Interferoni su proteinski molekuli s molekulskom težinom od 15.000 do 21.000 daltona koje proizvode i luče stanice kao odgovor na virusnu infekciju ili druge patogene.
Interferoni (IFN) su grupa autogenih glikoproteina čiji je biomehanizam djelovanja povezan s istovremenim antivirusnim djelovanjem - aktivacijom ćelijskih gena, uslijed čega se sintetiziraju proteini koji inhibiraju sintezu virusne DNK (RNA) i imaju imunomodulatorno djelovanje - sposobnost da se pojača ekspresija antigena na ćelijskim membranama i poveća aktivnost citotoksičnih T stanica i prirodnih stanica ubojica.
IFN se dijele u dvije vrste. Prvi tip, koji djeluje kao inhibitor replikacije virusa i ima pretežno antivirusno djelovanje, uključuje 22 različita podtipa IFN-α i jedan podtip IFN-β. Drugi tip, koji pokazuje imunomodulatornu aktivnost, uključuje IFN-γ.
Postoje tri imunološki različite klase IFN-a: IFN-α, IFN-β, IFN-γ.
Prirodni IFN uključuju limfoblastoidni i leukocitni IFN (IFN-α), sintetiziran od strane stimuliranih humanih monocita i B limfocita, koji se zatim ekstrahuju i prečišćavaju; IFN fibroblasta (IFN-β), dobijen iz kulture humanih fibroblasta, i IFN T-limfocita (IFN-γ).
Umjetno sintetizirani IFN-ovi uključuju rekombinantni IFN-α, koji je visoko pročišćeni pojedinačni podtip IFN-α proizveden korištenjem rekombinantne molekularne tehnologije.
Poznate su metode za dobijanje humanog leukocitnog interferona iz leukocita krvi humanog donora, izazvanog virusima i drugim induktorima.
Glavni nedostatak ovih metoda za proizvodnju interferona je vjerovatnoća kontaminacije konačnog proizvoda ljudskim virusima, kao što su virus hepatitisa B i C, virus imunodeficijencije itd.
Trenutno je metoda proizvodnje interferona mikrobiološkom sintezom prepoznata kao perspektivnija, što omogućava dobivanje ciljanog proizvoda sa značajno većim prinosom od relativno jeftinih početnih materijala. Pristupi korišteni ovdje omogućavaju stvaranje varijanti strukturnog gena koje su optimalne za ekspresiju bakterija, kao i regulatornih elemenata koji kontroliraju njegovu ekspresiju.
Kao izvorni mikroorganizmi koriste se različiti dizajni sojeva Pichia pastoris, Pseudomonas putida i Escherichia coli.
Nedostatak upotrebe P. pastoris kao proizvođača interferona su izuzetno teški uslovi fermentacije ove vrste kvasca i potreba da se striktno održava koncentracija induktora, posebno metanola, tokom procesa biosinteze.
Nedostatak korištenja Ps. putida je složenost procesa fermentacije na niskom nivou ekspresije (10 mg interferona po 1 litru podloge). Produktivnija je upotreba sojeva Escherichia coli.
Poznat je veliki broj plazmida i sojeva E. coli stvorenih na njihovoj osnovi koji eksprimiraju interferon: E. coli sojevi ATCC 31633 i 31644 sa plazmidima Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 ili Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli soj pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli soj pINF-F-Pa (AU 1312962), E. Coli soj SG 20050 sa plazmidom p280/21FN VK i dr. Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, br. 9, str. 1186-1193), E. Coli SG 20050 soj sa plazmidom pINF14 (SU 1703691), E. coli SG 20050 soj sa pINFRU41 plasmidom (4 soj pINFRU41) i dr. Nedostatak tehnologija zasnovanih na upotrebi ovih sojeva je njihova nestabilnost, kao i nedovoljan nivo ekspresije interferona.
Uz karakteristike korišćenih sojeva, efikasnost procesa u velikoj meri zavisi od tehnologije koja se koristi za izolaciju i prečišćavanje interferona.
Poznata je metoda za proizvodnju interferona, koja uključuje uzgoj Ps ćelija. putida, uništavanje biomase, tretman polietileniminom, frakcionisanje amonijum sulfatom, hidrofobna hromatografija na fenilsilohromu C-80, pH frakcionisanje lizata, njegova koncentracija i dijafiltracija, jonoizmenjivačka hromatografija na celulozi DE-52, eluiranje u pH gradijentu, ion izmjenjivačka hromatografija dobivenog eluenta na celulozi SM -52, koncentriranje propuštanjem kroz filter kasetu i gel filtracija na Sephadex G-100 (SU 1640996). Nedostatak ove metode, pored složene višestepene fermentacije, je i višestepenost procesa u dobijanju konačnog proizvoda.
