Interferoni: pojam, metode proizvodnje, primjena. Metoda za proizvodnju humanog imunog interferona Metode za proizvodnju interferona

Tema: Interferoni. Dobijanje interferona.

Interferoni su otkriveni 1957. godine na Nacionalnom institutu za zdravstvena istraživanja u Londonu kao faktori otpornosti na virusnu infekciju. Utvrđeno je da životinjske ćelije izložene virusu oslobađaju u okolinu faktor sposoban da pruži otpornost na virusnu infekciju zdravim ćelijama: činilo se da sprečava (ometa) proliferaciju virusa u ćeliji i zbog te sposobnosti je nazvan interferon. Postoje tri vrste interferona:

α, β, klasifikovan kao prva klasa, γ-interferon, klasifikovan kao druga klasa.

Interferon-α, koji proizvode leukociti, ima pretežno antivirusno, antiproliferativno i antitumorsko djelovanje.

Interferon-β, koji proizvode fibroblasti, ima pretežno antitumorsko i antivirusno djelovanje.

Interferon -γ - proizvode T limfociti i prirodne ćelije ubice (NΚ ćelije) i naziva se limfocitni i imuni. Ima pretežno imunomodulatorno i slabo antivirusno djelovanje.

Proizvodnju interferona klase I induciraju virusi, dvolančana RNK, sintetički dvolančani oligonukleotidi, proizvodnja interferona - γ - virusni i bakterijski antigeni ili antiserumi protiv površinskih determinanti limfocita. Antivirusno djelovanje interferona je zbog sposobnosti da u stanicama aktivira sintezu dva enzima - oligoadenilat sintetaze i protein kinaze, koji inhibiraju biosintezu proteina i reprodukciju virusa u inficiranoj stanici, što uzrokuje njenu lizu. Isti je mehanizam antiproliferativnog antitumorskog dejstva interferona.

Interferon-γ je multifunkcionalni imunomodulatorni limfokin koji utječe na rast i diferencijaciju različitih tipova stanica. Aktivira makrofage u fazi prijenosa antigenske informacije do limfocita, povećava njihovu antimikrobnu i antitumorsko djelovanje, te proizvodnju IL-1. IF-γ aktivira prirodne ćelije ubice, citotoksične limfocite koji suzbijaju rast tumora.

Interferoni-α su proteini, a β i γ - interferoni - su glikoproteini, tipični su globularni proteini. U α-interferonima su pronađene dvije disulfidne veze. Interferoni su proteini male molekularne težine od 146-166 aminokiselinskih ostataka, specifični za vrstu, tj. Ljudski interferon je biološki aktivan u ljudskom tijelu, mišji interferon je biološki aktivan samo u tijelu miša.

Najviše proučavani interferoni uključuju α-interferone; broj gena koji ih kodiraju je otprilike 20; lokalizirani su na 9. kromosomu. Što se tiče β-interferona, izolovan je samo jedan protein koji odgovara humanom β-interferonu - interferon β 1 - njemu odgovara gotovo sva antivirusna aktivnost. Moguće je da u genomu postoji određeni broj gena koji kodiraju različite β-interferone. Geni β-interferona su lokalizirani na hromozomu 9. Interferon-γ je predstavljen samo jednim pojedinačnim proteinom, koji je kodiran jednim genom koji se nalazi na 12. hromozomu.

Dobijanje interferona. Interferoni su jedan od najefikasnijih tretmana za virusne infekcije, ali su specifični za vrstu i mogu se dobiti samo iz ljudskih ćelija. Tehnologija izolacije i prečišćavanja interferona je neefikasna, prvenstveno zbog izuzetno niskog prinosa konačnog proizvoda (iz 1 litre krvi može se izdvojiti samo 1 μg interferona, odnosno otprilike jedna doza za injekciju).

U sadašnjoj fazi, metoda koja najviše obećava je biosinteza interferona pomoću genetski modificiranih mikroorganizama. Reverzno transkribovane cDNK su klonirane u E. coli. Gen za interferon je ubačen u vektorsku DNK, a na njega su pričvršćeni regulatorni elementi bakterije, programirajući njegovu transkripciju i translaciju u bakterijskoj ćeliji. Prvo, interferoni u ćeliji se sintetiziraju u obliku prekursora koji sadrže signalni peptid na N-kraju polipeptidnog lanca, koji se zatim odcjepljuje, što rezultira stvaranjem zrelog interferona, koji ima punu biološku aktivnost. Bakterije ne sadrže enzime koji bi mogli odcijepiti signalni peptid i formirati zreli protein. Stoga, da bi bakterije sintetizirale zreli interferon, u plazmid treba uvesti samo dio gena koji ga kodira i ukloniti dio gena koji kodira signalni peptid. Ovaj postupak je izveden na sljedeći način. Gen za interferon sadrži tri mjesta cijepanja sa restrikcijskim enzimom Sau 3A1, od kojih se jedno nalazi pored signalnog dijela. Nepotpuno cijepanje gena ovim enzimom omogućava izolaciju genskog fragmenta koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira zreli interferon, ali bez prvog cisteina. ATG triplet koji kodira cistein cijepa enzim zajedno sa signalnim dijelom. Da bi se obnovila polinukleotidna sekvenca kompletnog gena, hemijski je sintetizovan mali fragment DNK koji sadrži ovaj triplet, kao i susedni ATG triplet, početnu tačku sinteze proteina. Ovaj fragment je vezan za izolovani dio zrelog gena, i kao rezultat, kompletan zreli gen za interferon je obnovljen. Rekonstruisani gen je uveden u plazmid na način da se pored njega nalazi region promotora DNK, koji obezbeđuje početak sinteze mRNA. Ekstrakti iz E. coli koji sadrže takav plazmid imali su antivirusno djelovanje. Interferon sintetiziran genetskim inženjeringom izolovan je, pročišćen, a njegova fizičko-hemijska svojstva su se pokazala sličnima interferonu dobivenom iz krvi donora. Bilo je moguće dobiti bakterije sposobne sintetizirati do 5 mg interferona po 1 litri bakterijske suspenzije koja sadrži približno 1011 bakterijskih stanica, što je 5000 puta više od količine interferona koja se može ekstrahirati iz 1 litre krvi donora.

Koristeći tehnologije genetskog inženjeringa u različitim laboratorijama, dobijeni su sojevi bakterija koje proizvode različite interferone: α-, β- i γ-tipove. Nedostatak upotrebe E.coli za proizvodnju β- i γ-interferona je nepostojanje aparata za glikolizu eukariotskih proteina u bakteriji, što dovodi do sinteze ne-glikoliziranih molekula. I premda je uloga glikolize nejasna i neglikolizirani β- i γ-interferoni gotovo u potpunosti zadržavaju antivirusno djelovanje, ova karakteristika diktira oprezan pristup upotrebi genetski modificiranih lijekova u medicinskoj praksi.

Trenutno su geni interferona klonirani u kvasac i ćelije viših eukariota sposobne za glikolizu. Godine 1981. u SAD-u su po prvi put korištene genetski modificirane stanice kvasca Saccharomyces cerevisiae za sintezu humanog leukocitnog interferona. Rezultirajuća efikasna ekspresija LeIF gena i zamjena bakterija stanicama kvasca omogućila je povećanje proizvodnje interferona za 10 puta.

