή, όπου αποκόπτεται κατά τη διαδικασία της ώριμης ανθρώπινη έκκριση. Αυτή η επιλογή καθιστά δυνατή την απομόνωση και τον καθαρισμό της ώριμης ανοσολογικής ιντερφερόνης-στόχου χωρίς την καταφυγή στη συμπερίληψη μιας διαδικασίας σχεδιασμένης για την απομάκρυνση των μολυντών της ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης του ξενιστή ή των κυτταρικών υπολειμμάτων. Η έκφραση "ώριμη ανθρώπινη ανοσοϊντερφερόνη" όπως χρησιμοποιείται στο κείμενο σημαίνει προϊόν μικροβιακής ή κυτταρικής καλλιέργειας ανθρώπινης ανοσοιντερφερόνης που δεν περιέχει πεπτίδιο σηματοδότησης ή προπεπτιδική αλληλουχία που συνοδεύει απαραίτητα τη μετάφραση του mRNA της ανθρώπινης ανοσοποιητικής ιντερφερόνης. Η πρώτη ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ανοσοϊντερφερόνη που παράγεται σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση έχει τη μεθειονίνη ως το πρώτο της αμινοξύ (που προκύπτει από τη συμπερίληψη ενός κωδικονίου σήματος έναρξης ATG πριν από το δομικό γονίδιο) ή, εάν η μεθειονίνη διασπάται ενδο- ή εξωκυτταρικά, έχει ως φυσιολογικό Το πρώτο αμινοξύ είναι η κυστεΐνη. Η ώριμη ανθρώπινη ανοσοϊντερφερόνη μπορεί επίσης να ληφθεί ως σύζευγμα με μια πρωτεΐνη διαφορετική από ένα συμβατικό πολυπεπτίδιο σήματος, ένα συζυγές που μπορεί να διασπαστεί ειδικά μέσα ή έξω από το κύτταρο (βλ. Δημοσίευση Ευρεσιτεχνίας Η.Β. Αρ. 2007676Α). Τέλος, η ώριμη ανθρώπινη ανοσολογική ιντερφερόνη μπορεί να παραχθεί με άμεση έκφραση χωρίς την ανάγκη διάσπασης οποιωνδήποτε ξένων περιττών πολυπεπτιδίων. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό σε περιπτώσεις όπου ο ξενιστής δεν είναι σε θέση να αφαιρέσει ή δεν αφαιρεί αποτελεσματικά το πεπτίδιο-σηματοδότης και ο φορέας έκφρασης προορίζεται να εκφράζει την ώριμη ανθρώπινη ιντερφερόνη μαζί με το πεπτίδιο σήμα του. Η ώριμη ανθρώπινη ανοσοϊντερφερόνη που λαμβάνεται με αυτόν τον τρόπο απομονώνεται και καθαρίζεται σε επίπεδο κατάλληλο για χρήση στη θεραπεία ιογενών ασθενειών, κακοηθειών και ανοσοκατασταλμένων ή ανοσοανεπαρκών καταστάσεων. Η ανθρώπινη ανοσοϊντερφερόνη ελήφθη ως εξής. 1. Ανθρώπινοι ιστοί, όπως ανθρώπινος ιστός σπλήνας ή λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος, καλλιεργήθηκαν με μιτογόνα για να διεγείρουν την παραγωγή ανοσοποιητικής ιντερφερόνης. 2. Το κυτταρικό ίζημα από μια τέτοια κυτταρική καλλιέργεια εκχυλίστηκε παρουσία ενός αναστολέα ριβονουκλεάσης για να ληφθεί όλο το κυτταροπλασματικό RNA. 3. Ολικό αγγελιαφόρο RNA (mRNA) σε πολυαδενυλιωμένη μορφή απομονώθηκε σε στήλη ολιγο-dT. Αυτό το RNA κλασματοποιήθηκε κατά μέγεθος χρησιμοποιώντας βαθμίδωση πυκνότητας σακχαρόζης και ηλεκτροφόρηση γέλης οξέος-ουρίας. 4. Το αντίστοιχο RNA (12S έως 18S) μετατράπηκε στο αντίστοιχο μονόκλωνο συμπληρωματικό DNA (mDNA), από το οποίο ελήφθη δίκλωνο cDNA. Μετά την επέκταση poly-dC, εισήχθη σε έναν φορέα έτσι ώστε το πλασμίδιο να έχει έναν ή περισσότερους φαινοτυπικούς δείκτες. 5. Οι φορείς που ελήφθησαν έτσι χρησιμοποιήθηκαν για να μετασχηματίσουν βακτηριακά κύτταρα για να ληφθεί μια βιβλιοθήκη αποικιών. Ραδιοεπισημασμένα cDNA που προέρχονται τόσο από επαγόμενα όσο και από μη επαγόμενα RNA που απομονώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως χρησιμοποιήθηκαν για την ξεχωριστή ταυτοποίηση διπλών βιβλιοθηκών αποικιών. Η περίσσεια cDNA στη συνέχεια απομακρύνθηκε και οι αποικίες εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ για να ταυτοποιηθούν οι επαγόμενοι κλώνοι cDNA. 6. Το αντίστοιχο πλασμιδικό DNA απομονώθηκε από τους επαγόμενους κλώνους cDNA και προσδιορίστηκε η αλληλουχία βάσης του. 7. Το DNA της αλληλουχίας παρασκευάστηκε in vitro για συμπερίληψη σε κατάλληλο φορέα έκφρασης, ο οποίος χρησιμοποιήθηκε για να μετασχηματίσει ένα κατάλληλο κύτταρο ξενιστή, το οποίο με τη σειρά του αφέθηκε να αναπτυχθεί σε καλλιέργεια και να εκφράσει την ανθρώπινη ανοσοϊντερφερόνη-στόχο. 8. Σε ορισμένα συστήματα κυττάρου ξενιστή, όταν ενσωματώνονται σε ένα φορέα έκφρασης έτσι ώστε να εκφράζεται μαζί με ένα πεπτίδιο σήματος, η ώριμη μορφή της ανθρώπινης ανοσοϊντερφερόνης εκκρίνεται στο μέσο κυτταροκαλλιέργειας, διευκολύνοντας τις μεθόδους απομόνωσης και καθαρισμού. Περιγραφή των προτιμώμενων πραγματοποιήσεων της εφεύρεσης. Α. Σύστημα κυτταροκαλλιέργειας/φορείς κυτταροκαλλιέργειας. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων σπονδυλωτών σε καλλιέργεια (καλλιέργεια ιστού) έχει γίνει μια κοινή διαδικασία τα τελευταία χρόνια (βλ. Tissue Culture Academic Riess Kruse and Paterson ends, 1973). Εδώ, η σειρά ινοβλαστών νεφρού πιθήκου COS-7 χρησιμοποιήθηκε ως ξενιστής για την παραγωγή ανοσοποιητικής ιντερφερόνης (25a). Ωστόσο, τα πειράματα που περιγράφονται εδώ μπορούν να εκτελεστούν σε οποιαδήποτε κυτταρική σειρά που είναι ικανή να αναδιπλασιαστεί και να εκφράσει έναν συμβατό φορέα, για παράδειγμα, κυτταρικές σειρές W138, BHK, 3T3, CHO, VERO και HeLa. Επιπλέον, ο φορέας έκφρασης πρέπει να έχει μια αρχή αντιγραφής και έναν προαγωγέα που βρίσκεται ανοδικά του γονιδίου που πρόκειται να εκφραστεί, μαζί με τις απαραίτητες θέσεις δέσμευσης ριβοσώματος, θέσεις ματίσματος RNA, θέσεις πολυαδενυλίωσης και τερματιστές μεταγραφής. Αν και αυτά τα σημαντικά στοιχεία του SV40 έχουν χρησιμοποιηθεί εδώ, θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι η εφεύρεση, αν και περιγράφεται εδώ ως προς την προτιμώμενη πραγματοποίησή της, δεν θα πρέπει να θεωρείται ότι περιορίζεται μόνο σε αυτές τις αλληλουχίες. Για παράδειγμα, μπορούν να χρησιμοποιηθούν πηγές αντιγραφής άλλων ιών (για παράδειγμα, Polyoma, Adeno, VSV, BPV, κ.λπ.). ) φορείς, καθώς και κυτταρικές πηγές αντιγραφής DNA που μπορούν να λειτουργήσουν σε μη ολοκληρωμένη κατάσταση. Β. Έκφραση σε κυτταρική καλλιέργεια θηλαστικών. Η στρατηγική για τη σύνθεση της ανοσολογικής ιντερφερόνης σε κυτταροκαλλιέργεια θηλαστικών βασίζεται στην ανάπτυξη ενός φορέα ικανού τόσο για αυτόνομη αντιγραφή όσο και για έκφραση ενός ξένου γονιδίου υπό τον έλεγχο ενός ετερόλογου μεταγραφικού θραύσματος. Ο αναδιπλασιασμός αυτού του φορέα σε καλλιέργεια ιστού επιτεύχθηκε διεγείροντας τον εκκινητή της αντιγραφής DNA (που προέρχεται από τον ιό SV 40) και διεγείροντας μια βοηθητική λειτουργία (αντιγόνο Τ) εισάγοντας τον φορέα σε μια κυτταρική σειρά που εκφράζει ενδογενώς αυτό το αντιγόνο (23 και 29) . Ο όψιμος προαγωγέας του ιού SV 40 προηγείται του δομικού γονιδίου ιντερφερόνης και διασφαλίζει τη μεταγραφή του γονιδίου. Ο φορέας που χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία έκφρασης αποτελούνταν από τις αλληλουχίες του pBR 322, που παρέχει έναν δείκτη κατάλληλο για επιλογή σε Ε. coli (ανθεκτικό στην αμπικιλλίνη) καθώς και έναν εκκινητή της αντιγραφής του DNA. Αυτές οι αλληλουχίες ελήφθησαν από το πλασμίδιο pML - 1 (28) και αντιπροσωπεύουν την περιοχή που περιέχει τις θέσεις περιορισμού ECoRI και BamHI. Ο εκκινητής SV 40 ελήφθη ως μέρος ενός θραύσματος PVu II - Hind III μεγέθους 342 bp, συμπεριλαμβανομένης αυτής της περιοχής (30 και 31) (με τα δύο άκρα να έχουν μετατραπεί σε άκρα Eco RI). Αυτές οι αλληλουχίες, εκτός από το ότι περιέχουν τον ιικό εκκινητή της αντιγραφής του DNA, κωδικοποιούν έναν προαγωγέα τόσο για την πρώιμη όσο και για την όψιμη μεταγραφική μονάδα, ο προσανατολισμός της θέσης έναρξης από το SV - 40 ήταν τέτοιος ώστε ο προαγωγέας για την όψιμη μονάδα μεταγραφής βρισκόταν κοντά στο το γονίδιο που κωδικοποιεί την ιντερφερόνη. Στο σχ. Το Σχήμα 1 δείχνει φυγοκέντρηση βαθμίδωσης σακχαρόζης πολυ(Α) + RNA διεγερμένων λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος. Υπάρχουν δύο μέγιστα δραστικότητας ιντερφερόνης (που παρουσιάζονται με σκιασμένα ορθογώνια) με μεγέθη 12S και 16S. Η θέση των δεικτών rRNA (που φυγοκεντρούνται ανεξάρτητα) επισημαίνεται πάνω από το περίγραμμα απορρόφησης. Στο σχ. Το Σχήμα 2 δείχνει ηλεκτροφόρηση διεγερμένων από πολυ(Α)+ RNA PBL σε οξύ-ουρία-αγαρόζη. Παρατηρείται μόνο μία μέγιστη δραστηριότητα, η οποία μεταναστεύει μαζί με το 18S RNA. Η θέση των δεικτών ριβοσωμικού RNA που ηλεκτροφορήθηκαν στη γειτονική λωρίδα και αναπτύχθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου επισημαίνεται πάνω από το περίγραμμα δραστηριότητας. Στο σχ. Το Σχήμα 3 δείχνει μοτίβα υβριδισμού 96 αποικιών με επαγόμενους και μη επαγόμενους ανιχνευτές cDNA σημασμένους με 32Ρ. 96 μεμονωμένα προϊόντα μετασχηματισμού αναπτύχθηκαν σε μια πλάκα μικροτιτλοδότησης, αντιγράφηκαν σε δύο μεμβράνες νιτροκυτταρίνης και στη συνέχεια τα φίλτρα υβριδοποιήθηκαν με δείγματα 32 P-cDNA που προέρχονται είτε από επαγόμενα mRNAs (πάνω) είτε από mRNA που απομονώθηκαν από μη επαγόμενες καλλιέργειες pBL (μη επαγόμενες, κάτω). Τα φίλτρα πλύθηκαν για να απομακρυνθεί το μη υβριδοποιημένο RNA και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ. Αυτή η σειρά φίλτρων αντιπροσωπεύει 86 τέτοιες σειρές (8300 ανεξάρτητες αποικίες). Ένα παράδειγμα επαγόμενου κλώνου επισημαίνεται με H12. Σύκο. 4 είναι ένας χάρτης περιορισμού του ενθέτου cDNA του κλώνου 69. Το ένθετο cDNA σχετίζεται με θέσεις PstI (κουκκίδες και στα δύο άκρα) και ουρές ολιγο-dC-dG (ευθείες γραμμές). Ο αριθμός και το μέγεθος των θραυσμάτων που ελήφθησαν με πέψη με νουκλεάση περιορισμού προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου 6%. Οι θέσεις των θέσεων επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση (παρουσιάζεται στο Σχ. 5). Η κωδικοποιητική περιοχή του μεγαλύτερου ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης κυκλώνεται, η σκιασμένη περιοχή αντιπροσωπεύει τα 20 υπολείμματα της αλληλουχίας πεπτιδίου σήματος, ενώ η διακεκομμένη περιοχή αντιπροσωπεύει την ώριμη αλληλουχία IEN (46 αμινοξέα). Το άκρο 5" του mRNA βρίσκεται στα αριστερά και το άκρο 3" βρίσκεται στα δεξιά. Στο σχ. Το Σχήμα 5 δείχνει την νουκλεοτιδική αλληλουχία του ενθέματος cDNA του πλασμιδίου ρ69. Παρουσιάζεται επίσης η συναγόμενη αλληλουχία αμινοξέων της μακρύτερης ανοικτής περιοχής ανάγνωσης. Η πιθανή αλληλουχία σήματος αντιπροσωπεύεται από υπολείμματα επισημασμένα S1 έως S20. Στο σχ. Το Σχήμα 6 δείχνει ένα διάγραμμα του πλασμιδίου pSV69 που χρησιμοποιείται για την έκφραση της ΙΡΝ-γ σε κύτταρα πιθήκου. Σύκο. Το Σχήμα 7 απεικονίζει έναν υβριδισμό Southern 8 διαφορετικών ανθρώπινων γονιδιωματικών DNA που έχουν υποστεί πέψη με EcoRI υβριδοποιημένα με ένα σημασμένο με 32Ρ 600 bp θραύσμα DdeI. από το ένθετο cDNA του p69. Δύο θραύσματα Eco RI υβριδοποιήθηκαν σαφώς με τον ανιχνευτή σε κάθε δείγμα DNA. Στο σχ. Το Σχήμα 8 δείχνει έναν υβριδισμό Southern του ανθρώπινου γονιδιωματικού DNA που έχει υποστεί πέψη με 6 διαφορετικές ενδονουκλεάσες περιορισμού υβριδοποιημένες με έναν επισημασμένο με 32Ρ ανιχνευτή από το ρ69. Α. Πηγή IFN-mRNA

Λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος (PBL) ελήφθησαν από ανθρώπινους δότες χρησιμοποιώντας λευκοφόρηση. Τα PBL καθαρίστηκαν περαιτέρω με φυγοκέντρηση σε κλίση σε ένα μίγμα Ficoll-ηπαρίνης και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε συγκέντρωση 510 6 κύτταρα/ml σε RPMI 164 με 1% L-γλουταμίνη, 25 mM HEPS και 1% διάλυμα πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης (Gibco Jrand gsland, Ny). Αυτά τα κύτταρα προκλήθηκαν να παράγουν IFN-γ με τη μιτογόνο σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Β (N μg/ml) και καλλιεργήθηκαν για 34-48 ώρες στους 37°C σε 5% CO. Στην καλλιέργεια PBL προστέθηκε δεσακετυλοθυμοσίνη (0,1 μg/ml) για να αυξηθεί η σχετική απόδοση της δραστικότητας της IFN. Β. Απομόνωση αγγελιοφόρου RNA. Ολικό RNA από καλλιέργειες PBL εκχυλίστηκε ουσιαστικά όπως αναφέρεται από τον Bergen, S.L. et al. (33). Τα κύτταρα απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση και στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε 10 mM NaCl, 10 mM TrCS-HCl (ρΗ 7,5), 1,5 mM MgCl2 και 10 mM σύμπλοκο ριβονουκλεοζίτη-βαναδυλίου. Τα κύτταρα λύθηκαν με προσθήκη ΝΡ-40 (1% τελική συγκέντρωση) και οι πυρήνες απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση. Το υπερκείμενο περιείχε ολικό RNA, το οποίο καθαρίστηκε περαιτέρω με πολλαπλές εκχυλίσεις με φαινόλη και χλωροφόρμιο. Η υδατική φάση ρυθμίστηκε σε 0,2 Μ NaCl, και στη συνέχεια όλο το RNA καταβυθίστηκε με προσθήκη δύο όγκων αιθανόλης. Το RNA από μη επαγόμενες (μη διεγερμένες) καλλιέργειες απομονώθηκε με τον ίδιο τρόπο. Χρησιμοποιήθηκε χρωματογραφία ολιγο-dT κυτταρίνης για τον καθαρισμό του mRNA από άλλα είδη RNA (34). Οι τυπικές αποδόσεις από 1-2 L καλλιεργημένου PBL ήταν 5-10 mg ολικού RNA και 50-200 μg πολυ(Α) + RNA. Γ. Κλασματοποίηση του mRNA κατά μέγεθος. Χρησιμοποιήθηκαν δύο μέθοδοι για την κλασματοποίηση παρασκευασμάτων mRNA. Αυτές οι μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν ανεξάρτητα (και όχι μαζί) και καθεμία οδήγησε σε σημαντικό εμπλουτισμό του IFN - mRNA. Η φυγοκέντρηση βαθμίδωσης σακχαρόζης παρουσία του μετουσιωτικού φορμαμιδίου χρησιμοποιήθηκε για την κλασματοποίηση του mRNA. Διαβαθμίσεις από 5 έως 25% σακχαρόζη σε 70% φορμαμίδιο (32) φυγοκεντρήθηκαν στα 154.000 g για 19 ώρες στους 20 o C. Στη συνέχεια απομονώθηκαν διαδοχικά κλάσματα (0,5 ml) από την κορυφή της βαθμίδωσης, κατακρημνίστηκαν αιθανόλη και στη συνέχεια κατακρημνίσθηκαν εγχύθηκε σε Xenopus laevis socites για μετάφραση mRNA (35). Μετά από 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, το μέσο επώασης δοκιμάστηκε για αντιική δράση με την τυπική μέθοδο αναστολής του κυτταροπαθητικού αποτελέσματος χρησιμοποιώντας ιό φυσαλιδώδους στοματίτιδας (στέλεχος Indiana) ή ιό ευκεφαλομυκαρδίτιδας σε κύτταρα WISH (ανθρώπινο αμνίον), όπως περιγράφεται από τον Stewart (36), εκτός από το ότι Τα δείγματα επωάστηκαν με κύτταρα για 24 ώρες (αντί για 4) πριν από τη μόλυνση από τον ιό. Κατά συνέπεια, παρατηρήθηκαν δύο κορυφές δραστικότητας για το RNA κλασματοποιημένο στη βαθμίδωση σακχαρόζης (Σχ. 1). Μία κορυφή καταβυθίστηκε στο υπολογισμένο μέγεθος 12S και περιείχε 100-400 U/ml αντιική δράση (σε σύγκριση με το πρότυπο IFN-α) ανά μg εισερχόμενου RNA. Η άλλη κορυφή δραστηριότητας καθιζάνει στους 16S και περιείχε περίπου τη μισή δραστηριότητα της πιο αργής καταβυθισμένης κορυφής. Κάθε μία από αυτές τις κορυφές δραστηριότητας φαίνεται να οφείλεται στην ΙΡΝ-α, καθώς δεν παρατηρήθηκε δραστηριότητα για τα ίδια κλάσματα που δοκιμάστηκαν σε μια κυτταρική σειρά βοοειδών (MDBK), η οποία δεν προστατεύεται από την ανθρώπινη ΙΡΝ-α. Τόσο η δραστικότητα ΙΡΝ-γ όσο και η δραστικότητα ΙΡΝ-γ μπορούν εύκολα να προσδιοριστούν με την εξέταση του MDVC (5). Η κλασμάτωση του mRNA (260 μg) πραγματοποιήθηκε επίσης με ηλεκτροφόρηση μέσω πηκτωμάτων αγαρόζης οξέος-ουρίας. Το παχύρρευστο πήκτωμα αγαρόζης (37 και 38) αποτελούνταν από 1,75% αγαρόζη. Ο,025 Μ κιτρικό νάτριο, ρΗ 3,8 και 6 Μ ουρία. Διεξήχθη ηλεκτροφόρηση για 7 ώρες σε 25 mA και 4 o C. Η γέλη στη συνέχεια κόπηκε με λεπίδα ξυραφιού. Οι επιμέρους φέτες τήκονται στους 70°C και στη συνέχεια εκχυλίζονται δύο φορές με φαινόλη και μία φορά με χλωροφόρμιο. Τα κλάσματα κατακρημνίστηκαν με αιθανόλη, αναλύθηκαν διαδοχικά ως προς το περιεχόμενο IFN-γ mRNA με έγχυση Xenopus laevis societes, και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε αντιική ανάλυση. Για δείγματα κλασματοποιημένα με πήκτωμα, παρατηρήθηκε μόνο μία κορυφή δραστικότητας (Εικ. 2). Αυτή η κορυφή αναδύεται με 18S και έχει δραστηριότητα 600 U/ml ανά μικρογραμμάριο RNA εισόδου. Αυτή η δραστηριότητα φαίνεται επίσης να είναι ειδική για την IFN-γ, καθώς δεν προστατεύει τα κύτταρα MDVK. Η διαφορά μεγέθους που παρατηρείται στις βαθμίδες σακχαρόζης (12S και 16S) και στα πηκτώματα οξέος-ουρίας (18S) μπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός ότι αυτές οι ανεξάρτητες μέθοδοι κλασμάτωσης πραγματοποιήθηκαν υπό διαφορετικές συνθήκες πλήρους μετουσίωσης. Δ. Απόκτηση βιβλιοθήκης αποικιών,

Περιέχει αλληλουχίες IFN. 3 mg κλασματοποιημένου με πήκτωμα mRNA χρησιμοποιήθηκαν για να ληφθεί δίκλωνο cDNA σύμφωνα με πρότυπες μεθόδους (26 και 39)). Το cDNA κλασματοποιήθηκε κατά μέγεθος σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 6%. Κλάσματα δύο μεγεθών ηλεκτροεκλούστηκαν, 800 - 1500 bp. (138 ng) και > 1500 bp (204 ng). Τμήματα 35 ng κάθε μεγέθους cDNA επεκτάθηκαν με υπολείμματα δεοξυ C χρησιμοποιώντας τερματική τρανσφεράση δεοξυνουκλεοτιδίου (40) και συγκολλήθηκαν σε 300 ng πλασμιδίου pBK 322 (41), το οποίο προσδέθηκε ομοίως σε υπολείμματα δεοξυλίου στη θέση PstI (40). Κάθε μίγμα που είχε επανέλθει στη συνέχεια μετασχηματίστηκε σε Ε. coli Κ12 στέλεχος 294. Λήφθηκαν περίπου 8000 μετασχηματισμένα κύτταρα με cDNA 800-1500 bp. και 400 μετασχηματιστές cDNA > 1500 bp. Ε. Απομόνωση αποικιών από τη βιβλιοθήκη,