Poznata je i metoda za proizvodnju interferona, koja uključuje kultivaciju soja E. coli SG 20050/pIF16 u LB bujonu u tikvicama u termostatiranom šejkeru, centrifugiranje biomase, ispiranje puferskom otopinom i ultrazvučni tretman za uništavanje stanica. Dobiveni lizat se centrifugira, ispere sa 3M rastvorom uree u puferu, rastvori u rastvoru gvanidin hlorida u puferu, obradi ultrazvukom, centrifugira, oksidativnom sulfitolizom, dijalizom protiv 8 M uree, renaturacijom i finalnom dvostepenom hromatografijom na CM- 52 celuloza i Sephadex G-50 (RU 2054041).
Nedostaci ove metode su relativno niska produktivnost glavnih faza procesa izolacije i pročišćavanja. Ovo se posebno odnosi na ultrazvučnu obradu proizvoda, dijalizu i oksidativnu sulfitolizu, što dovodi do nestabilnosti prinosa interferona, kao i nemogućnosti upotrebe ove metode za industrijsku proizvodnju interferona.
Kao najbliži analog (prototip) može se navesti metoda za dobijanje interferona humanih leukocita, koja se sastoji u kultivaciji rekombinantnog soja E. coli, zamrzavanju nastale biomase na temperaturi koja ne prelazi -70°C, odmrzavanje, uništavanje ćelija mikroorganizama. sa lizozimom, uklanjanjem DNK i RNK uvođenjem u lizat DNK-aze i prečišćavanjem izolovanog nerastvorljivog oblika interferona ispiranjem puferskim rastvorom sa deterdžentima, otapanjem taloga interferona u rastvoru gvanidin hidrohlorida, renaturacijom i jednostepenim prečišćavanjem ionom izmjenjivačka hromatografija. Kao proizvođač koristi se soj E. coli SS5 dobijen korišćenjem rekombinantnog plazmida pSS5 koji sadrži tri promotora: Plac, Pt7 i Ptrp i alfa-interferon gen sa uvedenim nukleotidnim supstitucijama.
Ekspresija interferona od strane E. coli SS5 soja koji sadrži ovaj plazmid kontrolišu tri promotora: Plac, Pt7 i Ptrp. Nivo ekspresije interferona je oko 800 mg po 1 litru ćelijske suspenzije.
Nedostatak ove metode je niska tehnološka efikasnost upotrebe enzimske destrukcije ćelija, DNK i RNK mikroorganizma i jednostepenog hromatografskog prečišćavanja interferona. To uzrokuje nestabilnost u procesu oslobađanja interferona, dovodi do smanjenja njegove kvalitete i ograničava mogućnost korištenja gornje sheme za industrijsku proizvodnju interferona.
Nedostaci ovog plazmida i soja baziranog na njemu su upotreba u plazmidu jakog neregulisanog promotora faga T7 u soju E. coli BL21 (DE3), u kojem se gen T7 RNA polimeraze nalazi ispod promotora lac operon i koji uvijek "teče". Posljedično, u ćeliji se kontinuirano odvija sinteza interferona, što dovodi do disocijacije plazmida i smanjenja vitalnosti ćelija soja, a kao rezultat toga i smanjenja prinosa interferona.
Za dobivanje velikih količina IFN-a koriste se šestodnevne monoslojne kulture stanica pilećih embrija ili kultiviranih leukocita ljudske krvi inficiranih određenom vrstom virusa. Drugim riječima, da bi se dobio IFN, kreira se određeni sistem virus-ćelija.
Gen odgovoran za biosintezu IFN izolovan je iz ljudske ćelije. Egzogeni ljudski IFN se proizvodi korištenjem tehnologije rekombinantne DNK. Postupak za izolaciju cDNK IFN-a je sljedeći:
1) mRNA je izolirana iz ljudskih leukocita, frakcionirana po veličini, reverzno transkribirana i umetnuta na mjesto modificiranog plazmida.
2) Dobijeni proizvod se koristi za transformaciju E. coli; rezultirajući klonovi su podijeljeni u grupe koje su identificirane.
3) Svaka grupa klonova je hibridizovana sa IFN - mRNA.
4) Iz dobijenih hibrida koji sadrže cDNK i chRNA, mRNA se izoluje i prevodi u sistem sinteze proteina.
