Detekcija virusne DNK lančanom reakcijom polimeraze. Lančana reakcija polimeraze (PCR). Kome je propisano?

Provođenje PCR analize (PCR dijagnostike) počinje prikupljanjem materijala za pregled kod ginekologa, urologa ili dermatovenerologa. Kvalitetu i pouzdanost naknadno dobijenih rezultata osiguravaju najviša kvalifikacija i ogromno iskustvo ljekara medicinskog centra Euromedprestige, koji poštuju sva potrebna pravila za provođenje PCR analize: potpuna sterilnost, korištenje samo materijala za jednokratnu upotrebu.

Sakupljeni materijal iz četke stavlja se u posudu sa slanom otopinom. Nakon prikupljanja, uzorke treba što prije dostaviti u PCR laboratoriju.

PCR analiza se izvodi u laboratoriji u tri faze:

1. Ekstrakcija DNK
2. Amplifikacija fragmenata DNK
3. Detekcija produkata amplifikacije DNK

Ekstrakcija DNK je početna faza PCR dijagnostike, čija je suština sljedeća: liječnik uzima materijal za istraživanje od pacijenta i podvrgava ga posebnoj obradi. Tokom obrade, dvostruka spirala DNK se dijeli na pojedinačne niti. Materijalu pacijenta dodaje se posebna tekućina koja otapa organske tvari koje ometaju "čistoću" reakcije. Ovo uklanja lipide, aminokiseline, peptide, ugljikohidrate, proteine ​​i polisaharide. Kao rezultat, formira se DNK ili RNK.

Princip PCR metode je "konstrukcija" novih DNK ili RNK infekcija. To se ne može učiniti bez uklanjanja ćelijskog materijala.

Količina vremena utrošenog na ekstrakciju DNK ovisi o uzročniku infekcije i o vrsti materijala koji se koristi za PCR istraživanje. Na primjer, potrebno je 1,5-2 sata da se krv pripremi za sljedeću fazu.

0Niz ( => Analize) Niz ( => 2) Niz ( =>.html) 2

DNK amplifikacija

Da bi izvršili sljedeću fazu DNK dijagnostike – amplifikaciju DNK – liječnici koriste takozvane DNK matrice – DNK molekule infekcija, na koje će naknadno doći do „kloniranja“ DNK. Već je spomenuto da nije potrebno prisustvo kompletne DNK infekcije, za izvođenje ove faze dovoljan je mali komadić DNK molekula, koji je karakterističan samo za dati mikrob (infekciju).

Osnova amplifikacije DNK i, shodno tome, osnova cjelokupnog principa PCR reakcije je prirodni proces kompletiranja DNK za sva živa bića – replikacija DNK, koja se provodi udvostručavanjem jednog lanca DNK.

Počevši od jednog jedinog fragmenta DNK, laboratorijski doktor ga kopira i povećava broj kopija u režimu lančane reakcije: nakon prvog ciklusa već imate 2 fragmenta, nakon drugog ciklusa - 4, nakon trećeg - 8, nakon četvrti - 16, pa 32, 64, 128, 256... Sa svakim ciklusom se broj kopija udvostručuje, a nakon dvadeset ciklusa broj se već kreće u milione, a nakon trideset - u milijarde. Ciklus traje nekoliko minuta i svodi se na određenu promjenu temperature u vrlo malom hemijskom reaktoru. Ovdje, u otopini, sve potrebne komponente sinteze su prisutne u dovoljnim količinama, prije svega, nukleotidi A, G, T i C, a također se provode delikatne pripremne kemijske operacije tako da se odmah uzima tačna kopija iz svakog gotov segment DNK, zatim iz ove kopije - opet kopija, ovo je razgranata lančana reakcija.

Pričvršćivanjem prajmera na lanac DNK – umjetno sintetiziranih “komadića” DNK (parova nukleotida) sličnih DNK mikroba (infekcija) – formiraju se dvije kratke spirale koje se sastoje od dva lanca DNK sekcija, koje su neophodne za sintezu budućih DNK.

Sinteza novog lanca odvija se dovršavanjem svakog od dva lanca DNK. Proces amplifikacije odvija se uz pomoć specifične regije - DNK polimeraze, koja daje naziv laboratorijskoj metodi. Polimeraza djeluje kao katalizator reakcije i prati sekvencijalno vezivanje nukleotidnih baza na rastući novi lanac DNK.

Dakle, amplifikacija DNK je višestruko povećanje broja kopija DNK koje su specifične, odnosno svojstvene samo određenom organizmu. Nema potrebe da se kompletira ceo lanac DNK da bi se video infektivni agens. Potrebno je samo područje koje je karakteristično za datu bakteriju kao individuu.

5360 rub. Cijena sveobuhvatnog programa sa gastroenterologom

POPUST 25% NA KARDIOLOGU

- 25%primarni
Poseta lekaru
terapeut vikendom

5.160 RUB umjesto 5.420 rub. Skrining muškaraca na urološke infekcije

ALLERGOLOGY 5.120 RUB umjesto 5.590 rub.

Svi koraci pojačanja koji se jako ponavljaju javljaju se na različitim temperaturama. Za obavljanje PCR analize koristi se posebno programabilna oprema - PCR - termostat ili pojačalo, koji automatski mijenja temperature. Amplifikacija se provodi prema datom programu koji odgovara vrsti infekcije koja se otkriva. U zavisnosti od programa i vrste infekcije koja se otkriva, automatizovani PCR proces traje od 2 do 3 sata.

Kvalifikacije laboratorijskog doktora koji obavlja analizu igra važnu ulogu u PCR dijagnostici, od kojeg ovise ispravna podešavanja PCR opreme i interpretacija rezultata. Lekari Medicinskog centra Euromedprestige imaju veliko iskustvo u sprovođenju DNK dijagnostike, što obezbeđuje pouzdanost rezultata istraživanja i garantuje pozitivan uspeh u lečenju zaraznih bolesti. Da uradite PCR testove i izvršite kompletnu dijagnostiku i lečenje zaraznih bolesti u našem medicinskom centru Euromedprestige.

Tokom detekcije produkata amplifikacije, dobijena mješavina produkata amplifikacije se odvaja. Smjesi se dodaju specijalne otopine, koje fragmentima DNK daju sposobnost fluorescencije – reflektiraju se u narandžasto-crvenim svjetlećim prugama. Rezultirajući sjaj ukazuje na prisustvo DNK virusa, mikroba ili bakterija u materijalu uzetom od pacijenta za PCR analizu.

Lančana reakcija polimeraze (PCR)- eksperimentalna metoda molekularne biologije, koja je specifična amplifikacija nukleinskih kiselina inducirana sintetičkim oligonukleotidnim prajmerima in vitro.

Ideja o razvoju PCR metode pripada američkom istraživaču Kary Mullis, koji je 1983. godine stvorio metodu koja je omogućila amplificiranje DNK tokom cikličkih duplikacija pomoću enzima DNK polimeraze u umjetnim uvjetima. Nekoliko godina nakon objavljivanja ove ideje, 1993. godine, K. Mullis je za nju dobio Nobelovu nagradu.

Na početku primjene metode, nakon svakog ciklusa zagrijavanja-hlađenja, u reakcionu smjesu je bilo potrebno dodati DNK polimerazu, jer se na visokim temperaturama brzo inaktivira. Procedura je bila vrlo neefikasna i zahtijevala je mnogo vremena i enzima. Godine 1986. značajno je modificiran korištenjem DNK polimeraze iz termofilnih bakterija. Ovi enzimi su sposobni da izdrže mnoge reakcione cikluse, što omogućava automatizaciju PCR-a. Jedna od najčešće korištenih termostabilnih DNK polimeraza izolirana je iz bakterija Thermus aquaticus i imenovani Taq-DNK polimeraza.

Suština metode. Metoda se zasniva na ponovljenom selektivnom kopiranju specifičnog dijela DNK korištenjem enzima Taq DNK polimeraze. Lančana reakcija polimeraze omogućava dobijanje pojačala dužine do nekoliko hiljada parova baza. Da bi se povećala dužina PCR proizvoda na 20-40 hiljada parova baza, koristi se mješavina različitih polimeraza, ali to je još uvijek znatno manje od dužine kromosomske DNK eukariotske ćelije.

Reakcija se odvija u programabilnom termostatu (pojačivaču) - uređaju koji se može izvesti prilično brzo

hlađenje i zagrevanje epruveta (obično sa tačnošću od najmanje 0,1 °C). Pojačala vam omogućavaju postavljanje složenih programa, uključujući mogućnost "hot starta" i naknadnog skladištenja. Za PCR u realnom vremenu proizvode se uređaji opremljeni fluorescentnim detektorom. Postoje i uređaji sa automatskim poklopcem i pregradom za mikroploče, što im omogućava da se integrišu u automatizovane sisteme.

Obično se pri izvođenju PCR-a izvodi 20-45 ciklusa, od kojih se svaki sastoji od tri faze: denaturacija, žarenje prajmera, elongacija (sl. 6.1 i 6.2). Na sl. Slika 6.1 prikazuje dinamiku promjena temperature u epruveti tokom PCR ciklusa.

Rice. 6.1. Grafikon promjena temperature u epruveti tokom jednog ciklusa lančane reakcije polimeraze

Denaturacija DNK šablona se vrši zagrijavanjem reakcione smjese na 94-96 °C u trajanju od 5-90 s tako da se lanci DNK razdvoje. Treba napomenuti da se prije prvog ciklusa reakcijska smjesa prethodno zagrijava 2-5 minuta kako bi se u potpunosti denaturirala početna matrica, što omogućava smanjenje količine nespecifičnih produkta reakcije.

Rice. 6.2.Šema prvog kruga polimerazne lančane reakcije

Faza žarenja prajmera. Uz postepeno smanjenje temperature, prajmeri se komplementarno vezuju za matriks. Temperatura žarenja zavisi od sastava prajmera i obično je 4-5° niža od izračunate temperature topljenja. Trajanje etape je 5-60 s.

Tokom sledeće faze - izduženje- sinteza ćerke DNK lanca se dešava na matičnom matriksu. Temperatura elongacije zavisi od polimeraze. Obično korištene DNK polimeraze Taq i Pfu su najaktivnije na 72°C. Vrijeme elongacije, koje uglavnom ovisi o dužini PCR proizvoda, je tipično 1 minut na hiljadu parova baza.

Na kraju članka, vidi
Lančana reakcija polimeraze (PCR) izumio je 1983. Kary Mullis (američki naučnik). Nakon toga je dobio Nobelovu nagradu za ovaj izum. Trenutno je PCR dijagnostika jedna od najpreciznijih i najosjetljivijih metoda za dijagnosticiranje zaraznih bolesti.
Lančana reakcija polimeraze (PCR)- eksperimentalna metoda molekularne biologije, metoda za značajno povećanje malih koncentracija određenih fragmenata nukleinske kiseline (DNK) u biološkom materijalu (uzorku).
PCR metoda se zasniva na ponovljenom udvostručavanju određenog dijela DNK pomoću enzima u umjetnim uvjetima (in vitro). Kao rezultat, proizvode se količine DNK dovoljne za vizualnu detekciju. U ovom slučaju se kopira samo dio koji zadovoljava navedene uslove i to samo ako je prisutan u uzorku koji se proučava.
Osim jednostavnog povećanja broja DNK kopija (ovaj proces se naziva amplifikacija), PCR omogućava mnoge druge manipulacije s genetskim materijalom (uvođenje mutacija, spajanje fragmenata DNK), a široko se koristi u biološkoj i medicinskoj praksi, npr. , za dijagnosticiranje bolesti (nasljednih, infektivnih), za utvrđivanje očinstva, za kloniranje gena, uvođenje mutacija i izolaciju novih gena.