Interferoni se proizvode kao lijekovi u obliku kapi za nos, masti i otopina za injekcije. Postoje prirodni interferoni dobijeni iz limfocita krvi donora i umjetno sintetizirani korištenjem tehnologija genetskog inženjeringa (rekombinantno). Trenutno se u Rusiji i inostranstvu proizvode komercijalni lekovi - ljudski leukociti, limfoblasti (Velferon) i fibroblasti (Feron), kao i interferoni dobijeni metodama genetskog inženjeringa: rekombinantni α-interferon (Roferon, Realderon itd.), β-interferon i γ-interferon (Gammaferon).

Pošaljite svoj dobar rad u bazu znanja je jednostavno. Koristite obrazac ispod

Studenti, postdiplomci, mladi naučnici koji koriste bazu znanja u svom studiranju i radu biće vam veoma zahvalni.

Objavljeno na http://www.allbest.ru/

Uvod

1 Klasifikacija interferona

2 Metode za dobijanje interferona

2.1. Proizvodnja infekcijom ljudskih leukocita

2.2 Dobivanje interferona genetskim inženjeringom

3. Mehanizmi djelovanja interferona

4. Terapeutska upotreba humanog interferona

Zaključak

Spisak korišćene literature

Uvod

Godine 1957., Nacionalni institut za medicinska istraživanja u Londonu otkrio je da ljudske i životinjske ćelije izložene virusu luče supstance koje netaknute ćelije čine otpornim na virusnu infekciju. Čini se da sprječavaju (ometaju) reprodukciju virusa u ćeliji i stoga su nazvani interferoni. Interferoni pomažu našem tijelu u borbi protiv mnogih virusnih bolesti.

Preparati na bazi različitih vrsta interferona koriste se kao imunomodulatori za normalizaciju i jačanje imunološkog sistema, uključujući i liječenje raznih teških bolesti – akutnog virusnog hepatitisa, multiple skleroze, osteosarkoma, mijeloma i nekih vrsta limfoma.

Interferoni su proteinski molekuli s molekulskom težinom od 15.000 do 21.000 daltona koje proizvode i luče stanice kao odgovor na virusnu infekciju ili druge patogene.

Interferoni (IFN) su grupa autogenih glikoproteina čiji je biomehanizam djelovanja povezan s istovremenim antivirusnim djelovanjem - aktivacijom ćelijskih gena, uslijed čega se sintetiziraju proteini koji inhibiraju sintezu virusne DNK (RNA) i imaju imunomodulatorno djelovanje - sposobnost da se pojača ekspresija antigena na ćelijskim membranama i poveća aktivnost citotoksičnih T stanica i prirodnih stanica ubojica.

1. TOklasifikacija interferona

Ovisno o vrsti stanica koje proizvode, svi interferoni se mogu podijeliti na:

* b-interferoni.

* β-interferoni.

* g-interferoni.

Prema načinu proizvodnje interferoni se dijele na:

1. Prirodni, dobijeni iz kulture ljudskih ćelija leukocita stimuliranih virusima:

b-interferon, b-interferon, interferon-b Nl;

2. Rekombinantna, koju proizvode bakterije s integriranim interferonskim genom u njihov genom:

Interferon-b2A, interferon-b2B, interferon-blb.

Interferon - b proizvode leukociti, a naziva se leukocit; β-interferon se naziva fibroblastnim, jer ga sintetiziraju fibroblasti - ćelije vezivnog tkiva, a g-interferon se naziva imunim, jer ga proizvode aktivirani T-limfociti, makrofagi, prirodne ćelije ubice, tj.

Pod uticajem interferona-g povećava se proizvodnja citokina, kao što su interleukin-1, interleukin-2, interleukin-12, IFNb i faktor nekroze tumora-b.

2. Metode za dobijanje interferona

Interferoni se dobijaju na dva načina:

a) inficiranjem ljudskih leukocita ili limfocita sigurnim virusom, uslijed čega zaražene stanice sintetiziraju interferon, koji se potom izoluje i od njega se konstruiraju pripravci interferona;

b) genetskim inženjeringom - uzgojem rekombinantnih sojeva bakterija sposobnih da proizvode interferon u proizvodnim uslovima.

2 . 1 strdobijanje od straneinfekcija ljudskih leukocita

Poznate su metode za dobijanje humanog leukocitnog interferona iz leukocita krvi humanog donora, izazvanog virusima i drugim induktorima.

Leukociti ljudske krvi su glavni proizvođači prirodnog interferona-alfa, čija je količina za potrebe proizvodnje ograničena donorskim sirovinama. S tim u vezi, rješavanje pitanja optimizacije metoda uzgoja leukocita za povećanje prinosa ciljnog proizvoda i razvoj jedinstvene efikasne metode za dobijanje prirodnog IFN-a za kreiranje novih doznih oblika čini se vrlo važnim i relevantnim za praktičnu zdravstvenu zaštitu danas.

Poznata je tehnologija proizvodnje humanog leukocitnog interferona, koja uključuje sljedeći redoslijed operacija: izolaciju leukocita iz krvi donora, leukocitne ili eritrocitne mase, suspendiranje u hranljivom mediju na temperaturi od (37±0,5) o C, dodavanje induktor alantoičnog virusa u leukocite i inkubacija na (30±0,5) o C 3 sata. Nakon toga se virus induktor odvoji, a u sediment leukocita se dodaje hranjivi medij i suspenzija se drži na (37±) 0,5) o C tokom 18-20 sati.U ovoj fazi dolazi do biosinteze interferona u leukocitima i njegova akumulacija u hranjivom mediju dobijenom ovom tehnologijom ima antivirusnu aktivnost od 800-1000 IU po 1 ml lijeka.

Da bi se povećala proizvodnja interferona od strane leukocita u fazi biosinteze, u drugom propisu za proizvodnju humanog leukocitnog interferona N 302-82, suspenzija leukocita se drži na 37,5 o C 2-10 sati u hranljivoj podlozi. koji sadrži 100-200 jedinica/ml humanog interferona leukocita i 0,0015 jedinica/ml inzulina; početni stupanj; virus induktor se dodaje 1-2 sata; faza indukcije interferona. Zatim se virus induktor uklanja, a sedimentu leukocita se dodaje hranjiva podloga i suspenzija se drži na 37,5 o C 18-20 sati, faza biosinteze interferona, a supernatant koji sadrži interferon se inaktivira.

Uvođenje prve faze značajno povećava proizvodnju interferona od strane leukocita, a antivirusna aktivnost interferona dobijenog ovom metodom iznosi 4000-5000 IU/ml. Treba napomenuti da se u svim navedenim tehnologijama proizvodnje i drugim poznatim metodama za dobijanje humanog leukocitnog interferona leukociti izoluju iz krvi koja se čuva na 4-6 o C, a sam proces izolacije odvija se na istoj temperaturi, nakon čega slijedi njihovo unošenje u hranljivu podlogu na temperaturi od 37,5 o C i izvođenje faze prajminga, faze indukcije i biosinteze interferona.

