Dodatne metode ispitivanja krvi: određivanje retikulocitnog hematokrita. Brojanje retikulocita u razmazu nakon bojenja posebnim bojama. Zahtevaju odvojeno farbanje

Retikulociti su mlada crvena krvna zrnca nastala nakon što normoblasti izgube svoje jezgre. Karakteristična karakteristika retikulocita je prisustvo u njihovoj citoplazmi zrnasto-filamentne supstance (retikuluma), koja predstavlja agregirane ribozome i mitohondrije.

1.) Brojanje broja retikulocita u brisu nakon bojenja posebnim bojama.

Ova metoda je u praksi najčešće korištena metoda zbog činjenice da je jednostavna, prilično jeftina i ne zahtijeva posebnu skupu opremu, te se shodno tome može koristiti u bilo kojoj kliničko dijagnostičkoj laboratoriji.

Princip metode zasniva se na identifikaciji granulo-retikularne supstance retikulocita tokom supravitalnog bojenja alkalnim bojama (zasićeni rastvor briljantnog krezil plavog u apsolutnom alkoholu / rastvor Azur I / rastvor Azur II) uz njihovo dalje brojanje u razmazu krvi. Bojenje retikulocita vrši se ili na staklu ili u epruveti. Brojanje se vrši mikroskopom: razmazi pripremljeni jednom od gore navedenih metoda se mikroskopski pregledaju imerzionim sočivom; u razmazu su retikulociti i eritrociti obojeni žućkasto-zelenkasto, zrnasto-filamentozna tvar u retikulocitima je plava (kada je obojena azurom II i briljantnom kresil plavom) ili plavkasto-ljubičastom (kada je obojena azurom I).

2.) Brojanje broja retikulocita pomoću fluorescentne mikroskopije.

Ova metoda je jednostavna i zahtijeva malo vremena, preciznija je od konvencionalne metode, jer fluorescentna mikroskopija otkriva najmanja zrna mrežasto-filamentne tvari, ali je moguća samo uz fluorescentni mikroskop i specijalne boje, te je stoga dostupna samo u nekoliko laboratorija.

Princip brojanja broja retikulocita pomoću fluorescentne mikroskopije temelji se na sposobnosti tvari retikulocita da fluorescira nakon tretiranja krvi akridin narandžastom. Krv se pomiješa sa akridin narandžastom u epruveti ili mikseru u omjeru 1 dio krvi i 10 dijelova boje (smjesa se može čuvati ne više od 5 sati). Smjesa se miješa 2 minute, kap smjese se nanese na staklo i prekrije pokrovnim stakalcem. U tom slučaju tečnost ne bi trebalo da ide dalje od pokrovnog stakala.

Mikroskopija pomoću svjetlosnog filtera ZhS-17. U preparatu crvena krvna zrnca imaju tamnozelene obrise i ne fluoresciraju, a u retikulocitima, granulasto-mrežasta tvar svijetli jarko crveno, što retikulocite čini lakim za prebrojavanje. U krvi stabilizovanoj heparinom ili natrijum citratom, fluorescencija retikulocita nije primećena.

3.) Automatski broj retikulocita pomoću hematološkog analizatora.

U savremenim hematološkim analizatorima, tehnologija brojanja krvnih zrnaca zasniva se na konduktometrijskoj metodi koju su predložili H. Wallace i Joseph R. Culter 1947. Princip metode je da se broji i odredi priroda impulsa koji se javljaju kada ćelija prolazi kroz otvor (otvor) malog prečnika, na čijem se obe strane nalaze dve elektrode izolovane jedna od druge. Svaki prolazak ćelije kroz otvor je praćen pojavom električnog impulsa, koji se bilježi elektronskim senzorom. Podjelu ćelija u kategorije (eritrociti, leukociti, trombociti, sediment) aparat vrši na osnovu analize amplitude primljenih impulsa. Za određivanje koncentracije ćelija dovoljno je proći određenu zapreminu uzorka kroz kanal i izbrojati broj impulsa koji se generišu.

Treba napomenuti da pored klasičnog parametra retikulocita - relativnog (%) sadržaja retikulocita (RET%, procenat retikulocita), utvrđenog metodom 1 i 2 laboratorijske dijagnostike, u vezi sa pojavom visokotehnoloških hematološkim analizatorima (metoda 3) postalo je moguće dobiti (na primjer, pomoću patentirane fluorescentne boje za Sysmex-XT-2000i analizator) dodatne informativne parametre retikulocita:
retikulociti sa niskim sadržajem RNK, najzreliji (LFR%, frakcije retikulocita niske fluorescencije);
retikulociti sa prosečnim sadržajem RNK (MFR%, frakcije retikulocita srednje fluorescencije) - frakcija retikulocita sa prosečnom fluorescencijom);
retikulociti sa visokim sadržajem RNK (HFR%, frakcije retikulocita visoke fluorescencije) - frakcija retikulocita sa visokom fluorescencijom);
nezrela frakcija retikulocita (IRF%, frakcija nezrele retikulocita).

Diferencijacija retikulocita, na osnovu stepena zrelosti i, shodno tome, sadržaja nukleinskih kiselina, odraz je hematopoetske aktivnosti koštane srži.

Metodologija (Sysmex -XT- 2000i analizator). U protočnoj ćeliji, ćelije prelaze poluvodički laserski snop, uzrokujući raspršivanje zraka pod velikim i malim uglom i pobuđivanje fluorescentne boje. Ovo omogućava određivanje različitih faza zrelosti retikulocita na osnovu sadržaja RNK u ćelijama i intenziteta njihove luminescencije. Automatsko brojanje retikulocita je vrlo precizno (prebrojava se više od 30.000 crvenih krvnih zrnaca) i reproducibilno (koeficijent varijacije je oko 6%). Ova tehnologija osigurava precizno brojanje retikulocita čak i pri ekstremno niskim koncentracijama.

Detekcija granularno-retikularne supstance retikulocita kod bojenja briljantno-krezil plavom bez prethodne fiksacije.

reagensi:

1% rastvor briljantnog krezil plavog: 50 mg boje se rastvori u 5 ml fiziološke otopine i doda se 20 mg natrijum citrata (otopina se čuva u tamnoj staklenoj posudi, može se koristiti nekoliko dana).

metodologija:

Nanesite 2 kapi 1% rastvora briljantne kresil plave boje i 1 kap krvi na staklo sa udubljenjem. Pažljivo promiješajte staklenom šipkom i smjesu se stavi u vlažnu komoru (Petrijeva zdjelica, u koju se po rubovima stavljaju lagano navlažene rolne gaze ili vate) na 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim se prave brisevi i suše.

Broj retikulocita:

U razmazima, crvena krvna zrnca su obojena žućkasto-zelenom bojom, a zrnasto-retikularna tvar u retikulocitima je plava i ljubičasta.

Razmazi se pregledavaju mikroskopski pomoću imersionog sočiva. Retikulociti se broje na 1000 crvenih krvnih zrnaca (veća tačnost se postiže kada se broji 2000-3000 crvenih krvnih zrnaca).

Povećanje broja retikulocita se opaža kod:

stimulacija eritropoeze (gubitak krvi, hemoliza, retikulocitna kriza uz uspješno liječenje B12-deficitne anemije, akutni nedostatak kisika).

