Reakcija imunofluorescencije - RIF (Coons metoda) Postoje tri vrste direktne, indirektne i komplementarne metode. Koonsova reakcija je brza dijagnostička metoda za identifikaciju mikrobnih antigena ili određivanje antitijela.
Direktna RIF metoda zasniva se na činjenici da su tkivni antigeni ili mikrobi tretirani imunim serumima s antitijelima označenim fluorohromima u stanju da svijetle u UV zracima fluorescentnog mikroskopa. Bakterije u razmazu tretiranom takvim luminiscentnim serumom sijaju duž periferije ćelije u obliku zelene ivice.
Indirektna RIF metoda uključuje identifikaciju kompleksa antigen-antitijelo korištenjem
antiglobulinski (anti-antitijela) serum obilježen fluorohromom. Da bi se to postiglo, razmazi iz suspenzije mikroba tretiraju se antitijelima iz antimikrobnog zečjeg dijagnostičkog seruma. Zatim se ispiru antitela koja nisu vezana mikrobnim antigenima, a preostala antitela na mikrobima se detektuju tretiranjem razmaza sa antiglobulinskim (anti-zečjim) serumom označenim
fluorohromi. Kao rezultat, formira se kompleks mikroba + antimikrobna zečja antitijela + antizečja antitijela označena fluorohromom. Ovaj kompleks se uočava u fluorescentnim
mikroskop, kao i kod direktne metode.
23. Enzimski imunotest Sastojci, postavljanje, obračun, evaluacija. Područja upotrebe.
I Radioimunotest.
Radioimuna metoda ili analiza (RIA) je visoko osjetljiva metoda zasnovana na reakciji antigen-antitijelo korištenjem antigena ili antitijela obilježenih radionuklidom (125J, 14C, ZN, 51Cr, itd.). Nakon njihove interakcije, nastali radioaktivni imunološki kompleks se odvaja i njegova radioaktivnost se utvrđuje u odgovarajućem brojaču (beta ili gama zračenje). Intenzitet zračenja je direktno proporcionalan broju vezanih molekula antigena i antitijela.
dodati pacijentov krvni serum, antiglobulinski serum označen enzimom i supstrat/hromogen za enzim.
II. Prilikom određivanja antigena, antigen se dodaje u jažice sa sorbiranim antitijelima (npr. krvni serum sa željenim antigenom), dodaju se dijagnostički serum protiv njega i sekundarna antitijela (protiv dijagnostičkog seruma) označena enzimom, i onda supstrat/hromogen za enzim.
24. Reakcije imunološke lize, primjena. Reakcija fiksacije komplementa. Sastojci, postavka, računovodstvo, evaluacija. Aplikacija.
Reakcija fiksacije komplementa (CFR) je da kada antigeni i antitijela odgovaraju jedni drugima, oni formiraju imuni kompleks, za koji je komplement (C) vezan preko Fc fragmenta antitijela, a komplement je vezan kompleksom antigen-antitijelo. Ako se kompleks antigen-antitijelo ne formira, komplement ostaje slobodan. RSK se provodi u dvije faze: 1. faza - inkubacija smjese koja sadrži antigen + antitijelo + komplement, 2. faza (indikator) - detekcija slobodnog komplementa u smjesi dodavanjem hemolitičkog sistema koji se sastoji od ovčijih eritrocita i hemolitičkog seruma koji sadrži antitela na njih. U 1. fazi reakcije, kada se formira kompleks antigen-antitijelo, vezuje se komplement, a zatim u 2. fazi neće doći do hemolize eritrocita senzibiliziranih antitijelima (reakcija je pozitivna). Ako se antigen i antitijelo ne poklapaju (nema antigena ili antitijela u uzorku testa), komplement ostaje slobodan i u 2. fazi se pridružuje kompleksu eritrocit-anti-eritrocitno antitijelo, što uzrokuje hemolizu (negativna reakcija).
25. Dinamika formiranja ćelijskog imunološkog odgovora, njegove manifestacije. Imunološki
memorija.
Imuni ćelijski odgovor (ICR) je složena, višekomponentna kooperativna reakcija imunog sistema izazvana stranim antigenom (epitopi T-ćelija). Implementirano T-sistemom imuniteta. KIO faze
1. hvatanje antigena pomoću APC
2. Procesor. AG u proteazomima.
3. Formiranje kompleksa peptid + MHC klase I i II.
4. Transport komplementa do APC membrane.
5. Prepoznavanje komplementa od strane antigen-specifičnih T pomoćnih ćelija 1
6. aktivacija APC i T-helpera 1, oslobađanje IL-2 i gama interferona od strane E-helpera 1. Proliferacija i diferencijacija u području antigen zavisnih T limfocita.
