Punkcija regionalnih limfnih čvorova
Koža iznad limfnih čvorova tretira se 96% alkohola i 3-5% alkoholnog rastvora joda. Zatim 1. i 2. prstom lijeve ruke popravite limfni čvor. Desnom rukom uzmite sterilnu špricu s nekoliko kapi izotonične otopine natrijum hlorida, koja se ubrizgava paralelno sa uzdužnom osi limfnog čvora. Igla se gura u različitim smjerovima do suprotnog zida kapsule čvora i sadržaj šprica se polako ubrizgava. Prstima lijeve ruke lagano se masira limfni čvor. Kada se igla polako izvlači, istovremeno se izvlači klip šprica, aspirirajući sadržaj limfnog čvora. Materijal se nanosi na predmetno staklo (ako je količina materijala mala, dodaje se kap izotonične otopine natrijum hlorida) i prekriva se pokrovnim stakalcem. Proučavanje nativnog lijeka provodi se u tamnom vidnom polju pomoću svjetlosno-optičkog mikroskopa sa kondenzatorom tamnog polja (40, 7x, 10x ili 15x objektiv). Treponema pallidum se takođe može naći u preparatima u boji. Kada se boje prema Romanovsky-Giemsi, blijede treponeme su obojene ružičasto, prema Fontanu i Morozovu - smeđe (crne), prema Burri metodi, neobojena treponema se otkriva na tamnoj pozadini.Serološka dijagnoza
Standardne (klasične) i specifične serološke reakcije su od velikog značaja u dijagnostici sifilisa, proceni efikasnosti lečenja, utvrđivanju kriterijuma izlečenja i identifikaciji latentnih, rezistentnih oblika. Standardne ili klasične serološke reakcije (SSR) uključuju:- Wassermanova reakcija (WR),
- sedimentne reakcije Kahna i Sachs-Vitebskog (citoholne),
- reakcija na staklu (ekspresna metoda),
- treponema pallidum reakcija imobilizacije (treponema pallidum reakcija),
- imunofluorescentna reakcija (RIF).
Wassermanova reakcija (WR)
- razvio A. Wasserman zajedno sa A. Neisserom i C. Bruckom 1906. godine. Wassermanova reakcija se zasniva na fenomenu fiksacije komplementa (Bordet-Gengou reakcija) i omogućava određivanje antilipidnih antitijela (reagina). Prema modernim konceptima, Wassermanova reakcija otkriva antitijela na lipide makroorganizma, a ne Treponema pallidum, a reakcija otkriva autoimuni proces koji je uzrokovan denaturacijom tkiva makroorganizma Treponema pallidum sa stvaranjem lipoproteinskog kompleksa ( konjugat), u kojem su lipidi (hapteni) determinanta.RV se obično dijagnosticira sa dva ili tri antigena. Najčešće korišteni su visoko osjetljivi kardiolipin antigen (ekstrakt goveđeg srca obogaćen kolesterolom i lecitinom) i treponemski antigen (sonicirana suspenzija anatogenih kultiviranih treponemes pallidum). Zajedno sa serumskim reaginima pacijenta, ovi antigeni formiraju imuni kompleks sposoban da adsorbuje i veže komplement. Za vizualno određivanje formiranog kompleksa (reagini + antigen + komplement), kao indikator se koristi hemolitički sistem (mješavina ovčijih eritrocita sa hemolitičkim serumom). Ako je komplement vezan u fazi 1 reakcije (reagini + antigen + komplement), hemoliza ne nastaje - crvena krvna zrnca precipitiraju u lako uočljiv precipitat (PB pozitivan). Ako u fazi 1 komplement nije vezan zbog odsustva reagina u test serumu, koristit će ga hemolitički sistem i doći će do hemolize (RT negativan). Stepen ozbiljnosti hemolize pri postavljanju RV ocjenjuje se plusovima: potpuno odsustvo hemolize ++++ ili 4+ (RV je oštro pozitivan); jedva započeta hemoliza +++ ili 3+ (RV pozitivan); značajna hemoliza ++ ili 2+ (RV slabo pozitivan); nejasna slika hemolize ± (RV je sumnjiv); potpuna hemoliza - (negativna Wassermannova reakcija).
Pored kvalitativne procjene PB, postoji i kvantitativna procjena s različitim razrjeđenjima seruma (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Titar reagina je određen maksimalnim razrjeđenjem koje još uvijek daje oštro pozitivan (4+) rezultat. Kvantitativno stadijum RV je važan u dijagnostici nekih kliničkih oblika sifilitičke infekcije, kao i u praćenju efikasnosti lečenja. Trenutno se Wassermanova reakcija izvodi sa dva antigena (kardiolipin i treponemski glasni Reiter soj). U pravilu, RV postaje pozitivna 5-6 sedmica nakon infekcije kod 25-60% pacijenata, 7-8 sedmica - 75-96%, 9-19 sedmica - 100%, iako posljednjih godina ponekad i ranije ili kasnije . Istovremeno, titar reagina se postepeno povećava i dostiže maksimalnu vrijednost (1:160-1:320 i više) u slučaju generaliziranih osipa (sekundarni svježi sifilis). Kada je RV pozitivan, postavlja se dijagnoza primarnog seropozitivnog sifilisa.