5) Odrediti antivirusnu aktivnost interferona svake mješavine dobivene kao rezultat translacije. Grupe koje su pokazale aktivnost interferona sadrže klon sa cDNK hibridizovanom sa IFN - mRNA; klon koji sadrži cDNK humanog IFN-a pune dužine je ponovo identificiran.
2. Mehanizmi djelovanja interferona
IFN pokazuju neke aktivnosti kao limfokini i imunomodulatori. IFN tipa I, koji prvenstveno djeluju kao inhibitori replikacije virusa u ćeliji, ispoljavaju svoj učinak stimulirajući proizvodnju staničnih enzima ribozomima stanica domaćina, koji inhibiraju proizvodnju virusa, ometajući translaciju virusne mRNA i sintezu virusni proteini.
IFN proizvodi većina životinjskih vrsta, ali manifestacija njihove aktivnosti je specifična za vrstu, tj. djeluju samo u vrsti životinja u kojoj su proizvedeni.
IFN izazivaju indukciju tri enzima:
protein kinaza, koja remeti početnu fazu izgradnje peptidnog lanca;
oligoizoadenilat sintetaza, koja aktivira RNKazu, koja uništava virusnu RNK;
fosfodiesteraza, koja uništava konačne nukleotide tRNA, što dovodi do poremećaja elongacije peptida.
Uzimajući u obzir antivirusno i imunomodulatorno djelovanje IFN-a, NPO Biomed je predložio i uspješno testirao čepiće sa IFNan1 i probioticima za liječenje disbioze virusne i bakterijske etiologije, kandidijaze; u ginekološkoj praksi za liječenje endometritisa, kolpita, vaginitisa i ginekološkog herpesa.
3. Terapeutska upotreba humane INF
Postoje dvije generacije interferonskih lijekova. Prvu generaciju karakterizira prirodno porijeklo, u kojem se dobiva iz krvi davalaca. Od njega se dobija suvi ljudski leukocitni interferon koji se koristi za inhalaciju i ukapavanje u nosne prolaze. Takođe proizvode interferon u supozitorijama, prečišćeni koncentrovani interferon u suvom obliku i leukinferon.
Ova metoda proizvodnje lijekova na bazi interferona prilično je skupa i nedostupna, pa su krajem 20. stoljeća genetskim inženjeringom stvoreni interferonski lijekovi druge generacije.
Tako je bilo moguće razviti lijekove Viferon, Interal i druge koji sadrže rekombinantni humani interferon alfa
Zbog svojih jedinstvenih svojstava, preparati interferona koriste se u liječenju i prevenciji svih respiratornih bolesti, većine karcinoma, te za liječenje mnogih virusnih bolesti i gripa. Preparati interferona se široko koriste u liječenju hepatitisa B i C: interferon ograničava razvoj virusa, sprječava nastanak ciroze i eliminira smrt.
Neki interferonski lijekovi imaju nuspojave, kao što su osip na koži, alergije i bolesti hematopoetskog sistema.
Uz dugotrajnu upotrebu interferona, tijelo proizvodi antitijela na interferon, što ga čini nesposobnim da se bori protiv virusa. Razlog za ove pojave leži u prisustvu albumina u preparatima na bazi interferona.
Albumin se dobija iz krvi, tako da postoji rizik (iako minimalan) od zaraze hepatitisom i drugim bolestima koje se prenose krvlju.
|
Ime droge |
Podtip INF |
Način dobijanja |
farmakološki efekat |
Indikacije za upotrebu |
||||
|
Interferon |
Biosinteza u kultivisanim leukocitima krvi donora pod uticajem virusa |
Antivirusno, imunomodulatorno, antiproliferativno |
Virusne bolesti, leukemija, maligni melanom, rak bubrega, karcinoidni sindrom |
|||||
|
Interlock |
Biosinteza u kultivisanim leukocitima krvi donora pod uticajem paramikovirusa |
Suzbija aktivnost brojnih virusa |
Virusne bolesti oka, hepatitis |
Rekombinantna |
Antivirusno, imunomodulatorno, inhibira proliferaciju širokog spektra tumorskih ćelija |
Epitelni oblik akutne i rekurentne virusne infekcije oka; onkološke bolesti |
||
|
Interferon alfa-2a |
Rekombinantna. Protein koji sadrži 165 aminokiselina |
Antivirusno, antitumorsko djelovanje |
Leukemijska retikuloendotelioza, Kaposijev sarkom, rak bubrega, rak mokraćne bešike, melanom, herpes zoster |
|||||
|
Reaferon |
Rekombinantni INF proizveden od bakterijskog soja pseudomonasa, čiji genetski aparat sadrži gen za humani leukocitni IFN α2. Identično IFN α2 humanih leukocita. |
Virusne, tumorske bolesti |
||||||
|
Interferon alfa – n1 |
Visoko pročišćeni ljudski INF |
Antivirusno |
Hronični aktivni infektivni hepatitis B |
|||||
|
Inreferon beta |
Superprodukcija humanih fibroblasta stimulatorom u prisustvu metaboličkih inhibitora |
Antivirusno, imunomodulatorno, antitumorsko djelovanje |
Hronične virusne infekcije u oftalmologiji, ginekologiji i urologiji, dermatologiji, hepatologiji, onkologiji |
