Aglutinacija je lijepljenje i taloženje mikroba ili drugih stanica pod utjecajem antitijela u prisustvu elektrolita (izotonični rastvor natrijum hlorida). Grupe slijepljenih bakterija (ćelija) nazivaju se aglutinati. Za reakciju aglutinacije potrebne su sljedeće komponente:
1. Antitijela (aglutinini) koja se nalaze u serumu bolesne ili imune životinje.
2. Antigen - suspenzija živih ili ubijenih mikroba, crvenih krvnih zrnaca ili drugih ćelija.
3. Izotonični (0,9%) rastvor natrijum hlorida.
Reakcija aglutinacije za serodijagnostiku koristi se za trbušni tifus i paratifus (Vidalova reakcija), brucelozu (reakcija Wright i Heddleson), tularemiju itd. Antitijelo je pacijentov serum, a antigen je poznati mikrob. Prilikom identifikacije mikroba ili drugih ćelija, njihova suspenzija se koristi kao antigen, a poznati imunološki serum se koristi kao antitijelo. Ova reakcija se široko koristi za dijagnosticiranje crijevnih infekcija, velikog kašlja itd.
Metode stadijuma RA
Približan RA na staklu
Deployed RA
(metoda zapremine)
Reakcija koaglutinacije
Rasklopljeni RA na staklu (seroididentifikacija)
Reakcija aglutinacije na staklu. Dvije kapi specifičnog (adsorbiranog) seruma i kap izotonične otopine natrijum hlorida nanose se na staklo bez masti. Neadsorbirani serumi se prethodno razblažuju u omjeru 1:5 - 1:100. Kapi se moraju nanijeti na staklo tako da postoji razmak između njih. Kultura se temeljno melje na staklu petljom ili pipetom, a zatim se dodaje kapi izotonične otopine natrijum hlorida i jednoj od kapi seruma, miješajući svaku dok se ne formira homogena suspenzija. Kap seruma bez kulture je kontrola seruma.
Pažnja! Ne možete prenijeti kulturu iz seruma u kap izotonične otopine natrijum hlorida, koja služi kao kontrola antigena. Reakcija se odvija na sobnoj temperaturi 1-3 minuta. Ako kontrola seruma ostane prozirna, uočena je ujednačena zamućenost u kontroli antigena, a aglutinatne ljuspice se pojavljuju u kapi gdje se kultura pomiješa sa serumom na pozadini bistre tekućine, rezultat reakcije se smatra pozitivnim.
 |
Diagnostic Physiological
serum + rastvor kulture + kultura
Detaljna reakcija aglutinacije (volumenska metoda). Pripremaju se serijska, najčešće dvostruka, razrjeđenja seruma. Metoda se naziva volumetrijska. Za određivanje titra antitijela u krvnom serumu uzmite 6 epruveta. U prvu epruvetu sipajte 1 ml originalnog seruma u omjeru 1:50 i dodajte 1 ml fiziološkog rastvora u svih 6 epruveta koristeći graduisanu pipetu. Prva epruveta će dati razrjeđenje seruma od 1:100 sa zapreminom od 2 ml. Prebacite 1 ml iz prve epruvete u drugu epruvetu, gde razblaženje postaje 1:200. Zato napravite seriju serijskih razblaženja seruma u prvih 5 epruveta (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Iz pete epruvete sipajte 1 ml u rastvor za dezinfekciju. Dodajte 2 kapi dijagnostikuma u svih 6 epruveta. Šesta epruveta je kontrola kulture, jer sadrži samo fiziološki rastvor i dijagnostikum.
Takva kontrola je neophodna da bi se isključila spontana aglutinacija kulture. Epruvete se protresu i stave u termostat na 37°C na 2 sata, a zatim ostave jedan dan na sobnoj temperaturi, nakon čega se bilježe rezultati reakcije aglutinacije. Prilikom izvođenja reakcije aglutinacije sa serumima djece u prvim mjesecima života, zbog funkcionalne inferiornosti stvaranja antitijela, potrebno je utvrditi niže titre antitijela, što se uzima u obzir pri razrjeđivanju seruma. Početno razrjeđenje seruma je 1:25. U prvoj epruveti dobije se razrjeđenje 1:50, zatim 1:100 itd.