Smanjenje broja retikulocita se opaža kod:

inhibicija eritropoeze (aplastična i hipoplastična anemija, neliječena anemija s nedostatkom B12, metastaze raka u kostima),

bolesti bubrega, endokrine bolesti.

Primjećuje se povećanje njihovih retikulocita u perifernoj krvi (retikulocitoza): s hemolitičkom anemijom (broj retikulocita može doseći 60% ili više (posebno snažno raste tijekom hemolitičke krize); s akutnim gubitkom krvi (kriza retikulocita se javlja 3-5). dana nakon gubitka krvi), uključujući i povećanje retikulocita, omogućava sumnju na skriveno krvarenje (na primjer, kod pacijenata sa peptičkim ulkusom gastrointestinalnog trakta, tifusnom groznicom); s malarijom; s policitemijom; kada se anemija zbog nedostatka željeza liječi željezom (nekoliko dana (3 - 10) nakon početka antianemične terapije perniciozne anemije); sa akutnim nedostatkom kiseonika; sa metastazama tumora u koštanu srž. Treba imati na umu da u slučaju pojačanog razaranja crvenih krvnih zrnaca, udio retikulocita može premašiti 50% zbog umjetnog povećanja broja retikulocita (kao što je ranije navedeno, udio retikulocita se izračunava kao % svih crvenih krvnih zrnaca. U takvim slučajevima, za procjenu težine anemije, „retikularni koristi se indeks” koji se izračunava po formuli: (% retikulocita x hematokrit) / 45 x 1,85, gdje je 45 normalan hematokrit, 1,85 je broj dana potrebnih za prijem novih retikulocita u krv. Ako index

METODE ZA BROJANJE RETIKULOCITA

(1) Brojanje broja retikulocita u brisu nakon bojenja posebnim bojama. Ova metoda je u praksi najčešće korištena metoda zbog činjenice da je jednostavna, prilično jeftina i ne zahtijeva posebnu skupu opremu, te se shodno tome može koristiti u bilo kojoj kliničko dijagnostičkoj laboratoriji. Princip metode zasniva se na identifikaciji granulo-retikularne supstance retikulocita tokom supravitalnog bojenja alkalnim bojama (zasićeni rastvor briljantnog krezil plavog u apsolutnom alkoholu / rastvor Azur I / rastvor Azur II) uz njihovo dalje brojanje u razmazu krvi. Bojenje retikulocita vrši se ili na staklu ili u epruveti. Brojanje se vrši mikroskopom: razmazi pripremljeni jednom od gore navedenih metoda se mikroskopski pregledaju imerzionim sočivom; u razmazu su retikulociti i eritrociti obojeni žućkasto-zelenkasto, zrnasto-filamentozna tvar u retikulocitima je plava (kada je obojena azurom II i briljantnom kresil plavom) ili plavkasto-ljubičastom (kada je obojena azurom I). (2) Broj retikulocita pomoću fluorescentne mikroskopije. Ova metoda je jednostavna i zahtijeva malo vremena, preciznija je od konvencionalne metode, jer fluorescentna mikroskopija otkriva najmanja zrna mrežasto-filamentne tvari, ali je moguća samo uz fluorescentni mikroskop i specijalne boje, te je stoga dostupna samo u nekoliko laboratorija. Princip brojanja broja retikulocita pomoću fluorescentne mikroskopije temelji se na sposobnosti tvari retikulocita da fluorescira nakon tretiranja krvi akridin narandžastom. Krv se pomiješa sa akridin narandžastom u epruveti ili mikseru u omjeru 1 dio krvi i 10 dijelova boje (smjesa se može čuvati ne više od 5 sati). Smjesa se miješa 2 minute, kap smjese se nanese na staklo i prekrije pokrovnim stakalcem. U tom slučaju tečnost ne bi trebalo da ide dalje od pokrovnog stakala. Mikroskopija pomoću svjetlosnog filtera ZhS-17. U preparatu crvena krvna zrnca imaju tamnozelene obrise i ne fluoresciraju, a u retikulocitima, granulasto-mrežasta tvar svijetli jarko crveno, što retikulocite čini lakim za prebrojavanje. U krvi stabilizovanoj heparinom ili natrijum citratom, fluorescencija retikulocita nije primećena. (3) Automatsko brojanje retikulocita pomoću hematološkog analizatora. U modernim hematološkim analizatorima, tehnologija brojanja krvnih zrnaca temelji se na konduktometrijskoj metodi koju je predložio H. Wallace i Joseph R. Culter 1947. Princip metode je brojanje i određivanje prirode impulsa koji se javljaju kada ćelija prođe kroz rupu (otvor) malog prečnika, na čije se obje strane nalaze dvije elektrode. izolovani jedno od drugog. Svaki prolazak ćelije kroz otvor je praćen pojavom električnog impulsa, koji se bilježi elektronskim senzorom. Podjelu ćelija u kategorije (eritrociti, leukociti, trombociti, sediment) aparat vrši na osnovu analize amplitude primljenih impulsa. Za određivanje koncentracije ćelija dovoljno je proći određenu zapreminu uzorka kroz kanal i izbrojati broj impulsa koji se generišu. Treba napomenuti da pored klasičnog parametra retikulocita - relativnog (%) sadržaja retikulocita (RET%, procenat retikulocita), utvrđenog metodom 1 i 2 laboratorijske dijagnostike, u vezi sa pojavom visokotehnoloških hematološkim analizatorima (metoda 3) postalo je moguće dobiti (na primjer, korištenjem patentirane fluorescentne boje za analizator Sysmex -XT- 2000i) dodatne informativne parametre retikulocita: retikulociti sa niskim sadržajem RNK, najzreliji (LFR%, niska fluorescencija frakcije retikulocita); retikulociti sa prosečnim sadržajem RNK (MFR%, frakcije retikulocita srednje fluorescencije) - frakcija retikulocita sa prosečnom fluorescencijom); retikulociti sa visokim sadržajem RNK (HFR%, frakcije retikulocita visoke fluorescencije) - frakcija retikulocita sa visokom fluorescencijom); nezrela frakcija retikulocita (IRF%, frakcija nezrele retikulocita). Diferencijacija retikulocita, na osnovu stepena zrelosti i, shodno tome, sadržaja nukleinskih kiselina, odraz je hematopoetske aktivnosti koštane srži. Metodologija (Sysmex -XT- 2000i analizator). U protočnoj ćeliji, ćelije prelaze poluvodički laserski snop, uzrokujući raspršivanje zraka pod velikim i malim uglom i pobuđivanje fluorescentne boje. Ovo omogućava određivanje različitih faza zrelosti retikulocita na osnovu sadržaja RNK u ćelijama i intenziteta njihove luminescencije. Automatsko brojanje retikulocita je vrlo precizno (prebrojava se više od 30.000 crvenih krvnih zrnaca) i reproducibilno (koeficijent varijacije je oko 6%). Ova tehnologija osigurava precizno brojanje retikulocita čak i pri ekstremno niskim koncentracijama.