Specifičnost i primjena

Izvođenje PCR-a

Za izvođenje PCR-a u najjednostavnijem slučaju potrebne su sljedeće komponente:

• DNK šablon koji sadrži dio DNK koji treba amplificirati;
• dva prajmera komplementarna krajevima željenog fragmenta;
• termostabilna DNK polimeraza;
• deoksinukleotid trifosfati (A, G, C, T);
• Mg2+ joni neophodni za rad polimeraze;
• puferski rastvor.

PCR se izvodi u termičkom ciklusu - uređaju koji obezbjeđuje periodično hlađenje i zagrijavanje epruveta, obično s tačnošću od najmanje 0,1°C. Da biste izbjegli isparavanje reakcione smjese, dodajte ulje visokog ključanja, kao što je vazelin, u epruvetu. Dodatak specifičnih enzima može povećati prinos PCR reakcije.
Napredak reakcije

Tipično, PCR izvodi 20 - 35 ciklusa, od kojih se svaki sastoji od tri faze. Dvolančani DNK šablon se zagreva na 94 - 96°C (ili 98°C ako se koristi posebno termostabilna polimeraza) 0,5 - 2 minuta da bi se odvojili DNK lanci. Ova faza se zove denaturacija - razorene su vodikove veze između dva lanca. Ponekad se, prije prvog ciklusa, reakciona smjesa prethodno zagrijava 2 - 5 minuta da bi se matriks i prajmeri potpuno denaturirali.
Kada se lanci razdvoje, temperatura se snižava kako bi se prajmerima omogućilo da se vežu za jednolančani šablon. Ova faza se naziva žarenje. Temperatura žarenja zavisi od prajmera i obično se bira 4 - 5°C ispod njihove temperature topljenja. Trajanje faze je 0,5 - 2 minute.

DNK polimeraza replicira šablonski lanac koristeći prajmer kao prajmer. Ovo je faza elongacije. Temperatura elongacije zavisi od polimeraze. Obično korištene polimeraze su najaktivnije na 72°C. Vrijeme elongacije ovisi i o vrsti DNK polimeraze i o dužini amplificiranog fragmenta. Tipično, vrijeme elongacije se uzima kao jedan minut na hiljadu parova baza. Nakon što su svi ciklusi završeni, često se izvodi dodatni završni korak elongacije kako bi se kompletirali svi jednolančani fragmenti. Ova faza traje 10-15 minuta.
Priprema materijala za istraživanje i transport u laboratoriju

Za uspješnu analizu važno je pravilno prikupiti materijal od pacijenta i pravilno ga pripremiti. Poznato je da se u laboratorijskoj dijagnostici većina grešaka (do 70%) pravi upravo u fazi pripreme uzorka. Za prikupljanje krvi u laboratoriji INVITRO trenutno se koriste vakuumski sistemi koji, s jedne strane, minimalno ozljeđuju pacijenta, a s druge omogućavaju prikupljanje materijala na način da ne dolazi u kontakt sa bilo osoblja ili okoline. Time se izbjegava kontaminacija (kontaminacija) materijala i osigurava objektivnost PCR analize.

DNK – deoksiribonukleinska kiselina – je biološki polimer, jedna od dvije vrste nukleinskih kiselina koje osiguravaju skladištenje, prijenos s generacije na generaciju i implementaciju genetskog programa za razvoj i funkcioniranje živih organizama. Glavna uloga DNK u ćelijama je dugoročno skladištenje informacija o strukturi RNK i proteina.

RNK-ribonukleinska kiselina je biološki polimer sličan po svojoj hemijskoj strukturi DNK. Molekul RNK je izgrađen od istih monomernih jedinica - nukleotida - kao i DNK. U prirodi, RNK obično postoji kao jedan lanac. Kod nekih virusa, RNK je nosilac genetske informacije. U ćeliji igra važnu ulogu u prijenosu informacija sa DNK na protein. RNK se sintetiše na DNK šablonu. Ovaj proces se zove transkripcija. Postoje područja u DNK koja sadrže informacije odgovorne za sintezu tri vrste RNK, koje se razlikuju po funkcijama koje obavljaju: glasnička ili glasnička RNA (mRNA), ribosomska RNA (rRNA) i transportna RNA (tRNA). Sve tri vrste RNK su na ovaj ili onaj način uključene u sintezu proteina. Međutim, informacije o sintezi proteina sadržane su samo u mRNA.

Nukleotidi su osnovna ponavljajuća jedinica u molekulima nukleinske kiseline, proizvod hemijske kombinacije azotne baze, šećera sa pet ugljenika (pentoze) i jedne ili više fosfatnih grupa. Nukleotidi prisutni u nukleinskim kiselinama sadrže jednu fosfatnu grupu. Ime su dobili prema dušičnoj bazi koju sadrže - adenin (A), koji sadrži adenin, gvanin (G) - gvanin, citozin (C) - citozin, timin (T) - timin, uracil (U) - uracil. DNK sadrži 4 vrste nukleotida - A, T, G, C, RNK takođe sadrži 4 tipa - A, U, G, C. Šećer u svim nukleotidima DNK je deoksiriboza, RNK - riboza. Kada se formiraju nukleinske kiseline, nukleotidi se vezuju i formiraju šećerno-fosfatnu kičmu molekule, na čijoj se jednoj strani nalaze baze.

Prajmer je kratka DNK koja se koristi za repliciranje lanca šablona. Svaki od prajmera je komplementaran jednom od lanaca dvolančanog šablona, ​​uokvirujući početak i kraj amplificiranog regiona.

Književnost

1. Glick B., Pasternak J. Molekularna biotehnologija. Principi i primjena. Per. sa engleskog - M.: Mir, 2002. - 589 str., ilustr. ISBN 5-03-003328-9
2. Shchelkunov S.N. Genetski inženjering - Novosibirsk: Sibirsk. Univ. izdavačka kuća, 2004. - 496 str.; ill. ISBN 5-94087-098-8
3. Patrushev L.I. Umjetni genetski sistemi - M.: Nauka, 2005 - U 2 toma - ISBN 5-02-033278-X

BITAN!

Informacije u ovom odjeljku ne mogu se koristiti za samodijagnozu i samoliječenje. U slučaju boli ili drugog pogoršanja bolesti, dijagnostičke testove treba propisati samo liječnik. Da biste postavili dijagnozu i pravilno propisali liječenje, obratite se svom ljekaru.

Lančana reakcija polimeraze (PCR) je metoda biohemijske tehnologije u molekularnoj biologiji, koja se provodi radi povećanja jedne ili više kopija fragmenata DNK za nekoliko stupnjeva, što omogućava stvaranje od nekoliko hiljada do miliona kopija specifične sekvence DNK.

Razvijen 1983. od strane Caryja Mullisa, PCR je danas uobičajena i često nezamjenjiva tehnika koja se koristi u medicinskim i biološkim istraživačkim laboratorijama za razne različite primjene. To uključuje kloniranje DNK za sekvenciranje, filogeniju zasnovanu na DNK ili funkcionalnu analizu gena; dijagnoza nasljednih bolesti; otkrivanje genetskih otisaka prstiju (koristi se u forenzici i testiranju očinstva), te otkrivanje i dijagnostiku zaraznih bolesti. Godine 1993. Mullis je dobio Nobelovu nagradu za hemiju zajedno sa Michaelom Smithom za njihov rad na PCR-u.

Metoda se zasniva na termičkom ciklusu, koji se sastoji od ponovljenih ciklusa zagrijavanja i hlađenja reakcije na denaturaciju i repliciranje DNK pomoću enzima. Prajmeri, (kratki dijelovi DNK) koji sadrže sekvence komplementarne ciljnom mjestu zajedno sa DNK polimerazom (od čega je metoda dobila ime), ključne su komponente za pokretanje selektivne i ponovljene amplifikacije. U PCR procesu, sama sintetizirana DNK se koristi kao šablon za replikaciju, pokrećući lančanu reakciju u kojoj se DNK šablon eksponencijalno pojačava. PCR se može značajno modificirati za izvođenje širokog spektra genetskih manipulacija.

Gotovo sve PCR aplikacije koriste termostabilnu DNK polimerazu kao što je Taq polimeraza, enzim izvorno izoliran iz bakterija Thermusaquaticus. Ova DNK polimeraza enzimski sastavlja novi lanac DNK od građevnih blokova DNK - nukleotida, koristeći jednolančanu DNK kao šablon i DNK oligonukleotide (koji se nazivaju i DNK prajmeri) koji su neophodni za iniciranje sinteze DNK. Velika većina PCR metoda koristi termički ciklus, tj. naizmjenično zagrijavanje i hlađenje PCR uzorka u određenom nizu temperaturnih koraka. Ovi koraci termalnog ciklusa su neophodni da bi se prvo fizički razdvojili dva lanca dvostruke spirale DNK na visokoj temperaturi u procesu koji se naziva denaturacija DNK. Na nižim temperaturama, svaki lanac će se koristiti kao šablon u sintezi DNK pomoću DNK polimeraze kako bi se selektivno amplificirao ciljni DNK region. Selektivnost PCR rezultata pomoću prajmera koji su komplementarni ciljnom DNK regionu za amplifikaciju pod određenim uslovima termičkog ciklusa.

Principi PCR dijagnostike

PCR se koristi za amplifikaciju određenog dijela DNK lanca (ciljne DNK). Većina PCR metoda tipično amplificira fragmente DNK do ~10.000 parova baza (kb), iako neke metode mogu povećati fragmente do 40 kb. Reakcija proizvodi ograničenu količinu konačnog pojačanog proizvoda, koji je reguliran dostupnim reagensima u reakciji i povratnom inhibicijom produkta reakcije.

Osnovni PCR komplet zahtijeva nekoliko komponenti i reagensa. To uključuje:

• DNK šablon, koji sadrži ciljnu DNK regiju koju treba pojačati.
• Dva prajmera komplementarni krajevima od 3" svakog od smislenih i antisens lanaca ciljne DNK.
• Taq polimeraza ili druga DNK polimeraza koja radi na optimalnoj temperaturi od oko 70 °C.
• Deoksinukleozid trifosfati(dNTP; trifosfatne grupe koje sadrže nukleotide), gradivni blokovi iz kojih DNK polimeraza sintetizira novi lanac DNK.
• Puferski rastvor, pružajući odgovarajuće hemijske uslove za optimalnu aktivnost i stabilnost DNK polimeraze.
• Divalentni katjoni joni magnezija ili mangana; Mg2+ se obično koristi, ali Mn2+ se također može koristiti za PCR posredovanu DNK mutagenezu, budući da veće koncentracije Mn2+ povećavaju stopu greške tokom sinteze DNK.
• Monovalentni katjoni joni kalijuma.

PCR se obično izvodi u reakcionoj zapremini od 10-200 µl u malim reakcionim epruvetama (volumen 0,2-0,5 ml) u termičkom ciklusnom pojačivaču. Pojačalo zagrijava i hladi reakcijske cijevi kako bi se postigle temperature potrebne za svaki korak reakcije. Mnogi moderni termocikleri koriste Peltierov efekat, koji omogućava da se blok PCR cijevi zagrije i ohladi jednostavno promjenom smjera električne struje. Tankozidne reakcione cijevi promoviraju povoljnu toplinsku provodljivost kako bi se osigurala brza termička ravnoteža. Starijim biciklima koji nemaju zagrijani poklopac potreban je sloj ulja na površini reakcione smjese ili kuglica voska u epruveti.

Procedura

Tipično, PCR se sastoji od serije od 20-40 ponovljenih temperaturnih promjena koje se nazivaju ciklusi, pri čemu se svaki ciklus obično sastoji od 2-3 diskretna temperaturna koraka, obično tri. Bicikliranje često počinje i završava se jednim temperaturnim korakom (tzv čekanje) na visokoj temperaturi (>90°C) za ekspanziju finalnog proizvoda ili kratkotrajno skladištenje. Korištene temperature i dužina vremena primjene u svakom ciklusu zavise od mnogih parametara. To uključuje enzim koji se koristi za sintezu DNK, koncentraciju dvovalentnih jona i dNTP u reakciji i temperaturu topljenja (Tm) prajmera.