7. Formiranje zrelih T-limfocita različitih populacija i memorijskih T-limfocita.
8. Interakcija zrelih T-limfocita sa Ag i implementacija finalnog efektora.
Manifestacije CIO-a:
antiinfektivna AI:
antivirusno,
antibakterijski (intracelularne bakterije);
alergije tipa IV i I;
antitumorski AI;
transplant AI;
imunološka tolerancija;
imunološka memorija;
autoimunih procesa.
26. Karakteristike regulatornih i efektorskih subpopulacija T-limfocita. Basic
markeri. T ćelijski receptor (TCR). Genetska kontrola diverziteta TCR-a
T limfociti predstavljaju drugu važnu populaciju limfocita, čiji se prekursori formiraju u koštanoj srži, a zatim migriraju radi daljeg sazrijevanja i
diferencijacija u timus (naziv “T-limfocit” odražava ovisnost o timusu kao glavnom mjestu rane faze sazrijevanja).
Prema spektru biološke aktivnosti, T-limfociti su regulatorne i efektorske ćelije koje obezbeđuju adaptivnu funkciju T-imunog sistema. Ne proizvode molekule antitijela. TCR je membranski molekul koji se razlikuje od BCR-a, ali je strukturno i funkcionalno sličan antitijelima.
TCR – AG-specifičan. receptor. To je glavni molekul koji pripada Ig superfamiliji. Ima 3 dijela: supramembranski, membranski i citoplazmatski. TCR rep formiraju 2 globularna molekula alfa i beta, koji imaju varijabilne i konstantne domene (Vα i Vβ, Cα i Cβ).
Vα i Vβ formiraju aktivni TCR kompleks. Postoje 3 hipervarijabilne regije - konstantno određene regije (CDR). Funkcija KDO je prepoznavanje i vezivanje peptida T-ćelija, tj. determinantne grupe hipertenzije. TCR čvrsto sjedi na ćeliji i njegov citoplazmatski rep, njegov citoplazmatski dio, uključen je u provođenje inf. U jezgro nakon njegove interakcije sa AG. Približno 90% TCR. Oni nose alfa i beta lance, a otprilike 10% nosi gama i delta lance.
TCR je genetski kodiran. α i γ lanci, analogno IG lakim lancima, kodirani su V, G i C genima, a β i δ, po analogiji sa IG teškim lancima, kodirani su V, G, E. α i γ su na hromozomu 7, a β i δ su na hromozomu 14.
CD-3 receptor je komplementarna struktura, Ig molekul. Formiraju ga 3 transmembranska proteina: εδ, εγ i dimer-zeta., supramembrana, vmembrana i citosolni rep. Oni i TCR čine jedan kompleks, koji osigurava provođenje antigen-specifičnih signala u jezgro ćelije
CD4 i CD8. Oni se izražavaju ili istovremeno sa TCR-om ili odvojeno od njega. Oni djeluju kao ko-receptori. Oni pojačavaju adheziju na ćeliju koja predstavlja Ag. Oni osiguravaju provođenje signala specifičnog za antigen u ćelijsku jezgru.
T-limfociti se dijele prema vrsti prepoznavanja, MOLEKULI:
CD4 prepoznat MCG peptid klase 2
CD8 peptid + klasa 1 MHC
Karakteristike glavnih subpopulacija T-limfocita: populacija T-limfocita može se klasificirati u tri klase:
A. Pomagači, efektori HST (CD 4+) i citotoksični supresori (CD 8+);
B. Nestimulisane (CD 45 RA+) i memorijske ćelije (CD 45 RO+);
C. Tip 1 - (proizvodnja IL-2, INF-gama, TNF-beta);
Tip 2 - (proizvodnja IL-4, IL-5, IL-6, IL9, IL 10).
Reakcija imunofluorescencije (RIF) je serološka reakcija koja omogućava otkrivanje antitijela na poznate antigene. Metoda uključuje mikroskopiju obojenih razmaza.
Ova reakcija se koristi u imunologiji, virusologiji i mikrobiologiji. Omogućava vam da odredite prisutnost virusa, bakterija, gljivica, protozoa i ICC. RIF se vrlo široko koristi u dijagnostičkoj praksi za detekciju virusnih i bakterijskih antigena u infektivnom materijalu. Metoda se zasniva na sposobnosti fluorohroma da se veže za proteine bez narušavanja njihove imunološke specifičnosti. Uglavnom se koristi u dijagnostici infekcija urinarnog trakta.