Retikulocitopenija i retikulocitoza, uzroci razvoja, dijagnostička vrijednost njihovog otkrivanja.

studfiles.net

retikulociti (retikulociti)

Retikulociti su mlada crvena krvna zrnca nastala nakon što normoblasti izgube svoje jezgre.

Karakteristična karakteristika retikulocita je prisustvo zrnasto-mrežaste supstance, koja se pojavljuje supravitalnim bojenjem, odnosno bez preliminarne fiksacije ćelija.

Elektronska mikroskopija je pokazala da su granularno-mrežaste strukture ostaci endoplazmatskog retikuluma, ribozoma i mitohondrija koji sadrže RNK. U retikulocitima se u maloj mjeri sintetiziraju protein (globin), hem, purini, pirimidinski nukleotidi, fosfatidi i lipidi, ali se u njima ne sintetizira RNK. 2 dana retikulocit ostaje u krvotoku, nakon čega, kako se RNK smanjuje, postaje zreli eritrocit.

U brisevima obojenim konvencionalnim hematološkim metodama, retikulociti su sivkasto-ružičaste boje – polihromatofilni, tj. farbane različitim bojama.

Trenutno se koristi jedinstvena metoda za brojanje broja retikulocita nakon bojenja

briljantna kresil plava,
Azure I ili
Azure II direktno na staklu ili u epruveti.

1. Princip metode

Detekcija granularno-retikularne supstance eritrocita kada su obojeni alkalnim bojama uz njihovo daljnje brojanje u razmazu krvi.

2. Reagensi:

a) zasićeni rastvor briljantnog krezil plavog u apsolutnom alkoholu (za pripremu apsolutnog alkohola potrebno je natopiti 96% etanol u nekoliko izmena praha kalcinisanog bakar sulfata): 1,2 g boje na 100 ml alkohola;

b) rastvor azura I: azur I - 1 g, amonijum oksalat - 0,4 g, natrijum hlorid - 0,8 g, etil alkohol 96% - 10 ml, destilovana voda - 90 ml. Rastvor boje u zatvorenoj boci stavlja se u termostat na 37 °C 2-3 dana i periodično snažno protrese. Zatim ohladite na sobnu temperaturu i filtrirajte kroz papirni filter. Otopina se čuva u posudi od tamnog stakla. Ako se pojavi talog, boju treba ponovo filtrirati;

c) Azur II rastvor: Azur II - 1 g, natrijum citrat - 5 g, natrijum hlorid - 0,4 g, destilovana voda - 45 ml. Rastvor se ostavi u termostatu na 37 °C 2 dana uz povremeno miješanje. Da bi se ubrzalo otapanje, boja se može zagrijavati na laganoj vatri 15-20 minuta, bez dovođenja do ključanja. Ohladiti na sobnu temperaturu i filtrirati. Čuvati u posudama od tamnog stakla.

3. Bojanje

Bojenje na staklu:

dobro oprano i odmašćeno staklo zagreva se na plamenu plamenika. Koristeći staklenu šipku, nanesite kap jedne od boja na staklo i pripremite razmaz boje koristeći brušeno staklo. Steklografom označite stranu stakla na koju se nanosi potez boje. U ovom obliku staklo se može pripremiti za buduću upotrebu i čuvati na suhom, tamnom mjestu;
Na ovako pripremljeno staklo nanese se kap krvi, napravi se tanak razmaz i staklo se odmah stavi u vlažnu komoru. Da biste to učinili, koristite Petrijevu posudu s poklopcem, u koju se po rubovima stavljaju lagano navlažene rolne gaze ili pamuka;
Razmazi se drže u vlažnoj komori 3-5 minuta, a zatim se suše na vazduhu. Zrnasto-mrežasta tvar retikulocita obojena je ljubičasto-plavom bojom, jasno se ističe na zelenkasto-plavkastoj pozadini eritrocita.

In vitro bojenje:

1. metod: pre upotrebe pripremiti radni rastvor briljantnog kresil plavog u epruveti na bazi kapi 1% rastvora kalijum oksalata 4 kapi rastvora boje 1. U boju dodati 40 μl krvi (dve pipete do oznake 0,02 ). Smjesa se temeljno, ali lagano promiješa i ostavi 30 minuta. Promiješajte i pripremite tanke mrlje;
Metoda 2: 0,05 ml rastvora boje 3 i 0,2 ml krvi stavlja se u epruvetu. Smjesa se dobro promiješa i ostavi 20-30 minuta. Promiješajte i pripremite tanke mrlje;
Metoda 3: 0,3–0,5 ml rastvora boje 2 i 5–6 kapi krvi stavljaju se u epruvetu pomoću pipete iz aparata Pančenkov. Epruveta se zatvori gumenim čepom, smjesa se temeljito, ali pažljivo promiješa i ostavi 1-1½ sata (retikulociti se bolje boje uz izlaganje od 1½-3 sata). Promešati i pripremiti tanke mrlje.

4. Broj retikulocita

U razmazima crvena krvna zrnca su obojena žućkasto-zelenkasto, zrnasto-filamentozna tvar je plava ili plavkasto-ljubičasta.

Razmazi pripremljeni jednom od gore navedenih metoda se pregledavaju mikroskopski sa imersionom sočivom;
potrebno je izbrojati najmanje 1000 crvenih krvnih zrnaca i među njima zabilježiti broj crvenih krvnih stanica koje sadrže zrnasto-filamentoznu supstancu. Za ujednačene tanke razmaze u kojima se crvena krvna zrnca nalaze u jednom redu, odaberite vidno polje u kojem se nalazi, na primjer, 50 crvenih krvnih zrnaca, a zatim izračunajte 20 takvih vidnih polja;
U praksi, za veću preciznost, koriste poseban okular, u kojem se vidno polje može smanjiti na potrebnu veličinu. Ako nemate gotov okular, možete ga lako pripremiti tako da odvrnete okular ×7, u njega stavite komad papira sa izrezanim kvadratom i zašrafite ga. Broj izbrojanih retikulocita izražava se na 1000 ili na 100 crvenih krvnih zrnaca.

NORMALNO: 0,5–1,2% (30–70 × 109/l)

Povećanje broja retikulocita se opaža kod:

gubitak krvi (posebno akutni);
hemolitička anemija, posebno tokom krize (do 20-30%);
na pozadini liječenja megaloblastične anemije vitaminom B12 (retikulocitna kriza - povećanje broja retikulocita 4-8 dana liječenja).

Smanjenje broja retikulocita je karakteristično za:

aplastična i hipoplastična anemija;
neliječena megaloblastna anemija;
radijaciona bolest;
uzimanje citostatika.

Da li je Hrist živ? Da li je Hristos uskrsnuo iz mrtvih? Istraživači proučavaju činjenice

dyagnoz.ru

Retikulociti normalni i brojimo njihov broj

Krvne ćelije, retikulociti, čija norma varira zbog mnogih faktora, su neformirani oblici crvenih krvnih zrnaca, a mogu se naći u koštanoj srži i perifernoj krvi. U pravilu, retikulociti u krvi sazrijevaju za tri do pet dana, a zatim se te stanice pretvaraju u zrela crvena krvna zrnca. Štaviše, broj neformiranih crvenih krvnih zrnaca kod novorođenčadi znatno je veći nego kod odraslih.

