Uvod.
Karcinogeneza je višestepeni proces akumulacije mutacija i drugih genetskih promjena koje dovode do poremećaja ključnih ćelijskih funkcija, kao što su regulacija proliferacije i diferencijacije, prirodna stanična smrt (apoptoza), morfogenetske reakcije ćelije, a vjerovatno i do neefikasno funkcionisanje specifičnih i nespecifičnih faktora antitumorskog imuniteta. Samo kombinacija takvih promjena, stečenih, u pravilu, kao rezultat prilično duge evolucije neoplastičnih klonova, tijekom koje dolazi do selekcije stanica s potrebnim karakteristikama, može osigurati razvoj maligne neoplazme. Vjerovatnoća da će se u jednoj ćeliji dogoditi nekoliko genetskih promjena naglo se povećava kada se poremete sistemi koji kontroliraju integritet genoma. Stoga su mutacije koje dovode do genetske nestabilnosti također sastavni stupanj progresije tumora. Štaviše, neke urođene anomalije genetskih kontrolnih sistema su faktor koji predodređuje neizbežnu pojavu neoplazme: one toliko povećavaju verovatnoću pojave raznih onkogenih mutacija u svakoj ćeliji tela da pojedinac, pre ili kasnije, u nekom od ćelije proliferirajućeg klona, pod pritiskom selekcije, nužno će akumulirati potrebnu kombinaciju promjena i nastaje tumor.
Značajan napredak u razumijevanju mehanizama kancerogeneze povezan je s otkrićem prvo onkogena i protonkogena, a zatim - tumor supresori I mutatorski geni. Onkogeni su stanični ili virusni (uneseni virusom u ćeliju) geni, čija ekspresija može dovesti do razvoja tumora. Protoonkogeni su normalni ćelijski geni, čije poboljšanje ili modifikacija funkcije ih pretvara u onkogene. Supresori tumora (antionkogeni, recesivni tumorski geni) su stanični geni, čija inaktivacija naglo povećava vjerojatnost tumora, a obnavljanje funkcije, naprotiv, može potisnuti rast tumorskih stanica. Treba napomenuti da su takozvani “mutatorski” geni klasifikovani kao tumor supresori, tj. geni čija disfunkcija na ovaj ili onaj način povećava stopu pojave mutacija i/ili drugih genetskih promjena možda neće utjecati na rast neoplastičnih stanica. Međutim, njihova inaktivacija toliko povećava vjerovatnoću raznih onkogenih mutacija da je formiranje tumora samo pitanje vremena.
Pripadnost onkogenima ili tumor supresorima određuje se prema nekoliko kriterijuma: a) prirodna priroda promena u strukturi i/ili ekspresiji datog gena u ćelijama određenih ili različitih neoplazmi; b) pojava u mladoj ili mladoj dobi određenih oblika tumora kod osoba sa naslijeđenim germinalnim (tj. koje se javljaju u zametnoj ćeliji) mutacijama datog gena; c) naglo povećanje incidencije tumora kod transgenih životinja, bilo da eksprimiraju aktivirani oblik datog gena - u slučaju onkogena, ili nose inaktivirajuće mutacije ("nokaute") datog gena - u slučaju supresora tumora ; d) sposobnost izazivanja morfološke transformacije i/ili neograničenog rasta (onkogeni) u ćelijama kultivisanim in vitro, ili supresija ćelijskog rasta i/ili jačina znakova transformacije (tumorski supresori).
Posljednje dvije decenije obilježene su brzim otkrivanjem sve više novih onkogena i tumorskih supresora. Do danas je poznato oko stotinu potencijalnih onkogena (ćelijskih i virusnih) i oko dvadesetak tumorskih supresora. Opisani su genetski događaji koji dovode do aktivacije protoonkogena ili inaktivacije tumorskih supresora. Otkriveno je da je mehanizam djelovanja virusnih onkogena povezan s aktivacijom ćelijskih protoonkogena (retrovirusa) ili inaktivacijom tumorskih supresora ( DNK virusi) . Utvrđene su promjene onkogena i tumor supresora, karakteristične za određene oblike humanih tumora, uključujući i visoko specifične anomalije koje se koriste za dijagnostiku (tablice 1, 2).
Tabela 1.