Postoje sljedeće metode za izvođenje reakcije imunofluorescencije: direktna, indirektna, s komplementom. Direktna metoda uključuje bojenje materijala fluorohromima. Zbog sposobnosti mikrobnih ili tkivnih antigena da svijetle u UV zracima fluorescentnog mikroskopa, oni se definiraju kao ćelije sa svijetlo obojenim zelenim rubom.
Indirektna metoda uključuje određivanje kompleksa antigen+antitijelo. Za to se eksperimentalni materijal tretira antitijelima iz antimikrobnog zečjeg seruma namijenjenog dijagnostici. Nakon što se antitijela vežu za mikrobe, oni se odvajaju od onih koji se nisu vezali i tretiraju serumom protiv zeca označenim fluorohromom. Nakon toga, ultraljubičastim mikroskopom se određuje kompleks mikroba + animikrobna antitijela + anti-zečja antitijela na isti način kao i direktnom metodom.
Imunofluorescentna reakcija je neophodna u dijagnostici sifilisa. Pod uticajem fluorohroma, uzročnik sifilisa se identifikuje kao ćelija sa žuto-zelenom granicom. Odsustvo luminiscencije znači da pacijent nije zaražen sifilisom. Ovaj test se često propisuje za pozitivnu Wassermanovu reakciju. Ova metoda je vrlo učinkovita u dijagnostici, jer vam omogućava da identifikujete patogen u ranim fazama bolesti.
Osim što RIF omogućava dijagnosticiranje sifilisa, koristi se i za određivanje prisutnosti patogena kao što su klamidija, mikoplazma, trihomonas, kao i uzročnici gonoreje i genitalnog herpesa.
Za analizu se koriste brisevi ili venska krv. Postupak uzimanja brisa je potpuno bezbolan i ne predstavlja nikakvu opasnost. Za ovu analizu potrebno je pripremiti se. Dvanaest sati prije ne preporučuje se korištenje higijenskih proizvoda kao što su malo ili gelovi. Također, ponekad se, prema indikacijama ljekara, vrši i provokacija. Da biste to učinili, preporučuje se konzumiranje začinjene hrane ili alkohola, ili ubrizgavanje provokativnih supstanci, poput gonovaccine ili pirogenala. Uz to, interval između uzimanja antibakterijskih lijekova i uzimanja testa mora biti najmanje četrnaest dana.
Prilikom procjene rezultata treba uzeti u obzir činjenicu da se luminiscencija ne opaža samo kod živih bakterija, već i kod mrtvih, a to se posebno odnosi na klamidiju. Nakon kursa antibiotika, mrtve ćelije klamidije takođe sijaju.
Uz pravilnu pripremu pacijenta i poštivanje tehnike uzimanja brisa, ova analiza vam omogućava da identifikujete bolesti u ranim fazama, što je vrlo važno za pravovremeno liječenje. Pozitivni aspekti ove metode su kratko vrijeme za dobijanje rezultata, lakoća implementacije i niska cijena analize.
Nedostaci uključuju činjenicu da je za provođenje analize potrebna prilično velika količina ispitnog materijala. Osim toga, samo iskusni stručnjak treba procijeniti rezultate.
Sadržaj:Direktne metode
Mikroskopija tamnog polja
Treponema pallidum ne može rasti na hranjivim podlogama i ne vizualizira se pod svjetlosnim mikroskopom. Budući da je detekcija patogena konvencionalnom mikroskopom nemoguće, koristi se poseban mikroskop tamnog polja, gdje je patogen vidljiv u obliku spirale na tamnoj pozadini.
Za izvođenje mikroskopije, biomaterijal se uzima iz sumnjive lezije. Mikroskopija tamnog polja je mogući način za procjenu kožnih lezija kao što su šankr primarnog sifilisa ili kondilomi sekundarnog sifilisa. Ako je materijal makulopapularne lezije suv, pregledava se aspirat limfnih čvorova.
Negativan rezultat ne isključuje patološki proces, statistički, otkrivanje patogena moguće je samo u 80%.
PCR dijagnostika
Reakcija usmjerena na višestruko povećanje DNK Treponema pallidum omogućava da se izvuče zaključak o infekciji sifilisom ili njegovom odsustvu.
Biomaterijal za analizu može biti bilo šta: krv, sadržaj sifilida, cerebrospinalna tečnost itd. Test je pogodan za period inkubacije.