Detekcija retikulocita:

Prilikom identifikacije retikulocita, čija se norma određuje pomoću posebne tablice, potrebno je uzeti u obzir njihove razlike od zrelih crvenih krvnih stanica. Ova vrsta krvnih zrnaca ili sadrži cijelo jezgro, ili se njegovi ostaci uočavaju u sastavu zrnasto-filamentne tvari. Za određivanje broja takvih stanica potrebno je laboratorijski proučiti boju krvnog razmaza. Da biste to učinili, koristi se otopina plavog dijamanta, koja se nanosi na odmašćeno i prethodno oprano staklo, a tek onda se pravi razmaz.

Kada se otkriju retikulociti, čija je norma drugačija, odmah nakon razmaza upotrijebljeno staklo treba staviti u Petrijevu posudu - posebnu vlažnu komoru, zatim držati pet minuta, temeljito osušiti na svježem zraku, a zatim mikroskopirati. Štoviše, tvar granularno-filamentoznog tipa unutar retikulocita obično je obojena u ljubičasto-plavu nijansu, a pozadina eritrocita se ističe zbog svoje plavkasto-zelene nijanse.

Ako se koristi Gehl-Meyerova metoda, boja nezrelih krvnih stanica može se vidjeti mnogo bolje, ali za to je potrebna Widal cijev. U ovoj posudi se pomiješa nekoliko kapi krvi s otopinom dijamanta i natrijevog klorida, zatim se epruveta zatvori poklopcem, a sam bris se izvede u roku od sat vremena.

Broj retikulocita:

Prilikom izračunavanja broja nezrelih krvnih stanica, morate uzeti 1000 crvenih krvnih stanica kao osnovu, a zatim uzeti u obzir retikulocite, čija norma obično varira na razini od 0,2% -1,2% broja crvenih krvnih stanica odraslih. U prosjeku, kod većine ljudi, broj nezrelih crvenih krvnih stanica je obično 0,7% od ukupnog broja potpuno zrelih krvnih stanica. Ako je broj retikulocita 10% ili više veći od maksimalno dopuštene norme, osoba razvija retikulocitozu - bolest praćenu redovitim akutnim krvarenjem i hemolitičkom anemijom.

Prilikom brojanja retikulocita (norma kod djece je obično visoka), vrijedi provjeriti da njihov broj ne prelazi granične vrijednosti tipične za odrasle. Standardi zavise i od spola, jer se kod žena 2,07% nezrelih crvenih krvnih zrnaca još uvijek smatra prihvatljivim parametrom, a kod muškaraca ova brojka ne bi trebala prelaziti 1,92%.

U slučajevima kada je nivo retikulocita značajno povećan, to ukazuje na prisustvo poremećaja u organizmu kao što su malarija i talasemija, policitemija i hipoksija, anemija, sve vrste hemolitičkih sindroma, ali su takvi pokazatelji mogući i tokom lečenja cijanokobalaminom. Ako je nivo nezrelih crvenih krvnih zrnaca nizak, osoba može doživjeti aplastičnu i hipoplastičnu anemiju, sve vrste bolesti bubrega i miksedema, kao i širenje tumorskih metastaza na kosti.

Za dijagnozu težine anemije potrebno je izračunati „indeks retikulocita“, koji se izračunava kao omjer procenta retikulocita i normalnih vrijednosti hematokrita, pomnožen sa brojem dana potrebnih da nezrele ćelije uđu u perifernu krv. Ako rezultirajući indeks ne prelazi dva, indikator ukazuje na hipoproliferativnu komponentu anemije, a ako prelazi dva, ukazuje na vjerojatnost povećanog stvaranja crvenih krvnih zrnaca.

fb.ru

Test krvi. Analiza krvi

Određivanje koncentracije hemoglobina

Među metodama za određivanje hemoglobina, najčešće se koriste metode koje se zasnivaju na kolorimetriji, odnosno određivanju intenziteta boje. Najjednostavnija od njih je određivanje hemoglobina vizualnom kolorimetrijom u Sali hemometru, drvenom postolju sa središnjim graduisana epruveta, na čijim stranama se nalaze zatvorene staklene epruvete sa standardom boje (hlorovodonična kiselina hematin u glicerinu).U centralnu epruvetu prvo se sipa 0,1% rastvor hlorovodonične kiseline do oznake koja odgovara 2 ili 3 g. %, zatim pažljivo dodati (tačno!) 0,02 ml krvi uzete iz prsta posebnom pipetom pričvršćenom na hemometar. Pipeta se ispere površinskim slojem kiseline i nakon miješanja krvi i kiseline staklenim štapićem ostavi 5 minuta da nastane hematin hlorovodonične kiseline. Zatim, dodavanjem destilovane vode i stalnim mešanjem štapom, boja tečnosti u centralnoj epruveti u potpunosti odgovara standardima. Koncentracija hemoglobina odgovara nivou rastvora duž donjeg meniskusa. Koncentracija hemoglobina može se izraziti u g% hemoglobina ili u proizvoljnim jedinicama. 16,67 g hemoglobina uzima se kao 100 jedinica.

Koncentracija hemoglobina u krvi kod žena kreće se od 11,7 do 15,8 g/o ili od 117 do 158 g/l, kod muškaraca - od 13,3 do 18 g% ili od 133 do 180 g/l.

Vađenje krvi za brojanje formiranih elemenata

Za brojanje formiranih elemenata krv se razrjeđuje u mikserima (melanžerima) ili epruvetama, što se u posljednje vrijeme sve više koristi.Za brojanje crvenih krvnih zrnaca krv se razrjeđuje 200 puta sa 3% otopinom natrijum hlorida; ako za vađenje krvi koristimo hemometarsku pipetu zapremine 0,02 ml, onda moramo uzeti 4 ml rastvora natrijum hlorida.Za brojanje leukocita krv se razblaži 20 puta, dakle 0,02 ml krvi i 0,38 ml 3% uzet tonirani rastvor metilen plave octene kiseline, koji je neophodan da izazove uništavanje crvenih krvnih zrnaca.. Uzimanje krvi mora biti obavljeno sa velikom preciznošću, jer kod tako malih količina dolazi do ulaska vazdušnog mjehurića ili zaostale krvi na vanjsku stranu pipeta dovodi do povećanja greške u određivanju.Prije punjenja komore potrebno je obrisati brušeno staklo u komori kako bi se pojavili dugini prstenovi.Prije punjenja komore razrijeđena krv se dobro promiješa, kako se ćelije talože zidove epruvete ili ampule miksera, nakon čega se kap krvi unese ispod brušenog stakla komore i ostavi 1 minut na miru da se ćelije slegnu.

Brojanje formiranih elemenata vrši se pri malom povećanju mikroskopa (8X objektiv, 15X ili 10X okular) u zatamnjenom vidnom polju.

Crvena krvna zrnca se broje u 5 velikih kvadrata (16x5 = 80 malih kvadrata) koji se nalaze u različitim dijelovima komore; možete uzeti kvadrate smještene dijagonalno. Crvena krvna zrnca koja leže unutar kvadrata i ona koja se nalaze na njegovoj gornjoj i lijevoj strani podliježu brojanje; crvena krvna zrnca koja leže na donjoj i desnoj strani se ne broje, jer već pripadaju drugim kvadratima.