Sljedeća metoda za proizvodnju interferona odabrana je kao prototip, jer je po tehničkoj suštini najbliža. Svrha metode je povećanje prinosa ciljnog proizvoda. U tu svrhu predložena je metoda za proizvodnju interferona, koja uključuje izolaciju leukocita, suspendiranje u hranljivoj podlozi i prajming pod uslovima postepenog povećanja temperature suspenzije sa 20 o na (36,6 ± 0,1) o C za 4-6 sati, indukcija s alantoičnim virusom Newcastle bolesti, biosinteza interferona i inaktivacija virusa induktora. Komparativna analiza bitnih karakteristika metoda ukazuje da su karakteristične karakteristike predložene metode prajming leukocita uz spor porast temperature suspenzije sa 20 o na (36,6 ± 0,1) o C tokom 4-6 sati. Predloženi temperaturni režim za prajming leukocita osigurava uslove za intenzivnu biosintezu INF. Metoda se provodi na sljedeći način. Izolovani leukociti iz donorske krvi, leukocita ili mase eritrocita se suspenduju u 5 litara hranljivog medijuma (medij 199) koji sadrži 0,0015 jedinica/ml insulina i 1500-3000 IU/ml humanog interferona leukocita 5-10% 1 ljudske krvne plazme. humani albumin i antibiotici. 1 ml hranljive podloge sadrži 10020 miliona leukocita. Hranljivi medij koji sadrži gore navedene polazne komponente ima početnu temperaturu od 20 o C. U automatizovanom režimu, prema programu, temperatura suspenzije se povećava sa 20 o C na (36,6 ± 0,1) o C tokom 4-6 sati. Zatim se temperatura suspenzije dovede na (36,9±0,1) o C i u suspenziju se doda virus induktor u dozi od 2000-4000 GAE na 2 milijarde leukocita, suspenzija se inkubira na (36,9±0,1) o C 18-20 sati uz stalno mešanje. Leukociti se uklanjaju centrifugiranjem, a supernatant u količini od 4,5 litara koji sadrži interferon se zakiseli sa 10% hlorovodoničnom kiselinom do pH 2,2-2,4. Zakiseljeni poluproizvod interferona čuva se 10 dana da inaktivira virus induktora. Antivirusna aktivnost interferona dobijenog na ovaj način iznosi 10-12 hiljada IU/ml.

Dakle, predložena metoda za dobivanje humanog leukocitnog interferona osigurava povećanje njegove antivirusne aktivnosti za 2 ili više puta u odnosu na prethodnu metodu. Upotreba predložene metode u proizvodnji pomoći će uštedi materijalnih troškova, jer usmjeren je na efikasnije korištenje leukocita, a ne na povećanje njihovog broja.

Glavni nedostatak ovih metoda za proizvodnju interferona je vjerovatnoća kontaminacije konačnog proizvoda ljudskim virusima, kao što su virus hepatitisa B i C, virus imunodeficijencije itd.

2.2 Dobijanje interferonagenetski modifikovano

virus leukocitnog gena interferona

Trenutno je metoda proizvodnje interferona mikrobiološkom sintezom prepoznata kao perspektivnija, što omogućava dobivanje ciljanog proizvoda sa značajno većim prinosom od relativno jeftinih početnih materijala. Pristupi korišteni ovdje omogućavaju stvaranje varijanti strukturnog gena koje su optimalne za ekspresiju bakterija, kao i regulatornih elemenata koji kontroliraju njegovu ekspresiju.

Kao izvorni mikroorganizmi koriste se različiti dizajni sojeva Pichia pastoris, Pseudomonas putida i Escherichia coli.

Nedostatak upotrebe P. pastoris kao proizvođača interferona su izuzetno teški uslovi fermentacije ove vrste kvasca i potreba da se striktno održava koncentracija induktora, posebno metanola, tokom procesa biosinteze.

Nedostatak korištenja Ps. putida je složenost procesa fermentacije na niskom nivou ekspresije (10 mg interferona po 1 litru podloge). Produktivnija je upotreba sojeva Escherichia coli.

Poznat je veliki broj plazmida i sojeva E. coli stvorenih na njihovoj osnovi koji eksprimiraju interferon: E. coli sojevi ATCC 31633 i 31644 sa plazmidima Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 ili Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli soj pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli soj pINF-F-Pa (AU 1312962), E. Coli soj SG 20050 sa plazmidom p280/21FN Coli soj SG 20050 sa plazmidom pINF14 (SU 1703691), E. coli soj SG 20050 sa plazmidom pINF16 (RU 2054041) itd. Nedostatak tehnologija zasnovanih na upotrebi ovih sojeva je njihova nestabilnost, kao i nivo ins. ekspresija interferona.

Uz karakteristike korišćenih sojeva, efikasnost procesa u velikoj meri zavisi od tehnologije koja se koristi za izolaciju i prečišćavanje interferona.

Poznata je metoda za proizvodnju interferona, koja uključuje uzgoj Ps ćelija. putida, uništavanje biomase, tretman polietileniminom, frakcionisanje amonijum sulfatom, hidrofobna hromatografija na fenilsilohromu C-80, pH frakcionisanje lizata, njegova koncentracija i dijafiltracija, jonoizmenjivačka hromatografija na celulozi DE-52, eluiranje u pH gradijentu, ion izmjenjivačka hromatografija dobivenog eluenta na celulozi SM -52, koncentriranje propuštanjem kroz filter kasetu i gel filtracija na Sephadex G-100 (SU 1640996). Nedostatak ove metode, pored složene višestepene fermentacije, je i višestepenost procesa u dobijanju konačnog proizvoda.

Poznata je i metoda za proizvodnju interferona, koja uključuje kultivaciju soja E. coli SG 20050/pIF16 u LB bujonu u tikvicama u termostatiranom šejkeru, centrifugiranje biomase, ispiranje puferskom otopinom i ultrazvučni tretman za uništavanje stanica. Dobiveni lizat se centrifugira, ispere sa 3M rastvorom uree u puferu, rastvori u rastvoru gvanidin hlorida u puferu, obradi ultrazvukom, centrifugira, oksidativnom sulfitolizom, dijalizom protiv 8 M uree, renaturacijom i finalnom dvostepenom hromatografijom na CM- 52 celuloza i sephadex G-50 (RU 2054041) .

Nedostaci ove metode su relativno niska produktivnost glavnih faza procesa izolacije i pročišćavanja. Ovo se posebno odnosi na ultrazvučnu obradu proizvoda, dijalizu i oksidativnu sulfitolizu, što dovodi do nestabilnosti prinosa interferona, kao i nemogućnosti upotrebe ove metode za industrijsku proizvodnju interferona.

Kao najbliži analog (prototip) može se navesti metoda za dobijanje interferona humanih leukocita, koja se sastoji u kultivaciji rekombinantnog soja E. coli, zamrzavanju nastale biomase na temperaturi koja ne prelazi -70°C, odmrzavanje, uništavanje ćelija mikroorganizama. sa lizozimom, uklanjanjem DNK i RNK uvođenjem u lizat DNK-aze i prečišćavanjem izolovanog nerastvorljivog oblika interferona ispiranjem puferskim rastvorom sa deterdžentima, otapanjem taloga interferona u rastvoru gvanidin hidrohlorida, renaturacijom i jednostepenim prečišćavanjem ionom izmjenjivačka hromatografija. Kao proizvođač koristi se soj E. coli SS5 dobijen korišćenjem rekombinantnog plazmida pSS5 koji sadrži tri promotora: Plac, Pt7 i Ptrp i alfa-interferon gen sa uvedenim nukleotidnim supstitucijama.

Ekspresija interferona od strane E. coli SS5 soja koji sadrži ovaj plazmid kontrolišu tri promotora: Plac, Pt7 i Ptrp. Nivo ekspresije interferona je oko 800 mg po 1 litru ćelijske suspenzije.

Nedostatak ove metode je niska tehnološka efikasnost upotrebe enzimske destrukcije ćelija, DNK i RNK mikroorganizma i jednostepenog hromatografskog prečišćavanja interferona. To uzrokuje nestabilnost u procesu oslobađanja interferona, dovodi do smanjenja njegove kvalitete i ograničava mogućnost korištenja gornje sheme za industrijsku proizvodnju interferona.