Neke promjene u protoonkogenima karakteristične za ljudske tumore
| Protoonkogen | Funkcija proteina | Promjene | neoplazme* |
| ERBB1 (EGF-R) | receptor tirozin kinaze | amplifikacija i prekomjerna ekspresija gena | glioblastomi i drugi neurogeni tumori |
| ERBB2 (HER2) | receptor tirozin kinaze | karcinom dojke | |
| PDGF-Rb | receptor tirozin kinaze | hromozomske translokacije koje formiraju himerne gene TEL/PDGF-Rb, CVE6/PDGF-Rb, koji kodiraju trajno aktivirane receptore | hronična mijelomonocitna leukemija, akutna mijeloblastna leukemija |
| SRC | nereceptorska tirozin kinaza | mutacije kodona 531 koje ukidaju negativnu regulaciju aktivnosti kinaze | dio tumora debelog crijeva u kasnim fazama |
| K-RAS, N-RAS, H-RAS | sudjeluje u prijenosu mitogenih signala i regulaciji morfogenetskih reakcija | mutacije kodona 12,13,61 koje uzrokuju formiranje trajno aktiviranog GTP-vezanog oblika Ras | 60-80% slučajeva raka pankreasa; 25-30% raznih solidnih tumora i leukemija |
| PRAD1/ciklinD1 | reguliše ćelijski ciklus | amplifikacija i/ili prekomjerna ekspresija gena | karcinom dojke i pljuvačne žlezde |
| C-MYC | transkripcijski faktor, reguliše ćelijski ciklus i aktivnost telomeraze | a) hromozomske translokacije koje pokreću gen pod kontrolom regulatornih elemenata imunoglobulinskih gena; b) amplifikacija i/ili prekomjerna ekspresija gena; mutacije za stabilizaciju proteina |
a) Burkittov limfom b) mnogi oblici neoplazmi |
| CTNNB1 (beta-katenin) | a) faktor transkripcije koji reguliše c-MYC i ciklin D1; b) vezivanjem za kadherin učestvuje u formiranju adhezivnih kontakata |
mutacije koje povećavaju količinu beta-katenina koji nije povezan s E-kadherinom, koji funkcionira kao transkripcijski faktor | nasljedna adenomatozna polipoza debelog crijeva; |
| BCL2 | potiskuje apoptozu regulacijom permeabilnosti mitohondrijalnih i nuklearnih membrana | hromozomske translokacije koje pokreću gen pod kontrolom regulatornih elemenata imunoglobulinskih gena | folikularni limfom |
| ABL | reguliše ćelijski ciklus i apoptozu | hromozomske translokacije koje dovode do stvaranja himernih BCR/ABL gena, čiji proizvodi stimuliraju proliferaciju stanica i potiskuju apoptozu | sve kronične mijeloične leukemije, neke akutne limfoblastne leukemije |
| MDM2 | inaktivira p53 i pRb | amplifikacija i/ili prekomjerna ekspresija gena | neki osteosarkomi i sarkomi mekog tkiva |
* Kurziv označava nasljedne oblike bolesti koje nastaju zbog mutacija u zametnim stanicama. U drugim slučajevima, mutacije se javljaju u somatskim ćelijama koje formiraju tumore
Tabela 2.
Oblici humanih tumora koji nastaju inaktivacijom određenih tumorskih supresora i mutatorskih gena
| Gene | Funkcija proteina | neoplazme* |
| p53 | transkripcijski faktor; reguliše ćelijski ciklus i apoptozu, kontroliše integritet genoma | Li-Fraumeni sindrom i većina oblika sporadičnih tumora |
| INK4a-ARF | inhibicija Cdk4**, aktivacija p53** | nasledni melanomi I |
| Rb | kontroliše ulazak u S fazu regulacijom aktivnosti transkripcionog faktora E2F | naslednaretinoblastom |
| TbR-II | tip 2 receptor za citokin TGF-b | nasledna i sporadični karcinomi debelog crijeva |
| SMAD2, SMAD 3 | prenose signal od aktiviranih TGF-b receptora do Smad4 | karcinom debelog creva, pluća, pankreasa |
| SMAD4/DPC4 | transkripcijski faktor; posreduje u djelovanju citokina TGF-b, što dovodi do aktivacije Cdk inhibitora - p21WAF1, p27KIP1, p15INK4b | juvenilna hamartomatozna polipoza želuca i crijeva; različiti oblici sporadičnih tumora |
| E-kadherin | učestvuje u međućelijskim interakcijama; inicira signalizaciju koja aktivira p53, p27KIP1 | nasljedni karcinom želuca i mnogi oblici sporadičnih tumora |
| APC | veže i uništava citoplazmatski beta-katenin, sprečava stvaranje beta-katenin/Tcf transkripcionih kompleksa | nasledna adenomatozna polipoza i sporadični tumori debelog crijeva |
| VHL | potiskuje ekspresiju VEGF gena (faktor rasta vaskularnog endotela) i drugih gena koji se aktiviraju tokom hipoksije | von Hippel-Lindau sindrom (višestruki hemangiomi); bistrocelularni karcinom bubrega |
| WT1 | transkripcijski faktor; vezujući se za p53, modulira ekspresiju gena koji reaguju na p53 | nasljedni nefroblastomi (Wilmsov tumor) |
| PTEN/MMAC1 | fosfataza; stimuliše apoptozu potiskivanjem aktivnosti PI3K-PKB/Akt signalnog puta | Cowdenova bolest (više hamartoma); mnogi sporadični tumori |
| NF1 (neurofibromin) | protein iz GAP porodice; pretvara ras onkogen iz aktivnog u neaktivni oblik | neurofibromatoza tip 1 |
| NF2 (merlin) | učestvuje u interakcijama između membrane i citoskeleta | neurofibromatoza tip 2; sporadični meningiomi, mezoteliomi i drugi tumori |
| BRCA1 | povećava aktivnost p53 i drugih faktora transkripcije vezivanjem za RAD51 uključen je u prepoznavanje i/ili popravak oštećenja DNK | različiti oblici sporadičnih tumora |
| BRCA2 | transkripcijski faktor sa aktivnostima histon acetil transferaze; vezivanje za RAD51 učestvuje u popravci DNK | nasljedni tumori dojke i jajnika; različiti oblici sporadičnih tumora |
| MSH2, MLH1, PMS1, PMS2 | popravak nesparenih dijelova DNK (popravak neusklađenosti) | nepolipozni rak debelog crijeva i jajnika; mnogi sporadični tumori |
*
Kurziv označava nasljedne oblike bolesti koje nastaju zbog mutacija u zametnim stanicama.