Ako je rezultat reakcije pozitivan, epruvete pokazuju zaglavljene ćelije u obliku zrnaca ili pahuljica na pozadini bistre tečnosti. Aglutinat se postepeno taloži na dno u obliku "kišobrana", a tečnost iznad sedimenta postaje bistra. Kontrola antigena je jednolično zamućena.
Na osnovu prirode sedimenta razlikuje se fino i krupnozrnasta (ljuskasta) aglutinacija. Pri radu sa O-serumom postiže se fino zrnasta aglutinacija. Krupnozrnast - kada pokretni mikrobi stupaju u interakciju sa flagelarnim H-serumima. Javlja se brže od sitnozrnog, a nastali sediment je vrlo labav i lako se lomi.
Intenzitet reakcije se izražava na sljedeći način:
Sve ćelije su se slegle, tečnost u epruveti je potpuno prozirna. Rezultat reakcije je oštro pozitivan;
Manje je taloga, nema potpunog čišćenja tečnosti. Rezultat reakcije je pozitivan;
Taloga je još manje, tečnost je zamućenija. Rezultat reakcije je sumnjiv;
Na dnu epruvete je blagi talog, tečnost je mutna. Upitan rezultat reakcije;
Nema sedimenta, tečnost je jednolično zamućena, kao u kontroli antigena. Rezultat negativne reakcije
Reakcija aglutinacije (od lat. agglutinatio- lijepljenje) - lijepljenje tjelešca (bakterija, crvenih krvnih zrnaca, itd.) antitijelima u prisustvu elektrolita.
Reakcija aglutinacije manifestira se u obliku pahuljica ili sedimenta koji se sastoji od tjelešca (na primjer, bakterija) "zalijepljenih zajedno" antitijelima (slika 7.37). Reakcija aglutinacije se koristi za: određivanje patogena izolovanog od pacijenta; određivanje antitijela u krvnom serumu pacijenta; određivanje krvnih grupa.
Rice. 7.37 a, b. Reakcija aglutinacije saIgM-antitijela (a) iIgG-antitela (b)
1. Određivanje patogena izolovanog od pacijenta Približna reakcija aglutinacije na staklu (slika 7.38). Kapljici aglutinirajućeg seruma (razrjeđenje 1:20) dodaje se suspenzija bakterija izoliranih od pacijenta. Formira se flokulantni talog.
Rice. 7.38.
Ekstenzivna reakcija aglutinacije sa patogenom izolovanim od pacijenta (slika 7.39). Razrijeđenjima aglutinirajućeg seruma dodaje se suspenzija bakterija izoliranih od pacijenta.
Rice. 52
2. Određivanje antitijela u krvnom serumu pacijenta
Detaljna reakcija aglutinacije sa pacijentovim krvnim serumom (slika 7.39). Dijagnostikum se dodaje razblaženjima pacijentovog seruma.
- Aglutinacija sa O-diagnosticumom (bakterije ubijene toplotom, zadržavajući O-antigen) se javlja u obliku sitnozrnate aglutinacije.
- Aglutinacija sa H-diagnosticumom (bakterije ubijene formaldehidom, zadržavajući flagelarni H-antigen) je velika i odvija se brže.
3. Reakcija aglutinacije za određivanje krvnih grupa Reakcija aglutinacije za određivanje krvnih grupa koristi se za uspostavljanje ABO sistema (tabela b) pomoću aglutinacije eritrocita sa antitijelima imunog seruma protiv antigena krvne grupe A (I), B (III). Kontrola je: serum koji ne sadrži antitela, tj. serum AB (IV) krvna grupa; antigeni sadržani u crvenim krvnim zrncima grupa A (II), B (III). Negativna kontrola ne sadrži antigene, odnosno koriste se eritrociti grupe O (I).