Brojenjem broja crvenih krvnih zrnaca (A) u 5 velikih kvadrata, pronađite aritmetičku sredinu broja crvenih krvnih zrnaca u jednom malom kvadratu A/80, odnosno u 1/4000 µl. Stoga, da bismo pronašli broj crvenih krvnih zrnaca u 1 μl, moramo pomnožiti broj dobiven dijeljenjem sa 4000 i sa 200 (razrjeđivanje).

Tako dobijamo sledeću formulu:

X=A*4000*200/80,

gdje je X broj crvenih krvnih zrnaca u 1 μl, a A broj crvenih krvnih zrnaca u 5 velikih kvadrata. Ako bismo izbrojali crvena krvna zrnca u 5 velikih kvadrata i razrijedili krv 200 puta, onda je ukupan množitelj za broj A će biti 10.000.

Normalan sadržaj crvenih krvnih zrnaca u krvi žena je 4-5 * 106, muškaraca - 4,5-5,5 * 106.

Leukociti se broje u 100 velikih kvadrata, ne podijeljenih na male, što odgovara 1600 malih. Dakle, broj leukocita pronađenih u 100 kvadrata podijeljen je sa 1600, pomnožen sa 4000 i pomnožen sa 20 (razrjeđenje). U ovom slučaju, da biste dobili rezultat, dovoljno je pomnožiti broj izbrojanih leukocita sa 50. Normalan sadržaj leukocita u krvi je 5 * 103 - 8 * 103 u 1 μl.

Indeks boje krvi. Indeks boja krvi je broj koji pokazuje prosječnu zasićenost hemoglobinom pojedinog eritrocita date krvi u odnosu na zasićenost pojedinačnog eritrocita normalne krvi. Za normalan sadržaj hemoglobina uzima se 100 jedinica, a normalan broj eritrocita je 5 000 000. Vrijednost indeksa boja kod zdravih ljudi varira od 0,9 do 1,1 Studija brisa periferne krvi. U brisevima krvi se proučava morfologija crvenih krvnih zrnaca i izračunava formula leukocita, odnosno procentualni odnos između različitih vrsta leukocita.Da bi studija bila uspješna potrebno je izvršiti pripremu, fiksiranje i bojenje krvnih razmaza. izvadite s velikom pažnjom. Za pripremu razmaza koristite čistu staklenu površinu bez masnoće na udaljenosti od 0,5 cm od ruba stakalca, dodirnite kap krvi na mjestu uboda na prstu, a zatim stavite tlo pokrivno staklo pod uglom od 45° u odnosu na predmetno staklo i prvo dovesti do kapi krvi tako da se širi duž zadnje ivice pokrivnog stakla i pokretom pluća, bez oštrog pritiska, napravi razmaz. Razmaz bi trebao završiti „metlom“ na stakalcu. Razmaz se suši na vazduhu; kada se osuši, dobar, tanak bris ima žutu boju.

Jednostavnom, naoštrenom olovkom u sredini brisa se ispisuje ime pacijenta i datum istraživanja, nakon čega se brisevi fiksiraju u metil alkoholu najmanje 5 minuta i boje se metodom Romanovsky-Giemsa.

Boja se sastoji od mješavine kiselih (eozin) i bazičnih (Azur II) boja. Ova metoda bojenja omogućava razlikovanje stanica. Prva faza rada sa brisom je procjena morfologije crvenih krvnih zrnaca. Da biste to učinili, odaberite tanko mjesto gdje ćelije leže odvojeno, a ne u obliku stupaca novčića. Normalni eritrociti su ćelije bez jezgra, ružičasto obojene, okrugle, približno istog promjera - 7,5 mikrona, eritrociti imaju oblik bikonkavnog diska, stoga u razmazu imaju izrezivanje u centru i intenzivnije obojenu periferiju.

(modul direct4)

Priprema guste kapi

Za testiranje krvi na Plasmodium malariju, pravi se debela kap. Krv se uzima na uobičajen način iz mesa prsta. Kap krvi koja viri iz mjesta uboda dodiruje se površinom staklenog predmeta. 2-3 kapi odvojeno namažu se uglom druge čaše. Suhi razmaz se sipa (bez fiksiranja) bojom Romanovsky 30-40 minuta, zatim se obojena kap pažljivo ispere vodom i preparat osuši u okomitom položaju.

Podaci analize uzorka

Povećani broj eritrocita i hemoglobina u krvi može nastati kod bolesti crvenih elemenata krvi - eritremije, tada broj eritrocita dostiže 9-106 ili više.Povećan sadržaj eritrocita u krvi može se javiti sekundarno tj. je, kada nema bolesti crvenog lista hematopoeze, a povećava se broj crvenih krvnih zrnaca kao posljedica bolesti drugih organa i sistema (sa dekompenziranom difuznom pneumosklerozom, plućnim emfizemom, nekim vrstama urođenih srčanih mana, vaskularnom sklerozom sistema plućnih arterija, defekti desnog srca, cirkulatorna insuficijencija trećeg stepena itd.). Ovaj simptom se naziva eritrocitoza.

Morfološki izmijenjena crvena krvna zrnca pojavljuju se kod hiperkromne (megaloblastne) anemije. U tom slučaju se u krvi nalaze velika crvena krvna zrnca s visokim sadržajem hemoglobina (makrociti), embrionalna crvena krvna zrnca (megaloblasti), koja se obično ne nalaze u perifernoj krvi. Morfologija eritrocita se menja i kod hipohromne anemije: pojavljuju se mali eritrociti (mikrociti) promenjenog oblika (poikilociti) i eritrociti sa niskim sadržajem hemoglobina (hipohromni eritrociti).

Broj leukocita

Prilikom izračunavanja formule leukocita potrebno je odrediti strukturne karakteristike citoplazme i jezgra ćelija. Pripadnost ćelije jednoj ili drugoj grupi utvrđuje se na osnovu ukupnosti svih karakteristika citoplazme i jezgra.Prilikom izračunavanja formule mora se pridržavati iste metode pomeranja stakla pod mikroskopom. Najčešće korištena metoda je mikroskopija na 4 mjesta razmaza. Poznato je da su leukociti u razmazu raspoređeni neravnomjerno: na rubovima je manje limfocita nego u sredini, a monocita je više na kraju razmaza nego na početku. Stoga je pri izračunavanju formule leukocita najbolje kretati se isprekidanom linijom, brojeći sve naiđene ćelije. Brojanje 200 ćelija je praktični minimum za rutinske kliničke studije. Leukociti periferne krvi, u zavisnosti od prisustva ili odsustva granularnosti u citoplazmi, dijele se na granulocite (neutrofili, eozinofili, bazofili) i agranulocite (monociti i limfociti).

Neutrofili. Veličina ćelije je 10-12 mikrona. Citoplazma ćelija je blijedoružičasta s finom, obilnom, ljubičastom granularnošću. Normalno, u krvi se nalaze trakasti (2-4%) i segmentirani (60-65%) neutrofili.