**
INK4a/ARF lokus kodira dva proteina: p16 INK4a - inhibitor ciklin zavisnih kinaza Cdk4/6 i p19 ARF (Alternativni okvir čitanja) - proizvod alternativnog okvira za čitanje koji, vezujući p53 i Mdm2, blokira njihovu interakciju i sprečava degradaciju p53. Delecije i mnoge tačkaste mutacije u INK4a/ARF lokusu istovremeno inaktiviraju supresorske aktivnosti oba ova proteina.
Međutim, dugo vremena, znanje o svakom od onkogena ili tumorskih supresora izgledalo je diskretno, uglavnom nepovezano. Tek posljednjih godina počela je da se pojavljuje opća slika koja pokazuje da je velika većina poznatih protoonkogena i tumorskih supresora komponente nekoliko uobičajenih signalnih puteva koji kontroliraju ćelijski ciklus, apoptozu, integritet genoma, morfogenetske reakcije i ćelijska diferencijacija. Očigledno je da promjene u ovim signalnim putevima u konačnici dovode do razvoja malignih tumora. pruža informacije o glavnim ciljevima onkogena i tumorskih supresora.
Antionkogeni (ili tumor supresorski geni) su geni koji kodiraju ključne regulatorne proteine, čiji gubitak dovodi do poremećaja kontrole ćelijske proliferacije. Većina identificiranih antionkogena u normalnim stanicama su regulatori (faktori) procesa transkripcije ćelijskih gena, vjerovatno djelujući na poboljšanje programa ćelijske diferencijacije za razliku od programa proliferacije.
Proteini kodirani grupom gena supresora (p53, KB, C-LR! (p21), p15, p16, itd.) direktno su uključeni u proces ćelijske diobe, kontrolirajući njihov ulazak u jednu ili drugu fazu ćelijskog ciklusa Gubitak Aktivnost takvih gena na kraju izaziva neregulisanu ćelijsku proliferaciju.
Dakle, uz aktivaciju onkogena, poremećaji u funkcionisanju gena supresora tumora odlučujući su za pokretanje tumorogenih procesa, utičući na progresiju ćelijskog ciklusa, regulišući diferencijaciju i programiranu ćelijsku smrt, tj. prirodni proces njihove smrti, takozvana apoptoza. Ako većina izmijenjenih protoonkogena djeluje kao dominantni faktor sa genetske tačke gledišta, tumor supresorski geni obično djeluju recesivno.
Strukturne i funkcionalne promjene kod supresora tumora, kao i kod onkogena, mogu biti rezultat točkastih mutacija u kodirajućim i regulatornim regijama gena, insercija ili delecija koje uzrokuju poremećaje u procesu čitanja proteina, promjene u njihovoj konfiguraciji ili modulaciju ekspresije proteina. (formiranje proizvoda tokom ćelijske sinteze). Gubitak funkcija anti-^kogena u tumorskim ćelijama nastaje kao
obično kao rezultat inaktivacije oba alela. Pretpostavlja se da gubitak jednog alela kao rezultat delecije stvara mogućnost fatalnih recesivnih mutacija u preostalom (Knudsenova teorija). Ali postoje izuzeci od ovog pravila: na primjer, za p53 je pokazano postojanje mutacija s dominantnim svojstvima. Germinalne (naslijeđene) recesivne mutacije jednog od dva antionkogena alela mogu biti osnova nasljedne predispozicije za rak.
Eksperimentalne studije su pokazale da se inaktivacija antionkogena kao rezultat istovremenih poremećaja u odgovarajućim lokusima uparenih hromozoma (mutacije u jednom i brisanja u drugom) može eliminisati uvođenjem alela divljeg tipa (tj. strukturno nepromijenjenog, netaknutog) , što je osnova za naučni razvoj u oblasti genskih _terall_n tumora_.
Osim gubitka funkcije gena kao rezultat mutacije ili delecije, može doći do inaktivacije α-supresorskog gena zbog hipermetilacije sekvence DNK koja kodira gen. Ovo je karakteristična metoda inaktivacije određenih gena koji pripadaju grupi inhibitora kinaze koji regulišu redosled i brzinu faza ćelijskog ciklusa, na primer p/6 i p15.
Trenutno je potraga za genima supresora tumora izuzetno raširena.
Specifične delecije određenih hromozomskih regiona su identifikovane u različitim tipovima tumora. Odnos takvih delecija s razvojem tumora često se naziva „funkcionalni gubitak gena za supresiju tumora“.
Za identifikaciju hromozomskih regiona koji tvrde da su potencijalni antionkogeni, široko se koristi skrining na heterozigotne delecije.Delecija jednog od heterozigotnih alela može se otkriti tokom uporedne analize RSC proizvoda (po!utegave
cNat geasTtp) ili KET.P (gea^psIop Gga^tep! 1en§Y ro1utogPet) normalne i tumorske DNK tokom elektroforetskog odvajanja. Gubitak heterozigotnosti (1oz8 o!" be1er21205Yu - bOH) se smatra gubitkom jednog od dva alela u DNK tumora u poređenju sa DNK normalne somatske ćelije.
Trenutno je poznato nešto više od deset antionkozena. Poremećaji u antionkogenima javljaju se u približno 90% humanih tumora. Za svaki specifični tumor, spektar genetskih promjena je individualne prirode, ali se ipak uočavaju određeni obrasci u kršenju pojedinih gena ili njihovih klastera, što daje razlog da ih se povezuje s razvojem ili prirodom progresije određene patologije. Jedan od preduslova za rast tumora je poremećaj regulacije deobe ćelija. Treba naglasiti da promene u složenom lancu kontrole ćelijskog ciklusa, posredovane učešćem jednog ili drugog tumorskog supresora, mogu nastati u različitim fazama ciklusa i biti povezane sa razvojem različitih histoloških tipova tumora.