Tabela 7.6. Određivanje ABO krvnih grupa
| Rezultati reakcije |
Grupa |
|
|
pripadanje |
||
|
istraživao |
||
|
crvenih krvnih zrnaca sa |
serum (plazma) |
|
|
standard |
sa standardom |
|
|
serumi | ||
Aglutinacija je ljepljenje bakterija kao rezultat interakcije specifičnih AT s njima. Za izvođenje RA potrebne su tri komponente: 1) AG (aglutinogen); 2) AT (aglutinin); 3) rastvor elektrolita (izotonični rastvor natrijum hlorida). U reakciji aglutinacije učestvuju samo korpuskularni antigeni (bakterije, crvena krvna zrnca, čestice lateksa napunjene antigenom).
Reakcija aglutinacije na staklu. Kap dijagnostičkog seruma se pipetom nanosi na staklo bez masti (razrjeđenje seruma 1:10 - 1:20). Bakteriološkom petljom sa površine kosog agara uzima se čista kultura ispitivanog mikroorganizma, prenosi se u kap seruma i miješa. Rezultat reakcije se uzima u obzir golim okom nakon 3-5 minuta. Ako je reakcija pozitivna, u kapi seruma primjećuje se pojava pahuljica (velikih ili malih), koje su jasno vidljive na tamnoj pozadini kada se stakalca protrese. U slučaju negativne reakcije, tečnost ostaje jednolično zamućena.
Reakcija aglutinacije u epruvetama. U red epruveta dodaje se 1 ml fiziološke otopine. U prvu epruvetu dodaje se jednaka zapremina krvnog seruma koji se ispituje. Pripremaju se serijska dvostruka razrjeđenja seruma (titracija seruma), nakon čega se u svaku epruvetu dodaju 2 kapi suspenzije inaktiviranih bakterija (diagnosticum). Epruvete se stavljaju u termostat na 37 °C na 2 sata. Reakcija teče formiranjem malih pahuljica, nevidljivih golim okom, pa se rezultati bilježe pod blagim povećanjem u posebnom uređaju - aglutinoskopu. Intenzitet aglutinacije se uzima u obzir po sistemu “četiri plus”: potpuna aglutinacija - 4+, parcijalna aglutinacija - 3+ ili 2+, sumnjiv rezultat - +. Posljednje razrjeđenje u kojem je uočena aglutinacija 2+ uzima se kao titar antitijela u test serumu.
Reakcija aglutinacije u epruvetama (opsežna reakcija aglutinacije) provodi se kako bi se odredio titar antitijela na uzročnike tifusa i paratifusa (Vidalova reakcija), bruceloze (Wrightova reakcija) i tifusa (Weiglova reakcija).
Aglutinacija (od lat. agglutinatio - lijepljenje) je sljepljivanje (povezivanje) korpuskularnih čestica koje nose antigen (cijelih stanica, čestica lateksa i sl.) s molekulima specifičnih antitijela u prisustvu elektrolita, što završava stvaranjem ljuskica ili sedimenta. (aglutinirati) vidljivo golim okom. Priroda sedimenta ovisi o prirodi antigena: flagelirane bakterije proizvode grubi flokulentni sediment, bičate i nekapsularne bakterije proizvode sitnozrnati sediment, a kapsularne bakterije proizvode žilavi sediment. Pravi se razlika između direktne aglutinacije, u kojoj vlastiti antigeni bakterijske ili bilo koje druge ćelije, kao što su eritrociti, direktno učestvuju u interakciji sa specifičnim antitijelima; i indirektne, ili pasivne, u kojima bakterijske ćelije ili eritrociti, ili čestice lateksa nisu nosioci svojih, već stranih antigena (ili antitijela) sorbiranih na njima da bi se identificirala antitijela (ili antigeni) specifična za njih. Reakcija aglutinacije uglavnom uključuje antitijela koja pripadaju IgG i IgM klasama. Javlja se u dvije faze: prvo se javlja specifična interakcija između aktivnog centra antitijela i determinante antigena; ova faza može nastati u odsustvu elektrolita i nije praćena vidljivim promjenama u reakcionom sistemu. Za drugu fazu - formiranje aglutinata - neophodno je prisustvo elektrolita, koji smanjuju električni naboj kompleksa antigen + antitijelo i ubrzavaju proces njihovog lijepljenja. Ova faza se završava formiranjem aglutinata.