PCR je potpuno specifičan.
Indirektni serološki testovi na sifilis: treponemski i netreponemski testovi
Serološki testovi (DSR ili kompleks seroloških reakcija) smatraju se najčešćom metodom za dijagnosticiranje svih stadija sifilisa. Razlikuju se sljedeće reakcije:
- aglutinacija;
- padavine;
- imunofluorescencija;
- enzimski imunotest, itd.
Serološki testovi na sifilis se također dijele na treponemske i netreponemske.
Ne-treponemski
Ako se sumnja na stečeni sifilis, radi se skrining testiranje za koje se koriste ne-treponemski testovi , koji otkrivaju antitijela na lipoidne antigene tkiva domaćina ili patogena u različitim modifikacijama. U Ruskoj Federaciji rutinski se provodi reakcija mikroprecipitacije (MPR) koja omogućava otkrivanje antitijela na ćelije oštećene patogenom u krvi. Pouzdanost skrininga je visoka, ali je specifičnost niska, pa je testiranje pogodno za primarni masovni skrining u preventivne svrhe.
Procjenjuje se da je osjetljivost brzih testova 78-86% za otkrivanje primarnog sifilisa, 100% za sekundarni sifilis i 95-98% za otkrivanje tercijalnog sifilisa.
Specifičnost - od 85-99%, ponekad i manje, što se javlja u sledećim uslovima:
- gestacija;
- menstruacija;
- onkologija;
- bolesti vezivnog tkiva;
- virusne bolesti;
- bolesti jetre;
- vakcinacija;
- “svježi” MI;
- tifus, itd.
Osim toga, višak masnoće u ishrani, pijenje alkoholnih pića i uzimanje određenih lijekova mogu dovesti do lažno pozitivnih nalaza.
Rezultati skrining testa postaju pozitivni 1-2 sedmice nakon formiranja šankra. Netreponemski testovi daju negativan odgovor neko vrijeme nakon tretmana. U slučaju HIV statusa, netreponemska antitijela se mogu otkriti dugo vremena, ponekad i tokom života (što potvrđuju rezultati odgovarajuće randomizirane studije).
Druge vrste netreponemskih testova: VDRL, plazmoreagin test (RPR), toluidin crveni test, reakcija fiksacije komplementa sa kardiolipinskim antigenom (PCR).
Wassermanova reakcija (RW)
Fiksacija komplementa je odgovor imunog sistema na infekciju; rezultat varira od negativnog (stavite “-”) do oštro pozitivnog “++++” ili 4 plusa.
U početnoj fazi primarnog sifilisa RW je negativan.
Treponemal
Zbog mogućnosti lažno pozitivnih rezultata, za potvrdu bilo kakvog pozitivnog ili dvosmislenog rezultata netreponemskog testa, koristite treponemski testovi:
- imunofluorescentna reakcija (RIF);
- hemaglutinacija (HRHA),
- enzimski imunosorbentni test (ELISA) za imunoglobuline G (IgG) i imunoglobulin M (IgM);
- imunobloting;
- RIBT/RIT (reakcija imobilizacije treponema pallidum).
Treponemski testovi se ne koriste za procjenu efikasnosti terapije.
RIF za određivanje treponemskih antitijela klase IgG koristi se nakon pozitivnog rezultata brzih testova (osjetljivost 84% za primarni sifilis i 100% za ostale stadijume, specifičnost 96%). Nije primjenjivo za dijagnostiku kod novorođenčadi.
Neke laboratorije koriste "obrnute" skrining testove.
CDC (Centri za kontrolu i prevenciju bolesti, SAD) preporučuje tradicionalne studije, uz verifikaciju kvantitativnim netreponemskim testovima, a ako je rezultat pozitivan, provodi se liječenje.
Imunofluorescentna reakcija (RIF)
Na prikupljeni materijal se nanosi serum sa fluorohromom obeleženim antitelima specifičnim za antigen Treponema pallidum, patogen privlači imunološke komplekse, zbog čega počinje da svetli u fluorescentnom mikroskopu.
Reakcija pasivne hemoaglutinacije ili RPHA
Prije pojave hemaglutinacije (ljepljenja) crvenih krvnih zrnaca moraju proći najmanje 4 sedmice od trenutka uvođenja Treponema pallidum.
Pripremljena crvena krvna zrnca s fiksnim proteinskim frakcijama patogena stupaju u interakciju s plazmom; ako postoje antitijela na sifilis, dolazi do reakcije.