Ovo poglavlje razmatra trenutno najpoznatiji tumor supresorski geni, mogući mehanizmi njihovog djelovanja i učešće u proliferativnim procesima.
Gen p53 je jedan od najviše proučavanih predstavnika grupe gena supresora, koji trenutno igraju važnu ulogu u indukciji i progresiji rasta tumora. Multipotentni p53 gen je uključen u brojne važne procese u životu ćelije. Lokaliziran je na kromosomu 17 (17p13) i kodira faktor transkripcije koji osigurava proizvodnju i funkcioniranje proteina koji kontroliraju diobu stanica. U proteinu p53 mogu se razlikovati tri regiona: I-terminalni region koji sadrži domen transkripcione aktivacije, centralni region koji sadrži specifični DNK-vezujući domen i C-terminalni region koji sadrži multifunkcionalni domen [19].
Tokom rasta i diobe normalnih stanica dolazi do stalnog nagomilavanja kršenja primarne strukture DNK kao posljedica prirodne mutageneze ili grešaka u procesu njenog udvostručavanja (replikacije DNK). Poseban sistem za njihovo eliminisanje, uključujući lanac popravnih proteina, radi u određenim fazama ćelijskog ciklusa. Indukcija p53 uzrokuje zaustavljanje ćelijskog ciklusa nakon čega slijedi popravak oštećenja ili prirodna ćelijska smrt, čime se sprječava narušavanje integriteta genoma i sticanje tumorskog fenotipa.
Protein p53 kontroliše ispravnu progresiju ćelijskog ciklusa na brojnim kontrolnim tačkama (slika 3.1). Više je proučavan put koji vodi ka kašnjenju ćelijskog ciklusa u fazi 01, gdje jedna od centralnih uloga pripada IUAP1 (p21) genu. Gen p53 aktivira transkripciju proteina p21, koji je jedan od inhibitora kompleksa ciklinaze kinaze (CKA) - regulatora ćelijskog ciklusa. U ovom slučaju, p53 ne učestvuje samo u regulaciji faze 01, već učestvuje iu regulaciji faze 02 i same mitoze. Kao odgovor na smetnje u procesu duplikacije DNK na kontrolnoj tački ulaska u fazu 02 ili kao odgovor na poremećaje u formiranju mitotičkog vretena na kontrolnoj tački mitoze, dolazi do indukcije p53.
Osim toga, sam p53 regulira popravak i replikaciju DNK direktnim vezanjem za brojne proteine uključene u procese DNK. Tačan put koji povezuje oštećenje DNK i aktivaciju p53 nije poznat. Pretpostavlja se da uključuje proizvode supresorskog gena BKCA1 (Lgeas! kanser azoaaGec! §epe I), kao i ATM proteina (a(ax1a 1e1an§]ec:a5]a &epe), koji „prepoznaje“ oštećenje u DNK i aktivira p53 (slika 3.2).
Druga posljedica aktivacije p53 je prirodna, programirana ćelijska smrt ili aptoza. Gen p53 može uzrokovati apoptozu, povezanu ili nevezanu sa aktivacijom transkripcije ciljnih gena. U prvom slučaju, p53 aktivira transkripciju gena BAX i sličnih gena koji inhibiraju proteine koji imaju anti-apoptotički učinak (na primjer, onkogen BCL-2). Osim toga, p53 aktivira transkripciju gena MBM2, čiji proizvod, vezanjem za protein p53, inhibira njegovu sposobnost da aktivira transkripciju drugih ciljnih gena, čime se osigurava negativna samoregulacija. Pokazalo se da indukcija p53 izaziva zaustavljanje ćelijskog ciklusa na 01 ili apoptozu u zavisnosti od niza faktora, od kojih su najvažniji tip ćelije, koncentracija faktora rasta, nivo ekspresije gena supresora KB, AIR i (ili) faktor transkripcije E2P, ekspresija brojnih virusnih proteina, itd. .
Inaktivacija p53 daje ćelijama veću selektivnu prednost u proliferaciji. Poremećena funkcija p53 kao rezultat točkastih mutacija, delecija, formiranja kompleksa sa drugim ćelijskim regulatorom ili promjena unutarćelijske lokalizacije dovodi do gubitka supresivnih svojstava i stimulira tumorski proces. Prilikom proučavanja tumora različite histogeneze, ustanovljeno je da su u velikom procentu slučajeva oba alela p53 inaktivirana - jedan kao rezultat točkastih mutacija, drugi kao rezultat delecija.
p53 mutacije su najčešći genetski poremećaj zabilježen kod različitih tumora
| VKSA1 |
| ATM |
| r27K!R1 |
| Ts1SH1IN [>-Ss1K4/6 Cyclin E-S |
Genom sadrži gene koji inhibiraju ćelijsku proliferaciju i imaju antionkogeni učinak. Gubitak takvih gena od strane ćelije može dovesti do razvoja raka. Najviše proučavani antionkogeni su p53 i Rb.
Rb gen može biti izgubljen u retinoblastomu (učestalost retinoblastoma je jedan slučaj na 20 hiljada djece). 60% retinoblastoma se razvija sporadično, a 40% se klasifikuje kao nasljedni tumori s autosomno dominantnim tipom nasljeđivanja. Kod nasljednog Rb defekta drugi alel je normalan, pa je razvoj tumora moguć samo uz istovremeno oštećenje drugog (normalnog) Rb gena. Kod spontano nastalog retinoblastoma, gubitak Rb utiče na oba alela odjednom.