Sa sekundarnim svježim i sekundarnog rekurentnog sifilisa, RV je pozitivan kod 100% pacijenata, ali kod osiromašenih pacijenata sa oslabljenim imunitetom može se uočiti negativan rezultat. Potom se titar reagina postepeno smanjuje i u slučaju sekundarnog rekurentnog sifilisa obično ne prelazi 1:80-1:120.
Za tercijarni sifilis RV je pozitivan kod 65-70% pacijenata i obično se opaža nizak titar reagina (1:20-1:40). Kod kasnih oblika sifilisa (sifilis unutrašnjih organa, nervnog sistema) pozitivan RV se uočava u 50-80% slučajeva. Titar reagina se kreće od 1:5 do 1:320.
Za latentni sifilis pozitivan RV je uočen kod 100% pacijenata. Titar reagina je od 1:80 do 1:640, a kod kasnog latentnog sifilisa od 1:10 do 1:20. Brzo smanjenje titra reagina (do potpune negativnosti) tokom liječenja ukazuje na učinkovitost liječenja.
Nedostaci Wassermanove reakcije- nedovoljna osjetljivost (negativna u početnoj fazi primarnog sifilisa). Negativan je i kod 1/3 pacijenata ako su u prošlosti liječeni antibioticima, kod pacijenata sa tercijarnim aktivnim sifilisom sa lezijama kože i sluzokože, osteoartikularnog aparata, unutrašnjih organa, centralnog nervnog sistema i sa kasnim kongenitalnim sifilis.
Nedostatak specifičnosti- Wassermanova reakcija može biti pozitivna kod osoba koje ranije nisu imale i nemaju sifilis. Konkretno, lažno pozitivni (nespecifični) rezultati RV uočeni su kod pacijenata koji boluju od sistemskog eritematoznog lupusa, lepre, malarije, malignih neoplazmi, oštećenja jetre, opsežnog infarkta miokarda i drugih bolesti, a ponekad i kod potpuno zdravih osoba.
Otkrivena je kratkotrajna lažno pozitivna Wassermanova reakcija kod nekih žena prije ili poslije porođaja, kod narkomana, nakon anestezije ili pijenja alkohola. Po pravilu, lažno pozitivna RV je slabo izražena, često sa niskim titrom reagina (1:5-1:20), pozitivnim (3+) ili slabo pozitivnim (2+). Tokom masovnih seroloških pregleda, učestalost lažno pozitivnih rezultata je 0,1-0,15%. Za prevazilaženje nedovoljne osjetljivosti koriste se hladni test (Kolyar reakcija) i istovremeno se radi sa drugim serološkim reakcijama.
Sedimentne reakcije Kahna i Sachs-Vitebskog
Wassermanova reakcija se koristi u kombinaciji s dvije sedimentne reakcije (Kahn i Sachs-Vitebsky), kada se stadiju, pripremaju se koncentrisaniji antigeni. Ekspresna metoda (mikroreakcija na staklu) - odnosi se na lipidne reakcije i zasniva se na reakciji taloženja. Stavlja se sa specifičnim kardiolipinskim antigenom, čija se 1 kap pomiješa sa 2-3 kapi testnog krvnog seruma u jažice posebne staklene ploče.Prednost- brzina prijema odgovora (za 30-40 minuta). Rezultati se procjenjuju količinom taloženog sedimenta i veličinom pahuljica. Ekspresivnost se definiše kao CSR - 4+, 3+, 2+ i negativna. Treba napomenuti da se lažno pozitivni rezultati uočavaju češće nego kod RV. Ekspresna metoda se u pravilu koristi za masovne preglede na sifilis, za preglede u kliničko-dijagnostičkim laboratorijama, somatskim odjelima i bolnicama. Na osnovu rezultata ekspresne metode, zabranjena je dijagnoza sifilisa, isključena je njegova upotreba kod trudnica, donora, kao i za kontrolu nakon liječenja.
Treponema pallidum reakcija imobilizacije (TPI)
Treponema pallidum reakcija imobilizacije (TPI)- predložili su 1949. R. W. Nelson i M. Mayer. To je najspecifičniji dijagnostički test za sifilis. Međutim, složenost i visoka cijena proizvodnje ograničavaju njegovu upotrebu. U krvnom serumu pacijenata određuju se video-specifična antitijela (imobilizini) koja dovode do nepokretnosti Treponema pallidum u prisustvu komplementa. Antigen je živa patogena Treponema pallidum izolovana od zečeva zaraženih sifilisom. Pod mikroskopom se prebrojava izgubljena pokretljivost (imobilizirana) Treponema pallidum i procjenjuju se rezultati RIBT: imobilizacija Treponema pallidum od 51 do 100% je pozitivna; od 31 do 50% - slabo pozitivno; od 21 do 30% - sumnjivo; od 0 do 20% - negativno.RIBT je važan u diferencijalnoj dijagnozi za razlikovanje lažno pozitivnih seroloških reakcija od reakcija uzrokovanih sifilisom. Kasno postaje pozitivno od RV, RIF i samim tim ne koristi se za dijagnosticiranje infektivnih oblika sifilisa, iako je u sekundarnom periodu sifilisa pozitivan kod 85-100% bolesnika.