Nedostaci ovog plazmida i soja baziranog na njemu su upotreba u plazmidu jakog neregulisanog promotora faga T7 u soju E. coli BL21 (DE3), u kojem se gen T7 RNA polimeraze nalazi ispod promotora lac operon i koji uvijek "teče". Posljedično, u ćeliji se kontinuirano odvija sinteza interferona, što dovodi do disocijacije plazmida i smanjenja vitalnosti ćelija soja, a kao rezultat toga i smanjenja prinosa interferona.

Primjer dobivanja rekombinantnog interferona:

600 g biomase ćelija Pseudomonas putida 84 koje su sadržavale rekombinantni plazmid p VG-3, nakon kultivacije, sadržavalo je 130 mg alfa-2 interferona. Ćelije su stavljene u balistički dezintegrator od 5,0 L sa mehaničkom mešalicom i 3,0 L pufera za lizu koji sadrži 1,2% natrijum hlorida, 1,2% tris-(hidroksimetil)-aminometan, 10% saharozu, 0,15% etilendiamintetrasirćetnu kiselinu (EDTA). 0,02% fenilmetilsulfonil fluorida i 0,01% ditiotreitola pri pH 7,7. Biomasa je mešana do dobijanja homogene suspenzije 30 minuta, a zatim dezintegrisana u cirkulacijskom režimu u balističkom dezintegratoru u skladu sa uputstvom za upotrebu. Vreme dezintegracije je bilo 1,5 h. Proces dezintegracije je završen kada mikroskopiranjem preparata u više vidnih polja mikroskopa praktično nisu uočene cele ćelije mikroorganizama. Zapremina suspenzije lizirane biomase bila je 3,5 l.

Lizat dobijen u ovoj fazi je zatim ušao u fazu precipitacije nukleinske kiseline. Da bi se to učinilo, 180 ml 5% rastvora polietilenimina dodano je u posudu u kojoj se nalazi lizat uz mešanje brzinom od 1-1,2 l/h. Suspenzija je miješana 1 sat i centrifugirana da se odvoji sediment nukleinske kiseline 1 sat na (9500±500) o/min, na temperaturi od (5±2)C. Nakon centrifugiranja, supernatant je odvojen, čija je zapremina bila 3,0 L.

Uz lagano miješanje miješalicom, u supernatant se u malim porcijama sipa 182 g suhog amonijum sulfata (svaka naredna porcija se dodaje nakon što se prethodni potpuno otopi). Nakon što je dodavanje amonijum sulfata završeno, miješanje je nastavljeno sve dok se sol nije potpuno otopila i suspenzija proteinskog sedimenta je držana na temperaturi od (5 ± 2) C 16 sati, a zatim centrifugirana 1 sat na (13500 ±) 500) o/min na temperaturi od (5 ± 2) SO.

Dobiveni talog je otopljen u destilovanoj vodi, čime je ukupna zapremina iznosila 4 litre. Da bi se istaložili prateći proteini, izvedeno je kiselo frakcionisanje nastalog rastvora koji sadrži alfa-2 interferon. Da bi se to učinilo, otopini je dodano 5,0 ml 50% sirćetne kiseline do pH 4,75. Dobijena smeša je prebačena u frižider i ostavljena na temperaturi od (5±2)C 3 sata, zatim je proteinska suspenzija centrifugirana na (13500±500) o/min 30 minuta na (5±2)C.

U 4 L supernatanta dodano je 50,0 ml 1 M rastvora Tris do pH (6,9 ± 0,1). Koncentracija ukupnog proteina, određena Lowry metodom, iznosila je 9,0 mg/ml, biološka aktivnost alfa-2 interferona (6,80,5) 106 IU/ml. Specifična aktivnost 8,5105 IU/mg. Ukupan sadržaj alfa-2 interferona u ovoj fazi je 2,91010 IU.

Soloz KG sorbent u količini od 0,6 l u obliku vodene suspenzije stavljen je u hromatografsku kolonu. Zatim, pomoću peristaltičke pumpe, 2,0 l 0,2 M rastvora natrijum hidroksida, 6,0 l destilovane vode i 4,5 l 0,05 M tris-acetatnog puferskog rastvora na pH (7,1±0,1), što je praćeno pH metrom na izlaz kolone.

Proteinski rastvor koji sadrži alfa-2 interferon razrijeđen je destilovanom vodom do provodljivosti od (6,0+2,0) mS/cm na sobnoj temperaturi. Zapremina rastvora bila je 19,2 litara.

Rastvor je nanesen na kolonu brzinom od 1,5 l/sat, zatim je sorbent ispran sa 2,0 l tris-acetatnog pufera 0,05 M na pH 7,0. Eluiranje je obavljeno sa 1,2 l 0,05 M rastvora Tris sa pH (10,2 ± 0,1) Sadržaj interferona u frakcijama sakupljenim pomoću kolektora frakcija određen je enzimskim imunotestom.

Koncentracija ukupnog proteina, određena Lowry metodom, iznosi (2,2±0,2) mg/ml, biološka aktivnost alfa-2 interferona (2,1±0,5)107 IU/ml, specifična aktivnost lijeka (9,7±0,5) )106 IU/mg. Ukupan sadržaj alfa-2 interferona u ovoj fazi je (1,5±0,5)1010 IU.

Spherocell qae sorbent u količini od 0,15 l u obliku vodene suspenzije stavljen je u kolonu i ispran brzinom od 0,15 l/h sukcesivno sa 0,5 l 2 M rastvora natrijum hlorida, 1,5 l destilovane vode i 1,0. l trisacetatnog puferskog rastvora 0,05 M sa pH 8,0, praćenje pH rastvora pufera na izlazu iz kolone pH metrom.

Rastvor proteina od 0,7 L koji sadrži alfa-2 interferon nanesen je na kolonu sorbenta od 0,15 L Spherocell-QAE brzinom od 0,2 L/sat. Kolona je isprana sa 0,1 L tris-acetatnog 0,05 M puferskog rastvora (pH 8,0), zatim su proteini nečistoće isprani sa 1,0 L istog puferskog rastvora uz dodatak 0,05 M NaCl. Interferon je eluiran sa 0,8 L 0,1 M rastvora pufera natrijum acetata pri pH 5,0. Sadržaj alfa-2 interferona u frakcijama sakupljenim kolektorom određen je metodom enzimskog imunoeseja. Koncentracija proteina je bila (0,35±0,05) mg/ml, biološka aktivnost alfa-2 interferona (1,7±0,2)107 IU/ml. Specifična aktivnost lijeka je 5,5107 IU/mg proteina. Eluat je sadržavao 1,20x1010 ME. Prinos biološke aktivnosti u ovoj fazi je 82,5%.

Dobijeni rastvor je podešen na pH (5,0±0,1) sa 50% sirćetne kiseline i razblažen sa 0,05 M rastvorom pufera natrijum acetata. Specifična električna provodljivost iznosila je (0,29±0,02) mS/cm na temperaturi od (5±2)C. Ovako pripremljeni rastvor proteina nanesen je na kolonu sa Spherocell LP-M sorbentom brzinom od 0,1 l/h, ispran sa 0,3 l gornjeg puferskog rastvora, a zatim je interferon eluiran linearnim gradijentom koncentracije natrijum hlorida. kreiran korišćenjem Ultragrad gradijent miksera. Eluat je frakcionisan pomoću kolektora frakcija i izmerena je koncentracija ukupnog proteina i alfa-2 interferona. Koncentracija proteina u združenim frakcijama (0,45±0,02) mg/ml. Zapremina rastvora je 0,1 l. Ukupan sadržaj alfa-2 interferona (8,6±0,2)109 IU. Specifična aktivnost - e (7,5±0,2)107 IU/mg. Prinos u ovoj fazi je 73%.