P53 supresorski gen je nazvan molekulom 1995. Postoje "divlji" (nepromijenjeni) i mutirani oblici p53 antionkogena. U tumorskim ćelijama mnogih tipova karcinoma, akumulacija jednog od ovih oblika p53 nalazi se u suvišnim količinama, što remeti regulaciju ćelijskog ciklusa i ćelija dobija sposobnost da ubrza proliferaciju.
Regulacija proliferativne aktivnosti stanica korištenjem str 53 nastaje kroz pojačavanje ili slabljenje apoptoze. Aktivacija str 53 na pozadini aktivacije ćelijskih onkogena c-fos I c-myc uzrokuje odumiranje tumorskih stanica, što se opaža kada je tumor izložen kemoterapiji i zračenju. Mutacije str 53 ili njegovu inaktivaciju drugim sredstvima u pozadini pojačanog izražavanja c-fos, c-myc I bcl 2, naprotiv, dovode do povećane proliferacije ćelija i maligne transformacije.
TUMORSKI MARKERI
Tradicionalne morfološke studije, u pravilu, omogućuju precizno dijagnosticiranje diferenciranih tumora i njihovih metastaza. Za slabo diferencirane i nediferencirane maligne tumore koriste se metode istraživanja koje omogućavaju dijagnosticiranje promjena na ultrastrukturnom i molekularno genetskom nivou. U tu svrhu koriste se različite molekularne biološke i morfološke metode (PCR, hibridizacija in situ, blot i citogenetska analiza, imunohistohemijske metode, elektronska mikroskopija), koji omogućavaju identifikaciju biomolekularnih markera tumora.
Tumorski markeri su hromozomska, genska i epigenomska preraspodjela u tumorskim stanicama, koja omogućavaju dijagnosticiranje tumora, određivanje stepena rizika i predviđanje toka i ishoda bolesti. Biomolekularni tumor markeri su uži pojam koji objedinjuje samo markere proteinske prirode.
Među biomolekularnim markerima izdvajaju se markeri diferencijacije ćelija (histo- i citogenetski) i markeri progresije tumora (proliferacija, apoptoza, invazivni rast i metastaze).
Markeri ćelijske diferencijacije. Različiti tipovi ćelija imaju različite skupove antigena diferencijacije ili imunoloških fenotipova. Ekspresija mnogih antigena diferencijacije zavisi od stepena zrelosti (diferencijacije) tumorske ćelije. Dakle, markeri stanične diferencijacije omogućavaju procjenu ne samo histo- i citogeneze tumora, već i razine njegove diferencijacije i funkcionalne aktivnosti tumorskih stanica. Većina poznatih markera diferencijacije pripada strukturnim proteinima (proteini citoskeleta), enzimima, produktima sekrecije (hormoni, imunoglobulini, mucini), antigenima ćelijske površine i komponentama intercelularnog matriksa. Poznati su i proteinski tumorski markeri koje sintetiše samo embrionalno tkivo (α-fetoprotein) i specifični tumorski antigeni (na primjer, antigeni melanoma).
Markeri progresije tumora. Markeri ćelijske proliferacije se široko koriste za dijagnozu, prognozu i liječenje tumora. Postoje mnoge morfološke metode koje omogućavaju identifikaciju ćelija u različitim fazama mitotičkog ciklusa.
◊ Brojanje mitoza pomoću svjetlosne mikroskopije pomoću DNK cito- i histofotometrije, kao i protočne fotometrije - određivanje procenta ćelija u mitotičkoj fazi (mitotički indeks M).
◊ Korišćenje radioaktivne oznake (timidin, bromoksiuridin) - identifikacija ćelija u S, G 2, M fazama.
◊ Nedavno je korišćena imunohistohemijska detekcija antigena mitotičkog ciklusa: Ki-67 (OMIM *176 741, proliferirajući ćelijski antigen MKI67, određen komercijalnim monoklonskim antitelima KIA), PCNA (OMIM *176 740, proliferirajući ćelijski poznati nuklearni antigen PCNA, kao dodatne protein d DNK polimeraze), str 105, CDK-2, cdE. PCNA ima najveći domet, omogućavajući detekciju ćelija u gotovo svim fazama mitotičkog ciklusa. Nasuprot tome, selektin (CD62) označava samo ćelije koje se ne dijele.
◊ Mogućnost apoptoze u tumorskim ćelijama dokazuje ekspresija mnogih markera: CD95, receptori za TNF-α, TGF-β, kaspaze, Apaf-1, proapoptotični članovi porodice bcl 2, citokrom C, str 53. Međutim, o završenoj apoptozi možemo govoriti samo uz karakterističnu fragmentaciju DNK, otkrivenu metodom obilježavanja in situ(TUNEL test) Mjesta prekida DNK, kao i fragmentacija PARP(poli-ADP-riboza polimeraza, poli-ADP-riboza polimeraza) ili detekcija fosfatidilserina na vanjskoj površini ćelijske membrane apoptotičkih tijela (Aneksinski test).
Za nastanak tumora kod ljudi nije dovoljna samo aktivacija onkogena, jer se nekontrolisana dioba stanica sprječava supresorskim geni (Rb, p-53, APC geni), koji osiguravaju da se mitoza stanica zaustavi na kontrolnim tačkama. Na prvoj kontrolnoj tački dolazi do popravke oštećenja DNK jer G1/S kontrolni mehanizam blokira replikaciju DNK. Kada su procesi popravke poremećeni, dolazi do apoptoze. Na drugoj kontrolnoj tački, G2/M kontrolni mehanizam inhibira mitozu dok se replikacija ne završi.