U tercijarnom periodu sifilisa sa oštećenjem unutrašnjih organa, mišićno-koštanog sistema i nervnog sistema, RIBT je pozitivan u 98-100% slučajeva ( RV je često negativan).
Treba imati na umu da RIBT može biti lažno pozitivan ako test serum sadrži treponemocidne lijekove (penicilin, tetraciklin, makroliti, itd.), koji uzrokuju nespecifičnu imobilizaciju Treponema pallidum. U tu svrhu, krv se testira na RIBT ne ranije od 2 sedmice nakon prestanka uzimanja antibiotika i drugih lijekova.
RIBT se, kao i RIF, polako negativan tokom procesa liječenja, tako da se ne koristi kao kontrola tokom procesa liječenja.
Reakcija imunofluorescencije (RIF)
Reakcija imunofluorescencije (RIF)- razvijen 1954. od strane A.Coonsa i prvi put korišten za dijagnozu sifilitičke infekcije od strane Deacona, Falconea, Harrisa 1957. godine. RIF se zasniva na indirektnoj metodi za određivanje fluorescentnih antitijela. Antigen za proizvodnju je tkivno patogena Treponema pallidum fiksirana na staklenim predmetima, na koje se nanosi test serum. Ako test serum sadrži anti-treponemska antitijela povezana s IgM i IgG, ona se snažno vezuju za antigen - treponemu, što se detektuje u fluorescentnom mikroskopu korištenjem anti-species ("anti-humanog") fluorescentnog seruma.RIF rezultati uzimaju se u obzir intenzitetom sjaja blijede treponeme u preparatu (žuto-zeleni sjaj). U nedostatku antitreponemskih antitijela u serumu, treponema pallidum se ne otkriva. U prisustvu antitijela, otkriva se sjaj blijede treponeme, čiji je stupanj izražen u plusu: 0 i 1+ - negativna reakcija; od 2+ do 4+ - pozitivno.
RIF se odnosi na grupne treponemske reakcije i primjenjuje se u 10- i 200-strukom razrjeđenju test seruma (RIF-10 i RIF-200). RIF-10 se smatra osjetljivijim, ali se često dobijaju nespecifični pozitivni rezultati nego sa RIF-200 (ima veću specifičnost). obično, RIF postaje pozitivan ranije od RV- pozitivan kod primarnog seronegativnog sifilisa kod 80% bolesnika, u 100% u sekundarnom periodu sifilisa, uvijek pozitivan kod latentnog sifilisa i u 95-100% slučajeva kod kasnih oblika i kongenitalnog sifilisa.
Specifičnost RIF-a povećava se nakon prethodnog tretmana test seruma sorbent-ultrazvučnim treponemskim antigenom, koji veže grupna antitijela (RIF - abs).
Indikacije za RIBT i RIF- dijagnoza latentnog sifilisa za potvrdu specifičnosti kompleksa lipidnih reakcija u slučaju sumnje na sifilitičnu infekciju na osnovu pozitivnog RV. Pozitivni RIBT i RIF dokaz su latentnog sifilisa. U slučaju lažno pozitivnih RV kod različitih bolesti (sistemski eritematozni lupus, maligne neoplazme itd.) i ako su ponovljeni rezultati RIBT i RIF negativni, to ukazuje na nespecifičnu prirodu RV. Sumnja na kasne sifilitičke lezije unutrašnjih organa, mišićno-koštanog sistema, nervnog sistema ako pacijenti imaju negativan RV. Sumnja na primarni seronegativni sifilis, kada se kod pacijenata s ponovljenim studijama iscjedaka s površine erozije (čira), punkcija iz uvećanih regionalnih limfnih čvorova, treponema pallidum ne otkrije - u ovom slučaju se daje samo RIF - 10.
Prilikom pregleda osoba sa negativnim RV koji su imali dugotrajne seksualne i kućne kontakte sa pacijentima sa sifilisom, uzimajući u obzir vjerovatnu mogućnost njihovog liječenja u nedavnoj prošlosti antisifiliticima koji su uzrokovali RV negativnost. Enzimski imunosorbentni test (ELISA - enzimski imunosorbentni test) - metoda koju su razvili E. Engvall et al., S. Avrames (1971). Suština se sastoji u kombiniranju sifilitičkog antigena sorbiranog na površini nosača čvrste faze s antitijelom iz krvnog seruma koji se proučava i identifikaciji specifičnog kompleksa antigen-antitijelo korištenjem enzimom označenog anti-species imunološkog krvnog seruma. Ovo vam omogućava da vizuelno procenite rezultate ELISA-e prema stepenu promene boje supstrata pod dejstvom enzima uključenog u konjugat. Nepouzdani rezultati ELISA mogu nastati kao rezultat nedovoljnog razblaženja sastojaka, kršenja temperaturnih i vremenskih uslova, nekonzistentnosti pH rastvora, kontaminacije laboratorijskog staklenog posuđa i nepravilne tehnike ispiranja medija.
Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA)
Predloženo kao dijagnostički test za sifilis od T.Rathlev (1965,1967), T.Tomizawa (1966). Makromodifikacija reakcije se zove TRHA, mikromodifikacija je MNA-TR, automatska verzija je AMNA-TR, reakcija sa poliurea makrokapsulama umjesto crvenih krvnih zrnaca je MSA-TR. Osetljivost i specifičnost RPGA su slične RIBT, RIF, ali RPGA ima manju osetljivost u ranim oblicima sifilisa u poređenju sa RIF-abs i veću osetljivost u kasnijim oblicima, kongenitalnom sifilisu. RPGA se isporučuje u kvalitativnoj i kvantitativnoj verziji.Tehnika uzimanja krvi za serološke testove
Za ispitivanje na RV, RIF, RIBT krv se uzima iz ulnarne vene na prazan želudac ili ne ranije od 4 sata nakon obroka pomoću sterilnog šprica ili jedne igle (gravitacijom). Na mjestu sakupljanja koža je prethodno tretirana 70% alkoholom. Špric i iglu treba oprati izotoničnim rastvorom natrijum hlorida. U čistu, suvu, hladnu epruvetu sipa se 5-7 ml test krvi. Na epruvetu se lijepi prazan komad papira s prezimenom, inicijalima, anamnezom ili brojem ambulantne kartice pacijenta i datumom uzimanja krvi. Nakon uzimanja krvi, epruveta se stavlja u frižider na temperaturu od +4°+8°C do sledećeg dana. Sljedećeg dana serum se cijedi radi testiranja. Ako se krv ne upotrebi narednog dana, serum se mora iscijediti iz ugruška i čuvati u frižideru ne duže od 1 nedelje. Za RIBT testiranje, epruveta mora biti posebno pripremljena i sterilna. U slučaju kršenja pravila za prikupljanje krvi za istraživanje, nepoštivanje uslova može dovesti do izobličenja rezultata.Ne preporučuje se vađenje krvi za analizu nakon jela, pijenja alkohola, uzimanja raznih lijekova, nakon primjene raznih vakcina ili tokom menstrualnog ciklusa kod žena.
Za istraživanje ekspresnom metodom, krv je uzeta sa vrha prsta, kao što se radi kod uzimanja za ESR, ali je krv uzeta iz 1 kapilare više. Ekspresna metoda se može izvesti i sa krvnim serumom dobijenim venepunkcijom. Ako postoji potreba za ispitivanjem krvi u udaljenim laboratorijama, umjesto krvi se može poslati suhi serum (metoda suhe kapi). Da biste to učinili, sljedeći dan nakon uzimanja krvi, serum se odvaja od ugruška i uvlači u sterilnu špricu u količini od 1 ml. Zatim se serum u obliku 2 odvojena kruga izlije na traku debelog papira za pisanje (voštani papir ili celofan) dimenzija 6x8 cm.Na slobodnom rubu je ispisano prezime, inicijali ispitanika i datum uzimanja krvi. papir. Papir sa serumom zaštititi od direktne sunčeve svjetlosti i ostaviti na sobnoj temperaturi do sljedećeg dana. Serum se suši u obliku malih krugova sjajnog žućkastog staklastog filma. Nakon toga, trake papira sa osušenim serumom smotaju se kao farmaceutski prah i šalju u laboratoriju sa naznakom dijagnoze i svrhe za koju se ispituje.
Serološka rezistencija
Kod nekih (2% ili više) pacijenata sa sifilisom, uprkos potpunoj antisifilitičkoj terapiji, dolazi do usporavanja (odsutnosti) negativnih seroloških reakcija nakon završetka liječenja do 12 mjeseci ili više. Javlja se takozvana serološka rezistencija, koja se posljednjih godina često uočava. Postoje oblici serološke rezistencije:- Istinito(apsolutno, bezuslovno) - potrebno je provesti dodatni antisifilitički tretman, u kombinaciji sa nespecifičnom terapijom za povećanje imunoloških snaga organizma.
- Relativno- nakon potpunog tretmana, treponema pallidums formira ciste ili L-forme, koji su u tijelu u niskovirulentnom stanju i kao rezultat toga dodatni tretman ne mijenja pokazatelje seroloških reakcija, posebno RIF i RIBT.
Pseudo-otpor- nakon tretmana, uprkos pozitivnim serološkim reakcijama, Treponema pallidum je odsutna u organizmu. U tijelu nema antigena, ali se nastavlja proizvodnja antitijela koja se otkrivaju tokom seroloških reakcija.