Reakcije aglutinacije se izvode ili na staklenim ili glatkim kartonskim pločama, ili u sterilnim epruvetama za aglutinaciju. Reakcije aglutinacije (direktne i pasivne) na staklu se obično koriste kao ubrzana metoda za otkrivanje specifičnih antitijela u pacijentovom serumu (na primjer, kod bruceloze) ili za serološku identifikaciju patogena. U potonjem slučaju obično se koriste dobro pročišćeni (adsorbirani) dijagnostički serumi koji sadrže samo monoreceptorska antitijela ili njihov skup na različite antigene. Nesumnjiva prednost reakcije aglutinacije na staklu je jednostavnost njene implementacije i činjenica da traje nekoliko minuta ili čak sekundi, jer se obje komponente koriste u koncentriranom obliku. Međutim, ima samo kvalitativnu vrijednost i manje je osjetljiv od epruvete. Ekstenzivna reakcija aglutinacije u epruvetama daje preciznije rezultate, jer vam omogućava da odredite kvantitativni sadržaj antitijela u serumu (ustanovite njegov titar) i, ako je potrebno, registrujete činjenicu povećanja titra antitijela, što ima dijagnostičku vrijednost. . Za uspostavljanje reakcije dodaje se serum razrijeđen na određeni način s 0,85% otopinom NaCl i jednaku zapreminu (obično 0,5 ml) suspenzije standardnog dijagnostikuma (ili test kulture) koja sadrži 1 milijardu bakterija u 1 ml. aglutinacijske cijevi. Rezultati reakcije aglutinacije se prvo bilježe nakon 2 sata inkubacije epruveta na 37 °C i konačno nakon 20-24 sata prema dva kriterija: prisutnosti i veličini precipitata i stepenu transparentnosti tečnosti supernatanta. Ocjenjivanje se vrši po sistemu četiri ukrštanja. Reakcija je nužno praćena kontrolom seruma i antigena. U slučajevima kada se radi serološke identifikacije patogena detaljna reakcija aglutinacije u epruveti, ona ima dijagnostičku vrijednost ako se reakcija ocijeni pozitivnom kada se dijagnostički serum razrijedi najmanje do polovine svog titra.
Mora se uzeti u obzir da se pri miješanju otopina homolognih antigena i antitijela ne uočavaju uvijek vidljive manifestacije reakcije aglutinacije. Talog se formira samo pri određenim optimalnim omjerima obje komponente reakcije. Izvan ovih granica, uz značajan višak antigena ili antitijela, reakcija se ne opaža. Ovaj fenomen se naziva "prozonski fenomen". Uočava se i u reakciji aglutinacije i u reakciji precipitacije. Pojava prozone u imunološkim reakcijama objašnjava se činjenicom da su antigeni uključeni u njih, u pravilu, polideterminantni, a molekuli IgG antitijela imaju dva aktivna centra. U slučaju viška antitijela, površina svake čestice antigena je prekrivena molekulima antitijela tako da više nema slobodnih determinantnih grupa, tako da drugi, nevezani aktivni centar antitijela ne može stupiti u interakciju s drugom česticom antigena i vezati ih jedno za drugo. Stvaranje vidljivog aglutinata ili precipitata je takođe potisnuto kada postoji višak antigena, kada ne ostane niti jedan slobodni aktivni centar antitijela, pa se kompleksi antigen + antitijelo + antigen više ne mogu povećati.