Επαγόμενα cDNA. Οι προκύπτουσες αποικίες εμβολιάστηκαν χωριστά στα φρεάτια των πλακών μικροτιτλοδότησης που περιείχαν LB (58) + 5 mg/ml τετρακυκλίνη και αποθηκεύτηκαν στους -20 o C μετά την προσθήκη ZhDMSO στο 7%. Δύο αντίγραφα της βιβλιοθήκης αποικιών αναπτύχθηκαν σε φίλτρα νιτροκυτταρίνης και το DNA από κάθε αποικία στερεώθηκε στο φίλτρο χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Gruushtein-Hogness (42). 32 Ρ-επισημασμένοι ανιχνευτές cDNA παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας κλασματοποιημένα με γέλη mRNA 18S από επαγόμενες και μη επαγόμενες καλλιέργειες PBL. Το Oligo-d T 12-18 χρησιμοποιήθηκε ως εκκινητές. χρησιμοποιήθηκαν οι συνθήκες αντίδρασης που περιγράφηκαν προηγουμένως (Ι). Φίλτρα που περιέχουν 8000 προϊόντα μετασχηματισμού με μέγεθος cDNA 600-1500 bp. και 400 μετασχηματιστές με μέγεθος cDNA μεγαλύτερο από 1500 bp. υβριδοποιήθηκε με 2010 6 cpm επαγόμενα cDNA 30 P. Ένα διπλό σύνολο φίλτρων υβριδοποιήθηκε με 2010 6 cpm μη επαγόμενα 32P cDNA. Ο υβριδισμός πραγματοποιήθηκε για 16 ώρες χρησιμοποιώντας τις συνθήκες που περιγράφονται από τους Fritsch et al (43). Τα φίλτρα πλύθηκαν καλά (43) και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ Kodakov XR-5 χρησιμοποιώντας Du Pont Lighitning-Plus. εντατικοποιημένες οθόνες για 16-48 ώρες Το πρότυπο υβριδισμού για κάθε αποικία συγκρίθηκε με δύο δείγματα. Περίπου το 40% των αποικιών υβριδοποιήθηκαν σαφώς και με τους δύο ανιχνευτές, ενώ περίπου το 50% των αποικιών δεν υβριδοποιήθηκαν με κανέναν ανιχνευτή (βλ. Εικ. 3). 124 αποικίες υβριδοποιήθηκαν αισθητά με τον μεμονωμένο ανιχνευτή, αλλά μη ανιχνεύσιμα ή πολύ ασθενώς με τον μη επαγόμενο ανιχνευτή. Αυτές οι αποικίες εμβολιάστηκαν μεμονωμένα σε φρεάτια πλακών μικροτιτλοδότησης, αναπτύχθηκαν και μεταφέρθηκαν σε φίλτρα νιτροκυτταρίνης και στη συνέχεια υβριδοποιήθηκαν με τους ίδιους δύο ανιχνευτές όπως περιγράφηκε παραπάνω. Το πλασμίδιο DNA που απομονώθηκε από καθεμία από αυτές τις αποικίες με την ταχεία μέθοδο (44) δεσμεύτηκε επίσης σε φίλτρα νιτροκυτταρίνης και υβριδοποιήθηκε (45) στους διεγερμένους ανιχνευτές. Το DNA από 22 αποικίες που υβριδοποιήθηκαν μόνο με τους ανιχνευτές επαγωγής ονομάστηκαν «επαγόμενες» αποικίες. ΣΤ. Χαρακτηριστικά επαγόμενων αποικιών. Το πλασμιδικό DNA λήφθηκε από 5 επαγόμενες αποικίες (46) και χρησιμοποιήθηκε για να χαρακτηρίσει το ένθετο cDNA. Η σήμανση περιορισμού πέντε επαγόμενων πλασμιδίων (ρ67, ρ68, ρ69, ρ70 και ρ71) έδειξε ότι τέσσερα από αυτά έχουν παρόμοιους χάρτες περιορισμού. Αυτά τα τέσσερα πλασμίδια (ρ67, ρ69, ρ71 και ρ72) έχουν το καθένα τέσσερις θέσεις Dde, 2 θέσεις Hinf 1 και μία περιοχή Rsa 1 στο ένθετο cDNA. Το πέμπτο πλασμίδιο (ρ68) περιέχει το συνηθισμένο θραύσμα Dde 1 και φαίνεται να είναι ένας σύντομος κλώνος cDNA που σχετίζεται με τους άλλους τέσσερις. Η ομολογία που προτείνεται από τη χαρτογράφηση νουκλεάσης περιορισμού επιβεβαιώθηκε με υβριδισμό. Ένας ανιχνευτής DNA επισημασμένος με 32Ρ (47) παρασκευάστηκε από ένα θραύσμα DdeI 600 bp. πλασμίδια ρ67 και χρησιμοποιήθηκαν για υβριδισμό (42) με τις υπόλοιπες επαγόμενες αποικίες. Και οι πέντε αποικίες που χαρτογραφήθηκαν με νουκλεάση περιορισμού διασταυρώθηκαν με αυτόν τον ανιχνευτή, όπως και 17 άλλες αποικίες από τις 124 που εξετάστηκαν. Το μήκος του ενθέτου cDNA σε καθένα από αυτά τα πλασμίδια διασταυρούμενης υβριδοποίησης προσδιορίστηκε με πέψη PstI και ηλεκτροφόρηση πηκτής. Ο κλώνος με το μεγαλύτερο ένθετο cDNA φαίνεται να είναι ο κλώνος 69 με μέγεθος ένθετου 1200-1400 bp. Αυτό το DNA χρησιμοποιήθηκε σε όλα τα περαιτέρω πειράματα· ο χάρτης περιορισμού του φαίνεται στο Σχ. 4. Το ένθετο cDNA του p69 αποδείχθηκε ότι είναι ένα cDNA IFN-γ από τα προϊόντα που ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα συστήματα έκφρασης για να επιδεικνύουν αντιική δράση, όπως περιγράφεται λεπτομερέστερα παρακάτω. Ζ. Διαδοχική ανάλυση εισαγωγής cDNA ρ69. Η πλήρης αλληλουχία νουκλεοτιδίων του ενθέματος cDNA του πλασμιδίου ρ69 προσδιορίστηκε με τη μέθοδο τερματισμού της διδεοξυνουκλεοτιδικής αλυσίδας (48) μετά την υποκλωνοποίηση των θραυσμάτων στον φορέα M 13 m 7 (49) και με τη χημική μέθοδο των Maxam και Gilbert (52). Το μεγαλύτερο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης κωδικοποιεί την πρωτεΐνη των 166 αμινοξέων που φαίνεται στο ΣΧ. 5. Το πρώτο υπόλειμμα κωδικοποιεί το πρώτο κωδικόνιο μεθειονίνης που περιλαμβάνεται στο άκρο 5" του cDNA. Τα πρώτα 20 υπολείμματα στο αμινοτελικό άκρο είναι πιθανό να χρησιμεύουν ως αλληλουχία σήματος για την έκκριση των υπόλοιπων 146 αμινοξέων. Αυτή η πιθανή αλληλουχία σήματος μοιράζεται κοινά χαρακτηριστικά με άλλες γνωστές αλληλουχίες σήματος, όπως το μέγεθος και η υδροφοβία Επιπλέον, τέσσερα αμινοξέα που βρέθηκαν στην πιθανή αλληλουχία διάσπασης (ser-leu-glu-cys) ήταν πανομοιότυπα με τέσσερα υπολείμματα που βρέθηκαν στο σημείο διάσπασης αρκετών ιντερφερονών λευκοκυττάρων (LeIF B, C, D, F και H (2)). Η κωδικοποιημένη ώριμη αλληλουχία αμινοξέων των 146 αμινοξέων (εφεξής «ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ανοσοιντερφερόνη») έχει μοριακό βάρος 17140. Υπάρχουν δύο πιθανές θέσεις γλυκοζυλίωσης (50 ) στην κωδικοποιημένη πρωτεϊνική αλληλουχία, αμινοξέα 28 έως 30 (asn-gly-thr) και αμινοξέα 100 έως 102 (asn-tyr-ser) Η ύπαρξη αυτών των θέσεων είναι σύμφωνη με την παρατηρούμενη γλυκοζυλίωση της ανθρώπινης IFN-α (6 και 51). Επιπλέον, τα μόνα δύο υπολείμματα κυστεΐνης (θέσεις 1 και 3) είναι στερικά πολύ κοντά για να σχηματίσουν μια δισουλφιδική γέφυρα, η οποία είναι σύμφωνη με την παρατηρούμενη σταθερότητα της IFN-γ παρουσία αναγωγικών παραγόντων όπως η IFN-γ-μερκαπτοαιθανόλη (51). Η συναγόμενη ώριμη αλληλουχία αμινοξέων είναι γενικά βασική, με συνολικά 30 υπολείμματα λυσίνης, αργινίνης και ιστιδίνης και συνολικά 19 υπολείμματα ασπαρτικού και γλουταμικού οξέος. Η δομή του IFN-a mRNA, όπως προσδιορίζεται από την αλληλουχία DNA του πλασμιδίου ρ69, είναι αξιοσημείωτα διαφορετική από το mRNA IFN-(1,2) ή IFN-(5). Έτσι, η περιοχή κωδικοποίησης της IFN- είναι μικρότερη, αν και οι 5" αμετάφραστες και 3" μη μεταφρασμένες περιοχές είναι πολύ μεγαλύτερες από ό,τι στις IFN-FN- και IFN-. Η. Δομή της κωδικεύουσας αλληλουχίας του γονιδίου IFN-α. Η δομή του γονιδίου που κωδικοποιεί την ΙΡΝ-α αναλύθηκε με υβριδισμό. Σε αυτή τη διαδικασία (54), 5 μg ανθρώπινου DNA υψηλού μοριακού βάρους (που λαμβάνεται με τη μέθοδο 55) χωνεύονται μέχρι την ολοκλήρωση με διάφορες περιοριστικές ενδονουκλεάσες, ηλεκτροφορούνται σε πήκτωμα αγαρόζης 1,0% (56) και μεταφέρονται σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης (54) . Ένας ανιχνευτής DNA επισημασμένος με 32Ρ παρασκευάζεται (47) από ένα θραύσμα DdeI 600 bp. Ένθετα cDNA της ρ69 και υβριδοποιήθηκαν (43) με μια κηλίδα DNA στο φίλτρο. Στα 10 7 cpm, τα δείγματα υβριδοποιήθηκαν για 16 ώρες και στη συνέχεια πλύθηκαν όπως περιγράφεται (43). Οκτώ δείγματα γονιδιωματικού DNA από διαφορετικούς ανθρώπινους δότες υποβλήθηκαν σε πέψη με EcoRI και υβριδοποιήθηκαν με έναν επισημασμένο με ρ69 32 Ρ ανιχνευτή. Όπως φαίνεται στο ΣΧ. 7, παρατηρούνται δύο καθαρά σήματα υβριδισμού με μέγεθος 8,8 mb. και 2,0 mb, το οποίο προσδιορίστηκε συγκρίνοντας τις κινητικότητες με DNA που έχει υποστεί πέψη Hind III. Αυτό θα μπορούσε να είναι το αποτέλεσμα της παρουσίας είτε δύο γονιδίων IFN-γ είτε ενός γονιδίου που διασπάστηκε στη θέση Eco RI. Εφόσον το cDNA του p69 δεν περιέχει θέσεις Eco RI, για να εξηγηθεί η παρουσία του στο γονίδιο θα είναι απαραίτητο να υποθέσουμε μια ενδιάμεση αλληλουχία (εσώνιο) με μια εσωτερική θέση Eco RI. Για να γίνει διαφοροποίηση μεταξύ αυτών των δύο δυνατοτήτων, πραγματοποιήθηκε ένας άλλος υβριδισμός Southern με τον ίδιο ανιχνευτή και πέντε άλλες πέψεις ενδονουκλεάσης του ίδιου ανθρώπινου DNA (Εικ. 8). Δύο υβριδοποιήσιμα θραύσματα DNA παρατηρήθηκαν για άλλες χωνεύσεις ενδονουκλεάσης, PVUII - 6,7 kb. και 4,0 και Hinc II (2,5 kb και 2,2 kb). Ωστόσο, τα άλλα τρία πρότυπα πέψης ενδονουκλεάσης παράγουν μόνο ένα υβριδοποιητικό θραύσμα DNA: Hind III (9,0 kb), Bdl II (11,5 kb) και BamHI (9,5 kb) . o.) Δύο γονίδια IFN πρέπει να συνδέονται με ασυνήθιστα μικρή απόσταση (λιγότερο από 9,0 kbp) για να εμφανιστεί στο ίδιο τμήμα Hihd III. Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι μόνο ένα ομόλογο γονίδιο IFN-γ (σε αντίθεση με πολλά γονίδια που σχετίζονται με IFN-γ) υπάρχει στο ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA και ότι αυτό το γονίδιο διαχωρίζεται από ένα ή περισσότερα ιντρόνια που περιέχουν θέσεις Eco RI, PVU II και Hind II . Αυτή η υπόθεση επιβεβαιώθηκε με υβριδισμό ενός σημασμένου με 32P (47) θραύσματος που λήφθηκε από την 3" αμετάφραστη περιοχή του cDNA από το p69 (130 bp θραύσμα Dde I από τη θέση 860 στη θέση 990 στο Σχήμα 5) με μια πέψη Eco RI το ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA: Μόνο το θραύσμα EcoRI των 2,0 kb υβριδίζεται με αυτόν τον ανιχνευτή, υποδεικνύοντας ότι αυτό το θραύσμα περιέχει αμετάφραστες αλληλουχίες 3", ενώ το 3,8 kb Το θραύσμα Eco RI περιέχει αλληλουχίες 5". Η δομή του γονιδίου IFN- (ένα γονίδιο με τουλάχιστον ένα εσώνιο) διαφέρει σημαντικά από το IFN- (πολλά γονίδια (2) χωρίς εσώνια (56)) ή το IFN- (ένα γονίδιο χωρίς ιντρόνια (57) J. Κατασκευή φορέα κυτταροκαλλιέργειας pSV69. Το θραύσμα 342 ζευγών βάσης HindIII-PVUIII που περιλαμβάνει τον εκκινητή SV 40 μετατράπηκε σε θραύσμα δεσμευμένο σε θέση περιορισμού EcoR Ι. Η θέση HindIII μετατράπηκε με προσθήκη συνθετικού ολιγομερούς ( 5d AGCTGAATTC) και η θέση PVU II μετατράπηκε με αμβλεία σύνδεση σε θέση Eco RI, συμπληρωμένη με χρήση πολυμεράσης Ι (θραύσμα Klenow) Το προκύπτον θραύσμα Eco RI εισήχθη στη θέση Eco RI του pML - (28). με τον όψιμο προαγωγέα SV 40 προσανατολισμένο μακριά από το γονίδιο amp R τροποποιήθηκε περαιτέρω αφαιρώντας τη θέση Eco R Ι κοντά στο γονίδιο amp R του pML - 1 (27). Το 1023 bp θραύσμα HpaI - BglII απομονώθηκε από κλωνοποιημένο HBV DNA (60 ), και η θέση HpaI του ιού της ηπατίτιδας Β (HBV) μετατράπηκε σε θέση Eco RI με ένα συνθετικό ολιγομερές (5"dGGGAATTCGC). Αυτό το θραύσμα Eco RI-Bgl II κλωνοποιήθηκε απευθείας στις θέσεις EcoRI - BamH Ι ενός πλασμιδίου που περιγράφηκε προηγουμένως και φέρει τον εκκινητή SV 40. Η κωδικοποιητική αλληλουχία IFN στο 1250 bp PstI θραύσμα του p69 εισήχθη στο υπόλοιπο Eco RI ιστοσελίδα. μετά τη μετατροπή των άκρων PstI σε άκρα Eco R I. Αυτοί οι κλώνοι απομονώθηκαν στους οποίους ο όψιμος προαγωγέας SV 40 προηγήθηκε του γονιδίου ΙΡΝ-β. Το προκύπτον πλασμίδιο pSV69 (Εικ. 6) στη συνέχεια εισήχθη σε κύτταρα ιστοκαλλιέργειας (29), ιδιαίτερα σε κύτταρα COS-7, χρησιμοποιώντας την τεχνική DEAE-δεξτράνης (61), τροποποιημένο έτσι ώστε η επιμόλυνση παρουσία DEAE-δεξτράνης πραγματοποιήθηκε για 8 ώρες Το κυτταρικό μέσο άλλαζε κάθε 2-3 ημέρες. Συλλέγονταν 200 μl ημερησίως για βιοδοκιμασία ιντερφερόνης. Οι τυπικές αποδόσεις ήταν 50-100 U/ml σε δείγματα που αναλύθηκαν τρεις ή τέσσερις ημέρες μετά τη διαμόλυνση. Η ανάλυση έδειξε ότι το προϊόν έκφρασης δεν έχει το cys-tyr-cys-N-τελικό τμήμα της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ανοσοιντερφερόνης (βλ. Εικ. 5), υποδεικνύοντας ότι το φαινόμενο διάσπασης πεπτιδίου σήματος συνέβη στον δεσμό cys-GLN (αμινοξέα 3 και 4 στην εικ. 5) και ότι ο ώριμος πολυπεπτίτης στην πραγματικότητα αποτελείται από 143 αμινοξέα (ge3-cys-Tyr-cys-άνοση ιντερφερόνη). J. Μερικός καθαρισμός ανασυνδυασμένης ανθρώπινης γεζ-cys-Tyr-cys-άνοσης ιντερφερόνης. Για να ληφθούν μεγάλες ποσότητες ανθρώπινης ιντερφερόνης IFN-γ που εκκρίνεται από κύτταρα πιθήκου, φρέσκες μονοστοιβάδες κυττάρων COS-7 σε δέκα πλάκες των 10 cm επιμολύνθηκαν με συνολικά 30 μg pDL 1 3 σε 110 ml DEAE-δεξτράνη (200 μg/ml DEAE δεξτράνη 500.000 MW, 0,05 Μ Tris ρΗ 7,5 σε DMEM). Μετά από 16 ώρες στους 37°C, οι πλάκες πλύθηκαν δύο φορές με DMEM. Στη συνέχεια προστέθηκαν 15 ml φρέσκου DMEM συμπληρωμένου με 10% f.b.s., 2 mM γλουταμίνη, 50 μg/ml πενικιλλίνη G και 50 mg/ml στρεπτομυκίνη σε κάθε πλάκα. Το μέσο αντικαταστάθηκε με DMEM χωρίς ορό. Στη συνέχεια προστέθηκε καθημερινά φρέσκο ​​μέσο χωρίς ορό. Το συλλεχθέν μέσο αποθηκεύτηκε στους 4 o C μέχρι να χρησιμοποιηθεί για ανάλυση ή να συνδεθεί με CPG. Τα κλάσματα που συλλέχθηκαν 3 και 4 ημέρες μετά τη διαμόλυνση βρέθηκαν να διατηρούν σχεδόν όλη τη δραστικότητα. 0,5 g CPG (Electonucleonics CPG 350 ελεγχόμενο πορώδες γυαλί μεγέθους 120/200 σάκοι) προστέθηκε σε 100 ml υπερκειμένου κυττάρων και το προκύπτον μίγμα αναδεύτηκε για 3 ώρες στους 4 o C. Μετά από σύντομη φυγοκέντρηση σε φυγόκεντρο beuch top, το κατακάθι Τα σφαιρίδια συσκευάστηκαν στη στήλη και πλύθηκαν καλά με ένα ρυθμιστικό διάλυμα 20 mM NaP04, 1 Μ NaCl, 0,1% μερκαπτοαιθανόλη, ρΗ 7,2. Η δραστικότητα στη συνέχεια εκλούστηκε με το ίδιο ρυθμιστικό που περιείχε 30% αιθυλενογλυκόλη ακολουθούμενο από το παραπάνω ρυθμιστικό που περιέχει 50% αιθυλενογλυκόλη. Σχεδόν όλη η δραστηριότητα σχετίζεται με το CPG. Το 75% της εκλουόμενης δραστικότητας βρέθηκε σε κλάσματα που εκλούστηκαν με 30% αιθυλενογλυκόλη. Αυτά τα κλάσματα συλλέχθηκαν και αραιώθηκαν με 20 mM NaPO 4 1 Μ NaCl, ρΗ 7,2 σε τελική συγκέντρωση 10% αιθυλενογλυκόλης και εγχύθηκαν απευθείας σε στήλη Con A Sepharose 10 mL (Pharmacia). Μετά από ενδελεχή πλύση με 20 mM NaPO 4 - 1 Μ NaCl, ρΗ 7,2, οι δραστικότητες εκλούστηκαν με 20 mM NaP04 - 1 Μ NaCl - 0,2 Μ -μεθυλ-D-μαννοσίδη. Σημαντική ποσότητα δραστικότητας (55%) δεν σχετίζεται με αυτή τη λεκτίνη, το 45% της δραστικότητας εκλούεται από -μεθυλ-ϋ-μαννοσίδη. Κ. Φαρμακευτικές συνθέσεις. Οι ενώσεις της παρούσας εφεύρεσης μπορούν να διαμορφωθούν σύμφωνα με γνωστές μεθόδους σε φαρμακευτικά αποδεκτές συνθέσεις στις οποίες η ανθρώπινη ανοσοϊντερφερόνη συνδυάζεται με έναν φαρμακευτικά αποδεκτό φορέα. Κατάλληλοι φορείς και συνθέσεις τους περιγράφονται στο Pemington's Pharmaceutical Science, το οποίο ενσωματώνεται με παραπομπή Τέτοιες συνθέσεις θα περιέχουν μια αποτελεσματική ποσότητα της πρωτεΐνης ιντερφερόνης της παρούσας εφεύρεσης μαζί με μια κατάλληλη ποσότητα φορέα για να παρέχουν μια φαρμακευτικά αποδεκτή σύνθεση κατάλληλη για αποτελεσματική χορήγηση σε έναν ασθενή. Παρεντερική χορήγηση. Η ανθρώπινη ανοσοϊντερφερόνη της παρούσας εφεύρεσης μπορεί να χορηγηθεί παρεντερικά σε έναν ασθενή που χρειάζεται αντικαρκινική ή αντιική θεραπεία, καθώς και σε εκείνους που βρίσκονται σε ανοσοκατασταλμένη κατάσταση. Οι δόσεις και η συχνότητα χορήγησης μπορεί να είναι παρόμοιες με εκείνες που χρησιμοποιούνται συνήθως σε κλινικές μελέτες άλλων ανθρώπινων ιντερφερονών. δηλαδή περίπου (1-10)10 6 μονάδες ημερησίως και στην περίπτωση υλικών με καθαρότητα άνω του 1%, προφανώς μέχρι 5010 6 μονάδες. καθαρή ιντερφερόνη, κατάλληλη για παρεντερική χορήγηση. Είναι προτιμότερο να αποθηκεύονται οι αμπούλες σε κρύο (-20 o C) πριν από τη χρήση. Δεδομένα βιοερευνητικής έρευνας. 1. Χαρακτηριστικά αντιϊκής δράσης. Για την εξουδετέρωση των αντισωμάτων, τα δείγματα αραιώθηκαν, εάν ήταν απαραίτητο, σε συγκέντρωση 500 - 1000 μονάδες/ml με προσθήκη PBS - BSA. Ίσοι όγκοι δείγματος επωάστηκαν για 2-12 ώρες στους 4°C με μια σειρά αραιώσεων λευκοκυττάρων κατά του ανθρώπου, ινοβλαστών ή ανοσοορού ιντερφερόνης κουνελιού. Anti-IFN- και λαμβάνεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Αλλεργιών και Λοιμωδών Νοσημάτων. Το αντι-ΙΡΝ-α παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας αυθεντική ΙΡΝ-α (καθαρότητα 5-20%) καθαρισμένη από διεγερμένα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για 3 λεπτά στα 1200 xg 3 λεπτά πριν από τη δοκιμή. Για να ελεγχθεί η σταθερότητα του pH 2, τα δείγματα φέρθηκαν σε pH 2 με την προσθήκη 1 N. HCl, επωάζεται για 2-12 ώρες στους 4 o C και εξουδετερώνεται με προσθήκη 1 N. NaOH πριν από τη δοκιμή. Για τη δοκιμή ευαισθησίας σε δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS), τα δείγματα επωάστηκαν με ίσο όγκο 0,2% SDS για 2-12 ώρες στους 4 o C αμέσως πριν από την ανάλυση. Τα χαρακτηριστικά της IFN-γ που παράγεται σε κύτταρα COS-7 δίνονται στον πίνακα. Πηγές πληροφοριών. 1. Goeddel et αϊ., Nature 287, 411 (1930). 2. Goeddel et αϊ., Nature 290. 20 (1981). 3. Yelverton et αϊ., Nucleic Aceds Research 9. 731 (1981). 4. Gutterman et al., Annals of Int. Med. 93, 399 (1980). 5. Goeddel et αϊ., Nucleic Acids Reseach 8, 4057 (1980). 6. Yip et αϊ., Proc. Natl. Ακαδ. Sci. (ΗΠΑ) 78, 1601 (1981). 7. Taniguchi et αϊ., Proc. Natl. Ακαδ. Sci. (USA) 78, 3469 (1981). 8. Bloom, Nature 289, 593 (1980). 9. Sonnenfeld et αϊ., Cellular Immunol. 40, 285 (1978). 10. Fleischmann et αϊ., Infection and Immunity 26, 248 (1979). 11. Blalock et αϊ., Cellular Immunology 49, 390 (1980). 12. Rudin et αϊ., Proc. Natl. Ακαδ. Sci. (ΗΠΑ) 77, 5928 (1980). 13. Crane et αϊ., J. Natl. Cancer Inst. 61, 871 (1978). 14. Stinchcomb et al. Nature 282, 39 (1979). 15. Kingsman et αϊ., Gene 7, 141 (1979). 16. Tschumper el al.,. Gene 10, 157 (1980). 17. Mortimer et al., Microbiological Reviews 44, 519 (198). 18. Miozzari et αϊ., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978). 19. Jones, Genetics 85, 23 (1977). 20. Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980). 21. Hess et al., J. Adv. Enzyme Regul. 7, 149 (1968). 22. Holland et αϊ., Biochemistry 17, 4900 (1978). 23. Bostian et αϊ., Proc. Natl. Ακαδ. Sci. (ΗΠΑ) 77, 4504 (1980). 24. The Molecular Biology of Yeast (Αυγ. 11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Νέα Υόρκη. 25. Chambon, Αηη. Στροφή μηχανής. Biochemistry, 44, 613 (1975). 25α. Gluzman, Cell 23. 175 (1981). 26. Goeddel et αϊ., Nature 281, 544 (1979). 27. Itakura et αϊ., Science 198, 1056 (1977). 28. Lusky et αϊ., Nature 293, 79 (1981). 29. Gluzman et al. , Cold Spring Harbor Symp. Ποσ. Biol. 44, 293 (1980). 30. Fiers et αϊ., Nature 273, 113 (1978). 31. Reddy et αϊ., Science 200, 494 (1978). 32. Boedtker et al. ,Επαιτώ. στο Nucleic Acids Res. ΜοΙ. Biol. 19, 253 (1976). 33. Berger et αϊ., Biochemistry 18, 5143 (1979). 34. Aviv et αϊ., Proc. Natl. Ακαδ. Sci. USA 69, 1408 (1972). 35. Gurdon et al., J. Molec. Biol. 80, 539 (1975). 36. Stewart, The Interferon System. Springer, New fork, σελ. 13-26 (1979). 37. Lehrach et αϊ., Biochemistry 16, 4743 (1977). 38. Lynch el αϊ., Virology 98, 251 (1979). 39. Wickens et αϊ., J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978). 40. Chang et αϊ., Nature 275, 617 (1978). 41. Bolivar et αϊ., Gene 2, 95 (1977). 42. Grunstein et αϊ., Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ. 72, 3961 (1975). 43. Fritsch et αϊ., Cell 19, 959 (1980). 44. Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979). 45. Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7, 1541 (1979). 46. ​​Clewel et αϊ., Biochemistry 9, 4428 (1970). 47. Taylor et αϊ., Biochim. Biophys. Acta 442, 324 (1976). 48. Smith, Methods Enzymol. 61, 560 (1980). 49. Messing et αϊ., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981). 50. Winzler, Hormonal Proteins and Peptides (επιμ. Li) Academic Press, Νέα Υόρκη, σελ. 1 (1973). 51. Mathan et αϊ., Nature 292, 842 (1981). 52. Maxam et al., Methods ίη Enzymol. 65, 490 (1980). 53. Crea et αϊ., Proc. Natl. Ακαδ. Sci. (ΗΠΑ) 75, 5765 (1978). 54. Southern, J. Molec. Biol. 98, 503 (1975). 55. Blin et αϊ., Nucleic Acids Res. 3, 2303 (1976). 56. Lawn et αϊ., Science 212, 1159 (1981). 57. Lawn et αϊ., Nucleic Acids Res. 9, 1045 (1981). 58. Miller, Experiments in Molecular Genetics, σελ. 431-3, Cold Spring Harbor Lab. , Cold Spring Harbor, Νέα Υόρκη (1972). 59. Beggs, Nature 275, 104 (1978). 60. Valenzuela et al., Animal Virus Genetics (επιμ. Fields, Jaenisch and Fox) σελ. 57, Academic Press, Νέα Υόρκη (1980). 61. McCuthan et al., J. Natl. Cancer Inst. 41, 351 (1968).