Serološka rezistencija se može razviti zbog:
- neadekvatan tretman bez uzimanja u obzir trajanja i stadijuma bolesti;
- nedovoljna doza, a posebno zbog neuzimanja u obzir tjelesne težine pacijenata;
- kršenje intervala između primjene lijeka;
- perzistencija treponema pallidum u organizmu uprkos potpunom specifičnom tretmanu, zbog njihove rezistencije na penicilin i druge hemoterapijske lekove u prisustvu skrivenih, incistiranih lezija u unutrašnjim organima, nervnom sistemu, limfnim čvorovima, koji su nedostupni antibakterijskim lekovima (treponema pallidum često se nalaze u ožiljnim tkivima mnogo godina nakon završetka terapije, u limfnim čvorovima je ponekad moguće otkriti treponema pallidum 3-5 godina nakon antisifilitičke terapije);
- smanjenje zaštitnih snaga kod raznih bolesti i intoksikacija (endokrinopatije, alkoholizam, narkomanija itd.);
- opšta iscrpljenost (jedenje hrane siromašne vitaminima, proteinima, mastima).
- popratne nespecifične bolesti unutrašnjih organa, poremećaji kardiovaskularnog sistema, reumatizam, disfunkcija endokrinog i nervnog sistema, teške kronične dermatoze, maligne neoplazme;
- oštećenje nervnog sistema (teške povrede, potres mozga, mentalne traume);
- trudnoća; kronična intoksikacija alkoholom, nikotinom, drogama; zarazne bolesti (malarija, tuberkuloza, virusni hepatitis, dizenterija, tifus, tifus i povratna groznica).
Reakcija imunofluorescencije (RIF) je serološka reakcija koja omogućava otkrivanje antitijela na poznate antigene. Metoda uključuje mikroskopiju obojenih razmaza.
Ova reakcija se koristi u imunologiji, virusologiji i mikrobiologiji. Omogućava vam da odredite prisutnost virusa, bakterija, gljivica, protozoa i ICC. RIF se vrlo široko koristi u dijagnostičkoj praksi za detekciju virusnih i bakterijskih antigena u infektivnom materijalu. Metoda se zasniva na sposobnosti fluorohroma da se veže za proteine bez narušavanja njihove imunološke specifičnosti. Uglavnom se koristi u dijagnostici infekcija urinarnog trakta.
Postoje sljedeće metode za izvođenje reakcije imunofluorescencije: direktna, indirektna, s komplementom. Direktna metoda uključuje bojenje materijala fluorohromima. Zbog sposobnosti mikrobnih ili tkivnih antigena da svijetle u UV zracima fluorescentnog mikroskopa, oni se definiraju kao ćelije sa svijetlo obojenim zelenim rubom.
Indirektna metoda uključuje određivanje kompleksa antigen+antitijelo. Za to se eksperimentalni materijal tretira antitijelima iz antimikrobnog zečjeg seruma namijenjenog dijagnostici. Nakon što se antitijela vežu za mikrobe, oni se odvajaju od onih koji se nisu vezali i tretiraju serumom protiv zeca označenim fluorohromom. Nakon toga, ultraljubičastim mikroskopom se određuje kompleks mikroba + animikrobna antitijela + anti-zečja antitijela na isti način kao i direktnom metodom.
Imunofluorescentna reakcija je neophodna u dijagnostici sifilisa. Pod uticajem fluorohroma, uzročnik sifilisa se identifikuje kao ćelija sa žuto-zelenom granicom. Odsustvo luminiscencije znači da pacijent nije zaražen sifilisom. Ovaj test se često propisuje za pozitivnu Wassermanovu reakciju. Ova metoda je vrlo učinkovita u dijagnostici, jer vam omogućava da identifikujete patogen u ranim fazama bolesti.
Osim što RIF omogućava dijagnosticiranje sifilisa, koristi se i za određivanje prisutnosti patogena kao što su klamidija, mikoplazma, trihomonas, kao i uzročnici gonoreje i genitalnog herpesa.
Za analizu se koriste brisevi ili venska krv. Postupak uzimanja brisa je potpuno bezbolan i ne predstavlja nikakvu opasnost. Za ovu analizu potrebno je pripremiti se. Dvanaest sati prije ne preporučuje se korištenje higijenskih proizvoda kao što su malo ili gelovi. Također, ponekad se, prema indikacijama ljekara, vrši i provokacija. Da biste to učinili, preporučuje se konzumiranje začinjene hrane ili alkohola, ili ubrizgavanje provokativnih supstanci, poput gonovaccine ili pirogenala. Uz to, interval između uzimanja antibakterijskih lijekova i uzimanja testa mora biti najmanje četrnaest dana.
Prilikom procjene rezultata treba uzeti u obzir činjenicu da se luminiscencija ne opaža samo kod živih bakterija, već i kod mrtvih, a to se posebno odnosi na klamidiju. Nakon kursa antibiotika, mrtve ćelije klamidije takođe sijaju.
Uz pravilnu pripremu pacijenta i poštivanje tehnike uzimanja brisa, ova analiza vam omogućava da identifikujete bolesti u ranim fazama, što je vrlo važno za pravovremeno liječenje. Pozitivni aspekti ove metode su kratko vrijeme za dobijanje rezultata, lakoća implementacije i niska cijena analize.
Nedostaci uključuju činjenicu da je za provođenje analize potrebna prilično velika količina ispitnog materijala. Osim toga, samo iskusni stručnjak treba procijeniti rezultate.