Opcije za ubrzane reakcije aglutinacije. Reakcija pasivne hemaglutinacije i njene varijante
Klasična reakcija aglutinacije uključuje upotrebu korpuskularnih antigena. Međutim, mogu biti uključeni i rastvorljivi antigeni. Da bi to bilo moguće, takvi antigeni se adsorbuju na imunološki inertne čestice. Kao nosač se mogu koristiti čestice lateksa ili bentonita, ali se trenutno najčešće koriste životinjski ili ljudski eritrociti koji poboljšavaju njihova adsorbirajuća svojstva tretiranjem otopinama tanina, formalina ili benzidina. Crvena krvna zrnca koja su adsorbirala antigen na sebe nazivaju se senzibiliziranima ovim antigenom, a imunološka reakcija u kojoj sudjeluju naziva se reakcija indirektne ili pasivne hemaglutinacije (IRHA, ili RPHA), budući da crvena krvna zrnca u njoj sudjeluju pasivno.
RPGA se postavlja u posebne polistirenske ploče sa rupama koje imaju poluloptasto dno. Kada se koristi za serološku dijagnostiku, u ovim jažicama u fiziološkoj otopini se pripremaju dvostruka razrjeđenja test seruma, a zatim mu se kao dijagnostički agens dodaje suspenzija senzibiliziranih eritrocita. Rezultati se bilježe nakon 2 sata inkubacije na 37 °C korištenjem četverostrukog sistema. Uz pozitivnu reakciju, aglutinirana crvena krvna zrnca talože se na dno rupe i ravnomjerno je prekrivaju u obliku obrnutog kišobrana. Ako je reakcija negativna, crvena krvna zrnca se također talože, tečnost postaje bistra, a sediment izgleda kao mali "disk" u središtu bunara. Titar seruma u RPHA se smatra njegovim posljednjim razrjeđenjem, koje i dalje daje izraženu hemaglutinaciju bez značajnih znakova prisustva “diska”.
RPGA se može koristiti i kao ubrzana metoda bakteriološke dijagnostike za otkrivanje direktno u ispitivanom materijalu nepoznatih bakterija, virusa, toksina, na primjer, patogena kuge, stafilokoknih enterotoksina, itd. Sa ovom verzijom RPGA, eritrociti koji su se adsorbirali poznati su po svojoj specifičnosti se koriste kao poznata komponenta reakcije antitijela - antitijela eritrocit diagnosticum. Ako testni materijal sadrži dovoljnu količinu poznatog antigena, RPGA će biti pozitivan.
Opcije za upotrebu RPHA su: reakcija neutralizacije antigena (RNAg), reakcija neutralizacije antitela (RNAb), reakcija inhibicije pasivne hemaglutinacije (PHA). Za ove reakcije koristi se dijagnostika eritrocita antigena i antitijela. Dvije jednosmjerne reakcije koje se međusobno kontroliraju mogu se koristiti istovremeno, na primjer, RPHA sa dijagnostikumom antigena i RNAg sa dijagnostikumom eritrocita antitijela.
Reakcija neutralizacije antitijela (RNAb) sastoji se od miješanja suspenzije koja sadrži željeni antigen sa specifičnim imunološkim serumom koji sadrži poznata antitijela u odgovarajućim količinama i inkubacije na 37 °C dva sata. Nakon toga se dodaje antigenski eritrocitni dijagnostikum. Smjesa se promućka i ostavi na sobnoj temperaturi. Rezultati se uzimaju u obzir nakon 3-4 sata i konačno nakon 18-24 sata.Ako testni materijal sadrži antigen, on će vezati antitijela (neutralizirati ih), te stoga neće doći do hemaglutinacije.
Reakcija neutralizacije antigena (RNAg) se izvodi po istom principu. Samo u ovom slučaju se u ispitivanom materijalu otkrivaju antitijela. Specifični antigen koji se dodaje takvom test materijalu će se vezati za antitijela koja se u njemu nalaze, odnosno doći će do neutralizacije antigena antitijelima, te stoga neće doći do hemaglutinacije prilikom dodavanja eritrocitnog dijagnostikuma antitijela.