Ovo osigurava stabilnost genoma. U slučaju mutacija, supresorski geni dobijaju recesivnu osobinu na oba alela, aktivnost njihovih proteina naglo opada, ćelija sa genetskim oštećenjem ostvaruje svojstvo nekontrolisane reprodukcije i stvara klon sličnih potomaka. Objašnjenje za formiranje recesivnih supresorskih gena dao je Knudson, koji je predložio hipotezu karcinogeneze poznatu kao teorija „dva pogotka“. Njegova je suština sljedeća: jedan alel recesivnog supresorskog gena naslijeđen je od roditelja („prvi udarac“), a drugi je rezultat mutacije („drugi udarac“). Knudsonovu hipotezu potvrđuju citogenetske ili molekularne studije nekih tumora.
7. Uloga u karcinogenezi gena koji regulišu popravku DNK i apoptozu.
Tokom karcinogeneze, mutacije gena odgovornih za popravku i apoptozu DNK, koje dovode do smanjenja aktivnosti odgovarajućih enzima, doprinose povećanju nestabilnosti genoma tumorske ćelije. Osim toga, uz nekontrolisanu proliferaciju, zbog niske aktivnosti ili nestanka gena,
regulišući apoptozu (bcl-2, bac), dolazi do naglog povećanja broja tumorskih ćelija.
8. Odnos između tumora i tijela. Paraneoplastični sindrom. Mehanizmi antitumorske rezistencije organizma.
Odnos između tumora i tijela je vrlo raznolik i kontradiktoran. S jedne strane, organizam, koji je spoljašnja sredina za tumor, stvara neophodne uslove za njegovo postojanje i rast (obezbeđujući, na primer, njegovo snabdevanje krvlju), as druge strane, sprečava njegov razvoj većim ili manji uspeh.
Razvoj tumora je interaktivan proces (činovi “agresije” tumora se izmjenjuju s reaktivnim “kontramjerama” tijela). Ishod ove borbe predodređen je ogromnim potencijalom za „agresivnost“ tumora, s jedne strane, i ograničenim zaštitnim resursima organizma, s druge strane.
Imunološka zaštita. Ne pretvara se svaki klon tumorskih ćelija u organizmu u maligni tumor. Tijelo ima određena, iako ograničena, sredstva za suprotstavljanje. U prvim fazama djeluje sistem takozvane prirodne nespecifične rezistencije, sposoban da eliminira mali broj (od 1 do 1000) tumorskih stanica. Ovo uključuje prirodne ćelije ubice - velike granularne limfocite, koji čine 1 do 2,5% ukupne populacije perifernih limfocita, i makrofage. Specifični antitumorski imunitet se obično razvija prekasno i nije jako aktivan. Spontani tumori kod životinja i ljudi su slabo antigeni i lako prevladavaju ovu barijeru. Međutim, čini se da u nekim slučajevima može igrati značajnu ulogu.
Paraneoplastični sindrom je manifestacija generaliziranog djelovanja tumora na tijelo. Njegovi oblici su raznoliki - stanje imunosupresije (povećana sklonost zaraznim bolestima), sklonost povećanju zgrušavanja krvi, kardiovaskularno zatajenje, mišićna distrofija, neke rijetke dermatoze, smanjena tolerancija na glukozu, akutna hipoglikemija kod velikih tumora i dr. Jedna od manifestacija paraneoplastičnog sindroma je tzv
kancer kaheksija (opća iscrpljenost organizma), koja se javlja u periodu blizu terminalne faze i često se opaža kod raka želuca, gušterače i jetre
Karakterizira ga gubitak tjelesne težine, uglavnom zbog pojačanog razgradnje proteina skeletnih mišića (djelomično miokarda, kao i iscrpljivanje masnih depoa, praćeno averzijom prema hrani (anoreksija) i promjenama okusa. Jedan od uzroka kaheksije je povećana (ponekad za 20-50 %) potrošnja energije, očigledno zbog hormonske neravnoteže.
Mehanizmi antitumorske rezistencije mogu se uslovno podijeliti prema stadiju i faktoru karcinogeneze u tri glavna generalizirana tipa:
1. Anti-kancerogen, adresiran na fazu interakcije kancerogenog (uzročnog) faktora sa ćelijama, organelama, makromolekulama.
2. Anti-transformacija, usmjerena na fazu transformacije normalne ćelije u tumorsku i njenu inhibiciju.
3. Anticelularna, usmjerena na fazu transformacije formiranja pojedinačnih tumorskih ćelija u ćelijsku koloniju - tumor.
Antikarcinogeni mehanizmi su predstavljeni u tri grupe. Grupa 1 uključuje antikancerogene mehanizme koji djeluju protiv hemijskih kancerogenih faktora:
1. Reakcije inaktivacije kancerogena: a) oksidacija pomoću nespecifičnih oksidaza mikrosoma, na primjer policikličnih ugljovodonika; b) redukcija pomoću mikrosomalnih reduktaza, na primjer aminoazo boja - dimetilaminoazobenzen, o-aminoazotoluen; c) dimetilacija - enzimska ili neenzimska; d) konjugacija sa glukuronskom ili sumpornom kiselinom pomoću enzima (glukuronidaza sulfataza);