Reakcija imunofluorescencije (RIF, Koons metoda) je brza dijagnostička metoda za identifikaciju mikrobnih antigena ili određivanje antitijela. RIF se zasniva na upotrebi fluorescein izotiocijanat¾ FITC ili drugi fluorohromi, hemijski povezani, konjugovani sa AT. U isto vrijeme, označeni Abs zadržavaju imunološku specifičnost i stupaju u interakciju sa strogo definiranim korpuskularnim Ag-ima.
Postoje dvije glavne vrste metoda: direktna i indirektna.
Direktna RIF metoda zasniva se na činjenici da su tkivni antigeni ili mikrobi tretirani specifičnim serumima sa antitelima obeleženim fluorohromima u stanju da svetle u UV zracima fluorescentnog mikroskopa. Bakterije u razmazu tretiranom takvim luminiscentnim serumom sijaju duž periferije ćelije u obliku zelene ili žute ivice.
Indirektna RNIF metoda sastoji se od identifikacije kompleksa antigen-antitijelo korištenjem seruma antiglobulina (anti-antitijela) označenog fluorohromom. Da bi se to postiglo, razmazi mikroba koji se proučavaju tretiraju se antitijelima iz antimikrobnog dijagnostičkog seruma kunića. Zatim se ispiru antitela koja nisu vezana mikrobnim antigenima, a preostala antitela na mikrobima se detektuju tretiranjem razmaza antiglobulinskim (anti-zečjim) serumom obeleženim fluorohromima. Kao rezultat, formira se kompleks mikroba + antimikrobna zečja antitijela + anti-zečja antitijela označena fluorohromom. Ovaj kompleks se posmatra u fluorescentnom mikroskopu, kao u direktnoj metodi.
Mehanizam, svrha enzimskog imunosorbentnog testa (ELISA), sastojci
ELISA u čvrstoj fazi je najčešća verzija ELISA-e, kada se jedna od komponenti imunološke reakcije (antigeni ili antitijela) sorbira na čvrstom nosaču, na primjer, u jamicama polistirenskih mikroploča (slika 27). Prilikom određivanja antitijela, u jažice mikropločica se uzastopno dodaju krvni serum pacijenta, antiglobulinski serum obilježen enzimom, supstrat za enzim (H 2 O 2 ili fosfatid) i hromogen (indikator koji boji produkt fermentacije). sorbovanih antigena. Svaki put nakon dodavanja druge komponente, nevezani reagensi se uklanjaju iz jažica temeljnim pranjem. Ako je rezultat pozitivan, boja otopine hromogena se mijenja. Čvrstofazni nosač može biti senzibiliziran ne samo antigenom, već i antitijelima. Zatim se u jažice sa sorbovanim antitelima dodaje željeni antigen, dodaje se imuni serum protiv antigena obeleženog enzimom, a zatim se dodaje supstrat za enzim i hromogen.
Rice. 27. Princip ELISA za detekciju antimikrobnih antitela
Mehanizam, sastojci radioimunog testa (RIA)
Radioimunotest (RIA)¾ visoko osjetljiva metoda zasnovana na reakciji antigen-antitijelo korištenjem antigena ili antitijela označenih radioizotopima (l25 J, 14 C, 3 H, 51 Cr, itd.). Nakon njihove interakcije, nastali radioaktivni imunološki kompleks se odvaja i njegova radioaktivnost se određuje u odgovarajućem brojaču (beta ili gama zračenje): intenzitet zračenja je direktno proporcionalan broju vezanih molekula antigena i antitijela. U verziji RIA u čvrstoj fazi, jedna od komponenti reakcije (antigen ili antitijela) se sorbira na čvrstom nosaču, na primjer, u bušotinama polistirenskih mikropanela. U drugoj verziji metode, kompetitivna RIA, željeni antigen i antigen označen radionuklidima se takmiče jedni s drugima u vezivanju ograničene količine antitijela imunog seruma. Ova opcija se koristi za određivanje količine antigena u test materijalu. RIA se koristi za identifikaciju mikrobnih antigena, određivanje hormona, enzima, lijekova i imunoglobulina, kao i drugih supstanci sadržanih u test materijalu u niskim koncentracijama od ¾ 10 -10 -10 -12 g/l.
Trenutno se široko koriste serološke reakcije (SR) u kojima su uključeni obilježeni antigeni ili antitijela. To uključuje imunofluorescentnu reakciju, radioimune i enzimske imunološke metode, imunobloting reakciju, protočnu citometriju i elektronsku mikroskopiju.
Primjenjuju se:
1) za serodijagnostiku zaraznih bolesti, odnosno za otkrivanje antitela korišćenjem seta poznatih konjugovanih (hemijski kombinovanih) antigena sa različitim oznakama (enzimi, fluorohromne boje);
2) određivanje mikroorganizma ili njegovog serovara pomoću standardno označenih dijagnostičkih antitijela (brza dijagnostika).
Dijagnostički serumi se pripremaju imunizacijom životinja odgovarajućim antigenom, zatim se izoluju imunoglobulini i konjugiraju sa svjetlećim bojama (fluorohromima), enzimima i radioizotopima.