Eozinofili. Ćelije su iste veličine kao neutrofili, ponekad malo veće, citoplazma je ispunjena velikim žućkastocrvenim granulama, jezgro obično ima dva segmenta iste veličine. Eozinofili su normalno 2-4%.Bazofili. Ovo je najmanji granulocit po veličini. Jezgro je nepravilno, višestruko, zauzima gotovo cijelu ćeliju, blijedoružičasta citoplazma sadrži velike tamnoljubičaste granule. Granule bazofila se otapaju u vodi, a ponekad, kao rezultat ispiranja pri bojanju preparata, bezbojne ćelije ostaju na mjestu granula. Normalni bazofili su 0,1% Limfociti. Veličina ćelije se kreće od 7 do 10 mikrona. Jezgro je kompaktne strukture, okruglo ili u obliku zrna. Citoplazma ćelija je blijedoplava sa zonom čišćenja oko jezgra (perinuklearna), ponekad se u citoplazmi nalaze pojedinačna azurofilna zrna crveno-ljubičaste boje. U perifernoj krvi normalno ima 20-35% limfocita.Monociti. Veličina ćelije se kreće od 12 do 20 mikrona. Jezgro je često potkovičastog, ponekad nepravilnog oblika. Citoplazma je opsežnija od limfocita, pepeljasto plave boje sa finom, delikatnom, crvenkastom granularnošću.Monocita je normalno 6-8%.

Povećani nivo leukocita u krvi naziva se leukocitoza, a sniženi leukopenija.

Bojenje i brojanje retikulocita

Retikulociti su mlada crvena krvna zrnca s tankom plavom retinom ili granularnošću u citoplazmi. Ove ćelije karakterišu aktivnost crvene hematopoeze.Za određivanje broja retikulocita koristi se metoda supravitalnog (intravitalnog) bojenja. Na stakalcima se u apsolutnom alkoholu prave mrlje briljantne krezil plave boje, a zatim se na uobičajeni način na staklo premazano bojom napravi bris krvi i stavlja u vlažnu komoru na 3-5 minuta, nakon čega se osuši i mikroskopirano sa imersionom sočivom. Normalno ima 8-10 retikulocita na 1000 crvenih krvnih zrnaca, njihov broj se obično izražava u procentima (0,8-1%) ili u ppm (8-10% o) u odnosu na crvena krvna zrnca.Retikulociti su ćelije koje karakterišu povećana proizvodnja crvenih krvnih zrnaca u koštanoj srži.

Pojavljuju se u velikom procentu u perifernoj krvi kod hipohromne anemije („perniciozna anemija“), kod hemolitičke anemije i drugih bolesti. Smanjen sadržaj retikulocita i njihov potpuni nestanak u perifernoj krvi uočeni su tijekom egzacerbacije hiperhromne anemije.

Da bi se spriječilo agregiranje (sljepljivanje) krvnih pločica, vrši se punkcija kože kroz kap 14% otopine magnezijum sulfata nanesenu na prst. Krv se pomeša sa magnezijumom i na stakalcima se pripremaju tanki razmazi koji se zatim fiksiraju i boje po Romanovskom 2 sata.Određuje se broj krvnih pločica na 1000 crvenih krvnih zrnaca, a znajući broj crvenih krvnih zrnaca u 1 μl izračunava se broj trombocita u 1 μl krvi. Normalan broj trombocita se kreće od 250.000 do 400.000.

Određivanje ESR

Brzina sedimentacije eritrocita određuje se u krvi pomiješanoj u omjeru 4:1 sa natrijum citratom.Reakcija se izvodi u aparatu Panchenkov. Pančenkovljeva kapilara se ispere natrijum citratom, zatim se citrat dovede do oznake 50, gde se upiše slovo P (reagens) i uduva u Vidalevovu epruvetu. Koristeći istu kapilaru, dva puta se uzima krv do oznake K (krv) i miješa se sa citratom. Ista kapilara se napuni krvlju pomiješanom s citratom do odjeljka 0 i stavi okomito u stativ na sat vremena. Nakon sat vremena, veličina kolone plazme koja se formira iznad staloženih eritrocita se beleži u milimetrima, što je mera brzine sedimentacije eritrocita.Normalno ESR kod muškaraca iznosi 10 mm/h, kod žena - 14 mm/h.

Brzina sedimentacije eritrocita se povećava kod upalnih, akutnih i hroničnih bolesti, kod malignih tumora i drugih bolesti.

Test kompatibilnosti Rh faktora

U epruvetu bez citrata uzima se 2-3 ml krvi primaoca, nakon zgrušavanja krvi ugrušak se zaokruži staklenom šipkom i krv se centrifugira. Dvije kapi seruma iz ove epruvete nanose se na Petrijevu posudu, u nju se doda pola kapi donorske krvi, promiješa se i posuda se stavi u vodeno kupatilo (42-45°). Nakon 10 minuta, čaša se vadi i pregledava na svjetlu uz lagano ljuljanje. Pojava aglutinacije će ukazivati na neprihvatljivost transfuzije ove krvi.

… Određivanje broja retikulocita je važan pokazatelj funkcije koštane srži.

Retikulociti- to su mladi oblici eritrocita koji nastaju iz normoblasta nakon što su izgubili jezgro (nukleirani, nezreli eritrociti), čije sazrijevanje nastupa u roku od 24-48 sati nakon ispuštanja u perifernu krv iz koštane srži, a odražava regenerativnu sposobnost koštanu srž (tj. eritropoetska aktivnost koštane srži).

MORFOLOGIJA I KLINIČKI ZNAČAJ RETIKULOCITA

Retikulociti su obično veći od zrelih crvenih krvnih zrnaca. Citoplazma retikulocita sadrži bazofilnu mrežu (retikulum) u obliku malih zrnaca, pojedinačnih filamenata, glomerula itd., koji su agregirani ribozomi i mitohondriji.

Prema stepenu zrelosti, postoji 5 vrsta retikulocita:
(1) retikulociti koji imaju jezgro (eritronormoblasti), a njihova granularnost je locirana u obliku gustog ruba oko jezgra;
(2) retikulociti koji imaju zrnasto-mrežastu supstancu u obliku kuglice ili grudve;
(3) retikulociti, granulirani u obliku guste mreže;
(4) retikulociti, koji imaju zrnasto-mrežastu supstancu u obliku pojedinačnih niti;
(5) retikulociti koji sadrže pojedinačne granule.

Zapamti: normalno, prema G. A. Aleksejevu, skoro 80% retikulocita pripada grupama IV – V.

Normalno, periferna krv sadrži 0,2 - 1% retikulocita (“%” je sadržaj retikulocita od ukupnog broja crvenih krvnih zrnaca). Ovaj pokazatelj odražava mogućnost ulaska retikulocita u perifernu krv i njihovu daljnju transformaciju u zrele eritrocite (sazrevanje), kao varijanta norme, već u perifernoj krvi (u roku od nekoliko sati). ( ! ) U normalnoj eritropoezi, većina crvenih krvnih zrnaca prolazi kroz retikulocitni stadij u koštanoj srži.