2. Eliminacija ezo- i endogenih kancerogenih agenasa iz organizma u sastavu žuči, fecesa, urina;
3. Pinocitoza i fagocitoza kancerogenih agenasa, praćena njihovom neutralizacijom;
4. Formiranje antitela protiv kancerogena kao haptena;
5. Inhibicija slobodnih radikala antioksidansima.
U 2. grupu spadaju antikancerogeni mehanizmi koji djeluju protiv bioloških etioloških faktora - onkogenih virusa:
1. Inhibicija onkogenih virusa interferonima;
2. Neutralizacija onkogenih virusa specifičnim antitijelima. Treću grupu antikancerogenih mehanizama predstavljaju mehanizmi koji deluju na fizičke kancerogene faktore – jonizujuće zračenje. Glavne među njima su reakcije inhibicije stvaranja i inaktivacije slobodnih radikala (antiradikalne reakcije) i lipidnih i vodikovih peroksida (antiperoksidne reakcije), koji su, po svemu sudeći, „posrednici“ kroz koje jonizujuće zračenje, barem djelomično, ostvaruje svoje tumorsko dejstvo.uticaj. Antiradikalne i antiperoksidne reakcije obezbeđuju vitamin E, selen, glutation-disulfidni sistem (koji se sastoji od redukovanog i oksidovanog glutationa), glutation peroksidaza (razgradnja lipida i vodikovog peroksida), superoksid dismutaza, koja inaktivira superoksid anion radikal, katalazu, koja razgrađuje dolje vodikov peroksid.
Mehanizmi protiv transformacije
Zbog ovih mehanizama inhibira se transformacija normalne ćelije u tumorsku.
To uključuje:
1. Antimutacijski mehanizmi, koji su u funkciji ćelijskih enzimskih sistema za popravku DNK, eliminaciju oštećenja, „greške“ DNK (gena) i time održavanje genske homeostaze; 2. Antionkogeni mehanizmi, koji su u funkciji posebnih ćelijskih gena - antagonista onkogena i stoga se nazivaju antionkogeni. Njihovo djelovanje se svodi na suzbijanje reprodukcije stanica i stimulaciju njihove diferencijacije. Prisustvo antionkogena u normalnim ćelijama dokazano je eksperimentima grupe E. Stanbridgea i saradnika. Uveli su normalan hromozom (11. par iz ljudske ćelije) u Williamsovu tumorsku ćeliju. Kao rezultat toga, tumorske ćelije su podvrgnute transformaciji u normalne ćelije. Indirektni argument u korist antionkogena je odsustvo takvog gena (tzv. Rb gen) u 13. paru hromozoma u ćelijama retinoblastoma i u njihovim normalnim prekursorima - ćelijama retine.
Anticelularni mehanizmi
Ovi mehanizmi se aktiviraju od trenutka kada se formiraju prve ćelije blastoma. Oni su usmjereni na inhibiciju i uništavanje pojedinačnih tumorskih stanica i tumora u cjelini. Faktori koji uključuju antićelijske antitumorske mehanizme su antigena i „ćelijska“ stranost tumora. Postoje dvije grupe antićelijskih mehanizama: imunogeni i neimunogeni
1. Imunogeni antićelijski mehanizmi su funkcije imunog sistema, koji vrši tzv. imunološki nadzor postojanosti antigenskog sastava tkiva i organa tijela. Dijele se na specifične i nespecifične.
Specifični imunogeni mehanizmi uključuju citotoksično djelovanje, inhibiciju rasta i uništavanje tumorskih ćelija: a) limfociti imunog T-ubice; b) imuni makrofagi uz pomoć faktora koje oni luče: makrofag-lizin, lizozomalni enzimi, faktori komplementa, komponenta interferona koja inhibira rast, faktor nekroze tumora; c) K-limfociti, koji imaju Fc receptore za imunoglobuline i zbog toga pokazuju afinitet i citotoksičnost za tumorske ćelije koje su obložene IgG. Nespecifični imunogeni mehanizmi. To uključuje nespecifične citotoksične efekte, inhibiciju i lizu tumorskih ćelija: a) prirodne ćelije ubice (NK ćelije), koje su, kao i K-limfociti, vrsta limfocita kojima nedostaju karakteristični markeri T- i B-limfocita; b) nespecifično aktivirana (npr. pod uticajem mitogena, PHA itd.); c) nespecifično aktivirani makrofagi (npr. pod uticajem BCG-a ili bakterija, endotoksina, posebno lipopolisaharida iz gamo-negativnih mikroorganizama) uz pomoć faktora tumorske nekroze (TNF), interleukina-1, interferona itd. koji luče; d) „ukrštanja“ antitela.
2. Neimunogeni antićelijski faktori i mehanizmi.
Tu spadaju: 1) faktor nekroze tumora, 2) alogenska inhibicija, 3) interleukin-1, 4) inhibicija kejlona, 5) karcinoliza izazvana lipoproteinima, 6) kontaktna inhibicija, 7) labrocitoza, 8) regulacioni uticaj hormona.
Faktor nekroze tumora. Proizvode ga monociti, tkivni makrofagi, T- i B-limfociti, granulociti, mastociti. Izaziva uništavanje i smrt tumorskih ćelija. Interlekin-1 (IL-1). Mehanizam antiblastomskog djelovanja IL-1 povezan je sa stimulacijom K-limfocita, T-limfocita ubica, sintezom IL-2, koji zauzvrat stimulira reprodukciju i rast T-limfocita (uključujući T-limfocita ubice). -limfociti), aktivacija makrofaga, stvaranje γ-interferona i , možda dijelom pirogenim djelovanjem. Alogena inhibicija. U odnosu na tumorske ćelije, to je supresija vitalne aktivnosti i njihovo uništavanje od strane okolnih normalnih ćelija. Pretpostavlja se da je alogenska inhibicija uzrokovana citotoksičnim efektom antigena histoinkompatibilnih metabolita i razlikama na površini membrane Keylonova inhibicija. Keyloni su tkivno-specifični inhibitori proliferacije ćelija, uključujući tumorske ćelije. Karcinoliza izazvana lipoproteinima. Karcinoliza je otapanje tumorskih ćelija. Frakcija n-lipoproteina ima specifično onkolitičko dejstvo. Ova frakcija nema litički efekat na auto-, homo- i heterologne normalne ćelije.