• Faza inicijalizacije: Ovaj korak se sastoji od zagrijavanja reakcije na temperaturu od 94-96 °C (ili 98 °C ako se koriste visoko termostabilne polimeraze) u trajanju od 1-9 minuta. Korak je potreban samo za DNK polimeraze koje zahtijevaju aktivaciju toplinom, takozvani vrući start PCR.
• Faza denaturacije: To je prvi redovni termalni ciklus i sastoji se od zagrijavanja reakcije na 94-98°C u trajanju od 20-30 sekundi. Ovo uzrokuje cijepanje DNK šablona uz uništavanje vodikovih veza između komplementarnih baza i formiranje jednolančanih DNK molekula.
• Faza žarenja: Temperatura reakcije se smanjuje na 50-65°C u roku od 20-40 sekundi, što omogućava prajmerima da se vežu za jednolančani DNK šablon. Obično je temperatura žarenja oko 3-5 stepeni Celzijusa ispod Tm korišćenih prajmera. Stabilne DNK-DNK vodikove veze se formiraju samo kada se prajmerska sekvenca više poklapa sa šablonom sekvence. Polimeraza se vezuje za hibrid prajmera i šablona i započinje sintezu DNK.
• Faza ekspanzije/izduženja: Temperatura u ovoj fazi ovisi o korištenoj DNK polimerazi; Taq polimeraza ima svoju optimalnu temperaturu aktivnosti na 75-80°C; Za ovaj enzim se obično koristi temperatura od 72°C. U ovoj fazi, DNK polimeraza sintetizira novi DNK lanac komplementaran šablonskom DNK lancu, dodajući dNTP-ove koji su komplementarni šablonu u smjeru od 5" do 3", povezujući 5"-fosfatnu grupu dNTP-a sa 3"- hidroksilnu grupu na kraju rezultirajuće (produžne) DNK. Vrijeme produžetka ovisi i o korištenoj DNK polimerazi i o dužini fragmenta DNK koji treba pojačati. Tipično, na svojoj optimalnoj temperaturi, DNK polimeraza polimerizuje hiljadu baza u minuti. Pod optimalnim uslovima, tj. u odsustvu ograničenja zbog ograničavajućih supstrata ili reagensa, u svakom koraku ekspanzije, količina ciljne DNK se udvostručuje, što rezultira eksponencijalnom (geometrijskom) amplifikacijom fragmenta DNK.
• Završno produženje: Ovo je jedan korak, koji se ponekad izvodi na 70-74°C tokom 5-15 minuta nakon posljednjeg PCR ciklusa kako bi se osiguralo da je bilo koja preostala jednolančana DNK u potpunosti produžena.
• Konačno očekivanje: Ovaj korak na 4-15°C neograničeno može se koristiti za održavanje reakcije na kratko vrijeme. Da bi se testiralo da li je PCR sintetizirao očekivani DNK fragment (koji se ponekad naziva i "amplimer" ili "amplikon"), koristi se elektroforeza u agaroznom gelu za razdvajanje PCR proizvoda po veličini. Veličina PCR proizvoda određuje se poređenjem sa DNK ljestvicom (markerom molekularne težine), koja sadrži fragmente DNK poznate veličine, izvedene na gelu zajedno sa PCR proizvodima.

Koraci lančane reakcije polimeraze

PCR proces se može podijeliti u tri faze:

1. Eksponencijalno pojačanje: Tokom svakog ciklusa, količina proizvoda se udvostručuje (pod pretpostavkom 100% efikasnosti reakcije). Reakcija je vrlo osjetljiva: potrebna je samo mala količina DNK.
2. Faza za nivelisanje: Reakcija se usporava jer DNK polimeraza gubi aktivnost i potrošnja reagensa kao što su dNTP i prajmeri uzrokuje njihovo ograničavanje .
3. Plato: Proizvod se više ne akumulira zbog nedostatka reagensa i enzima.

PCR optimizacija

U praksi, PCR može biti neuspješan iz različitih razloga, posebno zbog njegove osjetljivosti na kontaminaciju, što uzrokuje amplifikaciju nusproizvoda DNK. U tom smislu, razvijen je niz tehnika i procedura za optimizaciju PCR uslova. Kontaminacija vanjske DNK rješava se laboratorijskim protokolima i procedurama koje prečišćavaju mješavine prije PCR-a od potencijalnih zagađivača DNK. Ovo obično uključuje prostorno odvajanje PCR kompleta od područja za analizu ili pročišćavanje PCR proizvoda, korištenje plastičnih pribora za jednokratnu upotrebu i temeljno čišćenje radne površine između koraka reakcije. Tehnike dizajna prajmera igraju važnu ulogu u poboljšanju oporavka PCR proizvoda i izbjegavanju stvaranja nusproizvoda, a korištenje alternativnih komponenti pufera ili enzima polimeraze može pomoći u amplifikaciji dugih ili na drugi način problematičnih dijelova DNK. Dodavanje reagensa kao što je formamid puferskim sistemima može povećati specifičnost i oporavak PCR-a. Kompjuterska simulacija teorijskih rezultata PCR-a (elektronski PCR) može se izvesti kao pomoć u dizajnu prajmera.

Primjena PCR

Selektivna ekstrakcija DNK

PCR omogućava izolaciju fragmenata DNK iz genomske DNK selektivnim amplifikacijom specifičnog regiona DNK. Ova primjena PCR-a nadopunjuje mnoge tehnike, kao što je generiranje hibridizacijskih sondi za Southern ili Northern bloting i kloniranje DNK, koje zahtijevaju velike količine DNK koja predstavlja specifičnu regiju DNK. PCR omogućava ovim metodama visok sadržaj čiste DNK, omogućavajući analizu DNK uzoraka čak i sa malim količinama početnog materijala.

Druge primjene PCR-a uključuju sekvenciranje DNK za identifikaciju nepoznatih sekvenci amplificiranih PCR-om, u kojem se jedan od prajmera za amplifikaciju može koristiti u Sangerovom sekvenciranju, ekstrakciji DNK sekvence za ubrzavanje tehnologija rekombinantne DNK koje uključuju umetanje sekvence DNK u plazmid ili genetski materijal drugog organizma. Kolonije bakterija (E. coli) mogu se brzo pregledati PCR-om kako bi se ispravio dizajn vektorske DNK. PCR se takođe može koristiti za genetsko uzimanje otisaka prstiju; tehnika koja se koristi u sudskoj medicini za identifikaciju osobe ili organizma upoređivanjem eksperimentalne DNK korištenjem različitih PCR metoda.

Neke metode PCR uzimanja otisaka prstiju imaju veliku diskriminatornu moć i mogu se koristiti za određivanje genetskih odnosa između pojedinaca, kao što su roditelj-djete ili između braće i sestara, a koriste se u otkrivanju očinstva. Ova tehnika se također može koristiti za određivanje evolucijskih odnosa između organizama.

DNK amplifikacija i kvantifikacija

Budući da PCR povećava broj kopija DNK regiona koji su ciljani, PCR se može koristiti za analizu vrlo malih količina uzorka. Ovo je često kritično u forenzičkim slučajevima kada su kao dokaz dostupni samo tragovi DNK. PCR se također može koristiti za analizu drevne DNK koja je stara desetinama hiljada godina. Ove PCR metode su uspješno korištene na životinjama kao što je četrdeset hiljada godina star mamut, kao i na ljudskoj DNK, u primjenama u rasponu od analize egipatskih mumija do identifikacije ruskog cara.

Kvantitativne PCR metode procjenjuju količinu date sekvence prisutne u uzorku, metoda koja se često koristi za kvantifikaciju nivoa ekspresije gena. PCR u realnom vremenu je uspostavljen alat za kvantitativnu analizu DNK koja mjeri akumulaciju DNK proizvoda nakon svakog ciklusa PCR amplifikacije.

PCR u dijagnostici bolesti

PCR omogućava ranu dijagnozu malignih bolesti kao što su leukemija i limfom, što je trenutno visoko razvijeno u istraživanju raka i već se rutinski koristi. PCR se može izvesti direktno na uzorcima genomske DNK kako bi se otkrile maligne ćelije specifične za translokaciju sa osjetljivošću koja je najmanje 10.000 puta veća od drugih metoda.

PCR također može otkriti nekulturne ili spororastuće mikroorganizme kao što su mikobakterije, anaerobne bakterije i virusi iz kulture tkiva i životinjskih modela. Osnova za primjenu PCR dijagnostike u području mikrobiologije je identifikacija infektivnih agenasa i diferencijacija nepatogenih sojeva od patogenih zbog specifičnih gena.

Virusna DNK se također može otkriti pomoću PCR-a. Prajmeri moraju biti specifični za ciljane virusne DNK sekvence, a PCR se može koristiti za dijagnostičke DNK testove ili sekvenciranje virusnog genoma. Visoka osjetljivost PCR-a omogućava vam da otkrijete viruse ubrzo nakon infekcije, pa čak i prije početka bolesti. Ovo rano otkrivanje virusa moglo bi ljekarima pružiti značajne mogućnosti liječenja. Količina virusa (“virusno opterećenje”) kod pacijenta se također može kvantificirati korištenjem DNK testiranja zasnovanog na PCR-u.