ΑΠΑΙΤΗΣΗ

Μια μέθοδος για την παραγωγή ανθρώπινης ανοσοποιητικής ιντερφερόνης, η οποία περιλαμβάνει την καλλιέργεια μιας ζωικής κυτταρικής σειράς, την απομόνωση και τον καθαρισμό του προϊόντος στόχου, που χαρακτηρίζεται από το ότι καλλιεργείται η κυτταρική σειρά COS-7 που μετασχηματίστηκε με ανασυνδυασμένο πλασμιδικό DNA pSVj69 και η ιντερφερόνη des-Cys-Tyr-Cys είναι απομονωμένη.

10267 0

Βιοσύνθεση σωματοτροπίνης και άλλων ανθρώπινων ορμονών

Η ανθρώπινη αυξητική ορμόνη, ή σωματοτροπίνη, συντίθεται στον ανθρώπινο εγκέφαλο στην πρόσθια υπόφυση. Απομονώθηκε για πρώτη φορά από πτωματικό υλικό και καθαρίστηκε το 1963. Με την έλλειψη σωματοτροπίνης, αναπτύσσεται ο νανισμός της υπόφυσης, η συχνότητα του οποίου υπολογίζεται σε 7 έως 10 περιπτώσεις ανά εκατομμύριο ανθρώπους.

Η ορμόνη είναι συγκεκριμένη για το είδος, δηλαδή, σε αντίθεση με την ινσουλίνη, οι ζωικές αυξητικές ορμόνες δεν έχουν καμία δραστηριότητα στο ανθρώπινο σώμα. Κατά συνέπεια, η μόνη θεραπεία για τον νανισμό της υπόφυσης είναι η ορμόνη της υπόφυσης, η οποία απομονώθηκε από τα πτώματα. Μελέτες έχουν δείξει ότι η ενδομυϊκή χορήγηση σωματοτροπίνης σε δόσεις των 10 mg ανά 1 kg σωματικού βάρους για ένα χρόνο, τρεις ενέσεις την εβδομάδα, αυξάνει το ύψος κατά περίπου 8-18 cm ετησίως.

Άρρωστα παιδιά τεσσάρων έως πέντε ετών, με συνεχή θεραπεία, έπιασαν την ανάπτυξη με τους συνομηλίκους τους μέχρι την εφηβεία (14-16 ετών). Αν λάβουμε υπόψη το γεγονός ότι 4-6 mg σωματοτροπίνης μπορούν να ληφθούν από ένα πτώμα, τότε μπορούμε να καταλάβουμε ότι η θεραπεία αυτής της ασθένειας με φυσική σωματοτροπίνη είναι εντελώς απελπιστική. Εκτός από την έλλειψη φαρμάκου, προέκυψαν και άλλα προβλήματα που σχετίζονται με την ετερογένεια της ορμόνης που απελευθερώνεται από το πτωματικό υλικό.

Υπήρχε επίσης κίνδυνος να μολυνθεί το υλικό της υπόφυσης από ιούς βραδείας ανάπτυξης. Τέτοιοι ιοί έχουν ασυνήθιστα μεγάλη περίοδο επώασης, επομένως τα παιδιά που λαμβάνουν το φάρμακο απαιτούν πολλά χρόνια ιατρικής επίβλεψης.

Η ανθρώπινη αυξητική ορμόνη, που συντίθεται σε ειδικά κατασκευασμένα βακτηριακά κύτταρα, έχει προφανή πλεονεκτήματα: διατίθεται σε μεγάλες ποσότητες, τα παρασκευάσματά της είναι βιοχημικά καθαρά και απαλλαγμένα από ιούς ρύπους.