Dijagnostička monoklonska antitijela se proizvode pomoću hibridnih stanica formiranih spajanjem imunog B limfocita sa ćelijom mijeloma. Hibridomi su sposobni da se brzo razmnožavaju in vitro u ćelijskoj kulturi i proizvode imunoglobulin karakterističan za uzete B-limfocite.
Označeni SR nisu inferiorni po specifičnosti u odnosu na druge SR, a po svojoj osjetljivosti su superiorniji od svih SR.
Reakcija imunofluorescencije (RIF)
Kao naljepnice koriste se svijetleće fluorohromne boje (fluorescein izotiocijanat, itd.).
Postoje različite modifikacije RIF-a. Za ekspresnu dijagnostiku zaraznih bolesti, Koons RIF se koristi za identifikaciju mikroba ili njihovih antigena u materijalu koji se proučava.
Postoje dvije metode RIF-a prema Koonsu: direktna i indirektna.
Direktne RIF komponente:
1) materijal za ispitivanje (stolica, nazofaringealni iscjedak i sl.);
2) označeni specifični imuni serum koji sadrži antitela na željeni antigen;
3) izotonični rastvor natrijum hlorida.
Razmaz sa test materijala tretira se označenim antiserumom.
Dolazi do AG-AT reakcije. Tokom luminiscentnog mikroskopskog pregleda detektuje se fluorescencija oznake u oblasti gde su AG-AT kompleksi lokalizovani (slika 34).
Komponente indirektni RIF namijenjen brzoj dijagnostici gripe A:
1) ispitani materijal se ispere iz nazofarinksa pacijenta sa sumnjom na influencu;
2) specifični antiserum sa antitelima protiv virusa influence A;
3) antiglobulinski serum (AT protiv imunoglobulina), obeležen fluorohromom;
4) izotonični rastvor natrijum hlorida.
Bris iz test materijala prvo se tretira imunim serumom na željeni antigen, a zatim obilježenim antiglobulinskim serumom.
Imuni kompleksi AG-AT - označeni AT se otkrivaju pomoću fluorescentnog mikroskopa.
Prednost indirektne metode je u tome što nema potrebe za pripremanjem širokog spektra fluorescentnih specifičnih seruma, već se koristi samo jedan fluorescentni antiglobulinski serum.
Za serološka dijagnoza gripe A, odnosno određivanje antitijela protiv virusa influence A u krvnom serumu korištenjem indirektni RIF koristiti influenza diagnosticum (antigen virusa influence A). Serodijagnostika virusnih infekcija uglavnom je retrospektivne prirode i koristi se za potvrdu dijagnoze i epidemiološke analize.
Enzimski imunosorbentni test (ELISA): kompetitivna metoda (određivanje HBs-AG virusa hepatitisa B) i indirektna metoda (serološka dijagnoza HIV infekcije)
Enzimski imunosorbentni test (ELISA)
Enzimi se koriste kao oznake: peroksidaza, alkalna fosfataza itd.
Pokazatelj reakcije je sposobnost enzima da izazovu reakciju boje kada djeluju na odgovarajući supstrat. Na primjer, supstrat za peroksidazu je otopina ortofenildiamina (OPD) ili tetrametilbenzidina (TMB).
Najviše se koriste ELISA u čvrstoj fazi (slika 35), indirektne i kompetitivne metode (slika 36).
Rezultati ELISA-e mogu se procijeniti vizualno i mjerenjem optičke gustine na spektrofotometru (ELISA analizator).
Prednosti ELISA-e uključuju:
Jednostavnost metoda procjene reakcija;
Stabilnost konjugata;
Lako podložan automatizaciji.
Sljedeći tipovi ELISA-e su dati kao primjeri:
A) takmičarski tip
Dizajniran za detekciju površinskog antigena virusa hepatitisa B (HBs Ag) u serumu i krvnoj plazmi za dijagnozu virusnog hepatitisa B i određivanje nosivosti HBs Ag.
Komponente:
1) materijal za ispitivanje – serum ili krvna plazma;
2) antitela na HBs Ag, adsorbovana na površini otvora polistirenske mikroploče;
3) konjugat – mišja monoklonska antitela na HBs Ag, obeležena peroksidazom;
4) ortofenilendiamin (OPD) – supstrat;
5) fosfatno-fiziološki pufer;
6) kontrolni serumi:
Pozitivan (serum sa HBs Ag);
Negativno (serum bez HBs Ag).
napredak:
2. Inkubacija 1 sat na 37°C.
3. Pranje rupa.
4. Dodatak konjugata.
5. Inkubacija 1 sat na 37°C.
6. Pranje rupa.
7. Ulazak u OFD. U prisustvu HBs Ag, rastvor u jamicama postaje žut.
8. ELISA brojanje se vrši pomoću optičke gustine pomoću fotometra. Stepen optičke gustine će biti obrnuto proporcionalan koncentraciji Ag HBs koji se proučava.
Reakcija se odvija u tri faze:
1. HBs Ag test seruma (plazma) se vezuje za homologna antitela adsorbovana na površini jažice. Formira se IR AG-AT. (HBs Ag – anti HBs AT).
2. Antitela na HBs Ag, obeležena peroksidazom, vezuju se za preostale slobodne determinante HBs Ag u AG-AT kompleksu. Formira se kompleks AT-AG obeleženog AT (anti HBs AT - HBs Ag - anti HBs AT obeležen peroksidazom).