Primjećuje se povećanje njihovih retikulocita u perifernoj krvi (retikulocitoza).:
s hemolitičkom anemijom (broj retikulocita može doseći 60% ili više (posebno snažno raste tijekom hemolitičke krize);
u slučaju akutnog gubitka krvi (kriza retikulocita nastaje 3-5 dana nakon gubitka krvi), uključujući povećanje retikulocita, što omogućava sumnju na skriveno krvarenje (na primjer, kod pacijenata s peptičkim ulkusom gastrointestinalnog trakta, tifusnom groznicom) ;
za malariju;
s policitemijom;
u liječenju gvožđem anemije usled nedostatka gvožđa (nekoliko dana (3 - 10) nakon početka antianemične terapije perniciozne anemije);
s akutnim nedostatkom kisika;
sa tumorskim metastazama u koštanu srž.

Treba zapamtiti da u slučaju povećanog razaranja eritrocita, udio retikulocita može premašiti 50% zbog umjetnog povećanja broja retikulocita (kao što je ranije navedeno, udio retikulocita se računa kao postotak svih eritrocita). U takvim slučajevima, za procjenu težine anemije, koristi se “retikularni indeks” koji se izračunava po formuli: (% retikulocita x hematokrit) / 45 x 1,85, gdje je 45 normalni hematokrit, 1,85 je broj dana potrebno da novi retikulociti uđu u krv. Ako index< 2 – говорит о гипопролиферативном компоненте анемии, если >2-3, tada dolazi do povećanja stvaranja crvenih krvnih zrnaca.

Prava retikulocitoza: povećanje broja retikulocita u perifernoj krvi uz istovremeno povećanje broja retikulocita u koštanoj srži.

Lažna retikulocitoza: izostanak povećanog broja retikulocita u koštanoj srži uz povećanje njihovog broja u perifernoj krvi (što ukazuje na pojačano ispiranje retikulocita iz koštane srži u perifernu krv).

Faktor koji dovodi do povećanja % vrijednosti retikulocita može biti upotreba sljedećih lijekova: kortikotropin, lijekovi protiv malarije, antipiretici, furazolidon (kod male djece), levodopa.

Zapamti: retikulocitoza, bez odgovarajuće eritronormoblastne reakcije koštane srži, uočava se kada su određena područja iritirana metastazama raka ili upalnim žarištima.

Uočeno je smanjenje broja ili izostanak retikulocita (retikulocitopenija):
za aregenerativnu aplastičnu i hipoplastičnu anemiju;
za anemiju uzrokovanu nedostatkom gvožđa, vitamina B12, folne kiseline (mikrocitno-hipohromna i megaloblastna anemija);
sa talasemijom;
sa sideroblastičnom anemijom;
s metastazama raka u kosti;
za zračenje i terapiju zračenjem;
kada se liječi citostaticima;
za autoimune bolesti hematopoetskog sistema;
za bolesti bubrega;
sa alkoholizmom;
s relapsom Addison-Biermerove anemije;
sa miksedemom.

Faktori koji iskrivljuju rezultat laboratorijskog ispitivanja % sadržaja retikulocita:
nepravilan izbor antikoagulansa ili nedovoljno miješanje krvi sa antikoagulansom;
produženo stiskanje ruke podvezom;
uzimanje sulfonamida (mogući su i podcijenjeni i precijenjeni rezultati);
transfuzija krvi neposredno prije studije;
hemoliza uzorka krvi.

Indikacije za propisivanje retikulocitnog testa:
procjena aktivnosti eritropoeze u stanjima praćenim hemolizom ili gubitkom krvi;
procjenu sposobnosti koštane srži da se regenerira nakon citotoksične terapije i transplantacije koštane srži;
vrijednost obnavljanja sinteze eritropoetina nakon transplantacije bubrega;
doping kontrola za sportiste (uzimanje eritropoetina);
dijagnoza neučinkovite hematopoeze ili smanjene proizvodnje crvenih krvnih stanica;
diferencijalna dijagnoza anemije;
otkrivanje narušenog regenerativnog kapaciteta koštane srži zbog nedostatka gvožđa, vitamina B12, B6, folata, bakra i praćenje odgovarajuće terapije;
procjena odgovora na terapiju eritropoetinom i eritrosupresorima.

METODE ZA BROJANJE RETIKULOCITA

(1) Brojanje broja retikulocita u brisu nakon bojenja posebnim bojama.

Brojanje se vrši mikroskopom: razmazi pripremljeni jednom od gore navedenih metoda se mikroskopski pregledaju imerzionim sočivom; u razmazu su retikulociti i eritrociti obojeni žućkasto-zelenkasto, zrnasto-filamentozna tvar u retikulocitima je plava (kada je obojena azurom II i briljantnom kresil plavom) ili plavkasto-ljubičastom (kada je obojena azurom I).

(2) Broj retikulocita pomoću fluorescentne mikroskopije.

(3) Automatsko brojanje retikulocita pomoću hematološkog analizatora.

Treba napomenuti da pored klasičnog parametra retikulocita - relativnog (%) sadržaja retikulocita (RET%, procenat retikulocita), utvrđenog metodom 1 i 2 laboratorijske dijagnostike, u vezi sa pojavom visokotehnoloških hematološkim analizatorima (metoda 3) postalo je moguće dobiti (na primjer, pomoću patentirane fluorescentne boje za Sysmex-XT-2000i analizator) dodatne informativne parametre retikulocita:
retikulociti sa niskim sadržajem RNK, najzreliji (LFR%, frakcije retikulocita niske fluorescencije, frakcija retikulocita sa niskom fluorescencijom);
retikulociti sa prosječnim sadržajem RNK(MFR%, frakcije retikulocita srednje fluorescencije) - frakcija retikulocita sa prosječnom fluorescencijom);
retikulociti sa visokim sadržajem RNK(HFR%, frakcije retikulocita visoke fluorescencije) - frakcija retikulocita sa visokom fluorescencijom);
nezrela frakcija retikulocita(IRF%, frakcija nezrelih retikulocita).

Diferencijacija retikulocita, na osnovu stepena zrelosti i, shodno tome, sadržaja nukleinskih kiselina, odraz je hematopoetske aktivnosti koštane srži.

Retikulociti su pokazatelj broja ćelija, prekursora crvenih krvnih zrnaca, formiranih u koštanoj srži. Retikulociti - mlada crvena krvna zrnca odražavaju regenerativnu sposobnost koštane srži. Brojanje retikulocita se koristi za procjenu intenziteta hematopoeze. Studija se provodi kod: smanjenja broja crvenih krvnih zrnaca, sumnje na hemolizu, procjene eritropoeze, u liječenju anemije suplementima željeza i vitaminom B 12, eritropoetinom.

Retikulociti su anukleatna, nezrela crvena krvna zrnca, čije sazrijevanje nastupa u roku od 24-48 sati nakon ispuštanja u perifernu krv iz koštane srži. Broj formiranih retikulocita odražava eritropoetsku aktivnost koštane srži. Drugim riječima, sadržaj retikulocita odražava brzinu formiranja crvenih krvnih zrnaca i služi kao indikator odgovora koštane srži na anemiju.