Η βιοσύνθεση της σωματοτροπίνης (που αποτελείται από το 191ο κατάλοιπο αμινοξέος) από ειδικά κατασκευασμένα βακτήρια με βάση το Escherichia coli πραγματοποιήθηκε από την Genentech. Δεδομένου ότι η σύνθεση του DNA σε mRNA παράγει ένα γονίδιο που κωδικοποιεί τον πρόδρομο της σωματοτροπίνης, η οποία δεν διασπάται στα βακτηριακά κύτταρα για να σχηματίσει τη δραστική ορμόνη, προχωρήσαμε ως εξής: στο 1ο στάδιο, κλωνοποιήσαμε ένα δίκλωνο αντίγραφο DNA του mRNA και, με διάσπαση με περιοριστικές ενδονουκλεάσες, λήφθηκε η αλληλουχία που κωδικοποιεί ολόκληρη την αλληλουχία αμινοξέων της ορμόνης, εκτός από τα πρώτα 23 αμινοξέα. Στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε ένα συνθετικό πολυνουκλεοτίδιο που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 1 έως 23. Στη συνέχεια, τα δύο θραύσματα συνδυάστηκαν μαζί και «προσαρμόστηκαν» σε ένα πλασμίδιο E. coli, μετά το οποίο τα βακτηριακά κύτταρα άρχισαν να συνθέτουν αυτήν την ορμόνη.

Μέχρι το 1980, ολοκληρώθηκαν οι κλινικές δοκιμές του φαρμάκου και οι δοκιμές τοξικότητας και ξεκίνησαν μαζικά πειράματα σε παιδιά κοντά στην εφηβεία. Τα αποτελέσματα ήταν ενθαρρυντικά και η συνθετική σωματοτροπίνη άρχισε να παράγεται σε βιομηχανική κλίμακα το 1982.

Μια άλλη ορμόνη, η β-ενδορφίνη, ένα οπιούχο του εγκεφάλου που αποτελείται από το 31ο αμινοξύ, συντέθηκε σε γενετικά τροποποιημένα κύτταρα E. coli. Το 1980, ο Αυστραλός επιστήμονας Shine και οι Αμερικανοί επιστήμονες Fettes, Len και Baxter κλωνοποίησαν επιτυχώς DNA που κωδικοποιεί β-ενδορφίνη σε κύτταρα E. ooli και έλαβαν αυτό το πολυπεπτίδιο ως πρωτεΐνη σύντηξης με το ένζυμο β-γαλακτοσιδάση. Στο πρώτο στάδιο, κλωνοποίησαν ένα θραύσμα DNA που ελήφθη ως αποτέλεσμα της αντίστροφης μεταγραφής του mRNA που κωδικοποιεί τη β-ενδορφίνη και στη συνέχεια το εισήγαγαν σε ένα πλασμίδιο E. coli πίσω από το γονίδιο β-γαλακτοσιδάσης, λαμβάνοντας έτσι μια υβριδική πρωτεΐνη που αποτελείται από β- γαλακτοσιδάση και β-ενδορφίνη. Στη συνέχεια η β-γαλακτοσιδάση διασπάστηκε ενζυματικά, λαμβάνοντας βιολογικά ενεργή β-ενδορφίνη.

Λήψη ιντερφερονών

Ένα άλλο αξιοσημείωτο επίτευγμα της γενετικής μηχανικής είναι η σύνθεση ιντερφερόνης.

Η ιντερφερόνη ελήφθη για πρώτη φορά το 1957 στο Εθνικό Ινστιτούτο Ιατρικής Έρευνας κοντά στο Λονδίνο. Πρόκειται για μια πρωτεΐνη που απελευθερώνεται σε πολύ μικρές ποσότητες από ζωικά και ανθρώπινα κύτταρα όταν οι ιοί εισέρχονται στον οργανισμό και στοχεύει στην καταπολέμησή τους. Οι πρώτες μελέτες αποκάλυψαν την υψηλή βιολογική δράση της ιντερφερόνης στη θεραπεία της γρίπης, της ηπατίτιδας, ακόμη και του καρκίνου (καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των μη φυσιολογικών κυττάρων).

Η ιντερφερόνη, όπως και η σωματοτροπίνη, έχει ειδικότητα είδους: οι ζωικές ιντερφερόνες είναι ανενεργές στο ανθρώπινο σώμα και μάλιστα απορρίπτονται από αυτό.

Το ανθρώπινο σώμα παράγει διάφορους τύπους ιντερφερονών: λευκοκύτταρα (α), ινοβλάστες (P) και ανοσοποιητικά (y) (Τ-λεμφοκύτταρα).

Οι φυσικές ιντερφερόνες λαμβάνονται από ανθρώπινο αίμα με εξαιρετικά χαμηλή απόδοση: το 1978, στο Central Health Laboratory στο Ελσίνκι (τότε ο παγκόσμιος ηγέτης στην παραγωγή λευκοκυτταρικής ιντερφερόνης), ελήφθησαν 0,1 g καθαρής ιντερφερόνης από 50 χιλιάδες λίτρα αίματος. .

Η διαδικασία παραγωγής ιντερφερονών ήταν βασικά η ίδια για όλους τους τύπους κυττάρων που αναπτύσσονται σε καλλιέργειες και παράγουν ιντερφερόνη. Τα κύτταρα του αίματος μολύνθηκαν με τον ιό Sendai και διηθήθηκαν σε υπερφυγόκεντρο μετά από 24 ώρες. Το υπερκείμενο περιείχε ένα ακατέργαστο παρασκεύασμα ιντερφερόνης, το οποίο υποβλήθηκε σε χρωματογραφικό καθαρισμό.

Το κόστος του φαρμάκου ήταν πολύ υψηλό - 400 g ιντερφερόνης κόστισαν 2,2 δισεκατομμύρια δολάρια. Ωστόσο, οι προοπτικές για τη φαρμακολογική του χρήση (συμπεριλαμβανομένων των τεσσάρων τύπων καρκίνου) μας ανάγκασαν να αναζητήσουμε νέους τρόπους για να τον αποκτήσουμε, κυρίως μέσω της γενετικής μηχανικής.

Τον Ιανουάριο του 1980, η ανθρώπινη ιντερφερόνη παρήχθη σε γενετικά τροποποιημένα κύτταρα E. coli. Η αρχική δυσκολία με αυτές τις μεθόδους ήταν ότι το mRNA της ιντερφερόνης είναι χαμηλό ακόμη και σε λευκοκύτταρα που διεγείρονται από ιογενή μόλυνση και ότι οι αποδόσεις ήταν πολύ χαμηλές: αναφέρθηκαν 1-2 μόρια ιντερφερόνης ανά βακτηριακό κύτταρο.

Το 1981, η Genentech κατάφερε να κατασκευάσει ανασυνδυασμένο DNA που κωδικοποιεί γ-ιντερφερόνη και το εισήγαγε στο γονιδίωμα βακτηρίων, ζυμομυκήτων και ακόμη και κυττάρων θηλαστικών, και κατάφεραν να συνθέσουν ιντερφερόνη με υψηλή απόδοση - 1 λίτρο κυτταροκαλλιέργειας ζυμομύκητα περιείχε 1 εκατομμύριο μονάδες ιντερφερόνης (μια μονάδα ιντερφερόνης αντιστοιχεί στην ποσότητα που προστατεύει το 50% των κυττάρων της καλλιέργειας από μόλυνση από τον ιό). Η διαδικασία διεξήχθη ως εξής: οι ερευνητές απομόνωσαν ένα μείγμα μορίων mRNA από ανθρώπινα λεμφοκύτταρα, έλαβαν τα μόρια των αντίστοιχων αντιγράφων DNA και τα εισήγαγαν σε κύτταρα E. coli. Στη συνέχεια, επιλέχθηκαν βακτήρια που παράγουν ιντερφερόνη.

Λήψη ανοσογόνων φαρμάκων και εμβολίων

Ένας άλλος τομέας εφαρμογής της γενετικής μηχανικής σχετίζεται με την παραγωγή νέων αποτελεσματικών, ασφαλών και φθηνών εμβολίων.

Τα εμβόλια είναι ένα από τα σημαντικότερα επιτεύγματα στην ιατρική και η χρήση τους είναι επίσης εξαιρετικά αποτελεσματική από οικονομική άποψη. Τα τελευταία χρόνια έχει δοθεί ιδιαίτερη προσοχή στην ανάπτυξη εμβολίων. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι μέχρι τώρα δεν ήταν δυνατή η λήψη πολύ αποτελεσματικών εμβολίων για την πρόληψη πολλών κοινών ή επικίνδυνων μολυσματικών ασθενειών.

Το αυξημένο ενδιαφέρον για τα εμβόλια προέκυψε αφού διαπιστώθηκε ο ρόλος των παθογόνων μικροοργανισμών στην ανάπτυξη ασθενειών που προηγουμένως δεν θεωρούνταν μολυσματικές. Για παράδειγμα, γαστρίτιδα, γαστρικά και δωδεκαδακτυλικά έλκη, κακοήθεις όγκοι του ήπατος (ιοί ηπατίτιδας Β και C).

Ως εκ τούτου, τα τελευταία 10-15 χρόνια, οι κυβερνήσεις πολλών χωρών έχουν αρχίσει να λαμβάνουν μέτρα με στόχο την εντατική ανάπτυξη και παραγωγή θεμελιωδώς νέων εμβολίων.

Τα εμβόλια που χρησιμοποιούνται σήμερα μπορούν να χωριστούν στους ακόλουθους τύπους ανάλογα με τις μεθόδους παραγωγής τους:
- Ζωντανά εξασθενημένα εμβόλια.
- αδρανοποιημένα εμβόλια.
- εμβόλια που περιέχουν καθαρισμένα συστατικά μικροοργανισμών (πρωτεΐνες ή πολυσακχαρίτες).
- ανασυνδυασμένα εμβόλια που περιέχουν συστατικά μικροοργανισμών που λαμβάνονται με γενετική μηχανική

Η τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA χρησιμοποιείται επίσης για τη δημιουργία νέων τύπων ζωντανών εξασθενημένων εμβολίων, επιτυγχάνοντας εξασθένηση μέσω στοχευμένης μετάλλαξης γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες λοιμογόνου δράσης του παθογόνου παράγοντα της νόσου. Η ίδια τεχνολογία χρησιμοποιείται επίσης για την παραγωγή ζωντανών ανασυνδυασμένων εμβολίων με την εισαγωγή γονιδίων που κωδικοποιούν ανοσογόνες πρωτεΐνες σε ζωντανούς μη παθογόνους ιούς ή βακτήρια (φορείς), τα οποία εγχέονται στον άνθρωπο.

Η αρχή της χρήσης εμβολίων DNA είναι ότι ένα μόριο DNA που περιέχει γονίδια που κωδικοποιούν ανοσογόνες πρωτεΐνες ενός παθογόνου μικροοργανισμού εισάγεται στο σώμα του ασθενούς. Τα εμβόλια DNA ονομάζονται επίσης γονιδιακά ή γενετικά εμβόλια.

Για τη λήψη εμβολίων DNA, ένα γονίδιο που κωδικοποιεί την παραγωγή μιας ανοσογονικής πρωτεΐνης από έναν μικροοργανισμό εισάγεται σε ένα βακτηριακό πλασμίδιο. Εκτός από το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη του εμβολίου, γενετικά στοιχεία που είναι απαραίτητα για την έκφραση («ενεργοποίηση») αυτού του γονιδίου σε ευκαρυωτικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων, εισάγονται στο πλασμίδιο για να διασφαλιστεί η πρωτεϊνοσύνθεση. Ένα τέτοιο πλασμίδιο εισάγεται σε καλλιέργεια βακτηριακών κυττάρων για να ληφθεί μεγάλος αριθμός αντιγράφων.

Το πλασμιδικό DNA στη συνέχεια απομονώνεται από τα βακτήρια και καθαρίζεται από άλλα μόρια DNA και ακαθαρσίες. Το καθαρισμένο μόριο DNA χρησιμεύει ως εμβόλιο. Η εισαγωγή ενός εμβολίου DNA διασφαλίζει τη σύνθεση ξένων πρωτεϊνών από τα κύτταρα του εμβολιασμένου οργανισμού, η οποία οδηγεί στην επακόλουθη ανάπτυξη ανοσίας έναντι του αντίστοιχου παθογόνου. Σε αυτή την περίπτωση, τα πλασμίδια που περιέχουν το αντίστοιχο γονίδιο δεν ενσωματώνονται στο DNA των ανθρώπινων χρωμοσωμάτων.

Τα εμβόλια DNA έχουν πολλά πλεονεκτήματα σε σχέση με τα παραδοσιακά εμβόλια:
- προωθεί την παραγωγή αντισωμάτων στο φυσικό μόριο των πρωτεϊνών του ιού.
- προωθεί την παραγωγή κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων.
- μπορεί να επηρεάσει επιλεκτικά διαφορετικούς υποπληθυσμούς Τ-λεμφοκυττάρων.
- συμβάλλουν στο σχηματισμό μακροπρόθεσμης ανοσίας.
- εξαλείφει τον κίνδυνο μόλυνσης.

L.V. Timoschenko, M.V. Τσούμπικ

Η ιντερφερόνη είναι μια σημαντική προστατευτική πρωτεΐνη του ανοσοποιητικού συστήματος. Ανακαλύφθηκε κατά τη διάρκεια της μελέτης της παρεμβολής του ιού, δηλαδή του φαινομένου όταν ζώα ή κυτταροκαλλιέργειες που είχαν μολυνθεί από έναν ιό έγιναν μη ευαίσθητα στη μόλυνση από άλλο ιό. Αποδείχθηκε ότι η παρεμβολή οφείλεται στην πρωτεΐνη που προκύπτει, η οποία έχει προστατευτικές αντιικές ιδιότητες. Αυτή η πρωτεΐνη ονομαζόταν ιντερφερόνη.

Η ιντερφερόνη είναι μια οικογένεια πρωτεϊνών γλυκοπρωτεΐνης που συντίθενται από κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος και του συνδετικού ιστού. Ανάλογα με το ποια κύτταρα συνθέτουν την ιντερφερόνη, υπάρχουν τρεις τύποι: α, β και γ-ιντερφερόνες.