Dobijeni rastvor od 0,1 L 3 je koncentrisan na (5,0 ± 0,2) ml pomoću ćelije za ultrafiltraciju koristeći Amicon YM-3 membranu. Ovako pripremljen uzorak je nanesen na kolonu sa Sephadex G-100 sorbentom, ekvilibriran sa fosfatnim puferom, brzinom od 0,025 l/h. Volumen frakcija je 10,0 ml. Frakcije dobijene hromatografijom ispitane su na sadržaj alfa-2 interferona primenom metode enzimskog imunoeseja i kombinovanjem frakcija koje sadrže glavni pik alfa-2 interferona. Volumen dobijenog rastvora bio je 30,2 ml. Koncentracija ukupnog proteina, određena Lowry metodom, iznosi (0,90 ± 0,02) mg/ml. Ukupan sadržaj alfa-2 interferona u rastvoru je 5,5109 ME. Specifična aktivnost rezultirajućeg preparata alfa-2 interferona je 2,3108 IU/mg. Prinos alfa-2 interferona u ovoj fazi je 90,2%. Dobiveni proizvod je steriliziran i zapakiran. Ukupan prinos leka je 35,8%, uključujući 51% u fazi prečišćavanja.

Za dobivanje velikih količina IFN-a koriste se šestodnevne monoslojne kulture stanica pilećih embrija ili kultiviranih leukocita ljudske krvi inficiranih određenom vrstom virusa. Drugim riječima, da bi se dobio IFN, kreira se specifičan sistem virus-ćelija.

Gen odgovoran za biosintezu IFN izolovan je iz ljudske ćelije. Egzogeni ljudski IFN se proizvodi korištenjem tehnologije rekombinantne DNK. Postupak za izolaciju cDNK IFN-a je sljedeći:

1) mRNA je izolirana iz ljudskih leukocita, frakcionirana po veličini, reverzno transkribirana i umetnuta na mjesto modificiranog plazmida.

2) Dobijeni proizvod se koristi za transformaciju E. coli; rezultirajući klonovi su podijeljeni u grupe koje su identificirane.

3) Svaka grupa klonova je hibridizovana sa IFN - mRNA.

4) Iz dobijenih hibrida koji sadrže cDNK i chRNA, mRNA se izoluje i prevodi u sistem sinteze proteina.

5) Odrediti antivirusnu aktivnost interferona svake mješavine dobivene kao rezultat translacije. Grupe koje su pokazale aktivnost interferona sadrže klon sa cDNK hibridizovanom sa IFN - mRNA; ponovo identificirati klon koji sadrži cDNK ljudskog IFN-a pune dužine.

3 . Mehanizmi djelovanja interferona

Interferoni pokazuju neke aktivnosti kao limfokini i imunomodulatori. IFN tipa I, koji prvenstveno djeluju kao inhibitori replikacije virusa u ćeliji, ispoljavaju svoj učinak stimulirajući proizvodnju staničnih enzima ribozomima stanica domaćina, koji inhibiraju proizvodnju virusa, ometajući translaciju virusne mRNA i sintezu virusni proteini.

Interferone proizvodi većina životinjskih vrsta, ali manifestacija njihove aktivnosti je specifična za vrstu, tj. djeluju samo u vrsti životinja u kojoj su proizvedeni.

Interferoniizazivaju indukciju tri enzima:

Protein kinaza, koja remeti početnu fazu izgradnje peptidnog lanca;

Oligoizoadenilat sintetaza, koja aktivira RNKazu, koja uništava virusnu RNK;

Fosfodiesteraza, koja uništava konačne nukleotide tRNA, što dovodi do poremećaja elongacije peptida.

Uzimajući u obzir antivirusno i imunomodulatorno dejstvo interferona, NPO „Biomed“ je predložio i uspešno testirao čepiće sa IFNan1 i probioticima za lečenje disbioze virusne i bakterijske etiologije, kandidijaze; u ginekološkoj praksi za liječenje endometritisa, kolpita, vaginitisa i ginekološkog herpesa.

4. Terapeutska upotreba interferonaosoba

Interferoni (INF) imaju univerzalno širok spektar antivirusnog djelovanja, jer ne djeluju na virione ili njihove NK, već izazivaju antivirusno stanje u ćeliji, stimulirajući stvaranje kompleksa proteina koji blokiraju transkripciju virusne mRNA. INF ne prodiru u ćelije, već stupaju u interakciju sa membranskim receptorima, izazivajući stvaranje cAMP, koji prenosi signal do odgovarajućeg DNK operona. Osim toga, INF aktiviraju gene koji kodiraju proizvode s direktnim antivirusnim djelovanjem - protein kinaze, koje ometaju sklapanje proteinske molekule, i adenilat sintetaze, čiji produkt aktivira endonukleazu koja uništava virusnu mRNA. Gama-INF aktivira citotoksične limfocite, prirodne ćelije ubice, monocite, makrofage, granulocite, koji doprinose uništavanju inficiranih ćelija.

Postoje dvije generacije interferonskih lijekova. Prvu generaciju karakterizira prirodno porijeklo, u kojem se dobiva iz krvi davalaca. Od njega se dobija suvi ljudski leukocitni interferon koji se koristi za inhalaciju i ukapavanje u nosne prolaze. Takođe proizvode interferon u supozitorijama, prečišćeni koncentrovani interferon u suvom obliku i leukinferon.

Ova metoda proizvodnje lijekova na bazi interferona prilično je skupa i nedostupna, pa su krajem 20. stoljeća genetskim inženjeringom stvoreni interferonski lijekovi druge generacije.

Tako je bilo moguće razviti lijekove Viferon, Interal i druge koji sadrže rekombinantni humani interferon-b.

Zbog svojih jedinstvenih svojstava koriste se preparati interferona tretman i prevenciju svih respiratornih bolesti, većine karcinoma, za liječenje mnogih virusnih bolesti i gripe. U liječenju se široko koriste preparati interferona hepatitis A hepatitis B i C: interferon ograničava razvoj virusa, sprečava nastanak ciroza i isključuje smrt.

Neki interferonski lijekovi imaju nuspojave, kao što su osip na koži, alergije i bolesti hematopoetskog sistema.

Uz produženu upotrebu interferona, tijelo proizvodi antitijela na interferon, zbog čega se ne može boriti virusi. Razlog za ove pojave leži u prisustvu albumina u preparatima na bazi interferona.

Albumin se dobija iz krvi, tako da postoji rizik (iako minimalan) od infekcije hepatitis i druge bolesti koje se prenose krvlju.