|||||
|
Interferon gama |
Rekombinantna |
Antivirusno, imunomodulatorno, antitumorsko djelovanje |
Hronične granulomatozne bolesti |
1. www.antibiotic.ru/ab/brviri.shtml
2. www.interferon.su/php/content.php?id=71
3. www.pharmvestnik.ru
4. Privremeni farmakopejski članak 42U-23/60-439-97. Interferon humani rekombinantni alfa-2.
5. Gavrikov A.V. Optimizacija biotehnološke proizvodnje rekombinantnih humanih interferonskih supstanci - M., 2003,
6. Glick B., Pasternak J. Molekularna biotehnologija / B. Glick, J. Pasternak. – M., Mir, 2002.
7. Državna farmakopeja SSSR-a. XI izd., broj 1.- P. 175.
8. Državni registar lijekova / Ed. A.V. Katlinsky i drugi - M., 2002.
9. Naroditsky B.S. Molekularna biotehnologija interferona. // zbornik naučno-praktične konferencije “Interferon – 50 godina”. – M., 2007, str. 17-23
10. Osnovi farmaceutske biotehnologije: Udžbenik / T.P. Prishchep, V.S. Čučalin, K.L. Zaikov, L.K. Mikhaleva. – Rostov na Donu: Phoenix; Tomsk: Izdavačka kuća NTL, 2006.
11. Frolov A.F., Vovk A.D., Dyadyun S.T. i dr. Efikasnost rekombinantnog alfa-dva-interferona kod virusnog hepatitisa B // Medicinski poslovi - Kijev, 1990. - Br. 9. - P. 105–108.
Upotreba: biotehnologija, medicinska industrija. Suština pronalaska: konstruisan je rekombinantni plazmid pSV69, uključujući fragment DNK koji kodira prekursor humanog imunog interferona; transformisati ćelijsku liniju COS-7 sa rezultujućim rekombinantnim vektorom, odabrati transformisane ćelije koje se uzgajaju u uslovima koji obezbeđuju akumulaciju ciljnog produkta i izolovati zreli oblik interferona bez N-terminalnog Cys-Tyr-Cys (des- Cys-Tyr-Cysinterferon). 8 ill.
Pronalazak se odnosi na tehnologiju rekombinantne DNK, na sredstva i metode korišćenja te tehnologije u otkrivanju sekvence DNK i njome određene sekvence aminokiselina za humani imuni interferon, njegovu proizvodnju, kao i na različite dobijene proizvode i njihovu upotrebu. Konkretnije, ovaj pronalazak se odnosi na izolaciju i identifikaciju DNK sekvenci koje kodiraju humani imuni interferon i na konstrukciju rekombinantnog ekspresionog vektora koji sadrži ove DNK sekvence operativno povezane sa sekvencama promotora, i na sprovođenje ekspresije sa tako dobijenim vektorima. U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na sisteme kulture domaćina, kao što su različiti mikroorganizmi i ćelijske kulture kičmenjaka, transformisane ekspresionim vektorima i na taj način usmjerene na ekspresiju prethodno navedenih DNK sekvenci. U još jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na sredstva i metode za pretvaranje krajnjih proizvoda takve ekspresije u nove entitete, kao što su farmaceutske kompozicije korisne za lečenje i prevenciju ljudi. U poželjnim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje specifične vektore ekspresije koji imaju sekvence takve da se ljudski imuni interferon proizvodi i oslobađa iz ćelija domaćina u zrelom obliku. Pored toga, ovaj pronalazak se odnosi na različite procese koji se koriste za dobijanje takvih sekvenci DNK, ekspresionih vektora, sistema kulture domaćina i krajnjih proizvoda i njihovih derivata, kao i specifičnih i povezanih stanja. Ovaj pronalazak je dijelom rezultat otkrića sekvence DNK i određene sekvence aminokiselina koja kodira ljudski imuni interferon. Pored toga, ovaj pronalazak pruža informacije o sekvenci na 3" i 5" bočnim sekvencama gena humanog imunog interferona, što olakšava njegovo in vitro povezivanje u ekspresione vektore. Konkretno, identificiran je segment DNK od 5" koji kodira predloženi endogeni signalni polipeptid, koji neposredno prethodi sekvenci aminokiselina navodnog zrelog humanog imunog interferona. Ova otkrića olakšavaju razvoj sredstava i metoda za dobijanje, korištenjem tehnologije rekombinantne DNK, dovoljnu količinu humanog imunog interferona, što je zauzvrat osiguralo mogućnost određivanja njegovih biohemijskih svojstava i bioaktivnosti. Publikacije i drugi materijali koji se koriste za osvetljavanje pozadine pronalaska, au nekim slučajevima i za isticanje dodatnih detalja u vezi sa njegovom primjenom, uključeni su referencom, numerirani radi praktičnosti u tekstu ispod, i shodno tome raspoređeni u popratnoj bibliografiji. STANJE PRONALASKA