Η άλφα ιντερφερόνη παράγεται από λευκοκύτταρα και ονομάζεται λευκοκύτταρα. Η βήτα ιντερφερόνη ονομάζεται ινοβλαστική, αφού συντίθεται από ινοβλάστες - κύτταρα συνδετικού ιστού, και η ιντερφερόνη γάμμα ονομάζεται ανοσοποιητική, αφού παράγεται από ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα, μακροφάγους, φυσικά κύτταρα φονείς, δηλαδή κύτταρα του ανοσοποιητικού.

Η ιντερφερόνη συντίθεται συνεχώς στον οργανισμό και η συγκέντρωσή της στο αίμα διατηρείται περίπου στα 2 IU/ml (1 διεθνής μονάδα - IU - είναι η ποσότητα ιντερφερόνης που προστατεύει μια κυτταρική καλλιέργεια από 1 CPD50 του ιού). Η παραγωγή ιντερφερόνης αυξάνεται απότομα κατά τη μόλυνση με ιούς, καθώς και όταν εκτίθεται σε επαγωγείς ιντερφερόνης, όπως το RNA, το DNA και τα πολύπλοκα πολυμερή. Τέτοιοι επαγωγείς ιντερφερόνης ονομάζονται ιντερφερονογόνα.

Εκτός από την αντιική δράση, η ιντερφερόνη έχει αντικαρκινική προστασία, καθώς καθυστερεί τον πολλαπλασιασμό (αναπαραγωγή) των καρκινικών κυττάρων, καθώς και ανοσοτροποποιητική δραστηριότητα, διεγείροντας τη φαγοκυττάρωση, φυσικά κύτταρα φονείς, ρυθμίζοντας το σχηματισμό αντισωμάτων από Β κύτταρα, ενεργοποιώντας την έκφραση των κύριων σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας.

Ο μηχανισμός δράσης της ιντερφερόνης είναι πολύπλοκος. Η ιντερφερόνη δεν επηρεάζει άμεσα τον ιό έξω από το κύτταρο, αλλά συνδέεται με ειδικούς κυτταρικούς υποδοχείς και επηρεάζει τη διαδικασία αναπαραγωγής του ιού μέσα στο κύτταρο στο στάδιο της πρωτεϊνοσύνθεσης.

Χρήση ιντερφερόνης. Η δράση της ιντερφερόνης είναι πιο αποτελεσματική όσο νωρίτερα αρχίσει να συντίθεται ή να εισέρχεται στο σώμα από έξω. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται για προφυλακτικούς σκοπούς για πολλές ιογενείς λοιμώξεις, όπως η γρίπη, καθώς και για θεραπευτικούς σκοπούς σε χρόνιες ιογενείς λοιμώξεις, όπως παρεντερική ηπατίτιδα (Β, C, D), έρπης, σκλήρυνση κατά πλάκας κ.λπ. Η ιντερφερόνη δίνει θετική έχει ως αποτέλεσμα τη θεραπεία κακοήθων όγκων και ασθενειών που σχετίζονται με ανοσοανεπάρκειες.

Οι ιντερφερόνες είναι ειδικές για τα είδη, δηλαδή η ανθρώπινη ιντερφερόνη είναι λιγότερο αποτελεσματική για τα ζώα και αντίστροφα. Ωστόσο, η ιδιαιτερότητα αυτού του είδους είναι σχετική.

Λήψη ιντερφερόνης. Η ιντερφερόνη λαμβάνεται με δύο τρόπους: α) με μόλυνση ανθρώπινων λευκοκυττάρων ή λεμφοκυττάρων με έναν ασφαλή ιό, ως αποτέλεσμα του οποίου τα μολυσμένα κύτταρα συνθέτουν ιντερφερόνη, η οποία στη συνέχεια απομονώνεται και κατασκευάζονται σκευάσματα ιντερφερόνης από αυτήν. β) γενετικά τροποποιημένο - με την ανάπτυξη ανασυνδυασμένων στελεχών βακτηρίων ικανών να παράγουν ιντερφερόνη υπό συνθήκες παραγωγής. Τυπικά, χρησιμοποιούνται ανασυνδυασμένα στελέχη ψευδομονάδας και Escherichia coli με γονίδια ιντερφερόνης ενσωματωμένα στο DNA τους. Η ιντερφερόνη που λαμβάνεται με γενετική μηχανική ονομάζεται ανασυνδυασμένη. Στη χώρα μας, η ανασυνδυασμένη ιντερφερόνη έλαβε την επίσημη ονομασία "Reaferon". Η παραγωγή αυτού του φαρμάκου είναι από πολλές απόψεις πιο αποτελεσματική και φθηνότερη από το φάρμακο των λευκοκυττάρων.

Η ανασυνδυασμένη ιντερφερόνη έχει βρει ευρεία χρήση στην ιατρική ως προληπτικός και θεραπευτικός παράγοντας για ιογενείς λοιμώξεις, νεοπλάσματα και ανοσοανεπάρκειες.

23. Παράγοντες ειδικής ανοσίας σε ιογενείς ασθένειες. Ο ρόλος της κυτταρικής ανοσίας στην προστασία του οργανισμού από τον ιό

Το συγκεκριμένο ανοσοποιητικό σύστημα έχει το δικό του κεντρικό (μυελός των οστών, θύμος, θύλακας του Fabricius στα πτηνά, συκώτι στα θηλαστικά) και περιφερειακά όργανα (σπληνός, λεμφαδένες, λεμφοειδείς ιστοί του γαστρεντερικού σωλήνα, καθώς και αίμα και λέμφος, τα οποία εισέρχονται και κυκλοφορούν συνεχώς όλα τα ανοσοεπαρκή κύτταρα).

Το όργανο ανοσίας είναι ο λεμφοειδής ιστός και οι κύριοι εκτελεστές του είναι τα μακροφάγα (καθώς και άλλα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα), διάφοροι πληθυσμοί και υποπληθυσμοί Τ- και Β-λεμφοκυττάρων.

Ο κύριος στόχος του ανοσοποιητικού συστήματος είναι τα αντιγόνα, η συντριπτική πλειοψηφία των οποίων είναι πρωτεϊνικής φύσης.

Τα λεμφοκύτταρα αντιπροσωπεύονται από δύο μεγάλους πληθυσμούς - Β και Τ κύτταρα, τα οποία είναι υπεύθυνα για την ειδική αναγνώριση των αντιγόνων. Έχοντας προκύψει από μια κοινή πηγή, το λεγόμενο βλαστοκύτταρο, και έχοντας υποστεί κατάλληλη διαφοροποίηση στα κεντρικά όργανα του ανοσοποιητικού συστήματος, τα Τ- και Β-λεμφοκύτταρα αποκτούν ανοσοικανότητα, εισέρχονται στο αίμα και κυκλοφορούν συνεχώς σε όλο το σώμα, παίζοντας το ρόλο των αποτελεσματικών υπερασπιστών της.

Τα Τ λεμφοκύτταρα παρέχουν τον κυτταρικό τύπο ανοσοαποκρίσεων και τα Β λεμφοκύτταρα παρέχουν τον χυμικό τύπο ανοσοαπόκρισης.

Η διαφοροποίηση των προδρόμων Τ-λεμφοκυττάρων σε ανοσοεπαρκή κύτταρα («εκπαίδευση») λαμβάνει χώρα στον θύμο υπό την επίδραση χυμικών παραγόντων που εκκρίνονται από τον θύμο αδένα. ωρίμανση των Β λεμφοκυττάρων - σε πτηνά στον θύλακα, στα θηλαστικά, πρώτα στο ήπαρ του εμβρύου και μετά τη γέννηση στο μυελό των οστών.

Τα ώριμα Β και Τ λεμφοκύτταρα αποκτούν την ικανότητα να αναγνωρίζουν ξένα αντιγόνα. Αφήνουν τον μυελό των οστών και τον θύμο και αποικίζουν τη σπλήνα, τους λεμφαδένες και άλλες συλλογές λεμφικών κυττάρων. Η συντριπτική πλειοψηφία των Τ και Β λεμφοκυττάρων κυκλοφορεί στο αίμα και τη λέμφο. Αυτή η σταθερή κυκλοφορία διασφαλίζει ότι όσο το δυνατόν περισσότερα σχετικά λεμφοκύτταρα έρχονται σε επαφή με το αντιγόνο (ιό).

Κάθε Β κύτταρο είναι γενετικά προγραμματισμένο να παράγει αντισώματα σε ένα συγκεκριμένο αντιγόνο. Έχοντας συναντήσει και αναγνωρίσει αυτό το αντιγόνο, τα Β κύτταρα πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται σε ενεργά πλασματοκύτταρα που εκκρίνουν αντισώματα σε αυτό το αντιγόνο. Ένα άλλο τμήμα των Β-λεμφοκυττάρων, έχοντας περάσει από 2-3 κύκλους διαίρεσης, μετατρέπεται σε κύτταρα μνήμης που δεν είναι ικανά να παράγουν αντισώματα. Μπορούν να ζήσουν για πολλούς μήνες, ακόμη και χρόνια, χωρίς να διαιρούνται, κυκλοφορώντας μεταξύ του αίματος και των δευτερογενών λεμφικών οργάνων. Αναγνωρίζουν γρήγορα το αντιγόνο όταν επανεισέρχεται στο σώμα, μετά την οποία τα κύτταρα μνήμης αποκτούν την ικανότητα να διαιρούνται και να μετατρέπονται σε πλασματοκύτταρα που εκκρίνουν αντισώματα.

Τα κύτταρα μνήμης σχηματίζονται από Τ λεμφοκύτταρα με τον ίδιο τρόπο. Αυτό μπορεί να ονομαστεί «απόθεμα» ανοσοεπαρκών κυττάρων.

Τα κύτταρα μνήμης καθορίζουν τη διάρκεια της επίκτητης ανοσίας. Με επανειλημμένη επαφή με αυτό το αντιγόνο, μετατρέπονται γρήγορα σε τελεστικά κύτταρα. Παράλληλα, τα Β κύτταρα της μνήμης παρέχουν τη σύνθεση αντισωμάτων σε μικρότερο χρονικό διάστημα, σε μεγαλύτερες ποσότητες και κυρίως IgG. Έχει διαπιστωθεί ότι υπάρχουν Τ βοηθητικά κύτταρα που καθορίζουν την εναλλαγή των κατηγοριών ανοσοσφαιρίνης.

Υπάρχουν δύο επιλογές για την έκδοση ανοσοαπόκρισης με τη μορφή βιοσύνθεσης αντισωμάτων:

πρωτογενής απόκριση - μετά την πρώτη συνάντηση του σώματος με ύπνο αντι-1.

δευτερογενής απόκριση - μετά από επανειλημμένη επαφή με το αντιγόνο, μετά από 2-3 εβδομάδες.

Διαφέρουν στους ακόλουθους δείκτες: τη διάρκεια της λανθάνουσας περιόδου. ο ρυθμός αύξησης του τίτλου αντισωμάτων, η συνολική ποσότητα των συντιθέμενων αντισωμάτων. αλληλουχία σύνθεσης ανοσοσφαιρινών διαφόρων τάξεων. Οι κυτταρικοί μηχανισμοί των πρωτογενών και δευτερογενών ανοσοαποκρίσεων διαφέρουν επίσης.

Κατά την πρωτογενή ανοσοαπόκριση, σημειώνεται: η βιοσύνθεση των αντισωμάτων μετά την λανθάνουσα περίοδο διαρκεί 3-3 ημέρες. ο ρυθμός σύνθεσης αντισωμάτων είναι σχετικά χαμηλός. ο τίτλος αντισωμάτων δεν φτάνει τις μέγιστες τιμές. Πρώτα συντίθεται IgM, μετά IgG και αργότερα IgA και IgE. Η δευτερογενής ανοσοαπόκριση χαρακτηρίζεται από: λανθάνουσα περίοδο - εντός αρκετών ωρών. ο ρυθμός σύνθεσης αντισωμάτων είναι λογαριθμικός. ο τίτλος αντισωμάτων φτάνει τις μέγιστες τιμές. Το IgG συντίθεται αμέσως.

Η δευτερογενής ανοσολογική απόκριση προκαλείται από κύτταρα της ανοσολογικής μνήμης.

Τα Τ κύτταρα έχουν πολλαπλούς πληθυσμούς με διαφορετικές λειτουργίες. Μερικά αλληλεπιδρούν με τα Β κύτταρα, βοηθώντας τα να πολλαπλασιαστούν, να ωριμάσουν και να σχηματίσουν αντισώματα και επίσης να ενεργοποιήσουν τα μακροφάγα - βοηθητικά Τ κύτταρα (Tx). Άλλα καταστέλλουν τις ανοσολογικές αποκρίσεις - κατασταλτικά Τ κύτταρα (Tc). ο τρίτος πληθυσμός των Τ κυττάρων καταστρέφει τα κύτταρα του σώματος που έχουν μολυνθεί με ιούς ή άλλους παράγοντες. Αυτός ο τύπος δραστηριότητας ονομάζεται κυτταροτοξικότητα και τα ίδια τα κύτταρα ονομάζονται κυτταροτοξικά Τ κύτταρα (Tc) ή φονικά Τ κύτταρα (Tk).

Επειδή τα βοηθητικά Τ κύτταρα και τα κατασταλτικά Τ κύτταρα δρουν ως ρυθμιστές της ανοσολογικής απόκρισης, αυτοί οι δύο τύποι Τ κυττάρων ονομάζονται ρυθμιστικά Τ κύτταρα.

Τα μακροφάγα είναι ουσιαστικός παράγοντας στην αντιϊκή ανοσία. Δεν καταστρέφουν μόνο ξένα αντιγόνα, αλλά παρέχουν επίσης αντιγονικούς καθοριστικούς παράγοντες για να πυροδοτήσουν μια αλυσίδα ανοσολογικών αντιδράσεων (παρούσα). Τα αντιγόνα που απορροφώνται από τα μακροφάγα διασπώνται σε μικρά θραύσματα (αντιγονικοί προσδιοριστές), τα οποία συνδέονται με μόρια πρωτεϊνών του κύριου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MHC I, II) και μεταφέρονται στην επιφάνεια των μακροφάγων, όπου αναγνωρίζονται από τα Τ λεμφοκύτταρα (Tx, Tk) και Β λεμφοκύτταρα, γεγονός που οδηγεί στην ενεργοποίηση και αναπαραγωγή τους.