Pogodan za potvrđivanje bilo kojeg stadijuma bolesti.
Vezani imunosorbentni test
Zasnovan je na reakciji antigen-antitijelo. Otkrivaju se antitijela različitih klasa, koja se mogu kvantificirati.
Dobijeni rezultati omogućavaju suditi o trajanju patološkog procesa, uspješnosti liječenja, imunološkom statusu i aktivnosti patogena.
Imunobloting je vrsta ELISA, koja se koristi za dubinsku dijagnostiku u slučaju svih sumnjivih rezultata.
Osetljivost i specifičnost su blizu 100%, današnja ultra-senzitivna metoda za identifikaciju proteina.
RIBT
Metoda se zasniva na reakciji antigen-antitijelo. Antigen je Treponema pallidum, uzgajan u testisima kunića. U interakciji s antitijelima zaražene osobe, patogeni gube svoju mobilnost. Reakcija se procjenjuje pomoću mikroskopije tamnog polja.
Bilješka
RIBT se trenutno rjeđe koristi zbog svoje složenosti, ali analiza može biti korisna za rješavanje kontroverznih pitanja (lažno pozitivne reakcije na sifilis).
Diferencijalna dijagnoza
Najveću poteškoću predstavlja dijagnosticiranje tercijalnog sifilisa, koji je uzrokovan simptomima kardiovaskularnog i nervnog sistema, kao i manifestacijama na koži.
Pacijenti se moraju pregledati i.
Navodimo bolesti s kojima se provodi diferencijalna dijagnoza za sifilis:
- dermatološke manifestacije;
- genitalne bradavice ();
- donovanoza;
- lymphogranuloma venereum;
- virus;
- skretanje.
Gdje počinje dijagnoza sifilisa?
U početku se vodi razgovor sa pacijentom, tokom kojeg se razjašnjavaju detalji: kada je došlo do sumnjivog seksualnog kontakta i koje pritužbe postoje.
Nakon prikupljanja anamneze, prelaze na fizikalni pregled, pri čemu posebnu pažnju posvećuju genitalnim i analnim područjima, sluznicama i limfnim čvorovima. Preliminarna dijagnoza je možda već postavljena. Konačna verifikacija se vrši pomoću laboratorijskih testova.
Pojednostavljeno rečeno, neki testovi identificiraju uzročnika sifilisa, dok drugi odražavaju reakciju tijela na unošenje Treponema pallidum.
Za postavljanje konačne dijagnoze, RPHA treba dopuniti 1 treponemskom i 1 netreponemskom analizom.
Dijagnoza sifilisa kod trudnica
Obavezno testiranje na sifilis provodi se nekoliko puta tokom trudnoće.
Uputnica za CSR test se izdaje tokom prve konsultacije žene, a pregled se obavlja tri puta tokom trudnoće. Posebno veliku pažnju zahtevaju pacijenti iz grupe visokog rizika sa komplikovanom anamnezom: asocijalni, zavisni itd.
Ako su rezultati testa pozitivni, provodi se dublja dijagnoza i propisuje liječenje prema indikacijama, što ovisi o stadiju i kliničkim manifestacijama.
Dijagnoza kongenitalnog sifilisa
Većina djece se rađa od majki koje nisu liječene ili koje se liječe prekasno.
Treponemski testovi koji koriste neonatalni serum se ne preporučuju zbog pasivnog prijenosa IgG antitijela. Sva novorođenčad rođena od majki sa sifilisom treba biti testirana kvantitativnim netreponemskim serološkim testom (RPR ili VDRL) koji se izvodi korištenjem seruma novorođenčeta.
Kako tumačiti rezultate seroloških studija
Reakcija mikroprecipitacije, RIF i RPGA su negativni - normalni, pozitivni - potvrda sifilisa.
Reakcija mikroprecipitacije je negativna, ostali su pozitivni - sifilis u anamnezi nakon specifične terapije ili kasni stadijum.
Negativan RIF sa pozitivnim RPGA i reakcijom mikroprecipitacije - rezultat je pod sumnjom, ponovite sveobuhvatnu procenu.
Negativan rezultat RIF-a i mikroprecipitacije, ali pozitivan RPHA je stanje nakon uspješne antibiotske terapije ili lažno pozitivan rezultat.
Pozitivan RIF sa negativnim RPGA i reakcijom mikroprecipitacije - rana faza, obavljeno liječenje ili nepouzdan rezultat.