Pored općeprihvaćenih parametara retikulocita - apsolutnog i relativnog (%) sadržaja retikulocita, pojava novih hematoloških analizatora (bojenje specijalnim bojama za nukleinske kiseline) omogućila je dobivanje dodatnih parametara retikulocita:

Retikulociti sa niskim sadržajem RNK, najzreliji (LFR%, frakcija retikulocita sa niskom fluorescencijom);
retikulociti sa prosečnim sadržajem RNK (MFR%, frakcija retikulocita sa prosečnom fluorescencijom);
retikulociti sa visokim sadržajem RNK (HFR%, frakcija retikulocita sa visokom fluorescencijom);
nezrela frakcija retikulocita (IRF%, frakcija nezrele retikulocita).

Diferencijacija retikulocita, na osnovu stepena zrelosti i, shodno tome, sadržaja nukleinskih kiselina, odraz je hematopoetske aktivnosti koštane srži.

Retikulociti su mlada crvena krvna zrnca nastala nakon što normoblasti izgube svoje jezgre.

Karakteristična karakteristika retikulocita je prisustvo zrnasto-mrežaste supstance, koja se pojavljuje sa supravitalnim bojenjem, odnosno bez preliminarne fiksacije ćelija.

Elektronski mikroskopski prikazano da granularno-retikularne strukture predstavljaju ostatke endoplazmatskog retikuluma, ribozoma i mitohondrija koji sadrže RNK. U retikulocitima se u maloj mjeri sintetiziraju protein (globin), hem, purini, pirimidinski nukleotidi, fosfatidi i lipidi, ali se u njima ne sintetizira RNK. 2 dana retikulocit ostaje u krvotoku, nakon čega, kako se RNK smanjuje, postaje zreli eritrocit.

U brisevima obojenim konvencionalnim hematološkim metodama, retikulociti su sivkasto-ružičaste boje – polihromatofilni, tj. farbane različitim bojama.

Metode brojanja retikulocita

Trenutno se koristi jedinstvena metoda za brojanje broja retikulocita nakon bojenja

briljantna kresil plava,
Azure I ili
Azure II direktno na staklu ili u epruveti.

1. Princip metode

Detekcija granularno-retikularne supstance eritrocita kada su obojeni alkalnim bojama uz njihovo daljnje brojanje u razmazu krvi.

2. Reagensi:

a) zasićeni rastvor briljantnog kresil plavog u apsolutnom alkoholu(za pripremu apsolutnog alkohola potrebno je natopiti 96% etanol u nekoliko izmjena praha kalciniranog bakar sulfata): 1,2 g boje na 100 ml alkohola;

b) azurno I rastvor: azur I - 1 g, amonijum oksalat - 0,4 g, natrijum hlorid - 0,8 g, etil alkohol 96% - 10 ml, destilovana voda - 90 ml. Rastvor boje u zatvorenoj boci stavlja se u termostat na 37 °C 2-3 dana i periodično snažno protrese. Zatim ohladite na sobnu temperaturu i filtrirajte kroz papirni filter. Otopina se čuva u posudi od tamnog stakla. Ako se pojavi talog, boju treba ponovo filtrirati;

c) Azur II rješenje: azur II - 1 g, natrijum citrat - 5 g, natrijum hlorid - 0,4 g, destilovana voda - 45 ml. Rastvor se ostavi u termostatu na 37 °C 2 dana uz povremeno miješanje. Da bi se ubrzalo otapanje, boja se može zagrijavati na laganoj vatri 15-20 minuta, bez dovođenja do ključanja. Ohladiti na sobnu temperaturu i filtrirati. Čuvati u posudama od tamnog stakla.

3. Bojanje

Bojenje na staklu:

dobro oprano i odmašćeno staklo zagreva se na plamenu plamenika. Koristeći staklenu šipku, nanesite kap jedne od boja na staklo i pripremite razmaz boje koristeći brušeno staklo. Steklografom označite stranu stakla na koju se nanosi potez boje. U ovom obliku staklo se može pripremiti za buduću upotrebu i čuvati na suhom, tamnom mjestu;
Na ovako pripremljeno staklo nanese se kap krvi, napravi se tanak razmaz i staklo se odmah stavi u vlažnu komoru. Da biste to učinili, koristite Petrijevu posudu s poklopcem, u koju se po rubovima stavljaju lagano navlažene rolne gaze ili pamuka;
Razmazi se drže u vlažnoj komori 3-5 minuta, a zatim se suše na vazduhu. Zrnasto-mrežasta tvar retikulocita obojena je ljubičasto-plavom bojom, jasno se ističe na zelenkasto-plavkastoj pozadini eritrocita.

In vitro bojenje:

metod 1: Prije upotrebe pripremiti radni rastvor briljantnog krezil plavog u epruveti na bazi kapi 1% rastvora kalijum oksalata i 4 kapi rastvora boje 1. U boju dodati 40 μl krvi (dve pipete do oznake 0,02). Smjesa se temeljno, ali lagano promiješa i ostavi 30 minuta. Promiješajte i pripremite tanke mrlje;
metod 2: U epruvetu se stavi 0,05 ml rastvora boje 3 i 0,2 ml krvi. Smjesa se dobro promiješa i ostavi 20-30 minuta. Promiješajte i pripremite tanke mrlje;
metod 3: 0,3-0,5 ml otopine boje 2 i 5-6 kapi krvi stavlja se u epruvetu pomoću pipete iz aparata Panchenkov. Epruveta se zatvori gumenim čepom, smjesa se temeljito, ali pažljivo promiješa i ostavi 1-1½ sata (retikulociti se bolje boje uz izlaganje od 1½-3 sata). Promešati i pripremiti tanke mrlje.

4. Broj retikulocita

U razmazima crvena krvna zrnca su obojena žućkasto-zelenkasto, zrnasto-filamentozna tvar je plava ili plavkasto-ljubičasta.

Razmazi pripremljeni jednom od gore navedenih metoda se pregledavaju mikroskopski sa imersionom sočivom;
potrebno je izbrojati najmanje 1000 crvenih krvnih zrnaca i među njima zabilježiti broj crvenih krvnih stanica koje sadrže zrnasto-filamentoznu supstancu. Za ujednačene tanke razmaze u kojima se crvena krvna zrnca nalaze u jednom redu, odaberite vidno polje u kojem se nalazi, na primjer, 50 crvenih krvnih zrnaca, a zatim izračunajte 20 takvih vidnih polja;
U praksi, za veću preciznost, koriste poseban okular, u kojem se vidno polje može smanjiti na potrebnu veličinu. Ako nemate gotov okular, možete ga lako pripremiti tako da odvrnete okular ×7, u njega stavite komad papira sa izrezanim kvadratom i zašrafite ga. Broj izbrojanih retikulocita izražava se na 1000 ili na 100 crvenih krvnih zrnaca.

Kvantitativni sadržaj retikulocita

NORMALNO: 0,5–1,2% (30–70 × 10 9 /l)

Povećanje broja retikulocita se opaža kod:

gubitak krvi (posebno akutni);
hemolitička anemija, posebno tokom krize (do 20-30%);
na pozadini liječenja megaloblastične anemije vitaminom B12 (retikulocitna kriza - povećanje broja retikulocita 4-8 dana liječenja).

Smanjenje broja retikulocita je karakteristično za:

aplastična i hipoplastična anemija;
neliječena megaloblastna anemija;
radijaciona bolest;
uzimanje citostatika.