Varijacije osnovnih metoda lančane reakcije polimeraze

• Alel-specifični PCR: Metoda dijagnostike ili kloniranja zasnovana na polimorfizmima jednog nukleotida (SNP) (razlike u jednoj bazi u DNK). Zahteva prethodno poznavanje sekvence DNK, uključujući razlike između alela, i koristi prajmere čiji 3" krajevi obuhvataju SNP. PCR amplifikacija pod strogim uslovima je mnogo manje efikasna u prisustvu nepodudarnosti između šablona i prajmera, tako da je uspešna amplifikacija sa SNP-om specifični prajmer signali o prisustvu specifičnih SNP-ova u sekvenci.
• PCR sklop ili ciklični sklop polimeraze (PCR): umjetna sinteza dugih DNK sekvenci izvođenjem PCR-a na rezervi dugih oligonukleotida sa kratkim preklapajućim segmentima. Oligonukleotidi se izmjenjuju između smjera smisla i antisense lanca, a segmenti koji se preklapaju određuju redoslijed PCR fragmenata, čime se selektivno proizvode konačni dugi DNK proizvod.
• Asimetrični PCR: Poželjno umnožava jedan lanac DNK u dvolančanom DNK šablonu. Koristi se u sekvencioniranju i hibridizacijskom sondiranju gdje je potrebno pojačanje samo jednog od dva komplementarna lanca. PCR se izvodi kao i obično, ali sa velikim viškom prajmera da bi se lanac amplificirao. Zbog spore (aritmetičke progresije) amplifikacije na kraju reakcije nakon upotrebe ograničavajućeg prajmera, potrebni su dodatni PCR ciklusi. Najnovija modifikacija ovog procesa, poznata kao "LATE-PCR" (linearnost nakon eksponencijalne faze - PCR), koristi ograničavajući prajmer sa višom temperaturom topljenja (Tm) od viška prajmera da bi se održala efikasnost reakcije kao koncentracija ograničavajućeg prajmera smanjuje se usred reakcije.
• Dial-out PCR: Veoma paralelna metoda za dobijanje preciznih molekula DNK za sintezu gena. Složeni skup molekula DNK modificira se jedinstvenim bočnim oznakama prije masovnog paralelnog sekvenciranja. Prajmeri usmjereni na oznaku zatim proizvode molekule sa datom sekvencom koristeći PCR.
• Amplifikacija zavisno od helikaze: slično tradicionalnom PCR-u, ali zahtijeva konstantnu temperaturu od ciklusa kroz cikluse denaturacije i žarenja/ekstenzije. Umjesto toplotne denaturacije koristi se DNK helikaza, enzim koji odmotava DNK.
• Hot start PCR: Tehnika koja smanjuje nespecifično pojačanje tokom početnog podešavanja PCR koraka. Može se izvršiti ručno zagrijavanjem reakcionih komponenti do temperature denaturacije (npr. 95 °C) prije dodavanja polimeraze. Razvijeni su specijalizovani enzimski sistemi koji inhibiraju aktivnost polimeraze na sobnoj temperaturi, bilo vezivanjem antitela ili u prisustvu kovalentno vezanih inhibitora koji se disociraju tek nakon koraka aktivacije na visokoj temperaturi. PCR „vrući početak/hladni završetak“ postiže se upotrebom novih hibridnih polimeraza koje su neaktivne na temperaturi okoline i odmah se aktiviraju na temperaturi elongacije.
• PCR specifičan za intermikrosatelitske sekvence (ISSR): PCR je metoda DNK otiska prsta koja povećava broj kopija regiona između jednostavnih ponavljajućih sekvenci kako bi se proizveo jedinstveni otisak prsta iz amplificirane dužine fragmenta.
• Inverted PCRširoko se koristi za identifikaciju regiona sekvence oko genomskih insercija. Uključuje seriju cijepanja DNK i samoligiranja koja proizvode poznate sekvence na oba kraja nepoznate sekvence.
• PCR posredovan ligacijom: Koristi male DNK linkere povezane sa DNK od interesa i više prajmera povezanih sa DNK linkerima; koristi se za sekvenciranje DNK, hodanje po genomu i otisak DNK.
• PCR specifičan za metilaciju(MSP): razvili Stephen Baylin i Jim Herman na Medicinskom fakultetu Johns Hopkins, koristi se za otkrivanje metilacije CpG ostrva u genomskoj DNK. DNK se prvo tretira natrijum bisulfitom, koji pretvara nemetilirane baze citozina u uracil, koji se PCR prajmerima prepoznaje kao timin. Zatim se izvode dva PCR-a na modifikovanoj DNK koristeći skupove identičnih prajmera, osim na bilo kom CpG ostrvu unutar sekvence prajmera. U tim tačkama, jedan set prajmera prepoznaje DNK sa citozinima kako bi povećao broj kopija metilirane DNK, a jedan set prepoznaje DNK sa uracilom ili timinom kako bi pojačao nemetiliranu DNK. MSP pomoću qPCR se također može izvesti da bi se dobile kvantitativne, a ne kvalitativne informacije o metilaciji.
• Miniprimer - PCR: Koriste se termostabilne polimeraze (S-Tbr), koje se mogu proširiti iz kratkih prajmera („smalligos“), sa brojem od 9 ili 10 nukleotida. Ova metoda omogućava PCR-u da cilja regije vezane manjim prajmerima i koristi se za amplifikaciju konzerviranih DNK sekvenci kao što je 16S (ili eukariotski 18S) rRNA gen.
• Multipleksno pojačanje sonde ovisno o ligaciji (MLPA): omogućava amplifikaciju više meta sa samo jednim parom prajmera, čime se izbegavaju ograničenja rezolucije multipleksnog PCR-a.
• Multiplex PCR sastoji se od više setova prajmera u jednoj PCR mješavini za proizvodnju amplikona različitih veličina koji su specifični za različite sekvence DNK. Ciljanjem nekoliko gena istovremeno, moguće je dobiti dodatne informacije tokom jednog testa, za koji bi inače bilo potrebno nekoliko puta više reagensa i više vremena za izvođenje. Temperature žarenja za svaki set prajmera moraju biti optimizirane da rade ispravno unutar jedne reakcije i sa veličinama amplikona. To jest, dužine njihovih baznih parova moraju biti dovoljno različite da proizvedu različite trake kada se vizualiziraju gel elektroforezom.
• Nested PCR: Povećava specifičnost DNK amplifikacije smanjenjem pozadine zbog nespecifične DNK amplifikacije. Dva seta prajmera se koriste u dva uzastopna PCR-a. U prvoj reakciji, jedan par prajmera se koristi za sintetizaciju DNK proizvoda koji se, pored predviđene mete, još uvijek mogu sastojati od nespecifično amplificiranih fragmenata DNK. Proizvodi se zatim koriste u drugom PCR-u sa skupom prajmera čija su mjesta vezivanja potpuno ili djelomično različita od 3" krajeva svakog od prajmera korištenih u prvoj reakciji. Ugniježđeni PCR je često uspješniji u specifičnom pojačavanju dugih DNK fragmenata nego tradicionalni PCR, ali zahtijeva detaljnije poznavanje ciljnih sekvenci.
• PCR sa preklapajućim ekstenzijama ili spajanje preklapajućim proširenjima(SOE): Tehnika genetskog inženjeringa koja se koristi za spajanje dva ili više komada DNK koji sadrže komplementarne sekvence. Koristi se za povezivanje dijelova DNK koji sadrže gene, regulatorne sekvence ili mutacije; Tehnika vam omogućava da kreirate specifične i dugačke strukture DNK.
• Kvantitativni PCR (qPCR): koristi se za mjerenje količine PCR proizvoda (obično u realnom vremenu). Kvantitativno mjeri početne količine DNK, cDNK ili RNK. qPCR se široko koristi za određivanje prisustva DNK sekvence u uzorku i broja njenih kopija u uzorku. Kvantitativni PCR u realnom vremenu ima veoma visok stepen tačnosti. QRT-PCR (ili QF-PCR) metode koriste fluorescentne boje kao što su Sybr Green, EvaGreen ili DNK sonde koje sadrže fluorofore kao što je TaqMan za mjerenje količine pojačanog proizvoda u realnom vremenu. Ponekad se naziva skraćenicom RT-PCR (PCR u realnom vremenu) ili RQ-PCR. QRT-PCR ili RTQ-PCR su prikladnije skraćenice, jer se RT-PCR obično odnosi na PCR sa reverznom transkripcijom, koji se često koristi u kombinaciji sa qPCR.
• PCR reverzne transkripcije (RT-PCR): da se poveća broj kopija DNK iz RNK. Reverzna transkriptaza transkribuje RNK u cDNK, koja se zatim umnožava pomoću PCR-a. RT-PCR se široko koristi u profiliranju ekspresije za otkrivanje ekspresije gena ili za određivanje sekvence RNA transkripta, uključujući mjesta početka i zaustavljanja transkripcije. Ako je poznata genomska DNK sekvenca gena, RT-PCR se može koristiti za mapiranje lokacije egzona i introna u genu. Kraj gena od 5" (koji odgovara mjestu početka transkripcije) se obično određuje RACE-PCR (brzo pojačavanje krajeva cDNK).
• PCR u čvrstoj fazi: pokriva nekoliko značenja, uključujući "Polonium Amplification" (gdje se PCR kolonija izvode na gel matriksu, na primjer), "Bridge PCR" (prajmeri su kovalentno povezani sa čvrstom potpornom površinom), tradicionalni PCR u čvrstoj fazi (gdje je "asimetrični PCR" " koristi se u prisustvu prajmera koji nose čvrstu podlogu sa sekvencom koja odgovara jednom od vodenih prajmera) i poboljšanog PCR-a na čvrstoj fazi (gde se tradicionalni PCR na čvrstoj fazi može poboljšati upotrebom prajmera sa visokim Tm i ugnežđenih čvrstih potpornih prajmera sa mogućnost primjene termičkog "koraka" za promoviranje formiranja prajmera na čvrstoj podlozi).
• Termalno asimetrični naizmjenični PCR (TAIL-PCR): koristi se za izolaciju nepoznatog niza koji slijedi poznatu sekvencu. U poznatoj sekvenci, TAIL-PCR koristi ugniježđeni par prajmera s različitim temperaturama žarenja; degenerirani prajmer se koristi za amplifikaciju u drugom smjeru od nepoznate sekvence.
• Touchdown PCR (PCR korak po korak): varijanta PCR-a koja ima za cilj smanjenje nespecifične pozadine postupnim snižavanjem temperature žarenja kako PCR ciklusi napreduju. Temperatura žarenja u početnim ciklusima je tipično nekoliko stepeni (3-5°C) iznad Tm korišćenih prajmera, dok je u kasnijim ciklusima temperatura nekoliko stepeni (3-5°C) ispod Tm prajmera. Više temperature obezbeđuju veću specifičnost za vezivanje prajmera, a niže temperature omogućavaju efikasnije pojačavanje specifičnih proizvoda nastalih tokom početnih ciklusa.
• PAN-AC: Koristi izotermne uslove za pojačanje i može se koristiti na živim ćelijama.
• Univerzalna brza šetnja kroz genom: za hodanje po genomu i genetsko uzimanje otisaka prstiju korištenjem specifičnijih "dvosmjernih" PCR-ova od tradicionalnih "jednosmjernih" pristupa (koristeći samo jedan gen-specifični prajmer i jedan opći prajmer - što može dovesti do artefaktičkog "šuma") zbog mehanizma , uključujući formiranje laso strukture. Pojednostavljeni derivati ​​UFW-a su "Lane RAGE" (laso-ovisni ugniježđeni PCR za brzu amplifikaciju krajeva genomske DNK), "5"RACE Lane" i "3"RACE Lane".
• UsilicoPCR(digitalni PCR, virtuelni PCR, e-PCR, e-PCR) se odnosi na računske alate koji se koriste za izračunavanje rezultata teorijske lančane reakcije polimeraze pomoću datog skupa prajmera (sonda) za amplifikaciju sekvenci DNK iz sekvenciranog genoma ili transkriptoma.

Istorija PCR-a

U članku u Journal of Molecular Biology iz 1971. Kleppe i njegovi koautori prvi su opisali metodu pomoću enzimatskog testa za repliciranje kratkog DNK šablona sa prajmerima in vitro. Međutim, ovoj ranoj manifestaciji osnovnog principa PCR-a nije se pridavala velika pažnja, a pronalazak lančane reakcije polimeraze 1983. generalno se pripisuje Karyju Mullis-u.

Kada je Mullis razvio PCR 1983. godine, radio je u Emeryvilleu u Kaliforniji za Cetus Corporation, ranu biotehnološku kompaniju. Tamo je bio odgovoran za sintezu kratkih DNK lanaca. Mullis je napisao da je zamislio PCR dok se jedne noći vozio autoputem Pacific Coast Highway u svom automobilu. U mislima je ponavljao novi način analize promjena (mutacija) u DNK kada je shvatio da je umjesto toga izumio metodu za povećanje broja kopija bilo kojeg dijela DNK kroz ponovljene cikluse umnožavanja koje pokreće DNK polimeraza. U časopisu Scientific American, Mullis je rezimirao proceduru: „Počevši od jedne molekule DNK genetskog materijala, PCR može generirati 100 milijardi takvih molekula u jednom danu. Ovu reakciju je lako izvesti. Ne zahtijeva ništa više od epruvete, nekoliko jednostavnih reagensa i izvora topline." Dobio je Nobelovu nagradu za hemiju 1993. za svoj izum, sedam godina nakon što su on i njegove kolege u Cetusu prvi put sproveli svoj prijedlog u praksu. Međutim, ostala je određena kontroverza oko intelektualnog i praktičnog doprinosa drugih naučnika Mullisovom radu i da li je on jedini izumitelj PCR principa.

PCR metoda se oslanja na upotrebu odgovarajuće DNK polimeraze koja može izdržati visoke temperature >90°C (194°F) potrebne za cijepanje dva lanca DNK u dvostrukoj spirali DNK nakon svakog ciklusa replikacije. DNK polimeraze koje su prvobitno korištene za in vitro eksperimente, nagovještavajući PCR, nisu bile u stanju izdržati tako visoke temperature. Stoga su rane procedure replikacije DNK bile vrlo neefikasne i dugotrajne, zahtijevajući velike količine DNK polimeraze i kontinuiranu obradu tokom cijelog procesa.