3. OPD stupa u interakciju s peroksidazom AT-AG-AT kompleksa i javlja se žuta boja.
B) indirektni tip
To je glavna test reakcija za dijagnosticiranje HIV infekcije.
Svrha: Serološka dijagnostika HIV infekcije - detekcija antitela na antigene HIV-a.
Komponente:
1) materijal za ispitivanje – krvni serum (AT do HIV Ags);
2) sintetički peptidi koji imitiraju 2 HIV antigena: gp 120 i gp 41, adsorbovani na površini polistirenske bušotine;
3) antiglobulinski serum obeležen peroksidazom, dobijen imunizacijom zečeva humanim globulinima (AT do AT);
5) fiziološki rastvor fosfatnog pufera;
6) kontrolni serumi:
Pozitivno;
Negativno.
napredak:
1. Dodavanje kontrolnih i test seruma.
2. Inkubacija 30 minuta na 37°C.
3. Pranje.
4. Dodatak antiglobulinskog seruma označenog enzimom.
5. Inkubacija 30 minuta na 37°C.
6. Pranje.
7. Ulazak u OFD.
Reakcija se odvija u 3 faze:
1. Antitela na HIV test seruma vezuju se za homologne antigene (gp 120 i gp 41), a na površini sorbenta se formira IR AG-AT (HIV Ag - AT na HIV).
2. Formiranje IR AG-AT-AT, obeleženog peroksidazom, jer Antitela test seruma su antigeni za antiglobulinski serum.
3. OPD stupa u interakciju sa peroksidazom kompleksa AG-AT-AT i dolazi do žutog obojenja rastvora bunara. Stepen enzimske aktivnosti je direktno proporcionalan koncentraciji testiranih antitijela.
61. Reakcija imunofluorescencije. Mehanizam, komponente, primjena. Direktne i indirektne metode postavljanja.
Postoje tri glavne vrste metoda: direktna, indirektna (slika 13.10), sa dopunom. Koonsova reakcija je brza dijagnostička metoda za identifikaciju mikrobnih antigena ili određivanje antitijela.
Direktna RIF metoda zasniva se na činjenici da su antigeni tkiva ili mikrobi tretirani imunim serumima sa antitelima obeleženim fluorohromima u stanju da svetle u UV zracima fluorescentnog mikroskopa. Bakterije u razmazu tretiranom takvim luminiscentnim serumom svetle duž periferije ćelije u u obliku zelene granice.
Indirektna RIF metoda sastoji se od identifikacije kompleksa antigen-antitijelo korištenjem seruma antiglobulina (anti-antitijela) označenog fluorohromom. Da bi se to postiglo, razmazi iz suspenzije mikroba tretiraju se antitijelima iz antimikrobnog zečjeg dijagnostičkog seruma. Zatim se ispiru antitela koja nisu vezana mikrobnim antigenima, a preostala antitela na mikrobima se detektuju tretiranjem razmaza antiglobulinskim (anti-zečjim) serumom obeleženim fluorohromima. Kao rezultat, formira se kompleks mikroba + antimikrobna zečja antitijela + antizečja antitijela označena fluorohromom. Ovaj kompleks se posmatra u fluorescentnom mikroskopu, kao u direktnoj metodi.
Kao naljepnice koriste se svijetleće fluorohromne boje (fluorescein izotiocijanat, itd.).
Postoje različite modifikacije RIF-a. Za ekspresnu dijagnostiku zaraznih bolesti, Koons RIF se koristi za identifikaciju mikroba ili njihovih antigena u test materijalu.
Postoje dvije metode RIF-a prema Koonsu: direktna i indirektna.
Direktne RIF komponente:
1) materijal koji se ispituje (stolica iz nazofarinksa i sl.);
2) označeni specifični imuni serum koji sadrži AT-la na željeni antigen;
3) izotonični rastvor natrijum hlorida.
Razmaz sa test materijala tretira se označenim antiserumom.
Dolazi do AG-AT reakcije. Tokom luminiscentnog mikroskopskog pregleda detektuje se fluorescencija u području gdje su AG-AT kompleksi lokalizirani.
Komponente indirektnog RIF-a:
1) gradivo koje se proučava;
2) specifični antiserum;
3) antiglobulinski serum (AT-la protiv imunoglobulina), obeležen fluorihromom;
4) Izotonični rastvor natrijum hlorida.
Bris iz test materijala prvo se tretira imunim serumom na željeni antigen, a zatim obilježenim antiglobulinskim serumom.
Luminescentni AG-AT kompleksi - označeni AT se detektuju pomoću fluorescentnog mikroskopa.
Prednost indirektne metode je u tome što nema potrebe za pripremanjem širokog spektra fluorescentnih specifičnih seruma, već se koristi samo jedan fluorescentni antiglobulinski serum.
Postoji i 4-komponentni tip indirektnog RIF-a, kada se dodatno uvodi komplement (serum zamorca). U pozitivnoj reakciji nastaje kompleks AG-AT - označenog - AT-komplementa.