Pozitivna reakcija mikroprecipitacije, koja nije potvrđena ni RPGA ni RIF-om, znači odsustvo sifilisa.
Instrumentalni pregled na sifilis
Instrumentalna dijagnostika se provodi ovisno o zahvaćenosti organa. Na primjer, granulomatozno oboljenje jetre može se vidjeti u abdomenu.
Pacijenti sa tercijarnim sifilisom mogu pokazati proširenje aorte. Linearna kalcifikacija duž aorte ukazuje na sifilitički aortitis.
Ova metoda koristi fenomen luminescencije.
Suština fenomena luminescencije je u tome da kada različite vrste energije (svjetlosna, električna itd.) apsorbiraju molekule određenih tvari, njihovi atomi prelaze u pobuđeno stanje, a zatim, vraćajući se u prvobitno stanje, oslobađaju apsorbovana energija u obliku svetlosnog zračenja.
U RIF-u se luminiscencija pojavljuje u obliku fluorescencije - to je sjaj koji se javlja u trenutku ozračivanja uzbudljivom svjetlošću i prestaje odmah nakon njegovog završetka.
Mnoge tvari i živi mikroorganizmi imaju vlastitu fluorescenciju (tzv. primarnu), ali je njen intenzitet vrlo nizak. Supstance koje imaju intenzivnu primarnu fluorescenciju i koje se koriste za davanje fluorescentnih svojstava nefluorescentnim supstancama nazivaju se fluorohromi. Ova indukovana fluorescencija naziva se sekundarna.
Za pobuđivanje fluorescencije tokom luminiscentne mikroskopije najčešće se koristi ultraljubičasti ili plavo-ljubičasti dio spektra (talasna dužina 300-460 nm). U ove svrhe laboratorije imaju fluorescentne mikroskope različitih modela - ML-1-ML-4, "Lumam".
U virološkoj praksi koriste se dvije glavne metode fluorescentne mikroskopije: fluorohromizacija i fluorescentna antitijela (ili FIF).
Fluorohromiranje- Ovo je tretman lekova fluorohromom u cilju povećanja jačine i kontrasta njihovog sjaja. Najveći interes je fluorohrom akridin narandžasta, koja izaziva polihromatsku fluorescenciju nukleinskih kiselina. Dakle, kada se lijekovi tretiraju ovim fluorohromom, deoksiribonukleinska kiselina fluorescira svijetlo zeleno, a ribonukleinska kiselina fluorescira rubin crveno.
RIF metoda se zasniva na činjenici da antitijela u kombinaciji s fluorohromom zadržavaju sposobnost da uđu u specifičnu vezu sa homolognim antigenom. Nastali kompleks antigen + antitijelo, zbog prisustva fluorohroma u njemu, detektuje se pod fluorescentnim mikroskopom po karakterističnom sjaju.
Za dobivanje antitijela koriste se visokoaktivni hiperimuni serumi iz kojih se izoluju antitijela i obilježavaju fluorohromom. Najčešće korišćeni fluorohromi su FITC-fluorescein izotiocijanat (zeleno svetlo) i PCX-rodamin sulfohlorid (crveno svetlo). Antitijela označena fluorohromom nazivaju se konjugati.
Postupak pripreme i bojenja preparata je sljedeći:
- pripremiti razmaze, otiske organa na stakalcima ili inficiranu ćelijsku kulturu na naslovnim stakalcima; Histosekcije se također mogu koristiti;
- preparati se suše na vazduhu i fiksiraju u ohlađenom acetonu na sobnoj temperaturi ili na minus 15°C (od 15 minuta do 4-16 sati);
- obojeno direktnom ili indirektnom metodom; voditi evidenciju pod fluorescentnim mikroskopom na osnovu intenziteta sjaja, procijenjenog u krstovima.
Istovremeno se pripremaju i boje - kontrolišu preparati od zdrave životinje.
Postoje dvije glavne metode korištenja fluorescentnih antitijela: direktna i indirektna.
Direktna metoda (u jednom koraku). Na fiksirani preparat se nanosi konjugat (fluorescentni serum za navodni virus) i drži 30 minuta na temperaturi od 37 °C u vlažnoj komori. Zatim se preparat ispere od nevezanog konjugata fiziološkim rastvorom (pH 7,2 - 7,5), osuši na vazduhu, nanese se nefluorescentno ulje i pregleda pod mikroskopom.
Direktna metoda omogućava detekciju i identifikaciju antigena. Da biste to učinili, morate imati fluorescentni serum za svaki virus.