Otkriće 1976. Taq polimeraze, DNK polimeraze izolirane iz termofilne bakterije, Thermusaquaticus, koji prirodno živi u toplim (50 do 80°C (122 do 176°F)) okruženjima kao što su topli izvori - utrlo je put za dramatično poboljšanje PCR metode. DNK polimeraza izolirana iz T.Aquaticus, stabilan je na visokim temperaturama i ostaje aktivan čak i nakon denaturacije DNK, čime se eliminira potreba za dodavanjem novih DNK polimeraza nakon svakog ciklusa. To je omogućilo automatizaciju procesa amplifikacije DNK na bazi termocikler pojačivača.

Ratovi patenata

Predloženu PCR metodu je patentirao Cary Mullis i pripisao ju je Cetus Corporation, gdje je Mullis radio kada je izumio tehniku ​​1983. godine. Enzim Taq polimeraza također je zaštićen patentima. Bilo je nekoliko visokih tužbi vezanih za tehniku, uključujući i neuspješnu tužbu koju je pokrenuo DuPont. Farmaceutska kompanija Hoffmann-La Roche stekla je prava na patente 1992. godine i trenutno drži one koji su još uvijek zaštićeni.

Slična bitka za patente oko enzima Taq polimeraze još uvijek traje u nekim jurisdikcijama širom svijeta između Rochea i Promega. Pravni argumenti prevazilazili su uslove originalnih patenata za PCR i Taq polimerazu, koji su istekli 28. marta 2005.

GOU VPO "Krasnoyarsk State Medical Academy"

nazvan po Yasenetsky Federalnoj agenciji za zdravstvo i društveni razvoj »

Zavod za medicinsku genetiku i kliničku neurofiziologiju IPO

OSNOVNI PRINCIPI METODE

POLIMERAZNA LANČANA REAKCIJA

Metodički priručnik za studente 3-4 godine

na specijalnostima opšte medicine (060101) i

Krasnojarsk - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Osnovni principi metode polimerazne lančane reakcije. Metodički priručnik za vannastavni rad studenata 3-4 godine na specijalnostima opšte medicine (060101) i pedijatrije (060103). – Krasnojarsk: Izdavačka kuća Državne obrazovne ustanove visokog stručnog obrazovanja KrasSMA, 2007. – 42 str.

Priručnik za nastavu u potpunosti je usklađen sa zahtjevima Državnog standarda (2000) i odražava glavne aspekte savremene metode dijagnosticiranja nasljednih ljudskih bolesti - metodu lančane reakcije polimeraze, obrazovni materijal je prilagođen obrazovnim tehnologijama, uzimajući u obzir specifičnosti. školovanja na 3-4 godine medicinskog i pedijatrijskog fakulteta.

Recenzenti:Šef Katedre za medicinsku genetiku Državne obrazovne ustanove visokog stručnog obrazovanja

„Novosibirski državni medicinski univerzitet Federalne agencije za zdravstvo i socijalni razvoj“, doktor medicinskih nauka, profesor;

DNK replikacija

Predmet proučavanja ove metode je deoksiribonukleinska kiselina (DNK). DNK je univerzalni nosilac genetskih informacija u svim organizmima koji postoje na Zemlji (s izuzetkom mikroorganizama koji sadrže RNK). DNK je dvostruki lanac uvijen u spiralu. Svaki lanac se sastoji od nukleotida povezanih u nizu. DNK lanci imaju suprotne smjerove: kraj od 5" jednog lanca odgovara kraju od 3" drugog lanca. Jedinstveno svojstvo DNK je njegova sposobnost udvostručavanja. Ovaj proces se zove replikacija. Replikacija molekula DNK događa se tokom sintetičkog perioda interfaze. Svaki od dva lanca "majčinog" molekula služi kao šablon za "ćerku". Nakon replikacije, novosintetizirana molekula DNK sadrži jedan „majčinski“ lanac, a drugi je novosintetizirani „ćerki“ lanac (polukonzervativna metoda). Za sintezu nove DNK molekule potrebno je da se stari molekul despirira i produži. Replikacija počinje na nekoliko mjesta u molekuli DNK. Zove se dio molekule DNK od početne točke jedne replikacije do početne točke druge replicon.

Početak replikacije je aktiviran prajmeri(prajmeri) koji se sastoje od 100-200 parova nukleotida. Enzim DNK helikaza se odmotava i dijeli matičnu spiralu DNK na dva lanca, na kojima se, po principu komplementarnosti, uz učešće enzima DNK polimeraze, sklapaju „ćerki“ DNK lanci. Da bi enzim započeo svoj rad, potrebno je prisustvo startnog bloka - malog početnog dvolančanog fragmenta. Početni blok se formira interakcijom prajmera sa komplementarnim regionom odgovarajućeg lanca roditeljske DNK. U svakom replikonu, DNK polimeraza se može kretati duž "majčinskog" lanca u samo jednom smjeru (5`=>3`).

Na vodećim pramenovima, kako se replikon odmotava, "kćerka" lanac postepeno kontinuirano raste. Na zaostalom lancu, lanac kćer se takođe sintetiše u pravcu (5`=>3`), ali u odvojenim fragmentima kako se replikon odmotava.

Dakle, dodavanje komplementarnih nukleotida lanaca "ćerke" događa se u suprotnim smjerovima (antiparalelno). Replikacija u svim replikonima se dešava istovremeno. Fragmenti i dijelovi "kćeri" lanaca sintetizirani u različitim replikonima su ušiveni u jedan lanac pomoću enzima ligaze. Replikaciju karakteriziraju polukonzervativnost, antiparalelnost i diskontinuitet. Cijeli genom ćelije se replicira jednom u vremenskom periodu koji odgovara jednom mitotičkom ciklusu. Kao rezultat procesa replikacije, iz jednog molekula DNK formiraju se dva molekula DNK, pri čemu je jedan lanac iz matičnog molekula DNK, a drugi, kćer, novosintetizovan (slika 1).

Rice. 1. Shema replikacije molekula DNK.

Dakle, ciklus replikacije DNK uključuje tri glavne faze:

1. odmotavanje spirale DNK i divergencija lanaca (denaturacija);

2. pričvršćivanje prajmera;

3. dovršavanje lanca podređene niti.

Princip PCR metode

Replikacija DNK čini osnovu PCR-a. U PCR-u, gore navedeni procesi se izvode u epruveti u cikličnom režimu. Prijelaz iz jedne faze reakcije u drugu postiže se promjenom temperature inkubacione smjese. Kada se rastvor zagreje na 93-95°C, dolazi do denaturacije DNK. Da bi se prešlo na sljedeću fazu - dodavanje ili "žarenje" prajmera - smjesa za inkubaciju se ohladi na 50-65°C. Zatim se smjesa zagrije na 70-72°C - optimalnu za taq-DNK polimerazu - u ovoj fazi dolazi do izgradnje novog lanca DNK. Zatim se ciklus ponovo ponavlja. Drugim riječima PCR metoda je višestruko povećanje broja kopija (pojačanje) specifičan dio DNK koji katalizira enzim DNK polimeraza.

Rast ćerki DNK lanaca mora se odvijati istovremeno na oba lanca DNK majke, tako da replikacija drugog lanca takođe zahteva sopstveni prajmer. Tako se u reakcionu smjesu dodaju dva prajmera: jedan za lanac “+”, drugi za lanac “-”. Nakon što se pričvrste za suprotne lance molekule DNK, prajmeri se ograničavaju na njen dio koji će se kasnije umnožavati ili umnožavati mnogo puta. Dužina takvog fragmenta, nazvanog amplikon, obično je nekoliko stotina nukleotida.

PCR faze

Svaki ciklus pojačanja uključuje 3 stupnja, koji se javljaju pri različitim temperaturnim uslovima (slika 2).

· 1. faza: Denaturacija DNK . Pojavljuje se na 93-95° u trajanju od 30-40 sekundi.

· 2. faza: prajmer žarenje . Vezivanje prajmera se dešava komplementarno odgovarajućim sekvencama na suprotnim lancima DNK na granicama specifičnog regiona. Svaki par prajmera ima svoju temperaturu žarenja, čije su vrijednosti u rasponu od 50-65°C. Vrijeme žarenja 20-60 sek.

· Faza 3: kompletiranje DNK lanaca Komplementarno kompletiranje DNK lanaca se dešava od 5" kraja do 3" kraja lanca u suprotnim smerovima, počevši od mesta vezivanja prajmera. Materijal za sintezu novih DNK lanaca je deoksiribonukleozid trifosfat koji se dodaje u otopinu. Proces sinteze katalizira enzim taq polimeraza i odvija se na temperaturi od 70-72°C. Vrijeme sinteze je 20-40 sekundi.

Novi DNK lanci formirani u prvom ciklusu amplifikacije služe kao šabloni za drugi ciklus amplifikacije, u kojem se formira specifični fragment DNK amplikona (slika 3). U narednim ciklusima amplifikacije, amplikoni služe kao šablon za sintezu novih lanaca.

Dakle, akumulacija amplikona u rastvoru se dešava prema formuli 2", gde je n broj ciklusa amplifikacije. Dakle, čak i ako je početna otopina u početku sadržavala samo jedan dvolančani DNK molekul, onda u 30-40 ciklusa oko U rastvoru se akumulira 108 molekula amplikona, što je dovoljno za pouzdanu vizuelnu detekciju ovog fragmenta elektroforezom u agaroznom gelu.

Proces pojačanja se izvodi u posebnom programabilnom termostatu ( termalni ciklus), koji prema datom programu automatski mijenja temperature prema broju ciklusa pojačanja.

Za izvođenje pojačanja potrebne su sljedeće komponente:

· DNK matrica(DNK ili njen dio koji sadrži željeni specifični fragment);

· Prajmeri(sintetski oligonukleotidi (20-30 parova nukleotida), komplementarni DNK sekvencama na granicama specifičnog fragmenta koji se utvrđuje). Izbor specifičnog fragmenta i odabir prajmera igra ključnu ulogu u specifičnosti amplifikacije, što utiče na kvalitet analize.

· Smjesa deoksinukleotid trifosfata (dNTP)(mješavina četiri dNTP-a, koji su materijal za sintezu novih komplementarnih DNK lanaca u ekvivalentnim koncentracijama od 200-500 µM)

· EnzimTaq-polimeraza(termostabilna DNK polimeraza koja katalizuje produžavanje lanaca prajmera uzastopnim dodavanjem nukleotidnih baza rastućem lancu sintetizovane DNK, 2-3 mM).

· Puferski rastvor(reakcioni medij koji sadrži jone Mg2+ neophodne za održavanje aktivnosti enzima, pH 6,8-7,8).

Za identifikaciju specifičnih regiona genoma RNA virusa, prvo se dobije kopija DNK iz RNA šablona koristeći reakciju reverzne transkripcije (RT) koju katalizira enzim revertaza (reverzna transkriptaza).

Rice. 2. Amplifikacija (1. ciklus).

Rice. 3. Amplifikacija (2. ciklus).

Glavne primjene PCR-a

· klinička medicina:

o dijagnoza infekcija,

o identifikacija mutacija, uključujući dijagnozu nasljednih bolesti,

o genotipizacija, uključujući HLA genotipizaciju,

o ćelijske tehnologije

· ekologija (kao način praćenja stanja i kvaliteta ekoloških objekata i prehrambenih proizvoda)

· određivanje transgenih organizama (GMO)

Lična identifikacija, utvrđivanje očinstva, forenzika

· opšta i specifična biologija,

Osnovni principi

organizacija dijagnostičkih laboratorija

Rad u PCR laboratoriji obavlja se u skladu sa „Pravilima uređenja, sigurnosnih mjera, industrijske sanitacije, protivepidemijskog režima i lične higijene pri radu u laboratorijama (odjelima, odjeljenjima) sanitarno-epidemioloških ustanova zdravstvenog sistema.