A. Ljudski imuni interferon
Ljudski interferoni se mogu svrstati u tri grupe u zavisnosti od njihove različite antigenosti i bioloških i biohemijskih svojstava. Prvu grupu čini porodica leukocitnih interferona (α-interferon, Le IF ili IFN-), koje uglavnom proizvode odgovarajuće ljudske krvne ćelije pod uticajem virusa. Ovi interferoni su dobijeni mikrobiološki i otkrivena je njihova biološka aktivnost (1, 2, 3). Njihova biološka svojstva odredila su njihovu upotrebu u klinikama kao terapijskih sredstava u liječenju virusnih infekcija i malignih stanja (4). U drugoj grupi je interferon humanih fibroblasta (- interferon, FIF ili IFN-), koji tipično proizvode fibroblasti pod uticajem virusa, koji je takođe proizveden mikrobiološki i za koji je utvrđeno da ispoljava širok spektar bioloških aktivnosti (5). Klinička ispitivanja također ukazuju na njegovu potencijalnu terapeutsku vrijednost. Interferoni leukocita i fibroblasta imaju veoma izražene sličnosti u svojim biološkim svojstvima, uprkos činjenici da je stepen homologije na nivou aminokiselina relativno nizak. Osim toga, obje grupe interferona sadrže od 165 do 166 aminokiselina i kiseli su stabilni proteini. Ljudski imuni interferon (--interferon, IIF ili IFN-), koji je predmet ovog izuma za razliku od - i - interferona, labilan je na pH 2, proizvodi se uglavnom mitogenom indukcijom limfocita i također je potpuno različit u antigena svojstva. Do nedavno, ljudski imuni interferon se mogao dobiti samo u vrlo malim količinama, što je prirodno otežavalo njegovu karakterizaciju. Nedavno je prijavljeno mnogo veće, ali ipak djelomično, pročišćavanje humanog imunog interferona (6). Izvještava se da je ovo jedinjenje dobiveno iz kultura limfocita stimuliranih kombinacijom fitohemaglutinina i estera forbola i pročišćeno serijskim hromatografskim razdvajanjem. Ovaj postupak je rezultirao proizvodom s molekulskom težinom od 58 000. Ljudski imuni interferon je proizveden u vrlo malim količinama prevođenjem mRNA u oscite koji pokazuju karakteristike interferonske aktivnosti humanog imunog interferona, te se nadalo da se cDNK imunog interferona može sintetizirati i klonirano (7). Do sada dobijena količina imunog interferona očito je nedovoljna za izvođenje neupitnih eksperimenata za karakterizaciju i utvrđivanje bioloških svojstava prečišćene komponente. Međutim, in vitro studije sprovedene sa sirovim preparatima, kao i in vivo eksperimenti sa preparatima interferona za pacove, sugerišu da glavna funkcija imunog interferona može biti imunoregulatorno sredstvo (8 i 9). Imuni interferon ima ne samo antivirusnu i antićelijsku aktivnost, zajedničku svim ljudskim interferonima, već i potencirajući učinak na ove aktivnosti - i - interferone (10). Dodatno, antiproliferativni efekat α-interferona na tumorske ćelije in vitro je približno 10-100 puta veći nego kod drugih klasa interferona (8, 11, 12). Ovaj rezultat, zajedno sa njegovom snažnom imunoregulatornom ulogom (8 i 9), sugerira mnogo veći antitumorski kapacitet za IFN-γ nego za FN-γ i IFN-γ. Zaista, u in vivo eksperimentima na miševima i pacovima, IFN-α lijekovi pokazuju izraženu superiornost nad interferonima stimuliranim virusom u smislu antitumorske aktivnosti protiv osteosarkoma (13). Sve ove studije prije ovog pronalaska su morale biti izvedene na značajno kontaminiranim preparatima zbog njihove izuzetno niske dostupnosti. Međutim, oni su jasno potvrdili vrlo važne biološke funkcije imunog interferona. Imuni interferon ima ne samo primarnu antivirusnu aktivnost, već