Indirektna metoda (dvostepena). Neobilježeni serum koji sadrži antitijela na navodni virus nanosi se na fiksirani preparat, inkubira 30 minuta na 37 °C, a nevezana antitijela se isperu. Fluorescentni serum protiv vrsta koji odgovara vrsti životinja koje proizvode homologna antivirusna antitijela se nanosi na preparat i inkubira 30 minuta na 37 °C. Zatim se preparat ispere od nevezanih obeleženih antitela, osuši na vazduhu, nanese se nefluorescentno ulje i pregleda pod fluorescentnim mikroskopom.
Anti-species serumi se dobijaju imunizacijom globulinima životinja onih vrsta koje služe kao proizvođači antivirusnih antitijela. Dakle, ako su antivirusna antitijela dobivena kod kunića, tada se koristi fluorescentni anti-zečji serum.
Indirektna metoda omogućava ne samo otkrivanje i identifikaciju antigena, već i otkrivanje i određivanje titra antitijela. Osim toga, ova metoda može detektirati antigene različitih virusa jednim označenim serumom, budući da se zasniva na korištenju seruma protiv vrsta. Najčešće se koriste serumi protiv zeca, goveda, serumi protiv konja i globulinski serumi protiv zamorca.
Razvijeno je nekoliko modifikacija indirektne metode. Metod koji koristi komplement zaslužuje najveću pažnju. Metoda se sastoji u nanošenju inaktiviranog nefluorescentnog specifičnog seruma i komplementa zamorčića na fiksirani preparat, inkubacije 30 minuta na 37 °C, ispiranja i identifikacije kompleksa antigen + antitijelo + komplement, primjene fluorescentnog antikomplementarnog seruma i inkubacije 30 minuta na 37 °C, isprano, osušeno na zraku i ispitano pod fluorescentnim mikroskopom.
Prednosti RIF-a: visoka specifičnost i osjetljivost; jednostavnost tehnike uprizorenja; Potreban je minimalan broj komponenti. Ovo je ekspresna dijagnostička metoda, jer odgovor možete dobiti u roku od nekoliko sati. Nedostaci su subjektivnost u proceni intenziteta sjaja i, nažalost, ponekad su fluorescentni serumi lošeg kvaliteta. Trenutno se RIF široko koristi u dijagnostici virusnih bolesti životinja.
Ako pronađete grešku, označite dio teksta i kliknite Ctrl+Enter.
Metoda imunofluorescencije (RIF, imunofluorescentna reakcija, Coons reakcija) je metoda za detekciju specifičnih antigena korištenjem antitijela konjugiranih na fluorohrom. Ima visoku osjetljivost i specifičnost.
Koristi se za ekspresnu dijagnostiku infektivnih bolesti (identifikacija patogena u test materijalu), kao i za određivanje AT i površinskih receptora i markera leukocita (imunofenotipizacija) i drugih ćelija.
Detekcija bakterijskih i virusnih antigena u infektivnim materijalima, životinjskim tkivima i ćelijskim kulturama pomoću fluorescentnih antitijela (seruma) ima široku primjenu u dijagnostičkoj praksi. Priprema fluorescentnih seruma zasniva se na sposobnosti određenih fluorohroma (na primjer, fluorescein izotiocijanata) da uđu u kemijsku vezu s proteinima seruma bez narušavanja njihove imunološke specifičnosti.
Postoje tri vrste metoda: direktna, indirektna, sa dopunom. Direktna RIF metoda zasniva se na činjenici da su tkivni antigeni ili mikrobi tretirani imunim serumima s antitijelima označenim fluorohromima u stanju da svijetle u UV zracima fluorescentnog mikroskopa. Bakterije u razmazu tretiranom takvim luminiscentnim serumom sijaju duž periferije ćelije u obliku zelene ivice.
Indirektna RIF metoda uključuje otkrivanje kompleksa antigen-antitijelo korištenjem seruma antiglobulina (anti-antitijela) označenog fluorohromom. Da bi se to postiglo, razmazi iz suspenzije mikroba tretiraju se antitijelima iz antimikrobnog zečjeg dijagnostičkog seruma. Zatim se ispiru antitela koja nisu vezana mikrobnim antigenima, a preostala antitela na mikrobima se detektuju tretiranjem razmaza antiglobulinskim (anti-zečjim) serumom obeleženim fluorohromima. Kao rezultat, formira se kompleks mikroba + antimikrobna zečja antitijela + anti-zečja antitijela označena fluorohromom. Ovaj kompleks se posmatra u fluorescentnom mikroskopu, kao u direktnoj metodi.