Tabela 1

Spektar aktivnosti interferona

Ime droge	Podtip INF	Način dobijanja	farmakološki efekat	Indikacije za upotrebu
Interferon		Biosinteza u kultivisanim leukocitima krvi donora pod uticajem virusa	Antivirusno, imunomodulatorno, antiproliferativno	Virusne bolesti, leukemija, maligni melanom, rak bubrega, karcinoidni sindrom
Interlock		Biosinteza u kultivisanim leukocitima krvi donora pod uticajem paramikovirusa	Suzbija aktivnost brojnih virusa	Virusne bolesti oka, hepatitis
Interferon alfa-2		Rekombinantna	Antivirusno, imunomodulatorno, inhibira proliferaciju širokog spektra tumorskih ćelija	Epitelni oblik akutne i rekurentne virusne infekcije oka; onkološke bolesti
Interferon alfa-2a		Rekombinantna. Protein koji sadrži 165 aminokiselina	Antivirusno, antitumorsko djelovanje	Leukemijska retikuloendotelioza, Kaposijev sarkom, rak bubrega, rak mokraćne bešike, melanom, herpes zoster
Reaferon		Rekombinantni INF proizveden od bakterijskog soja pseudomonas, čiji genetski aparat sadrži gen za humani leukocit INF b2. Identično ljudskom leukocitu INF b2.		Virusne, tumorske bolesti
Interferon alfa - n1		Visoko pročišćeni ljudski INF	Antivirusno	Hronični aktivni infektivni hepatitis B
Inreferon beta		Superprodukcija humanih fibroblasta stimulatorom u prisustvu metaboličkih inhibitora	Antivirusno, imunomodulatorno, antitumorsko djelovanje	Hronične virusne infekcije u oftalmologiji, ginekologiji i urologiji, dermatologiji, hepatologiji, onkologiji
Interferon gama		Rekombinantna	Antivirusno, imunomodulatorno, antitumorsko djelovanje	Hronične granulomatozne bolesti

INF-bIINF-V sličniji jedno drugom. Njihovi geni su lokalizirani na hromozomu 9. Za proizvodnju oba, virusi su inducirajući signal. Imaju izražen antivirusni i antitumorski učinak, a u znatno manjoj mjeri pokazuju imunomodulatorna svojstva.

INF-G ima izražen imunomodulatorni efekat, zajedno sa interleukinom-2 (IL-2) i faktorom tumorske nekroze (TNF ili TNF), jedan je od glavnih proinflamatornih citokina i induktor je ćelijskog imuniteta. Antivirusna i antitumorska svojstva su manje izražena od INF-b i INF-c. Gen INF-g nalazi se na hromozomu 12, glavne ćelije koje proizvode su T-limfociti, prirodne ćelije ubice (NK ćelije). Indukcijski signal za proizvodnju može biti bilo koji antigen ili drugi citokini.

Antivirusni efekat interferona sastoji se u supresiji sinteze virusne RNK, supresiji sinteze proteina virusne ovojnice. Mehanizam ovog efekta je aktivacija intracelularnih enzima, poput protein kinaze ili adenilat sintetaze. Protein kinaza uništava inicijacijski faktor sinteze proteina iz glasničke RNK, što potiskuje sintezu proteina. Adenilat sintetaza - uzrokuje sintezu supstanci koje uništavaju virusnu RNK.

Imunomodulatorni efekat interferona - sposobnost regulacije interakcije ćelija uključenih u imunološki odgovor. Interferoni obavljaju ovu funkciju regulacijom osjetljivosti stanica na citokine i ekspresijom molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti tipa I (MHC1) na ćelijskim membranama. Povećana ekspresija MHC1 na ćelijama zaraženim virusom značajno povećava vjerovatnoću da će ih imunokompetentne stanice prepoznati i eliminirati iz tijela. INF-g ima najizraženija imunomodulatorna svojstva, kao proizvod pomoćnika T-limfocita tipa I, zajedno sa drugim proinflamatornim citokinima, aktivira makrofage, T-citotoksične limfocite, prirodne ćelije ubice (NK ćelije), potiskuje aktivnost B-limfocita, aktivira prostaglandinski i kortikosteroidni sistem. Svi ovi faktori pojačavaju fagocitne i citotoksične reakcije u području žarišta upale i doprinose efikasnoj eliminaciji infektivnog agensa.

Antitumorski efekat interferona povezana sa njihovom sposobnošću da uspore ili potisnu rast ćelijskih kultura i aktiviraju antitumorske mehanizme imunog sistema. Ovo svojstvo interferona otkriveno je davno i široko se koristi u terapeutske svrhe. Svi antitumorski efekti interferona dijele se na direktne i indirektne. U direktnoj vezi sa sposobnošću direktnog uticaja na tumorske ćelije, njihov rast i diferencijaciju. Indirektni su povezani sa povećanjem sposobnosti imunokompetentnih ćelija da otkriju i unište atipične ćelije organizma.

Direktni antitumorski efekti interferona:

· Supresija sinteze RNK.

· Supresija sinteze proteina.

· Stimulacija sazrevanja nediferenciranih ćelija.

· Povećana ekspresija membranskih antigena tumorskih ćelija i hormonskih receptora.

· Poremećaj procesa vaskularnog formiranja.

· Neutralizacija onkovirusa.

· Suzbijanje dejstva faktora rasta tumora.

Indirektni antitumorski efekti interferona:

· Stimulacija aktivnosti ćelija imunog sistema (makrofagi, NK ćelije, T-citotoksični limfociti).

· Povećana ekspresija molekula histokompatibilnosti klase I na ćelijama.

Antiproliferativni efekat interferona leži u sposobnosti interferona da ispolje svojstva citostatika - da potiskuju ćelijski rast suzbijanjem sinteze RNK i proteina, kao i da inhibiraju faktore rasta koji stimulišu ćelijsku proliferaciju.

Induktori INF je vrlo raznolika grupa prirodnih i sintetičkih spojeva koji mogu uzrokovati da tijelo formira vlastiti (endogeni) INF. Kao i INF, imaju univerzalno širok spektar antivirusnog djelovanja, kao i imunomodulatorno djelovanje, što određuje njihovu efikasnost kod mnogih nevirusnih bolesti.

tabela 2

Spektar antivirusne aktivnosti induktora INF

Droga	Indikacije za upotrebu
akridanoni (cikloferon, neovir)	Gripa, encefalitis, bjesnilo, HIV infekcija, AIDS
Fluorenoni (amiksin)	Gripa, ARVI, herpes, hepatitis A, encefalitis, bjesnilo, multipla skleroza
Poli (I): poli(U) - ampligen	HIV infekcija, AIDS
Poli(G): poli(C)-poligvacil	Gripa, hepatitis B, encefalitis, bjesnilo
Dvolančana RNA (larifan, ridostin)	Gripa, ARVI, herpes, encefalitis, bjesnilo
Poli(A): poli(U)-poludan	Herpetične lezije oka
Polifenoli (megasin, kagocel, savrac, ratosin, gozalidon)	Gripa. ARVI, herpes, encefalitis, bjesnilo, hepatitis, enterovirusne infekcije

Zaključak

Interferon je porodica glikoproteinskih proteina koje sintetišu ćelije imunog sistema i vezivnog tkiva. U zavisnosti od toga koje ćelije sintetiziraju interferon, postoje tri tipa: b, c i g interferona.

Interferon se dobija na dva načina: a) inficiranjem ljudskih leukocita ili limfocita sigurnim virusom; b) genetski modifikovani.

U našoj zemlji rekombinantni interferon je dobio službeni naziv "Reaferon". Proizvodnja ovog lijeka je na mnogo načina efikasnija i jeftinija od leukocita.

Djelovanje interferona je efikasnije što se ranije počinje sintetizirati ili ulaziti u tijelo izvana. Stoga se koristi u profilaktičke svrhe kod mnogih virusnih infekcija, kao što je gripa, kao i u terapeutske svrhe kod kroničnih virusnih infekcija, kao što su parenteralni hepatitis (B, C, D), herpes, multipla skleroza itd. Interferon daje pozitivan rezultira u liječenju malignih tumora i bolesti povezanih s imunodeficijencijama.

Interferoni su specifični za vrstu, odnosno ljudski interferon je manje efikasan za životinje i obrnuto. Međutim, specifičnost ove vrste je relativna.

Bibliografija

1. Privremeni farmakopejski članak 42U-23/60-439-97. Interferon humani rekombinantni alfa-2.

2. Gavrikov A.V. Optimizacija biotehnološke proizvodnje rekombinantnih humanih interferonskih supstanci - M., 2003,

3. Galynkin V.A., Zaikina N.A., Kocherovets V.I., Potekhina T.S. Osnove farmaceutske mikrobiologije. Sankt Peterburg: Prospekt Nauki, 2008. -304 str.