vjerovatno i jaku imunoregulatornu i antitumornu aktivnost, što ga jasno identificira kao potencijalno obećavajuću kliničku metu. Bilo je jasno da bi upotreba tehnologije rekombinantne DNK bila najefikasniji način za dobijanje velikih količina potrebnog humanog imunog interferona. Bez obzira na to da li tako proizvedene supstance uključuju glikozilaciju, što se smatra karakteristikom prirodnog materijala ljudskog porijekla, vjerojatno će pokazati bioaktivnost koja bi ih kvalificirala za kliničku upotrebu u liječenju širokog spektra virusnih bolesti, neoplazmi i suzbijena stanja, imunitet. B. Rekombinantna DNK tehnologija
Rekombinantna DNK tehnologija je dostigla zrelost. Molekularni biolozi mogu prilično lako da rekombinuju različite sekvence DNK, stvarajući nove tipove DNK koji mogu proizvesti značajne količine egzogenih proteinskih proizvoda u transformisanim mikrobima. U osnovi, razvijeni su načini i metode za in vitro vezivanje različitih DNK fragmenata sa tupim ili “ljepljivim” krajevima, uz pomoć kojih se dobijaju potencijalni ekspresioni vektori pogodni za transformaciju specifičnih mikroorganizama, čime se reguliše ciljana sinteza željenog egzogenog proizvodi. Međutim, za pojedinačne proizvode ovaj put ostaje prilično težak, a nauka još nije dostigla fazu na kojoj se može garantovati uspjeh. Plazmid, nehromozomska petlja dvolančane DNK koja se nalazi u bakterijama i drugim mikrobima, i često u više kopija po ćeliji, ostaje osnovni element tehnologije rekombinantne DNK. Informacije kodirane u plazmidnoj DNK uključuju informacije potrebne za reprodukciju plazmida u ćelijama kćerima (tj. porijeklo replikacije) i obično jednu ili više fenotipskih karakteristika selekcije, kao što je otpornost bakterija na antibiotike, što omogućava kloniranje ćelije domaćina koji sadrže plazmid od interesa, biti prepoznati i preferirano rasti na selektivnim podlogama. Prednost plazmida leži u činjenici da ih može specifično probaviti jedna ili druga restrikcijska endonukleaza ili "restrikcioni enzim", od kojih svaki prepoznaje različite dijelove plazmidne DNK. Heterologni geni ili fragmenti gena mogu se zatim inkorporirati u plazmid spajanjem krajeva na mjesto cijepanja ili na rekonstruirane krajeve u blizini mjesta cijepanja. Tako se dobijaju takozvani vektori ekspresije koji se mogu replicirati. Rekombinacija DNK se događa izvan ćelije, ali rezultirajući "rekombinantni" ekspresioni vektor ili plazmid koji se može replicirati može se uvesti u ćelije na način poznat kao transformacija, stvarajući velike količine rekombinantnih vektora kao rezultat rasta transformanta. Štaviše, ako je gen na odgovarajući način orijentisan u odnosu na region plazmida koji kontroliše transkripciju i translaciju kodirajuće DNK, rezultujući ekspresioni vektor se može koristiti za stvarno proizvodnju polipeptidne sekvence koju kodira umetnuti gen, tj. za proces koji se zove izraz. Ekspresija se pokreće u regionu poznatom kao promotor, koji je prepoznat i vezan RNA polimerazom. Tokom transkripcione faze ekspresije, DNK se odmotava, izlažući je kao hemijski šablon za inicirano sintezu RNK glasnika iz DNK sekvence. Glasnička RNK se zauzvrat prevodi u polipeptid sa sekvencom aminokiselina koju kodira mRNA. Svaka aminokiselina je kodirana nukleotidnim tripletom ili "kodonom", koji zajedno čine "strukturni gen", odnosno dio koji kodira sekvencu aminokiselina eksprimiranog polipeptidnog proizvoda. Translacija je inicirana "start" signalom (obično ATG, koji postaje AUG u rezultirajućem glasniku RNK). Takozvani “stop” kodoni određuju kraj translacije i, shodno tome, dodavanje sljedećih aminokiselinskih jedinica. Ciljni proizvod se može dobiti lizom, ako je potrebno, ćelije domaćina i odvajanjem proizvoda od preostalih proteina korištenjem odgovarajućih metoda prečišćavanja. U praksi, upotreba tehnologije rekombinantne DNK može obezbijediti