Reakcija koaglutinacije. To je jedna od opcija za pasivnu, odnosno ubrzanu reakciju aglutinacije na staklu posredovanu ćelijama koje nose antitijela. Ova reakcija se zasniva na jedinstvenom svojstvu Staphylococcus aureus, koji sadrži protein A u svom ćelijskom zidu, da se veže za Fc fragmente IgG i IgM. U tom slučaju, aktivni centri antitijela ostaju slobodni i mogu stupiti u interakciju sa specifičnim determinantama antigena. Kap 2% suspenzije stafilokoka, senzibilizirane odgovarajućim antitijelima, nanosi se na stakalce i dodaje se kap suspenzije bakterije koja se proučava. Ako se antigen poklapa sa antitijelima, jasna aglutinacija stafilokoka napunjenih antitijelima se javlja unutar 30-60 s.
Reakcija lateks aglutinacije (LAR). Nosilac antitela u ovom dijagnostičkom sistemu su male standardne čestice lateksa. Reakcija se izvodi mikrometodom u jamicama na staklu. Glavni uslov za uspješno postavljanje PAH-a je striktno pridržavanje kvantitativnih odnosa komponenti sistema: 10 μl preparata od lateksa senzibiliziranog antitijelima dodaje se na 50 μl test materijala. Specifičnost PAH-a se kontroliše korišćenjem tri kontrolna testa sadržana u komercijalnim sistemima za testiranje: poznata pozitivna reakcija, poznata negativna reakcija i kontrola kvaliteta suspenzija lateksa korišćenjem lateksa koji nije osetljiv na PAH (koji ne sadrži antitela) sa test materijalom. U našoj zemlji se kao nosioci specifičnih antitela koriste polistirenski monodisperzni lateksi različitih prečnika čestica (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). LAG se koristi za brzo otkrivanje mikroorganizama ili njihovih antigena u ispitivanom materijalu.
Imunomagnetna detekcija antigena. Jedna od opcija za ubrzanu reakciju aglutinacije na staklu povezana je sa upotrebom supermagnetnih polimernih čestica obloženih specifičnim antitijelima. Jedna takva čestica veže do 107-108 mikrobnih ćelija, zbog čega osjetljivost ove metode dostiže 5 CFU/ml. Imunomagnetna detekcija mikroorganizama može se koristiti u kombinaciji sa CPR.
Reakcija agregatne hemaglutinacije (AHA). Omogućava vam da brzo otkrijete u krvi pacijenata i antigene koji slobodno cirkuliraju (antigenemija) i antigene povezane s antitijelima - cirkulirajući imuni kompleksi (CIC). Za RAHA se koriste crvena krvna zrnca senzibilizirana odgovarajućim antitijelima. Dodavanje krvnog seruma pacijenta, koji sadrži antigene, senzibiliziranim eritrocitima na kojima su fiksirana antitijela dovodi do sljepljivanja (aglutinacije) eritrocita i imunoloških kompleksa.
Antiglobulin Coombs test (R. Coombs reakcija). Puna (divalentna) antitijela se određuju pomoću direktne i pasivne reakcije aglutinacije. Nepotpuna (monovalentna, blokirajuća) antitijela se ovim metodama ne otkrivaju, jer, kada se spoje s antigenom, blokiraju ga, ali ne mogu uzrokovati agregaciju antigena u velike konglomerate. Nepotpuna (blokirajuća) antitijela su ona u kojima funkcionira samo jedan aktivni centar; drugi aktivni centar ne radi iz nepoznatog razloga. Za otkrivanje nepotpunih antitijela koristi se posebna Coombsova reakcija (slika 72). Reakcija uključuje: pacijentov serum, u kojem su određena nepotpuna antitijela, korpuskularni antigen-dijagnostikum, antiglobulinski serum koji sadrži antitijela na humani globulin. Reakcija se odvija u dvije faze:
Interakcija antigena s nekompletnim antitijelima. Nema vidljivih manifestacija. Prva faza se završava ispiranjem antigena iz preostalog seruma pacijenta.
Interakcija antiglobulinskog seruma dobivenog kao rezultat imunizacije životinje ljudskim globulinom s nepotpunim antitijelima adsorbiranim na antigen. Zbog činjenice da su antiglobulinska antitijela dvovalentna, vežu dva monovalentna antitijela odvojenih kompleksa antigen + nekompletno antitijelo, što dovodi do njihovog lijepljenja i pojave vidljivog precipitata.