4. Glick B., Pasternak J. Molekularna biotehnologija. Principi i primjena. M.: Mir, 2002. -589 str.

5. Državna farmakopeja SSSR-a. XI izd., broj 1.-- P. 175.

6. Državni registar lijekova / Ed. A.V. Katlinsky i drugi - M., 2002.

7. Elinov N.P. Osnove biotehnologije. Sankt Peterburg: Nauka.-1995.-600 str.

8. Elinov N.P., Zaikina I.A., Sokolova I.P. Vodič za laboratorijsku nastavu iz mikrobiologije - M.: Medicina, 1998.

9. Karabelsky A.V. Rekombinantni interferoni.- M.: Book on Demand, 2010.- 132 str.

10. Maškina O.S., Butorina A.K. Genetski inženjering i biološka sigurnost. Voronjež: VSU, 2005. 71 str.

11. Naroditsky B.S. Molekularna biotehnologija interferona. // zbornik naučno-praktične konferencije "Interferon - 50 godina". - M., 2007, str. 17-23

12. Osnove farmaceutske biotehnologije: Udžbenik / T.V. Prishchep, V.S. Čučalin, K.L. Zaikov, L, K. Mikhaleva, L.S. Belova - Rostov n/a: Phoenix; Tomsk: Izdavačka kuća NTL, 2006.- 256 str.

13. Frolov A.F., Vovk A.D., Dyadyun S.T. i dr. Učinkovitost rekombinantnog alfa-dva-interferona kod virusnog hepatitisa B // Medicinski poslovi.- Kijev, 1990.- br. 9.-- str. 105-108.

14. http://interferon.su/php/content.php?id=577

15. http://ru-patent.info/20/95-99/2098124.html

16. www.antibiotic.ru/ab/brviri.shtml

17. www.pharmvestnik.ru

Objavljeno na Allbest.ru

...

Slični dokumenti

Klase interferona: prirodni i umjetno sintetizirani. Metode dobivanja humanog leukocitnog interferona iz leukocita krvi donora i mikrobiološka sinteza. Mehanizmi djelovanja interferona, terapijska primjena.

sažetak, dodan 27.01.2010

Povijest otkrića interferona, njihove karakteristike, klasifikacija, mehanizam djelovanja i karakteristike proizvodnje; kliničke karakteristike njihove upotrebe. Tehnološka shema za proizvodnju leukocitnog i rekombinantnog interferona u preparativnim količinama.

kurs, dodan 23.12.2012

Urođeni antivirusni imunitet. Vrste interferona i mehanizmi antivirusnog djelovanja interferona. Sposobnost antitijela i komplementa da ograniče širenje virusa i spriječe ponovnu infekciju. Zaobilaženje imunološke kontrole virusima.

sažetak, dodan 27.09.2009

Proučavanje svojstava interferona. Proučavanje glavnog djelovanja proteina koji ima antivirusno, antiproliferativno i imunomodulatorno djelovanje. Upotreba interferona u liječenju malignih tumora i bolesti povezanih s imunodeficijencijom.

prezentacija, dodano 17.11.2015

Proces transfuzije krvi i njegova svrha, procjena sigurnosti u sadašnjoj fazi razvoja medicine. Patološki učinak donorske krvi, njegovi uzroci i metode rehabilitacije pacijenta. Primjena reinfuzije i autohemotransfuzije krvi i njihove prednosti.

sažetak, dodan 13.07.2009

Vrste imunomodulacije. Koncept imunotropnih lijekova. Interferoni i njihovi induktori. Mehanizam imunomodulatornog dejstva bakterijskih vakcina. Indikacije za propisivanje a-IF lijekova. Kontraindikacije za terapiju interferonskim lijekovima.

prezentacija, dodano 03.04.2014

Analiza krvnih zrnaca: crvena krvna zrnca, leukociti, trombociti. Hemoglobin i njegove funkcije u tijelu. Granulociti, monociti i limfociti kao komponente leukocita. Patologije u sastavu krvi, njihov utjecaj na funkcije ljudskog tijela.

sažetak, dodan 06.10.2008

Terapijski i profilaktički mehanizam djelovanja terapijskog blata, njihova klasifikacija i upotreba u svrhu termičkog djelovanja na organizam. Indikacije i kontraindikacije za toplinsku terapiju. Tehnika za opšte i lokalne aplikacije blata i kupke.

sažetak, dodan 21.12.2014

Funkcije krvno-tečnog tkiva kardiovaskularnog sistema kičmenjaka. Njegov sastav i oblikovani elementi. Formiranje crvenih krvnih zrnaca, vrste patologija. Glavna sfera djelovanja leukocita. Limfociti su glavne ćelije imunog sistema. Promjene u krvi povezane sa godinama.

prezentacija, dodano 14.10.2015

Starosna periodizacija osobe. Hematopoeza u embriogenezi. Promjene u koncentraciji eritrocita, leukocita, limfocita i trombocita s godinama. Specifična težina i viskoznost krvi u novorođenčadi i starijih osoba. Klasifikacija i vrijeme razvoja leukocita.

Interferoni su proteinski molekuli s molekulskom težinom od 15.000 do 21.000 daltona koje proizvode i luče stanice kao odgovor na virusnu infekciju ili druge patogene.

IFN se dijele u dvije vrste. Prvi tip, koji djeluje kao inhibitor replikacije virusa i ima pretežno antivirusno djelovanje, uključuje 22 različita podtipa IFN-α i jedan podtip IFN-β. Drugi tip, koji pokazuje imunomodulatornu aktivnost, uključuje IFN-γ.

Postoje tri imunološki različite klase IFN-a: IFN-α, IFN-β, IFN-γ.

Prirodni IFN uključuju limfoblastoidni i leukocitni IFN (IFN-α), sintetiziran od strane stimuliranih humanih monocita i B limfocita, koji se zatim ekstrahuju i prečišćavaju; IFN fibroblasta (IFN-β), dobijen iz kulture humanih fibroblasta, i IFN T-limfocita (IFN-γ).

Umjetno sintetizirani IFN-ovi uključuju rekombinantni IFN-α, koji je visoko pročišćeni pojedinačni podtip IFN-α proizveden korištenjem rekombinantne molekularne tehnologije.

Poznate su metode za dobijanje humanog leukocitnog interferona iz leukocita krvi humanog donora, izazvanog virusima i drugim induktorima.

Glavni nedostatak ovih metoda za proizvodnju interferona je vjerovatnoća kontaminacije konačnog proizvoda ljudskim virusima, kao što su virus hepatitisa B i C, virus imunodeficijencije itd.

Kao izvorni mikroorganizmi koriste se različiti dizajni sojeva Pichia pastoris, Pseudomonas putida i Escherichia coli.

Nedostatak korištenja Ps. putida je složenost procesa fermentacije na niskom nivou ekspresije (10 mg interferona po 1 litru podloge). Produktivnija je upotreba sojeva Escherichia coli.

Poznat je veliki broj plazmida i sojeva E. coli stvorenih na njihovoj osnovi koji eksprimiraju interferon: E. coli sojevi ATCC 31633 i 31644 sa plazmidima Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 ili Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli soj pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli soj pINF-F-Pa (AU 1312962), E. Coli soj SG 20050 sa plazmidom p280/21FN VK i dr. Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, br. 9, str. 1186-1193), soj E. Coli SG 20050 sa plazmidom pINF14 (SU 1703691), soj E. coli SG 20050 sa plazmidom pINF14 (RU4401) i dr. Nedostatak tehnologija zasnovanih na upotrebi ovih sojeva je njihova nestabilnost, kao i nedovoljan nivo ekspresije interferona.