ekspresiju potpuno heterolognih polipeptida (tzv. direktna ekspresija) ili, alternativno, heterolognih polipeptida vezanih za dio aminokiselinske sekvence homolognog polipeptida. U potonjem slučaju, ciljni bioaktivni proizvod ponekad ostaje neaktivan u homologno-heterolognom fuzijskom polipeptidu sve dok se ne rascijepi u ekstracelularno okruženje (vidi UK Patent Published No. 2007676A i American Scientist 68, 664 (1980). C. Cell Culture Technology Tehnologija). Umjetnost kulture ćelija ili tkiva za proučavanje genetike i fiziologije ćelija je dobro razvijena.Poznati su uređaji i metode za održavanje trajnih ćelijskih linija dobijenih uzastopnim nizom transfera iz izomiranih normalnih ćelija.Za istraživačke primjene, takve ćelijske linije se održavaju na čvrstim podlogama u tečnom mediju ili uzgajanim u suspenziji koja sadrži pomoćne hranljive materije.Priprema većih serija preparata svodi se samo na mehaničke probleme.Detaljniji opis pozadine pronalaska može se naći u Microbiology and Edition, Harpes and Row Reblishers , Inc., Hagerstown, Maryland (1973), posebno na strani 1122, i dalje Scientific American 245, 66 i dalje (1981), od kojih je svaki ovdje uključen referencom. Ovaj pronalazak se zasniva na otkriću da se tehnologija rekombinantne DNK može korisno koristiti za proizvodnju humanog imunog interferona, poželjno u direktnom obliku i u količinama dovoljnim za pokretanje i provođenje životinjskih i kliničkih testiranja neophodnih prije stavljanja u promet. Ovaj proizvod je pogodan za upotrebu u svim svojim oblicima za prevenciju i liječenje virusnih infekcija, malignih oboljenja i stanja sa potlačenim ili defektnim imunološkim sistemom. Njegove varijante uključuju različite oligomerne oblike, koji mogu uključivati glikozilaciju. Ovaj proizvod se proizvodi u reinženjeringu genetski transformiranih mikroorganizama ili transformiranih sistema staničnih kultura. Kako se ovdje koristi, izraz "transformirajuća ćelija" odnosi se na ćeliju u koju je uvedena DNK, pri čemu je navedena DNK proizvod egzogene rekombinacije DNK, i potomstvo bilo koje takve ćelije koja zadržava tako uvedenu DNK. Stoga je sada moguće dobiti i osloboditi ljudski imuni interferon efikasnije nego što je to ranije bilo moguće. Jedan od bitnih faktora ovog pronalaska u njegovom najpoželjnijem ostvarenju je sposobnost da se genetski usmjeri mikroorganizam ili ćelijska kultura da proizvede ljudski imuni interferon u dovoljnim količinama da ga ćelije domaćini luče u zrelom obliku. Ovaj pronalazak uključuje tako dobijeni humani imuni interferon, sredstva i metode za njegovu proizvodnju. Ovaj pronalazak je dalje usmjeren na vektore ekspresije DNK sposobne za replikaciju koji čuvaju sekvence gena koji kodiraju humani imuni interferon u obliku dostupnom za ekspresiju. Ovaj pronalazak je također usmjeren na mikrobne sojeve ili ćelijske kulture transformirane ekspresijskim vektorima koji su prethodno opisani, i na mikrobne ili ćelijske kulture takvih transformiranih sojeva ili kultura koje su sposobne da proizvode humani imuni interferon. U još jednom aspektu, ovaj pronalazak je usmjeren na različite procese korisne za proizvodnju navedenih genskih sekvenci imunog interferona, vektora ekspresije DNK, mikrobnih sojeva i ćelijskih kultura, i njihovih specifičnih varijanti. Pored toga, ovaj pronalazak ima za cilj dobijanje fermentacionih kultura ovih mikroorganizama i ćelijskih kultura. Ovaj pronalazak je također usmjeren na proizvodnju humanog imunog interferona kao produkta direktne ekspresije kojeg luče ćelije domaćini u zrelom obliku. Ovaj napredak može koristiti gen koji kodira zrelu sekvencu humanog imunog interferona plus 5" bočnu DNK koja kodira signalni polipeptid. Vjeruje se da signalni polipeptid služi za transport molekula do ćelijskog zida domaćina, gdje se odcjepljuje tokom procesa zrelosti. ljudski sekret. Ova opcija omogućava