Mehanizam. Razmaz test materijala se priprema na staklenom predmetu, fiksira na plamen i tretira imunološkim zečjim serumom koji sadrži antitijela protiv antigena patogena. Da bi se formirao kompleks antigen-antitijelo, preparat se stavlja u vlažnu komoru i inkubira na 37 °C 15 minuta, nakon čega se temeljito ispere izotoničnom otopinom natrijum hlorida kako bi se uklonila antitijela koja se nisu vezala za antigen. Zatim se na preparat nanese fluorescentni antiglobulinski serum protiv zečjih globulina, inkubira 15 minuta na 37 °C, a zatim se preparat dobro ispere izotoničnim rastvorom natrijum hlorida. Kao rezultat vezivanja fluorescentnog antiglobulinskog seruma sa specifičnim antitijelima fiksiranim na antigen, nastaju svijetleći kompleksi antigen-antitijelo, koji se otkrivaju fluorescentnom mikroskopijom.
22. Enzimski imunotest- laboratorijska imunološka metoda za kvalitativno ili kvantitativno određivanje različitih spojeva, makromolekula, virusa itd., koja se zasniva na specifičnoj reakciji antigen-antitijelo. Identifikacija formiranog kompleksa vrši se korištenjem enzima kao oznake za snimanje signala.
klasifikacija:
Konkurentski (sistem istovremeno sadrži analizirano jedinjenje i njegov analog)
Nekonkurentno (ako je samo analizirano jedinjenje i njegovi odgovarajući centri vezivanja (antigen i specifična antitela) prisutni u sistemu)
Direktno i indirektno
1.serum koji sadrži mješavinu antitijela se inkubira sa antitijelima fiksiranim na čvrstu podlogu.
2.pri čemu se ne vežu ag se uklanjaju ponovljenim pranjem.
3. dodati enzimom obeležen antiserum antitelu koje vezuje antitelo
4. odrediti količinu markerskog enzima vezanog za at
Indirektno:
Ab-pozitivni serum
1.specifična antitijela u test serumu vezuju antitijela fiksirana na čvrstu podlogu
2. specifična antitela obeležena enzimom ne stupaju u interakciju sa vezanim antitelima, sadržaj markera u supstratu je nizak
Ab-negativni serum
1. Nespecifična antitijela u test serumu ne vezuju antitijela fiksirana na čvrstu podlogu
2. Specifična antitela obeležena enzimom deluju sa fiksiranim antitelom – sadržaj markera je visok
Najčešći je IFA u čvrstoj fazi, u kojem se jedna od komponenti imunološke reakcije (antigen ili antitijelo) sorbira na čvrstom nosaču. Polistirenski mikropaneli se koriste kao čvrsti nosač. Prilikom određivanja antitijela, krvni serum obilježen enzimom i mješavina otopina za enzim i hromogen se uzastopno dodaju u jažice sa sorbiranim antigenom. Svaki put nakon dodavanja druge komponente, nevezani reagensi se uklanjaju iz jažica temeljnim pranjem. Ako je rezultat pozitivan, boja otopine hromogena se mijenja.
Čvrstofazni nosač može biti senzibiliziran ne samo antigenom, već i antitijelom. Zatim se u jažice sa sorbovanim antitelima dodaje željeni antigen, dodaje se imuni serum protiv antigena obeleženog enzimom, a zatim se dodaje mešavina rastvora supstrata za enzim i hromogena.
primjena: za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih virusnim i bakterijskim patogenima.
23. Serološka reakcija- reakcija kojom se proučava reakcija antigena (mikroba, virusa, stranog proteina) sa antitijelima u krvnom serumu.
Serološke studije- to su metode za proučavanje određenih antitijela ili antigena u krvnom serumu pacijenata, na osnovu imunoloških reakcija. Koriste se i za otkrivanje antigena mikroba ili tkiva u svrhu njihove identifikacije.
Detekcija antitijela na uzročnik infekcije ili odgovarajući antigen u krvnom serumu pacijenta omogućava nam da utvrdimo uzrok bolesti.
Serološke studije se koriste i za određivanje antigena krvnih grupa, tkivnih antigena i nivoa humoralnog imuniteta.
Serološke studije uključuju različite serološke reakcije:
1. Reakcija aglutinacije.
2. Reakcija precipitacije.
3. Reakcija neutralizacije.
4. Reakcija koja uključuje komplement.
5. Reakcija upotrebom obilježenih antitijela ili antigena.