Kontaminacija DNK uzoraka

Provođenje PCR dijagnostike je povezano s problemom zbog visoke osjetljivosti metode - mogućnost kontaminacije. Unošenje tragova pozitivne DNK u reakcijsku epruvetu (specifični proizvodi amplifikacije DNK - amplikoni; DNK standard koji se koristi kao pozitivna kontrola; pozitivna DNK iz kliničkog uzorka) dovodi do amplifikacije specifičnog DNK fragmenta tokom PCR-a i kao rezultat , do pojave lažno pozitivnih rezultata.

U procesu rada možete naići dvije vrste kontaminacije:

1. unakrsna kontaminacija od uzorka do uzorka (tokom obrade kliničkih uzoraka ili prilikom rastvaranja reakcione smjese), što dovodi do sporadičnih lažno pozitivnih rezultata;

2. kontaminacija proizvodima amplifikacije(amplikoni), što je od najveće važnosti, jer se tokom PCR procesa amplikoni akumuliraju u ogromnim količinama i idealni su proizvodi za reamplifikaciju.

Kontaminacija staklenog posuđa, automatskih pipeta i laboratorijske opreme, površine laboratorijskih klupa, pa čak i površine kože laboratorijskih radnika sa količinama u tragovima amplikona dovodi do sistematskih lažno pozitivnih rezultata. Utvrđivanje izvora kontaminacije može biti vrlo teško i zahtijeva značajno ulaganje vremena i novca. Dosadašnje iskustvo stečeno u laboratorijama koje koriste PCR metodu za dijagnostiku omogućava nam da formulišemo osnovne zahtjeve za organizaciju takvih laboratorija i izvođenje samih analiza. Usklađenost sa ovim zahtjevima eliminira mogućnost kontaminacije i lažno pozitivnih rezultata.

Faze PCR analize

Geografski su razdvojeni tako što su smešteni u odvojene prostorije (sl. 4, 5):

· Pre-PCR soba, gde se obrađuju klinički uzorci, izoluje se DNK, priprema reakciona smeša za PCR i obavlja se PCR (ako postoje uslovi, preporučljivo je i poslednje dve faze da se sprovedu u dodatnoj zasebnoj prostoriji). U ovim prostorijama zabranjeno je obavljanje svih drugih vrsta radova sa test agensima, čija se PCR dijagnostika obavlja u ovoj laboratoriji.

· Post-PCR soba, gdje se vrši detekcija produkata amplifikacije. U ovoj prostoriji mogu se koristiti i druge metode detekcije. Preporučljivo je locirati prostoriju za detekciju proizvoda amplifikacije što je dalje moguće od prostorija za pre-PCR.

Radne prostorije su opremljene ultraljubičastim lampama sa maksimalnim zračenjem u području od 260 nm (tip DB-60) po stopi od 2,5 W po 1 m3. Lampe su postavljene tako da su površine radnih stolova, opreme i materijala sa kojima operater ima kontakt prilikom PCR analize izložene direktnom zračenju. Ozračenje se vrši u roku od 1 sata prije početka rada i 1 sat nakon završetka rada.

Laboranti rade u specijalnoj laboratorijskoj odjeći koja se mijenja pri prelasku iz jedne prostorije u drugu i u jednokratnim rukavicama. Odjeća iz različitih prostorija se obrađuje posebno. Različiti zaposlenici rade u različitim fazama PCR analize.

Za rad se koriste odvojeni setovi dozatora, plastično i stakleno posuđe, laboratorijska oprema, mantili i rukavice, namijenjeni za različite faze analize i nisu prenosivi iz jedne prostorije u drugu. Oprema, materijali i potrepštine u svakoj prostoriji su na odgovarajući način označeni.

Sve faze rada se izvode samo uz pomoć potrošnog materijala za jednokratnu upotrebu: vrhova za automatske pipete, epruvete, rukavice itd. Obavezno promijenite vrhove kada prelazite s uzorka na uzorak. Potrebno je koristiti vrhove s filterom - aerosolnom barijerom kako bi se spriječilo da mikrokapljice otopine uđu u pipetu. Korištene cijevi i vrhovi se odlažu u posebne posude ili posude koje sadrže otopinu za dezinfekciju. Klinički uzorci se čuvaju odvojeno od reagensa.

Za obradu i čišćenje radnog mjesta svaka prostorija je opremljena štapićima od pamučne gaze (maramice), pincetama, dezinfekcijskim i inaktivirajućim otopinama.

PCR dijagnostička laboratorija isključuje poslove vezane za proizvodnju (kloniranje) i izolaciju rekombinantnih plazmida koji sadrže sekvence DNK ili fragmente gena patogena koji se dijagnosticiraju u ovoj laboratoriji.

Prikupljanje kliničkog materijala

Materijal koji se proučava za PCR može biti struganje epitelnih ćelija, krvi, plazme, seruma, pleuralne i cerebrospinalne tečnosti, urina, sputuma, sluzi i drugih bioloških sekreta, biopsije.

Materijal se prikuplja u sali za tretmane odgovarajućeg profila. Nakon prikupljanja, uzorke treba što prije dostaviti u PCR dijagnostičku laboratoriju.

Uzorci se moraju uzimati sterilnim, po mogućnosti za jednokratnu upotrebu, instrumentima samo u sterilnim plastičnim epruvetama za jednokratnu upotrebu ili staklenim epruvetama, prethodno tretiranih sat vremena mešavinom hroma, dobro isprati destilovanom vodom i kalcinisati u sušionici na temperaturi od 150°C za 1 sat.

Zona detekcije (drugi sprat ili druga zgrada).

Rice. 4. PCR laboratorijski uređaj sa detekcijom elektroforezom.

Zona detekcije (drugi sprat ili druga zgrada)

Rice. 5. PCR laboratorijski uređaj sa fluorescentnom detekcijom (kvantitativna analiza).

Rice. 6. Soba za ekstrakciju DNK. Prikazana je stolna kutija sa germicidnom lampom.

Rice. 7. Amplification room.

Rice. 8. Soba za detekciju.

Rice. 9. Uzorci krvi za DNK dijagnostiku nasljednih bolesti.

Čuvanje i transport uzoraka

Za dijagnosticiranje nasljednih bolesti, uzorci krvi se čuvaju na posebnim papirnim formularima ili u epindorfima (plastične cijevi) u zamrznutom stanju dugo vremena (slika 9).

Za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, uzorci se drže na sobnoj temperaturi ne više od 2 sata. Ako je potrebno duže skladištenje, uzorci se mogu staviti u frižider na temperaturu od 2-8°C ne duže od jednog dana. Duže skladištenje (do 2 sedmice) dozvoljeno je zamrznuti u zamrzivaču na temperaturi od minus 20°C. Ponovljeno zamrzavanje i odmrzavanje uzoraka nije dozvoljeno.

Ako su PCR dijagnostička laboratorija i prostorija za uzimanje uzoraka geografski razdvojeni, transport uzoraka treba obavljati u termosama ili termo posudama u skladu sa pravilima za čuvanje uzoraka i pravilima za transport infektivnih materijala.

Ekstrakcija DNK iz uzoraka

Postala je široko rasprostranjena metoda sorpcije u čvrstoj fazi koja se sastoji od dodavanja sredstva za lizu koji sadrži otopinu gvanidina, sorpcije DNK na sorbentu, ponovljenog ispiranja i resorpcije DNK puferskom otopinom. Prilikom obrade seruma, plazme ili pune krvi obično se koristi metoda ekstrakcije fenola. Metoda uključuje deproteinizaciju fenolom/hloroformom nakon čega slijedi precipitacija DNK (ili RNK) etanolom ili izopropanolom. Obrada se vrši u Eppendor P mikrocentrifužnim epruvetama zapremine 1,5 ml. Vrijeme obrade je 1,5-2 sata (slika 10).

Rice. 10. Ekstrakcija DNK.

Izvođenje PCR-a

Određena količina uzorka iz obrađenog kliničkog uzorka se prenosi u specijalnu mikrocentrifugirnu epruvetu tipa Eppendorf zapremine 0,2 ili 0,5 ml. U koju se dodaje mešavina za amplifikacija koja se sastoji od vode, PCR pufera, dNTP rastvora, rastvora prajmera i rastvora. ista epruveta. Taq polimeraza (koja se dodaje u smešu poslednja). Tipično, zapremina reakcione smeše je 25 µl. Zatim se u svaku epruvetu dodaje jedna kap mineralnog ulja kako bi se sprečilo isparavanje reakcione smeše tokom procesa amplifikacije. cijevi se prenose na programabilni termostat (pojačalo), gdje se pojačavanje vrši automatski prema zadatom programu (slika 11).

Rice. jedanaest. Pojačalo" Thermocycler ».

Vrijeme reakcije, ovisno o navedenom programu, je 2-3 sata. Paralelno sa eksperimentalnim uzorcima postavljaju se kontrolni uzorci: pozitivna kontrola uključuje sve komponente reakcije, ali se umjesto materijala kliničkog uzorka dodaje kontrolni DNK preparat ispitivanog gena. Negativna kontrola uključuje sve komponente reakcije, ali se umjesto kliničkog materijala ili DNK preparata dodaje odgovarajuća količina deionizirane vode ili ekstrakta koji ne sadrži DNK koja se testira. Negativna kontrola je neophodna da bi se provjerili komponente reakcije na odsustvo DNK zbog kontaminacije i da bi se isključili lažno pozitivni rezultati.

Registracija rezultata

Amplificirani specifični DNK fragment se detektuje elektroforezom u agaroznom gelu u prisustvu etidijum bromida. Etidijum bromid formira stabilno intersticijalno jedinjenje sa fragmentima DNK, koje se pojavljuje u obliku svetlećih traka kada se gel ozrači UV zračenjem talasne dužine 290-330 nm. U zavisnosti od veličine amplikona nastalih kao rezultat PCR-a, koristi se gel sa sadržajem agaroze od 1,5% do 2,5%. Za pripremu agaroznog gela, mješavina agaroze, pufera i vode se otopi u mikrovalnoj pećnici ili u vodenom kupatilu i doda se otopina etidijevog bromida. Smjesa, ohlađena na 50-60°C, ulijeva se u kalup u sloju debljine 4-6 mm i posebnim češljevima se prave džepovi u gelu za nanošenje uzorka. Češljevi se postavljaju na način da između dna jažica i baze gela ostane sloj agaroze od 0,5-1 mm. Nakon što se gel stvrdne, pojačalo se nanosi na džepove u količini od 5-15 μl. Preporučuje se izvođenje elektroforeze mješavine markera dužine DNK fragmenta paralelno s kontrolnim i eksperimentalnim uzorcima. Tipično, takva mješavina sadrži deset fragmenata DNK dužine 100, 200, 300, itd. parova baza.

Korištenje ovakvog testa omogućava verifikaciju dužine amplikona u kontrolnim i eksperimentalnim uzorcima. Gel sa nanesenim uzorkom se prenosi u komoru za elektroforezu napunjenu puferom, komora se povezuje na izvor napajanja i vrši se elektroforetsko odvajanje produkata amplifikacije u trajanju od 30-45 minuta pri jakosti električnog polja od 10-15 V/ cm. U tom slučaju, prednji dio boje uključen u reakcijsku smjesu mora se kretati najmanje 3 cm.

Nakon što je elektroforeza završena, gel se prenosi u stakleni transiluminator i gleda pod ultraljubičastim svjetlom. Za dokumentaciju, gel se fotografiše na Micrat 300 filmu ili snima pomoću video sistema spojenog na računar.