Τα βοηθητικά Τ, όταν ενεργοποιούνται, συνθέτουν παράγοντες (μεσολαβητές) για να διεγείρουν τα Β- και Τ-λεμφοκύτταρα. Τα ενεργοποιημένα φονικά Τ κύτταρα πολλαπλασιάζονται και σχηματίζεται μια δεξαμενή κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων που μπορεί να εξασφαλίσει τον θάνατο των κυττάρων-στόχων, δηλαδή των κυττάρων που έχουν μολυνθεί από τον ιό.

Η κύρια ιδιότητα όλων των φονικών κυττάρων είναι ότι υπό την επιρροή τους και το κύτταρο στόχο, ενεργοποιούνται οι μηχανισμοί της αλόπτωσης (προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος). Η λύση των κυττάρων λαμβάνει χώρα μετά την αποκόλληση του φονικού κυττάρου, επιτρέποντας σε ένα φονικό κύτταρο να οδηγεί πολλαπλά κύτταρα-στόχους. Η διαδικασία λύσης περιλαμβάνει περφορίνες και γρανζύμα που εκκρίνονται από λεμφοκύτταρα. Η περφορίνη, που είναι ενσωματωμένη στην κυτταρική μεμβράνη, σχηματίζει ένα κανάλι σε αυτήν μέσω του οποίου ο λοβός διεισδύει στο κύτταρο. Το κύτταρο διογκώνεται και λύεται. Τα γκράνζυμα πιστεύεται ότι μεσολαβούν στην πρόκληση απόπτωσης.

Τα ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται σε πλασματοκύτταρα, τα οποία συνθέτουν και εκκρίνουν αντισώματα της κατάλληλης κατηγορίας (IgM, IgG, IgA, IgD, IgE).

Η συντονισμένη αλληλεπίδραση των μακροφάγων, των Τ- και των Β-λεμφοκυττάρων κατά την αντιμετώπιση ενός αντιγόνου παρέχει τόσο χυμική όσο και κυτταρική ανοσολογική απόκριση. Όλες οι μορφές ανοσοαπόκρισης απαιτούν συντονισμένη αλληλεπίδραση των κύριων παραγόντων του ανοσοποιητικού συστήματος: μακροφάγα, Τ-, Β-λεμφοκύτταρα, κύτταρα ΝΚ, σύστημα ιντερφερόνης, συμπλήρωμα, κύριο σύστημα ιστοσυμβατότητας. Η αλληλεπίδραση μεταξύ τους πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας μια ποικιλία συντιθέμενων και εκκρινόμενων μεσολαβητών.

Οι μεσολαβητές που παράγονται από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος και εμπλέκονται στη ρύθμιση της δραστηριότητάς του ονομάζονται συλλογικά κυτοκίνες (από το ελληνικό cytos - κύτταρο και κινεο - για να τεθεί σε κίνηση). Διακρίνονται σε μονοκίνες - μεσολαβητές που παράγονται από μονοκύτταρα και μακροφάγα. λεμφοκίνες - μεσολαβητές που εκκρίνονται από ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα. λεμφοκίνες που αναγνωρίζονται χημικά και λαμβάνονται σε καθαρή μορφή. Το 1979 προτάθηκε να ονομαστούν ιντερλευκίνες. Υποδεικνύονται με αριθμούς - 1, 2, 3, 4, 5 κ.λπ. Η οικογένεια ιντερλευκινών αναπληρώνεται με νέους εκπροσώπους που πραγματοποιούν αμοιβαία ρύθμιση του ανοσοποιητικού, νευρικού και ενδοκρινικού συστήματος. Όλα τα ανοσοεπαρκή κύτταρα φέρουν μοναδικούς υποδοχείς στις μεμβράνες τους, με τη βοήθεια των οποίων αναγνωρίζουν και αντιλαμβάνονται σήματα από άλλα ανοσοκύτταρα, αναδιατάσσουν το μεταβολισμό τους, συνθέτουν ή εξαλείφουν τους δικούς τους υποδοχείς. Χάρη σε αυτό, όλα τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος λειτουργούν ως ένα καλά λαδωμένο σύστημα.

24. Ιικές πρωτεΐνες, ο ρόλος τους στην οροδιάγνωση. Ειδικά αντισώματα. Χαρακτηριστικά ανοσοσφαιρινών.

Πρωτεΐνες ιών

Εντοπισμός ιικών πρωτεϊνών

Οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με τον κύκλο ζωής του ιού χωρίζονται σε πρωτεΐνες που καθορίζονται από το γονιδίωμα του ιού και σε πρωτεΐνες κυτταρικής προέλευσης. Παραδείγματα κυτταρικών πρωτεϊνών που βρίσκονται σε ορισμένα ιοσωμάτια περιλαμβάνουν την κυτταροσκελετική πρωτεΐνη ακτίνη και τις πυρηνικές πρωτεΐνες ιστόνες. Οι πρωτεΐνες κυτταρικής προέλευσης που εμπλέκονται στη διαδικασία αντιγραφής του ιού θα συζητηθούν στην ενότητα για την αλληλεπίδραση ιού-κυττάρου.

Με βάση τη θέση τους, οι πρωτεΐνες που προσδιορίζονται από το γονιδίωμα του ιού χωρίζονται σε δύο ομάδες:

1) δομικές πρωτεΐνες- αυτές είναι πρωτεΐνες που συνθέτουν το HF, ονομάζονται VP.

2) μη δομικές πρωτεΐνες- πρόκειται για πρόδρομες ενώσεις δομικών πρωτεϊνών, ρυθμιστικών πρωτεϊνών και ενζύμων που εξυπηρετούν τη διαδικασία της ενδοκυτταρικής αναπαραγωγής του ιού και δεν αποτελούν μέρος του HF. Ονομάζονται ως πρωτεΐνες NS (σχήμα).
Ιδιότητες ιικών πρωτεϊνών

Τα Virions περιέχουν πρωτεΐνες με διαφορετικά μοριακά βάρη (από 4 έως 100 kDa), που αποτελούνται από μία ή περισσότερες πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Η ποσότητα αυτών των πρωτεϊνών ποικίλλει επίσης μεταξύ των ιών. Το νουκλεοκαψίδιο TMV περιέχει μία πρωτεΐνη. Για άλλους ιούς, το ιοσωμάτιο μπορεί να περιέχει αρκετές δεκάδες πρωτεΐνες που έχουν διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες. Οι πρωτεΐνες που σχηματίζουν το καψίδιο, το νουκλεοκαψίδιο και το κέλυφος του πυρήνα έχουν μια κοινή ιδιότητα - την ικανότητα αυτοσυναρμολόγησης.
Η σύνθεση του HF μπορεί να περιλαμβάνει πρωτεΐνες χαμηλού μοριακού βάρους που δεν εμπλέκονται στο σχηματισμό του καψιδίου. Για παράδειγμα, γονιδιωματικές πρωτεΐνες picornaviruses και adenoviruses. Η γονιδιωματική πρωτεΐνη συνδέεται ομοιοπολικά με το νουκλεϊκό οξύ και συμμετέχει στην αντιγραφή του.

Εντοπισμός ιικών πρωτεϊνών

Παρουσιάζονται σύνθετες πρωτεΐνες γλυκοπρωτεΐνες(ορίζεται ως gp) και λιποπρωτεΐνες. Η παρουσία μιας γλυκοπρωτεΐνης καθορίζει την παρουσία ενός συστατικού υδατάνθρακα στο ιοσωματίδιο, το οποίο μπορεί να αντιπροσωπεύεται από ολιγοσακχαρίτες τύπου μαννόζης, γαλακτόζη, Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη ή νευραμινικό οξύ. Οι ιογενείς γλυκοπρωτεΐνες, κατά κανόνα, εκτίθενται στην εξωτερική επιφάνεια του ιού και εκτελούν τρεις κύριες λειτουργίες: εξασφαλίζουν τη σύνδεση του ιού με τον κυτταρικό υποδοχέα (τη λειτουργία μιας πρωτεΐνης προσκόλλησης), έχουν δραστηριότητα σύντηξης (παρέχουν σύντηξη μεμβράνης) και να καθορίσουν τις αντιγονικές ιδιότητες των ιών. Ταυτόχρονα, οι ιογενείς γλυκοπρωτεΐνες μπορούν επίσης να είναι μη δομικές πρωτεΐνες και, παραμένοντας σε ενιαία μορφή στη μεμβράνη του τραχιού ενδοπλασματικού δικτύου (RER), εκτελούν τις λειτουργίες των τρανλοκασών, εξασφαλίζοντας τη μεταφορά ιικών συστατικών στον αυλό του.
Ιογενής λιποπρωτεΐνεςαντιπροσωπεύονται από πρωτεΐνες ακυλιωμένες, κατά κανόνα, με μυριστικό οξύ. Τα υπολείμματα λιπαρών οξέων που συνδέονται με ένα μόριο πρωτεΐνης λειτουργούν ως λιπόφιλη άγκυρα.
Ιογενής ενζυμικές πρωτεΐνεςμπορεί να είναι μέρος του ιικού σωματιδίου ή να είναι μη δομικές πρωτεΐνες και να εμφανίζονται στο κύτταρο μετά την έκφραση του ιικού γονιδιώματος. Το πιο εξοπλισμένο με ένζυμα είναι το virion του ιού της ευλογιάς, το οποίο έχει ένα σχεδόν πλήρες σύνολο ενζύμων που είναι απαραίτητα για την ανεξάρτητη ενδοκυτταρική αναπαραγωγή του ιού. Ταυτόχρονα, μικροί, απλά οργανωμένοι ισομετρικοί ιοί με θετικό γονιδίωμα RNA μπορεί να μην έχουν κανένα ένζυμο στο ιοσωμάτιο.
Οι λειτουργικά ενεργές ιικές πρωτεΐνες αντιπροσωπεύονται, πρώτα απ 'όλα, από ένζυμα μεταβολισμού νουκλεϊκών οξέων, τα οποία παρέχουν πολύπλοκους μηχανισμούς αντιγραφής/μεταγραφής του ιικού γονιδιώματος. ένζυμα που πραγματοποιούν μετα-μεταφραστική επεξεργασία και τροποποίηση πρωτεϊνών και ένζυμα που εμπλέκονται στη διείσδυση ιοσωμάτων στο κύτταρο ξενιστή.
Η πρώτη ομάδα ενζύμων είναι η πιο πολυάριθμη και περιλαμβάνει τόσο ανάλογα κυτταρικών ενζύμων όσο και ειδικά για τον ιό ένζυμα.

εξαρτώμενη από DNA πολυμεράση DNA - πραγματοποιεί σύνθεση DNA σε μήτρα DNA (ιός ευλογιάς).

RNA πολυμεράση εξαρτώμενη από το DNA - πραγματοποιεί τη σύνθεση του mRNA σε μια μήτρα DNA (ιός ευλογιάς).

RNA-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση - πραγματοποιεί σύνθεση RNA σε ένα πρότυπο RNA. Εκτελεί τις λειτουργίες μεταγραφάσης και ρεπλικάσης. Ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά το 1970 από τη Βαλτιμόρη στον ιό της φυσαλιδώδους στοματίτιδας. Είναι μέρος των βιριόντων ή είναι πρωτεΐνη NS ιών που περιέχουν RNA.

Αντίστροφη μεταγραφάση ή ρεβερτάση ή εξαρτώμενη από RNA πολυμεράση DNA πραγματοποιεί σύνθεση DNA σε ένα πρότυπο RNA. Ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά το 1970 σε ρετροϊούς από τους Temin και Mizutani.
Ελικάση- ξετυλίγει τη δομή του δίκλωνου DNA. Επιπλέον, οι ελικάσες έχουν δραστικότητα ελικάσης RNA εξαρτώμενης από τριφωσφορικό νουκλεοτίδιο, η οποία περιλαμβάνει τρεις διεργασίες: δέσμευση τριφωσφορικού δεοξυνουκλεοτιδίου, υδρόλυση του και, λόγω αυτής της ενέργειας, ξετύλιγμα δίκλωνου RNA.

Ένζυμα τροποποίησης mRNA : πολυμεράση πολυ-Α - αδενυλιώνει το άκρο 3" του RNA χρησιμοποιώντας την ενέργεια του ΑΤΡ· ένζυμο καπακιού και σύμπλοκο μεθυλοτρανσφεράσης - καταλύει το σχηματισμό μιας δομής καπακιού στο άκρο 5".

ATPase, GTPase - διενεργούν υδρόλυση των αντίστοιχων ενεργειακών υποστρωμάτων.

Ριβονουκλεάση Η - καταστρέφει το RNA που βρίσκεται σε διπλή όψη με το DNA. Η δεύτερη ομάδα ιικών ενζύμων είναι τα ένζυμα του μεταβολισμού των πρωτεϊνών.

Παραθέτουμε μερικά μόνο από αυτά:

Πρωτεϊνάσες - ένζυμα που εμπλέκονται στη μετα-μεταφραστική επεξεργασία πολυπρωτεϊνών. Είναι πρωτεΐνες NS των ιών RNA.

Πρωτεϊνικές κινάσες - ένζυμα που φωσφορυλιώνουν τις δομικές πρωτεΐνες των βιριόντων. Βρέθηκε στον ιό της φυσαλιδώδους στοματίτιδας, στον ιό της λύσσας, στους αλφαϊούς και στους ρετροϊούς.

Παραδείγματα ενζύμων που εμπλέκονται στη διείσδυση ιών στα κύτταρα είναι λυσοζύμηβακτηριοφάγους και νευραμινιδάσητου ιού της γρίπης.

Στη διαδικασία σχηματισμού της επίκτητης μολυσματικής ανοσίας, σημαντικό ρόλο έχουν τα αντισώματα (αντι - κατά, σώμα - ρωσική λέξη, δηλ. ουσία). Και παρόλο που ένα ξένο αντιγόνο μπλοκάρεται από συγκεκριμένα κύτταρα του σώματος και υφίσταται φαγοκυττάρωση, μια ενεργή επίδραση στο αντιγόνο είναι δυνατή μόνο με την παρουσία αντισωμάτων.

Τα αντισώματα είναι ειδικές πρωτεΐνες, ανοσοσφαιρίνες, που σχηματίζονται στο σώμα υπό την επίδραση ενός αντιγόνου και έχουν την ιδιότητα να συνδέονται ειδικά με αυτό και να διαφέρουν από τις συνηθισμένες σφαιρίνες παρουσία ενός ενεργού κέντρου.