Sadržaj teme "Imunomodulatori. Imunodijagnostika zaraznih bolesti.":Detaljna reakcija aglutinacije (RA). Za određivanje AT u krvnom serumu pacijenta, a ekstenzivna reakcija aglutinacije (RA). Da bi se to postiglo, nizu razrjeđenja krvnog seruma dodaje se dijagnostikum - suspenzija ubijenih mikroorganizama ili čestica sa sorbiranim Ag. Maksimalno davanje razblaženja aglutinacija Ag se naziva titar seruma.
Vrste reakcija aglutinacije (RA) za otkrivanje AT - test kapi krvi na tularemiju (sa dijagnostikom nanesenom na kap krvi i pojavom vidljivih bjelkastih aglutinata) i Huddlesonov test za brucelozu (sa dijagnostikumom obojenim gencijan violetom nanesenim na kap krvi serum).
Približna reakcija aglutinacije (RA)
Za identifikaciju izolovanih mikroorganizama, približni RA se stavlja na staklena stakalca. Da bi se to postiglo, kultura patogena se dodaje kapi standardnog dijagnostičkog antiseruma (razrijeđenog 1:10, 1:20). Ako je rezultat pozitivan, izvodi se detaljna reakcija uz povećanje razrjeđenja antiseruma.
Reakcija smatra se pozitivnim ako se primijeti aglutinacija u razrjeđenjima koja su blizu titra dijagnostičkog seruma.
OAS. Somatski O-Ags stabilni su na toplinu i mogu izdržati ključanje 2 sata.U interakciji sa AT formiraju sitnozrnate agregate.
N-Ag. N-Ag (flagelati) termolabilni su i brzo se razgrađuju na 100 °C, kao i pod uticajem etanola. U reakcijama s H-antiserumom, nakon 2 sata inkubacije, formiraju se labave velike pahuljice (nastale od bakterija koje se lijepe sa flagelama).
Vi-Ar tifusna bakterija je relativno toplotno stabilna (podnosi temperaturu od 60-62 °C 2 sata); Kada se inkubira sa Vi antiserumom, formira se sitnozrnasti aglutinat.
Direktne reakcije hemaglutinacije
Najjednostavniji od ovih reakcije - aglutinacija crvena krvna zrnca, ili hemaglutinacija, koja se koristi za određivanje krvnih grupa u ABO sistemu. Za utvrđivanje aglutinacija(ili nedostatak istih) koristite standardne antiserume sa anti-A i anti-B aglutininima. Reakcija se naziva direktna, jer su Ags koji se proučavaju prirodne komponente crvenih krvnih zrnaca.
Zajedničko sa direktna hemaglutinacija virusna hemaglutinacija ima mehanizme. Mnogi virusi su sposobni spontano aglutinirati eritrocite ptica i sisara; njihov dodatak suspenziji eritrocita uzrokuje stvaranje agregata iz njih.
Reakcija aglutinacije
Aglutinacija (lat. agglutinatio– lijepljenje) – lijepljenje (povezivanje) korpuskularnih čestica koje nose antigen (cijele ćelije, čestice lateksa i sl.) sa molekulima specifičnih antitijela u prisustvu elektrolita, koje završava stvaranjem ljuskica ili sedimenta (aglutinata) vidljivih za golim okom. Priroda sedimenta ovisi o prirodi antigena: flagelirane bakterije proizvode grubi flokulantni sediment, ne-flagelarne i nekapsularne bakterije proizvode sitnozrnati sediment, a kapsularne bakterije proizvode žilavi sediment. Pravi se razlika između direktne aglutinacije, u kojoj vlastiti antigeni bakterijske ili bilo koje druge ćelije, kao što su eritrociti, direktno učestvuju u interakciji sa specifičnim antitijelima; i indirektne, ili pasivne, u kojima bakterijske ćelije ili eritrociti, ili čestice lateksa nisu nosioci svojih, već stranih antigena (ili antitijela) sorbiranih na njima da bi se identificirala antitijela (ili antigeni) specifična za njih. Reakcija aglutinacije uglavnom uključuje antitijela koja pripadaju IgG i IgM klasama. Javlja se u dvije faze: prvo se javlja specifična interakcija između aktivnog centra antitijela i determinante antigena; ova faza može nastati u odsustvu elektrolita i nije praćena vidljivim promjenama u reakcionom sistemu. Za drugu fazu - formiranje aglutinata - neophodno je prisustvo elektrolita, koji smanjuju električni naboj kompleksa antigen + antitijelo i ubrzavaju proces njihovog lijepljenja. Ova faza se završava formiranjem aglutinata.