Prije svega, procjenjuju se kontrolni uzorci. Narandžasta svijetleća traka trebala bi biti prisutna u elektroforetskoj stazi koja odgovara pozitivnoj kontroli. Njegova elektroforetska pokretljivost mora odgovarati dužini amplikona navedenoj u uputama.

U elektroforetskoj stazi koja odgovara negativnoj kontroli, takva traka bi trebala biti odsutna. Prisustvo takve trake u negativnoj kontroli ukazuje na kontaminaciju – kontaminaciju reagensa korišćenih sa test DNK ili amplikonom. Test uzorci se ocjenjuju prisustvom trake na odgovarajućoj stazi, koja se nalazi na istom nivou kao i traka u uzorku pozitivne kontrole. Intenzitet trake odgovara količini DNK koja se testira u uzorku, što omogućava polukvantitativnu procjenu PCR-a. Obično se pozitivni rezultati ocjenjuju na skali od četiri stepena. Ako je sjaj trake u ispitnom uzorku vrlo slab, onda takav uzorak treba preurediti (slika 12).

Rice. 12. Elektroforeza u agaroznom gelu.

Primjena PCR zadijagnostika tačkastih mutacija i polimorfizama gena

Jedno od vodećih područja primjene PCR-a u praktičnoj zdravstvu je dijagnostika točkastih mutacija i polimorfizama gena. . Postoje direktne i indirektne metode DNK dijagnostike. U situacijama kada je poznat gen čije oštećenje dovodi do razvoja nasljedne bolesti, ovo oštećenje se može otkriti molekularno genetskim metodama. Takve metode se nazivaju direktnim. Direktnim metodama otkrivaju se nepravilnosti u primarnoj sekvenci nukleotida DNK (mutacije i njihovi tipovi). Direktne metode karakteriziraju preciznost koja dostiže gotovo 100%.

Međutim, u praksi se ove metode mogu koristiti pod određenim uslovima:

· sa poznatom citogenetskom lokalizacijom gena odgovornog za nastanak nasledne bolesti;

· gen bolesti mora biti kloniran i poznata njegova nukleotidna sekvenca.

Svrha direktne DNK dijagnostike je identifikacija mutantnih alela.

Tako se u situacijama kada se zna kakvo oštećenje DNK dovodi do nasljedne bolesti, direktno se ispituje DNK fragment koji sadrži oštećenje, odnosno koristi se direktna dijagnostička metoda DNK.

Međutim, do danas geni mnogih bolesti nisu mapirani, njihova egzon-intronska organizacija je nepoznata, a mnoge nasljedne bolesti karakterizira naglašena genetska heterogenost, što ne dozvoljava potpunu primjenu direktnih DNK dijagnostičkih metoda. Stoga se u slučajevima kada je lokalizacija oštećenja nepoznata, koristi se drugi pristup, koji se odnosi na proučavanje blizine gena odgovornog za gensku bolest, u kombinaciji sa porodičnom analizom, odnosno indirektnim metodama molekularno-genetske dijagnostike bolesti. koriste se nasljedne bolesti.

Različite metode se mogu koristiti za otkrivanje točkastih mutacija i malih delecija, ali sve se oslanjaju na PCR metodu. Ova reakcija vam omogućava da umnožite sekvencu nukleotida DNK mnogo puta, a zatim tražite mutacije. Metode za traženje fragmenata DNK koji nose mutacije zasnivaju se na komparativnoj analizi mutantnih i normalnih DNK nukleotidnih sekvenci.

Analiza PCR proizvoda

u procesu direktne DNK dijagnostike

Uključuje proučavanje specifičnih karakteristika amplificiranog genskog regiona. Dakle, kod bolesti uzrokovanih ekspanzijom trinukleotidnih ponavljanja, proizvodi amplifikacije se razlikuju po dužini (što odražava različit broj tripleta u proučavanom genskom području) i, kao posljedicu, po brzini kretanja u gelu. Zahvaljujući tome postiže se jasno elektroforetsko razdvajanje normalnih i mutantnih alela i precizno određivanje patološki izduženog fragmenta, odnosno DNK dijagnostika bolesti (Sl. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Rice. 14. Dijagnoza delecije GAG u genu DYT 1 kod pacijenata sa dopa nezavisnom distonijom (elektroforeza na poliakrilamidnom gelu). Trake 2,3,6 – bolesni; staze 1,4,5 – kontrola. Tanka strelica označava normalni alel, debela strelica označava mutantni kraći alel (brisanje tri nukleotida).

Ako je cijela DNK regija koja se proučava dio proširene delecije, tada PCR amplifikacija DNK iz ovog izbrisanog alela neće biti provedena zbog nedostatka mjesta za hibridizaciju prajmera. U ovom slučaju, homozigotna delecija će se dijagnosticirati na osnovu potpunog odsustva produkta PCR reakcije (sinteza DNK je nemoguća iz obje kopije gena). Kod heterozigotne delecije moguće je detektirati PCR proizvod sintetiziran iz normalnog (zadržanog) alela; međutim, da bi se pouzdano dijagnosticirala takva mutacija, potrebno je koristiti složenije metode snimanja DNK koje omogućavaju procjenu doze konačnog PCR-a. proizvod.

Za identifikaciju tačkastih mutacija (najčešće supstitucije nukleotida) na određenim mjestima koristi se PCR metoda u kombinaciji s drugim metodama molekularne genetičke analize. Ako su lokacija i priroda navodne tačkaste mutacije precizno poznate, onda je restrikcijske endonukleaze (restrikcijskim enzimima) su posebni stanični enzimi izolirani iz različitih sojeva bakterija.

Ovi enzimi prepoznaju specifične nukleotidne sekvence u rasponu od četiri do deset nukleotida u dužini. Nakon toga se vrši restrikcija (lat. (rezanje)) ovih sekvenci kao dijela dvolančane DNK molekule.Svaki restrikcijski enzim prepoznaje i na određenom mjestu seče strogo definisanu, specifičnu nukleotidnu sekvencu - restriktivno mjesto (mjesto za prepoznavanje).

U slučajevima kada tačkasta mutacija promijeni prirodno mjesto prepoznavanja za određeni restrikcijski enzim, ovaj enzim neće moći odcijepiti mutantni fragment amplificiran PCR-om. U nekim slučajevima, mutacija dovodi do pojave novog mjesta prepoznavanja za određeni restrikcijski enzim koji je normalno odsutan.

U obje situacije, mutantni i normalni PCR produkti tretirani odabranim restrikcijskim enzimom će proizvesti restrikcijske fragmente različite dužine, koji se mogu lako detektirati elektroforezom (slika 15).

Dakle, ako je potrebno brzo otkriti bilo koju specifičnu točkastu mutaciju, zadatak se svodi na traženje odgovarajućeg restrikcijskog enzima čije je mjesto prepoznavanja lokalizirano na mjestu poremećene sekvence nukleotida. Tretman PCR proizvoda takvim restrikcijskim enzimom omogućit će lako razlikovanje normalnih i mutantnih alela. Restrikciona analiza uvelike pojednostavljuje otkrivanje poznatih tačkastih mutacija i sada se široko koristi za direktnu DNK dijagnozu nasljednih bolesti.

Završna faza molekularna genetska analiza mutacija je određivanje nukleotidne sekvence fragmenta DNK koji se proučava (sekvenciranje), koji se upoređuje sa normom i formuliše konačna genetska dijagnoza. Zahvaljujući uspjesima molekularne genetike, danas su razvijene DNK dijagnostičke metode za više od 400 nasljednih bolesti.

Rice. 15. Detekcija tačkaste mutacije pomoću restrikcijske analize: A – amplificirana genska regija koja sadrži restrikcijsko mjestoAGCTza restrikcijsku endonukleazuAlu I. MutacijaG→ Amijenja ovu nukleotidnu sekvencu, što rezultira restrikcijskim enzimomAluIblokiran; B – elektroferogram restrikcijskih proizvoda: kolosek 1 – homozigotnost za normalni alel; kolosijek 2 – homozigotnost za mutaciju; kolosijek 3 – heterozigotno stanje (normalan alel + mutacija).

Dijagnoza nasljednih bolesti, zasnovana na direktnom ispitivanju mutantnih alela kod pacijenata, članova njihovih porodica ili sumnjivih heterozigotnih nosilaca patoloških mutacija, pogodna je za predsimptomatsku i prenatalnu dijagnostiku, koja se može primijeniti u najranijim fazama fetalnog razvoja, prije pojava bilo kakvih kliničkih ili biohemijskih simptoma bolesti.

Bez obzira na metodu detekcije mutacije, tačne molekularne karakteristike svake mutacije mogu se dobiti samo direktnim sekvenciranjem. Za automatizaciju ovog procesa posljednjih godina uveliko se koriste posebni uređaji - sekvenceri, koji omogućavaju značajno ubrzanje procesa čitanja DNK informacija.

Put ka široj upotrebi molekularno bioloških istraživanja u kliničko-dijagnostičkim laboratorijama otvara se ubrzavanjem analitičkog procesa izvođenjem svih postupaka u jednom kontinuumu, bez prijenosa uzorka, stvaranjem uslova za sprječavanje kontaminacije pri paralelnom ispitivanju većeg broja analita i objektivnim evidentiranjem rezultata. rezultate u svakom ciklusu.

Glavne modifikacije PCR metode

Koristi se za brzo skeniranje i traženje poznatih genskih mutacija.

Multiplex (multi-primer) PCR

Ova metoda se zasniva na istovremenoj amplifikaciji nekoliko egzona ispitivanog gena u jednoj reakciji. Ovo omogućava ekonomičan brzi skrining najčešćih mutacija. Na primjer, za brzo dijagnosticiranje delecija u genu za distrofin kod pacijenata s progresivnom Duchenne/Beckerovom mišićnom distrofijom, provodi se simultana amplifikacija skupa najčešće mutiranih egzona ovog gena. Budući da se ove bolesti nasljeđuju na X-vezani recesivni način i da su povezane s oštećenjem jedinog X hromozoma kod dječaka, u slučaju produžene delecije, elektroforeza produkta reakcije će otkriti odsustvo jednog ili više fragmenata DNK (egzona). ), što može poslužiti kao molekularna potvrda dijagnoze. Osim toga, odabirom specifičnih genskih sekcija za PCR amplifikaciju, moguća je prilično precizna procjena ukupne dužine delecije i graničnih tačaka gena (sve do egzona).

Kombinovana upotreba nekoliko multipleksnih reakcija omogućava dijagnosticiranje do 98% svih delecija koje se javljaju kod pacijenata s progresivnom Duchenne/Beckerovom mišićnom distrofijom. Ovo predstavlja približno 60% od ukupnog broja poznatih mutacija u genu za distrofin i ukazuje na veoma visoku efikasnost ove metode skrininga za DNK dijagnozu distrofinopatija (Sl. 16).

Rice. 16. Direktna DNK dijagnoza Duchenneove mišićne distrofije korištenjem multipleks PCR (agaroznog gel elektroforeza). Kod svake od ispitivanih osoba istovremeno su amplificirana četiri egzona gena za distrofin (egzoni 17, 19, 44 i 45; strelice pokazuju odgovarajuće produkte amplifikacije). Traka 1 – kontrolna, traka 2-5 – pacijenti sa Duchenneovom mišićnom distrofijom sa različitim delecijama gena za distrofin (trake 2 i 5 – delecija egzona 45, staza 3 – delecija egzona 44, staza 4 – delecija egzona 17 i 19 ).