Τα αντισώματα είναι ένας σημαντικός ειδικός παράγοντας στην άμυνα του οργανισμού έναντι των παθογόνων μικροοργανισμών και των γενετικά ξένων ουσιών και κυττάρων.
Τα αντισώματα σχηματίζονται στο σώμα ως αποτέλεσμα μόλυνσης (φυσική ανοσοποίηση), ή εμβολιασμού με νεκρά και ζωντανά εμβόλια (τεχνητή ανοσοποίηση), ή επαφή του λεμφικού συστήματος με ξένα κύτταρα, ιστούς (μεταμοσχεύσεις) ή με δικά του κατεστραμμένα κύτταρα που έχουν γίνονται αυτοαντιγόνα.
Τα αντισώματα ανήκουν σε ένα συγκεκριμένο κλάσμα πρωτεΐνης, κυρίως α-σφαιρίνες, που ονομάζονται IgY.

Τα αντισώματα χωρίζονται σε ομάδες:

• Το πρώτο είναι μικρά μόρια με σταθερά καθίζησης 7S (α-σφαιρίνες).
• το δεύτερο είναι μεγάλα μόρια με σταθερά καθίζησης 19 S (a - σφαιρίνες).

Το μόριο αντισώματος περιλαμβάνει τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες που αποτελούνται από αμινοξέα. Δύο από αυτά είναι βαριά (mm 70.000 daltons) και δύο είναι ελαφριά (mm 20.000 daltons). Οι ελαφριές και οι βαριές αλυσίδες συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικές γέφυρες. Οι ελαφριές αλυσίδες είναι κοινές σε όλες τις κλάσεις και υποκατηγορίες. Οι βαριές αλυσίδες έχουν χαρακτηριστικά δομικά χαρακτηριστικά για κάθε κατηγορία ανοσοσφαιρινών.
Το μόριο αντισώματος περιέχει ενεργά κέντρα που βρίσκονται στα άκρα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων και αντιδρούν ειδικά με το αντιγόνο. Τα ατελή αντισώματα είναι μονοσθενή (ένας αντικαθοριστικός παράγοντας), τα πλήρη αντισώματα έχουν δύο και σπανιότερα είναι περισσότερο αντικαθοριστικά.

Η διαφορά μεταξύ συγκεκριμένων ανοσοσφαιρινών είναι στη δομή των βαριών αλυσίδων και στο χωρικό μοτίβο των αντικαθοριστικών παραγόντων. Σύμφωνα με την ταξινόμηση του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ), υπάρχουν πέντε κατηγορίες κύριων ανοσοσφαιρινών: Η IgG κυκλοφορεί στο αίμα και αποτελεί το 80% όλων των αντισωμάτων. Περάστε από τον πλακούντα. Μοριακό βάρος 160000. Μέγεθος 235 x 40A o. Σημαντικός ως ειδικός παράγοντας ανοσίας. Εξουδετερώνουν το αντιγόνο με τη σωματιδοποίηση του (καταβύθιση, καθίζηση, συγκόλληση), η οποία διευκολύνει τη φαγοκυττάρωση, τη λύση και την εξουδετέρωση. Προωθεί την εμφάνιση καθυστερημένων αλλεργικών αντιδράσεων. Σε σύγκριση με άλλες ανοσοσφαιρίνες, το IgG είναι σχετικά ανθεκτικό στη θερμότητα - μπορεί να αντέξει τη θέρμανση στους 75 o C για 30 λεπτά.
Το Ig M - κυκλοφορεί στο αίμα, αποτελώντας το 5-10% όλων των αντισωμάτων. Μοριακό βάρος 950000, σταθερά καθίζησης 19 S, λειτουργικά πεντασθενές, εμφανίζεται για πρώτη φορά μετά τη μόλυνση ή τον εμβολιασμό ενός ζώου. Το Ig M δεν εμπλέκεται σε αλλεργικές αντιδράσεις και δεν διέρχεται από τον πλακούντα. Δρα στα θετικά κατά Gram βακτήρια, ενεργοποιεί τη φαγοκυττάρωση. Η κατηγορία Ig M περιλαμβάνει αντισώματα ανθρώπινων ομάδων αίματος - Α, Β, Ο.
Ig A - περιλαμβάνει δύο τύπους: ορό και εκκριτικό. Ο ορός Ig A έχει μοριακό βάρος 170.000, σταθερά καθίζησης 7 S. Δεν έχει την ικανότητα να καθιζάνει διαλυτά αντιγόνα, συμμετέχει στην αντίδραση εξουδετέρωσης των τοξινών, είναι θερμοσταθερός, συντίθεται στον σπλήνα, στους λεμφαδένες και βλεννογόνους και εισέρχεται στις εκκρίσεις - σάλιο, δακρυϊκό υγρό, βρογχικό υγρό μυστικό, πρωτόγαλα.
Η εκκριτική Ig A (S Ig A) χαρακτηρίζεται από την παρουσία ενός δομικού πρόσθετου συστατικού, είναι ένα πολυμερές, σταθερά καθίζησης 11 S και 15 S, μοριακού βάρους 380.000, που συντίθεται στους βλεννογόνους. Η βιολογική λειτουργία του S Ig A είναι κυρίως τοπική προστασία των βλεννογόνων, για παράδειγμα σε παθήσεις του γαστρεντερικού ή της αναπνευστικής οδού. Έχουν βακτηριοκτόνα και οψωνικά αποτελέσματα.
Ig D - η συγκέντρωση στον ορό του αίματος δεν είναι μεγαλύτερη από 1%, μοριακό βάρος 160000, σταθερά καθίζησης 7 S. Η Ig D έχει ενεργοποιημένη δραστηριότητα και δεν δεσμεύεται στους ιστούς. Αύξηση της περιεκτικότητάς του παρατηρήθηκε στο ανθρώπινο μυέλωμα.
Ig E - μοριακό βάρος 190.000, σταθερά καθίζησης 8,5 S. Το Ig E είναι θερμοευαίσθητο, συνδέεται ισχυρά με τα κύτταρα των ιστών, με τα βασεόφιλα των ιστών και συμμετέχει σε μια αντίδραση άμεσης υπερευαισθησίας. Το Ig E παίζει προστατευτικό ρόλο σε ελμινθίαση και πρωτόζωα και ενισχύει τη φαγοκυτταρική δραστηριότητα των μακροφάγων και των ηωσινόφιλων.
Τα αντισώματα είναι ασταθή σε θερμοκρασίες 70 0 C και οι αλκοόλες τα μετουσιώνουν. Η δραστηριότητα του αντισώματος διαταράσσεται όταν το pH του περιβάλλοντος, οι ηλεκτρολύτες κ.λπ. αλλάζουν (σβήνουν).
Όλα τα αντισώματα έχουν ένα ενεργό κέντρο - μια περιοχή θέσης 700 A o, η οποία είναι το 2% της επιφάνειας του αντισώματος. Το ενεργό κέντρο αποτελείται από 10-20 αμινοξέα. Τις περισσότερες φορές περιέχουν τυροσίνη, λυσίνη και τρυπτοφάνη. Στα θετικά φορτισμένα απτένια, τα αντισώματα έχουν μια αρνητικά φορτισμένη ομάδα - COOH -. Τα αρνητικά φορτισμένα απτένια ενώνονται με μια ομάδα NH 4 +.
Τα αντισώματα έχουν την ικανότητα να διακρίνουν ένα αντιγόνο από ένα άλλο. Αλληλεπιδρούν μόνο με εκείνα τα αντιγόνα (με σπάνιες εξαιρέσεις) έναντι των οποίων αναπτύσσονται και τα ταιριάζουν σύμφωνα με τη χωρική τους δομή. Αυτή η ικανότητα αντισωμάτων ονομάζεται συμπληρωματικότητα.
Η ειδικότητα του αντισώματος καθορίζεται από τη χημική δομή και το χωρικό πρότυπο των αντικαθοριστικών παραγόντων. Συνδέεται με την πρωτογενή δομή (εναλλαγή αμινοξέων) του μορίου πρωτεΐνης αντισώματος.
Οι βαριές και ελαφριές αλυσίδες των ανοσοσφαιρινών καθορίζουν την ειδικότητα της ενεργού θέσης.
Πρόσφατα, ανακαλύφθηκε ότι υπάρχουν αντισώματα κατά των αντισωμάτων. Σταματούν τη δράση των φυσιολογικών αντισωμάτων. Με βάση αυτή την ανακάλυψη, αναδύεται μια νέα θεωρία - ρύθμιση δικτύου του ανοσοποιητικού συστήματος του σώματος.
Η θεωρία του σχηματισμού αντισωμάτων αγγίζει μια σειρά ζητημάτων από διάφορους σχετικούς κλάδους (γενετική, βιοχημεία, μορφολογία, κυτταρολογία, μοριακή βιολογία), τα οποία επί του παρόντος είναι συνυφασμένα με την ανοσολογία. Υπάρχουν αρκετές υποθέσεις για τη σύνθεση αντισωμάτων. Η υπόθεση κλωνικής επιλογής του F. Burnet έλαβε τη μεγαλύτερη αναγνώριση. Σύμφωνα με αυτήν, το σώμα περιέχει περισσότερους από 10.000 κλώνους λεμφοειδών και ανοσολογικά ικανών κυττάρων ικανών να αντιδρούν με διάφορα αντιγόνα ή τους καθοριστικούς παράγοντες τους και να παράγουν αντισώματα. Υποτίθεται ότι οι κλώνοι τέτοιων κυττάρων είναι ικανοί να αντιδρούν με τις δικές τους πρωτεΐνες, ως αποτέλεσμα των οποίων καταστρέφονται. Έτσι πεθαίνουν τα κύτταρα που σχηματίζουν αντισυγκολλητίνες έναντι του Α-αντιγόνου σε οργανισμούς με ομάδα αίματος Α και αντι-Β-συγκολλητίνες με ομάδα αίματος Β.
Εάν οποιοδήποτε αντιγόνο εισαχθεί στο έμβρυο, τότε με παρόμοιο τρόπο καταστρέφει τον αντίστοιχο κλώνο κυττάρων και το νεογέννητο θα είναι ανεκτικό σε αυτό το αντιγόνο καθ 'όλη τη διάρκεια της μετέπειτα ζωής του. Τώρα το νεογέννητο έχει μόνο «δικό του» ή «ξένο» που έχει έρθει από έξω, το οποίο αναγνωρίζεται από μεσεγχυματικά κύτταρα, στην επιφάνεια των οποίων υπάρχουν αντίστοιχοι υποδοχείς «σημαία» - αντικαθοριστικοί παράγοντες. Σύμφωνα με τον F. Burnet, ένα μεσεγχυματικό κύτταρο που έχει λάβει διέγερση αντιγόνου δημιουργεί έναν πληθυσμό θυγατρικών κυττάρων που παράγουν ειδικά (αντιστοιχούντα στο αντιγόνο) αντισώματα. Η ειδικότητα των αντισωμάτων εξαρτάται από τον βαθμό αλληλεπίδρασής τους με το αντιγόνο.
Ο σχηματισμός ενός συμπλέγματος αντιγόνου-αντισώματος περιλαμβάνει δυνάμεις έλξης Coulomb και Van Der Waals μεταξύ ιοντικών ομάδων, πολικών και λονδρέζικων δυνάμεων και διατομικών ομοιοπολικών δεσμών.
Είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρούν ως ολόκληρα μόρια. Επομένως, υπάρχει σημαντικός αριθμός μορίων αντισώματος ανά μόριο αντιγόνου. Δημιουργούν στρώμα πάχους έως 30 A o. Το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος μπορεί να διαχωριστεί διατηρώντας τις αρχικές ιδιότητες των μορίων. Η πρώτη φάση της σύνδεσης ενός αντισώματος με ένα αντιγόνο είναι μη ειδική, αόρατη και χαρακτηρίζεται από την απορρόφηση του αντισώματος στην επιφάνεια του αντιγόνου ή του απτενίου. Εμφανίζεται σε θερμοκρασία 37 ο C σε λίγα λεπτά. Η δεύτερη φάση είναι συγκεκριμένη, ορατή και τελειώνει με το φαινόμενο της συγκόλλησης, της καθίζησης ή της λύσης. Αυτή η φάση απαιτεί την παρουσία ηλεκτρολυτών, και σε ορισμένες περιπτώσεις συμπληρώματος.
Παρά την αναστρεψιμότητα της διαδικασίας, ο σχηματισμός συμπλόκου μεταξύ αντιγόνου και αντισώματος παίζει θετικό ρόλο στην προστασία του σώματος, ο οποίος καταλήγει σε οψωνοποίηση, εξουδετέρωση, ακινητοποίηση και επιταχυνόμενη εξάλειψη των αντιγόνων.

Τα αντισώματα ταξινομούνται ανάλογα με τη φύση της επίδρασής τους στο αντιγόνο:

1. πήξη (κατακρημνίσεις, συγκολλητίνες), διευκολύνουν τη φαγοκυττάρωση.
2. λύση (διόρθωση συμπληρώματος: βακτηριόλυση, κυτταρόλυση, αιμόλυση), προκαλούν διάλυση αντιγόνου.
3. εξουδετερώνουν (αντιοξίνες), στερούν το αντιγόνο από την τοξικότητα.

Η αντίδραση αντιγόνου-αντισώματος μπορεί να είναι ωφέλιμη, επιβλαβής ή αδιάφορη για τον οργανισμό. Το θετικό αποτέλεσμα της αντίδρασης είναι ότι εξουδετερώνει δηλητήρια, βακτήρια, διευκολύνει τη φαγοκυττάρωση, καθιζάνει πρωτεΐνες, στερώντας τους την τοξικότητα, λύει τρεπόνεμα, λεπτοσπείρα, ζωικά κύτταρα.
Το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος μπορεί να προκαλέσει πυρετό, διαταραχή κυτταρικής διαπερατότητας, μέθη.Μπορεί να εμφανιστούν αιμόλυση, αναφυλακτικό σοκ, κνίδωση, αλλεργικός πυρετός, βρογχικό άσθμα, αυτοάνοση διαταραχή, απόρριψη μοσχεύματος, αλλεργικές αντιδράσεις.
Το ανοσοποιητικό σύστημα δεν έχει έτοιμες δομές που παράγουν αντισώματα και πραγματοποιούν ανοσολογικές αντιδράσεις.Τα αντισώματα σχηματίζονται κατά την ανοσογένεση.