Uz karakteristike korišćenih sojeva, efikasnost procesa u velikoj meri zavisi od tehnologije koja se koristi za izolaciju i prečišćavanje interferona.

Ekspresija interferona od strane E. coli SS5 soja koji sadrži ovaj plazmid kontrolišu tri promotora: Plac, Pt7 i Ptrp. Nivo ekspresije interferona je oko 800 mg po 1 litru ćelijske suspenzije.

Gen odgovoran za biosintezu IFN izolovan je iz ljudske ćelije. Egzogeni ljudski IFN se proizvodi korištenjem tehnologije rekombinantne DNK. Postupak za izolaciju cDNK IFN-a je sljedeći:

1) mRNA je izolirana iz ljudskih leukocita, frakcionirana po veličini, reverzno transkribirana i umetnuta na mjesto modificiranog plazmida.

2) Dobijeni proizvod se koristi za transformaciju E. coli; rezultirajući klonovi su podijeljeni u grupe koje su identificirane.

3) Svaka grupa klonova je hibridizovana sa IFN - mRNA.

4) Iz dobijenih hibrida koji sadrže cDNK i chRNA, mRNA se izoluje i prevodi u sistem sinteze proteina.

5) Odrediti antivirusnu aktivnost interferona svake mješavine dobivene kao rezultat translacije. Grupe koje su pokazale aktivnost interferona sadrže klon sa cDNK hibridizovanom sa IFN - mRNA; klon koji sadrži cDNK humanog IFN-a pune dužine je ponovo identificiran.

2. Mehanizmi djelovanja interferona

IFN pokazuju neke aktivnosti kao limfokini i imunomodulatori. IFN tipa I, koji prvenstveno djeluju kao inhibitori replikacije virusa u ćeliji, ispoljavaju svoj učinak stimulirajući proizvodnju staničnih enzima ribozomima stanica domaćina, koji inhibiraju proizvodnju virusa, ometajući translaciju virusne mRNA i sintezu virusni proteini.

IFN proizvodi većina životinjskih vrsta, ali manifestacija njihove aktivnosti je specifična za vrstu, tj. djeluju samo u vrsti životinja u kojoj su proizvedeni.

IFN izazivaju indukciju tri enzima:

protein kinaza, koja remeti početnu fazu izgradnje peptidnog lanca;

oligoizoadenilat sintetaza, koja aktivira RNKazu, koja uništava virusnu RNK;

fosfodiesteraza, koja uništava konačne nukleotide tRNA, što dovodi do poremećaja elongacije peptida.

Uzimajući u obzir antivirusno i imunomodulatorno djelovanje IFN-a, NPO Biomed je predložio i uspješno testirao čepiće sa IFNan1 i probioticima za liječenje disbakterioze virusne i bakterijske etiologije, kandidijaze; u ginekološkoj praksi za liječenje endometritisa, kolpita, vaginitisa i ginekološkog herpesa.

3. Terapeutska upotreba humane INF

Ova metoda proizvodnje lijekova na bazi interferona prilično je skupa i nedostupna, pa su krajem 20. stoljeća genetskim inženjeringom stvoreni interferonski lijekovi druge generacije.

Tako je bilo moguće razviti lijekove Viferon, Interal i druge koji sadrže rekombinantni humani interferon alfa

Zbog svojih jedinstvenih svojstava, preparati interferona koriste se u liječenju i prevenciji svih respiratornih bolesti, većine karcinoma, te za liječenje mnogih virusnih bolesti i gripa. Preparati interferona se široko koriste u liječenju hepatitisa B i C: interferon ograničava razvoj virusa, sprječava nastanak ciroze i eliminira smrt.

Neki interferonski lijekovi imaju nuspojave, kao što su osip na koži, alergije i bolesti hematopoetskog sistema.

Uz dugotrajnu upotrebu interferona, tijelo proizvodi antitijela na interferon, što ga čini nesposobnim da se bori protiv virusa. Razlog za ove pojave leži u prisustvu albumina u preparatima na bazi interferona.

Albumin se dobija iz krvi, tako da postoji rizik (iako minimalan) od zaraze hepatitisom i drugim bolestima koje se prenose krvlju.

Ime droge	Podtip INF	Način dobijanja	farmakološki efekat	Indikacije za upotrebu
Interferon		Biosinteza u kultivisanim leukocitima krvi donora pod uticajem virusa	Antivirusno, imunomodulatorno, antiproliferativno	Virusne bolesti, leukemija, maligni melanom, rak bubrega, karcinoidni sindrom
Interlock		Biosinteza u kultivisanim leukocitima krvi donora pod uticajem paramikovirusa	Suzbija aktivnost brojnih virusa	Virusne bolesti oka, hepatitis	Rekombinantna	Antivirusno, imunomodulatorno, inhibira proliferaciju širokog spektra tumorskih ćelija	Epitelni oblik akutne i rekurentne virusne infekcije oka; onkološke bolesti
Interferon alfa-2a		Rekombinantna. Protein koji sadrži 165 aminokiselina	Antivirusno, antitumorsko djelovanje	Leukemijska retikuloendotelioza, Kaposijev sarkom, rak bubrega, rak mokraćne bešike, melanom, herpes zoster
Reaferon		Rekombinantni INF proizveden od bakterijskog soja pseudomonasa, čiji genetski aparat sadrži gen za humani leukocitni IFN α2. Identično IFN α2 humanih leukocita.		Virusne, tumorske bolesti
Interferon alfa – n1		Visoko pročišćeni ljudski INF	Antivirusno	Hronični aktivni infektivni hepatitis B
Inreferon beta		Superprodukcija humanih fibroblasta stimulatorom u prisustvu metaboličkih inhibitora	Antivirusno, imunomodulatorno, antitumorsko djelovanje	Hronične virusne infekcije u oftalmologiji, ginekologiji i urologiji, dermatologiji, hepatologiji, onkologiji
Interferon gama		Rekombinantna	Antivirusno, imunomodulatorno, antitumorsko djelovanje	Hronične granulomatozne bolesti

1. www.antibiotic.ru/ab/brviri.shtml

2. www.interferon.su/php/content.php?id=71

3. www.pharmvestnik.ru

4. Privremeni farmakopejski članak 42U-23/60-439-97. Interferon humani rekombinantni alfa-2.

5. Gavrikov A.V. Optimizacija biotehnološke proizvodnje rekombinantnih humanih interferonskih supstanci - M., 2003,

6. Glick B., Pasternak J. Molekularna biotehnologija / B. Glick, J. Pasternak. – M., Mir, 2002.

7. Državna farmakopeja SSSR-a. XI izd., broj 1.- P. 175.

8. Državni registar lijekova / Ed. A.V. Katlinsky i drugi - M., 2002.

9. Naroditsky B.S. Molekularna biotehnologija interferona. // zbornik naučno-praktične konferencije “Interferon – 50 godina”. – M., 2007, str. 17-23

10. Osnove farmaceutske biotehnologije: Udžbenik / T.P. Prishchep, V.S. Čučalin, K.L. Zaikov, L.K. Mikhaleva. – Rostov na Donu: Phoenix; Tomsk: Izdavačka kuća NTL, 2006.

11. Frolov A.F., Vovk A.D., Dyadyun S.T. i dr. Efikasnost rekombinantnog alfa-dva-interferona kod virusnog hepatitisa B // Medicinski poslovi - Kijev, 1990. - Br. 9. - P. 105–108.