Alel-specifična amplifikacija

Metoda se zasniva na upotrebi dva nezavisna para prajmera za specifičnu regiju gena: jedan prajmer u oba para je uobičajen, a drugi prajmer u svakom paru ima drugačiju strukturu i komplementaran je normalnoj ili mutantnoj DNK sekvenci. Kao rezultat takve reakcije, dvije vrste PCR proizvoda mogu se istovremeno sintetizirati u otopini - normalni i mutantni. Štaviše, dizajn prajmera koji se koristi omogućava jasno razlikovanje normalnih i mutantnih produkata amplifikacije prema njihovoj molekularnoj veličini. Ova metoda je vrlo vizualna i omogućava vam da provjerite i homo- i heterozigotno nošenje mutiranog alela.

Metoda za modifikaciju amplificirane DNK usmjerene na mjesto

Metoda se zasniva na upotrebi takozvanog mismatch prajmera u PCR-u (koji nije u potpunosti komplementaran šablonu), koji se od šablonske DNK sekvence razlikuje za jedan nukleotid. Kao rezultat uključivanja navedenog prajmera u mutantni PCR proizvod, u njemu se formira umjetno stvoreno restrikcijsko mjesto za jednu od restrikcijskih endonukleaza, što omogućava direktnu DNK dijagnozu određene poznate mutacije pomoću restrikcijske analize. Stvaranje takvog umjetnog restriktivnog mjesta je neophodno ako pretraga nije otkrila postojanje poznatog i dostupnog enzima, čije je „prirodno” restriktivno mjesto pogođeno kao rezultat pojave mutacije koja se proučava u molekuli DNK. .

PCR metoda reverzne transkriptaze (RT- PCR)

Ova metoda se koristi u slučajevima kada je prikladnije koristiti ne genomsku DNK kao predmet proučavanja, već kompaktniju i informacijski bogatiju cDNK dobijenu nakon odgovarajuće obrade uzoraka tkiva, na primjer, biopsijskog materijala ili ćelijskih linija limfocita, fibroblasti, itd. Važan uslov je ekspresija (barem minimalna) željenog gena u tkivu koje se proučava.

U prvoj fazi se vrši reverzna transkripcija mRNA, a rezultirajući molekuli cDNK služe kao šablon za PCR. Nakon toga, kritični region cDNK, amplificiran u dovoljnoj količini, podvrgava se sekvenciranju i drugim metodama skrininga mutacija, direktnoj elektroforetskoj studiji (detekcija delecija, insercija, itd.) ili integraciji u sistem ekspresije kako bi se dobio proteinski proizvod i njegovu direktnu analizu.

Ova metoda je posebno efikasna za otkrivanje mutacija koje dovode do sinteze “krnjeg” proteina (besmislene mutacije, mutacije spajanja, velike delecije) – takozvana PTT analiza (Protein Truncation Test). PTT analiza se obično koristi u proučavanju dugih multi-egzonskih gena, kao što su Duchenne/Beckerova mišićna distrofija, ataksija-telangiektazija ili neurofibromatoza tipa 1.

PCR u realnom vremenu(PCR u realnom vremenu, engleski)

Svake godine PCR u realnom vremenu postaje sve popularnija dijagnostička metoda u praktičnoj zdravstvenoj zaštiti. Njegova osnovna karakteristika je praćenje i kvantitativna analiza akumulacije proizvoda lančane reakcije polimeraze i automatska registracija i interpretacija dobijenih rezultata. Ova metoda ne zahtijeva fazu elektroforeze, što smanjuje zahtjeve za PCR laboratorijom. Zahvaljujući uštedi proizvodnog prostora, smanjenju broja osoblja i potražnji za kvantitativnim određivanjem DNK/RNA, ova metoda se posljednjih godina uspješno koristi u najvećim sanitarno-epidemiološkim, dijagnostičkim i istraživačkim centrima u razvijenim zemljama svijeta, zamjenjujući PCR u svom trenutnom („klasičnom“) formatu.

PCR u realnom vremenu koristi fluorescentno obilježene oligonukleotidne sonde za otkrivanje DNK dok se umnožava. PCR u realnom vremenu omogućava potpunu analizu uzorka u roku od 20-60 minuta i teoretski je sposoban detektirati čak i jedan DNK ili RNK molekul u uzorku.

Rice. 17. PCR u realnom vremenu.

PCR u realnom vremenu koristi TaqMan sistem koji kontroliše PCR kinetiku direktno tokom amplifikacije koristeći gašenje rezonancije fluorescencije. Za detekciju se koristi sonda koja nosi fluorofor i gasitelj komplementaran srednjem dijelu amplificiranog fragmenta. Kada su fluorofor i gasitelj vezani za oligonukleotidnu sondu, uočava se samo manja fluorescentna emisija. Tokom procesa amplifikacije, zbog 5" egzonukleazne aktivnosti Taq polimeraze, fluorescentna oznaka odlazi u rastvor, oslobođena od svoje blizine gasitelju, i generiše fluorescentni signal koji se povećava u realnom vremenu proporcionalno akumulaciji pojačala ( Slika 17).

Glavne prednosti PCR u realnom vremenu u odnosu na PCR sa gel elektroforezom:

· Cela metoda se odvija u jednoj epruveti;

· Metoda traje 1 sat;

· 1-2 radne sobe su dovoljne;

· Uz kvalitativnu procjenu rezultata, postoji mogućnost kvantitativne procjene (npr. kod propisivanja antivirusne terapije za AIDS ili virusni hepatitis potrebno je znati virusno opterećenje, odnosno količinu virusa po jedinici koja obezbeđuje PCR u realnom vremenu);

· Rizik od kontaminacije je naglo smanjen.

Zaključak

PCR metoda je jedna od najčešćih metoda molekularno bioloških istraživanja. Kliničari bi ovu metodu trebali inteligentno koristiti, a ljekar koji odluči da koristi PCR u svom radu mora imati određena znanja o karakteristikama i mogućnostima ove metode. Drugo, mora postojati bliska povratna informacija između kliničara i PCR laboratorije, koja je neophodna za analizu složenih slučajeva i razvoj ispravne dijagnostičke strategije. Treće, PCR analiza nije lijek za dijagnostiku (prvenstveno zaraznih bolesti) i ne zamjenjuje postojeće metode istraživanja, već ih samo nadopunjuje. I što je najvažnije, PCR ne može zamijeniti intuiciju i analitičko razmišljanje koje liječnik koji očekuje uspjeh mora imati.

P . S . Molekularno biološka istraživanja - mijenjanje smjernica za dijagnozu i liječenje. Upotreba molekularno bioloških metoda povezana je s perspektivom radikalne promjene naglaska u laboratorijskoj dijagnostici. Možda se ne radi samo o pravovremenim informacijama, već o tome da ih dobijete unaprijed. Ako se sada laboratorijski testovi u većini slučajeva provode već kada se bolest razvila i liječenje je počelo, onda se očekuje da će molekularno-biološki laboratorijski podaci omogućiti da se utvrdi sklonost osobe određenim vrstama patologije i stepen osjetljivosti na određene lijekove. , koji će opravdati prediktivnu, preventivnu i personalizovanu prirodu buduće medicine.

PROMJENA DIJAGNOSTIKE I ORIJENTACIJE U LJEČENJU

NASLJEDNE BOLESTI

Danas U budućnosti

Dijagnoza Genetski pasoš

8. Koliko je radnih prostorija potrebno za rad PCR laboratorije sa fluorescentnom detekcijom (kvantitativna analiza, PCR u realnom vremenu)?

9. Šta je detekcija?

10. Koje metode DNK dijagnostike postoje?

11. Rad kog enzima je u osnovi PCR?

12. Zašto se zona detekcije mora ukloniti iz drugih radnih područja?

13. Šta je restriktivna lokacija?

14. Koje su razlike između direktne i indirektne DNK dijagnostičke metode?

15. Šta je sekvenciranje?

16. Šta je multipleks PCR?

17. Koje vrste mutacija se određuju PCR-om?

18. Šta je kontaminacija?

19. Koja je suština alel-specifične metode amplifikacije?

20. Uslovi skladištenja PCR materijala?

21. U kom uređaju se pojačava?

22. Šta je metoda PCR reverzne transkriptaze (RT-PCR)?

23. Šta služi kao materijal za PCR dijagnostiku?

24. Navedite vrste kontaminacije?

Testovi za samopripremu

1. Endonukleazni restrikcijski enzimi:

a) enzimi koji "razbijaju" DNK na strogo određenim mjestima;

b) enzimi koji spajaju lomove u molekulu DNK;

c) enzimi koji obezbeđuju jedinjenja koja vrše popravku DNK.

2. Amplifikacija gena:

3. Koja metoda molekularne genetike se koristi za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih mutiranim genom poznate sekvence?

a) upotreba specifičnog restriktivnog enzima;

b) direktna detekcija upotrebom specifičnih molekularnih sondi;

c) porodična analiza distribucije polimorfizama dužine normalnih restrikcijskih fragmenata.

4. DNK sekvenciranje:

a) identifikacija sekvence baze DNK;

b) višestruko ponavljanje bilo kojeg dijela DNK;

c) izolacija fragmenta DNK koji sadrži gen koji se proučava.

5. Za dobijanje DNK uzoraka možete koristiti :

b) horionske resice;

c) amnionska tečnost;

d) ćelije amnionske tečnosti;

e) biopsijski uzorci kože, mišića, jetre,

e) sve je tačno osim tačke "c",

g) sve je tačno osim tačke “d”,

h) sve gore navedeno je tačno.

6. Za dijagnosticiranje koje se mutacije koristi PCR metoda:

a) genomski;

b) hromozomski;

c) gen (tačka).

7. Prajmer je:

a) komplementarni dio DNK;

b) sintetički oligonukleotid označen (radioaktivno ili fluorescentno) sekvencu komplementarnu mutantnom ili normalnom genu;

c) oligonukleotid koji djeluje kao “prajmer” i inicira sintezu polinukleotidnog lanca na DNK ili RNK matrici.

8. Ko je razvio princip PCR metode?

b) K. Mullis

9. Koristi li se PCR metoda za dijagnosticiranje ekspanzije trinukleotidnih ponavljanja (dinamički tip mutacije)?

10. U kojim oblastima se koristi PCR?

a) klinička medicina;

b) određivanje transgenih organizama (GMO)

c) lična identifikacija, utvrđivanje očinstva, forenzika

d) sve gore navedeno,

e) ništa od navedenog..

Primjeri odgovora: 1 – a; 2 – b; 3 – b; 4 – a; 5 – e; 6 – u; 7 – u; 8 – b; 9 – a, 10 – g.

Main

1.Bočkova genetika. Moskva. GEOTAR, 2002.

Dodatno

1. , Bakharev i liječenje urođenih i nasljednih bolesti kod djece. – Moskva, 2004.

2. DNK dijagnostika i medicinsko genetičko savjetovanje. – Moskva, 2004.

3. Ginter genetika. – Moskva, 2003.

4. Gorbunov osnove medicinske genetike. – Sankt Peterburg: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molekularna klinička dijagnostika. – Svijet, 1999.

6. Menšikov - biološka istraživanja u kliničkoj laboratorijskoj dijagnostici: mogućnosti problema (predavanja). Klinička laboratorijska dijagnostika, br. 3, 2006.

7. Kornienkov rad u PCR laboratoriji tokom in-line analize biološkog materijala. Klinička laboratorijska dijagnostika, br. 10, 2006.

8. Organizacija rada PCR laboratorije. Metodička uputstva. MU 1.3.1794-03. Glavni sanitarni doktor Ruske Federacije, 2003.

9. Erlich H. A. PCR tehnologija. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Kvantitativni PCR u realnom vremenu. Genome Res. – br. 6, 1996.

OSNOVNI PRINCIPI METODE

POLIMERAZNA LANČANA REAKCIJA

Metodički priručnik za vannastavni rad studenata 3-4 godine na specijalnostima opšte medicine (060101) i pedijatrije (060103).

GOU VPO "Državna medicinska akademija Krasnojarsk Federalne agencije za zdravstvo i socijalni razvoj"

Rusija, Krasnojarsk,