Kontaktno kočenje. Smatra se da su ciklički nukleotidi - ciklički adenozin-3, 5-monofosfat (cAMP) i ciklički gvanozin-3,5-monofosfat (cGMP) - uključeni u implementaciju fenomena kontaktne inhibicije.
Povećanje koncentracije cAMP-a aktivira kontaktnu inhibiciju. protiv,
cGMP inhibira kontaktnu inhibiciju i stimulira diobu stanica. Labrocitoza. Karcinogeneza je praćena povećanjem broja mastocita (mastocita) koji proizvode heparin, koji inhibira stvaranje fibrina na površini tumorskih stanica (fiksiranih i cirkulirajućih u krvi). Ovo sprečava razvoj metastaza inhibiranjem transformacije embolije ćelije raka u ćelijsku tromboemboliju. Regulatorni uticaj hormona. Hormoni imaju regulatorni efekat na otpornost organizma na blastome. Karakteristična karakteristika ovog efekta je njegova raznolikost, ovisno o dozi hormona i vrsti tumora. Postavlja se pitanje: zašto, unatoč tako snažnim antićelijskim mehanizmima usmjerenim protiv tumorske stanice, ova potonja često perzistira i pretvara se u blastom? To se događa jer uzroci tumora istovremeno (davno prije razvoja tumora) uzrokuju imunosupresiju. Nastali tumor, zauzvrat, sam potencira imunosupresiju. Treba napomenuti da imunosupresija koja je nastala izvan veze sa djelovanjem kancerogena, na primjer, nasljedni T-imuni nedostatak (sa Wiskott-Aldrichovim sindromom, itd.), kao i stečena (koristi se tokom transplantacije organa ili se razvija tokom organa transplantacije ili razvoja tokom liječenja citostaticima) naglo povećava rizik od razvoja tumora. Dakle, imunosupresija tokom transplantacije organa povećava rizik od razvoja tumora za 50-100 puta. Brojni drugi fenomeni također sprječavaju uništavanje i, naprotiv, pospješuju očuvanje tumorskih ćelija: antigensko pojednostavljenje; reverzija antigena - pojava embrionalnih antigenskih proteina na koje tijelo ima urođenu toleranciju; pojava posebnih antitijela koja štite tumorske stanice od T-limfocita i nazivaju se "blokirajućim" antitijelima.
Ako proteini kodirani onkogeni doprinose razvoju, onda mutacije u tumor supresorski geni promoviraju malignitet kroz različite mehanizme i uz gubitak funkcije oba alela gena.
Tumorski supresorski geni veoma heterogena. Neki od njih zapravo potiskuju tumore regulacijom ćelijskog ciklusa ili izazivanjem inhibicije rasta kroz kontakt stanica-ćelija; Tumorski supresorski geni ovog tipa su CCC, jer direktno reguliraju rast stanica.
Ostalo tumor supresorski geni, „domarski” geni, uključeni su u popravku prekida DNK i održavaju integritet genoma. Gubitak oba alela gena uključenih u popravku DNK ili lom hromozoma dovodi do raka indirektno, omogućavajući akumulaciju naknadnih sekundarnih mutacija, kako u protoonkogenima, tako i u drugim genima za supresiju tumora.
Većina proizvoda tumor supresorski geni istaknuto i opisano. Budući da geni supresori tumora i njihovi proizvodi štite od raka, nadamo se da će njihovo razumijevanje na kraju dovesti do poboljšanih terapija protiv raka.
Tumorski supresorski geni:
1. Tumorski supresorski gen RB1: funkcije gena: sinteza p110, regulacija ćelijskog ciklusa. Tumori sa genskom patologijom: retinoblastom, sitnoćelijski karcinom pluća, rak dojke.
2.: funkcije gena: sinteza p53, regulacija ćelijskog ciklusa. Bolesti uzrokovane genskom patologijom: Li-Fraumeni sindrom, rak pluća, rak dojke, mnoge druge.
3. Tumorski supresorski gen DCC: funkcije gena: Dcc receptor, smanjeno preživljavanje ćelije u odsustvu signala preživljavanja od njegovog neutrino liganda. Bolesti uzrokovane genskom patologijom: kolorektalni karcinom.
4. Tumorski supresorski gen VHL: funkcije gena: sinteza Vhl, dijela oblika citoplazmatskog destruktivnog kompleksa sa APC, koji normalno, u prisustvu kisika, inhibira indukciju rasta krvnih žila. Bolesti uzrokovane genskom patologijom: Hippel-Lindauov sindrom, bistrocelularni karcinom bubrega.
5. Tumorski supresorski geni BRCA1, BRCA2: funkcije gena: sinteza Brcal, Brca2, popravak hromozoma kao odgovor na dvostruke lomove DNK. Bolesti uzrokovane genskom patologijom: rak dojke, rak jajnika.
6. Tumorski supresorski geni MLH1, MSH2: funkcije gena: sinteza Mlhl, Msh2, popravka neusklađenosti nukleotida između lanaca DNK. Bolesti uzrokovane genskom patologijom: kolorektalni karcinom.