Reakcije aglutinacije se izvode ili na staklenim ili glatkim kartonskim pločama, ili u sterilnim epruvetama za aglutinaciju. Reakcije aglutinacije (direktne i pasivne) na staklu se obično koriste kao ubrzana metoda za otkrivanje specifičnih antitijela u pacijentovom serumu (na primjer, kod bruceloze) ili za serološku identifikaciju patogena. U potonjem slučaju obično se koriste dobro pročišćeni (adsorbirani) dijagnostički serumi koji sadrže samo monoreceptorska antitijela ili njihov skup na različite antigene. Nesumnjiva prednost reakcije aglutinacije na staklu je jednostavnost njene implementacije i činjenica da traje nekoliko minuta ili čak sekundi, jer se obje komponente koriste u koncentriranom obliku. Međutim, ima samo kvalitativnu vrijednost i manje je osjetljiv od epruvete. Ekstenzivna reakcija aglutinacije u epruvetama daje preciznije rezultate, jer vam omogućava da odredite kvantitativni sadržaj antitijela u serumu (ustanovite njegov titar) i, ako je potrebno, registrujete činjenicu povećanja titra antitijela, što ima dijagnostičku vrijednost. . Da biste postavili reakciju, dodajte serum razrijeđen na određeni način sa 0,85% otopinom NaCl i jednaku zapreminu (obično 0,5 ml) suspenzije standardnog dijagnostikuma (ili test kulture), koja sadrži 1 milijardu bakterija u 1 ml, u aglutinaciju cijevi. Rezultati reakcije aglutinacije prvo se bilježe nakon 2 sata inkubacije epruveta na temperaturi od 37 °C i konačno nakon 20-24 sata prema dva kriterija: prisutnosti i veličini precipitata i stepenu prozirnosti epruvete. supernatantna tečnost. Ocjenjivanje se vrši po sistemu četiri ukrštanja. Reakcija je nužno praćena kontrolom seruma i antigena. U slučajevima kada se radi serološke identifikacije patogena detaljna reakcija aglutinacije u epruveti, ona ima dijagnostičku vrijednost ako se reakcija ocijeni pozitivnom kada se dijagnostički serum razrijedi najmanje do polovine svog titra.
Mora se uzeti u obzir da se pri miješanju otopina homolognih antigena i antitijela ne uočavaju uvijek vidljive manifestacije reakcije aglutinacije. Talog se formira samo pri određenim optimalnim omjerima obje komponente reakcije. Izvan ovih granica, uz značajan višak antigena ili antitijela, reakcija se ne opaža. Ovaj fenomen se naziva "prozonski fenomen". Uočava se i u reakciji aglutinacije i u reakciji precipitacije. Pojava prozone u imunološkim reakcijama objašnjava se činjenicom da su antigeni uključeni u njih, u pravilu, polideterminantni, a molekuli IgG antitijela imaju dva aktivna centra. U slučaju viška antitijela, površina svake čestice antigena je prekrivena molekulima antitijela tako da više nema slobodnih determinantnih grupa, tako da drugi, nevezani aktivni centar antitijela ne može stupiti u interakciju s drugom česticom antigena i vezati ih jedno za drugo. Stvaranje vidljivog aglutinata ili precipitata je takođe potisnuto kada postoji višak antigena, kada ne ostane niti jedan slobodni aktivni centar antitijela, pa se kompleksi antigen + antitijelo + antigen više ne mogu povećati.