izolaciju i pročišćavanje ciljanog zrelog imunološkog interferona bez pribjegavanja uključivanju postupka dizajniranog za uklanjanje intracelularnih proteinskih kontaminanata domaćina ili ćelijskih ostataka. Izraz "zreli ljudski imuni interferon" kako se koristi u tekstu označava proizvod mikrobne ili ćelijske kulture humanog imunog interferona koji ne sadrži signalni peptid ili prepeptidnu sekvencu koja nužno prati translaciju mRNA humanog imunog interferona. Prvi rekombinantni humani imunološki interferon proizveden u skladu sa ovim izumom ima metionin kao svoju prvu aminokiselinu (koja je rezultat uključivanja kodona startnog signala ATG prije strukturnog gena) ili, ako se metionin cijepa intra- ili ekstracelularno, ima normalno Prva aminokiselina je cistein. Zreli ljudski imuni interferon se takođe može dobiti kao konjugat sa proteinom koji nije konvencionalni signalni polipeptid, konjugat koji se može specifično odcepiti unutar ili izvan ćelije (videti UK Patent Publication No. 2007676A). Konačno, zreli ljudski imuni interferon može se proizvesti direktnom ekspresijom bez potrebe za cijepanjem bilo kakvih stranih nepotrebnih polipeptida. Ovo je posebno važno u slučajevima kada domaćin nije u stanju da ukloni ili ne uklanja signalni peptid efikasno, a ekspresioni vektor je namenjen da ekspresuje zreli humani interferon zajedno sa svojim signalnim peptidom. Tako dobijeni zreli ljudski imuni interferon se izoluje i prečišćava do nivoa pogodnog za upotrebu u lečenju virusnih bolesti, maligniteta i imunosupresivnih ili imunodeficijencija. Ljudski imuni interferon je dobijen na sljedeći način. 1. Ljudska tkiva, kao što je tkivo ljudske slezine ili limfociti periferne krvi, uzgajana su sa mitogenima da bi se stimulisala proizvodnja imunog interferona. 2. Ćelijski pelet iz takve ćelijske kulture je ekstrahovan u prisustvu inhibitora ribonukleaze da bi se dobila sva citoplazmatska RNK. 3. Ukupna glasnička RNK (mRNA) u poliadeniliranom obliku je izolirana na oligo-dT koloni. Ova RNK je frakcionisana po veličini korišćenjem gradijenta gustine saharoze i elektroforeze u gelu sa kiselinom i ureom. 4. Odgovarajuća RNK (12S do 18S) je pretvorena u odgovarajuću jednolančanu komplementarnu DNK (mDNK), iz koje je dobijena dvolančana cDNK. Nakon poli-dC ekstenzije, umetnut je u vektor tako da plazmid ima jedan ili više fenotipskih markera. 5. Tako dobijeni vektori su korišteni za transformaciju bakterijskih ćelija kako bi se dobila biblioteka kolonija. Radio-obilježene cDNK izvedene iz induciranih i neinduciranih RNK izolovanih kao što je prethodno opisano korištene su za odvojenu identifikaciju duplikata biblioteka kolonija. Višak cDNK je zatim uklonjen, a kolonije su izložene rendgenskom filmu kako bi se identificirali inducirani klonovi cDNK. 6. Odgovarajuća plazmidna DNK je izolovana iz indukovanih cDNK klonova i određena je njena bazna sekvenca. 7. Sekvencirana DNK je pripremljena in vitro za uključivanje u odgovarajući ekspresijski vektor, koji je korišten za transformaciju odgovarajuće ćelije domaćina, koja je zauzvrat ostavljena da raste u kulturi i ekspresira ciljni humani imuni interferon. 8. U nekim sistemima ćelija domaćina, kada se inkorporira u ekspresijski vektor tako da se eksprimira zajedno sa signalnim peptidom, zreli oblik humanog imunog interferona se luči u medijum ćelijske kulture, olakšavajući metode izolacije i prečišćavanja. Opis poželjnih ostvarenja pronalaska. A. Sistem ćelijske kulture/vektori ćelijske kulture. Razmnožavanje ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postala je uobičajena procedura poslednjih godina (videti akademske studije za kulturu tkiva Riess Kruse i Paterson ends, 1973). Ovdje je linija fibroblasta bubrega majmuna COS-7 korištena kao domaćin za proizvodnju imunog interferona (25a). Međutim, eksperimenti opisani ovdje mogu se izvesti na bilo kojoj ćelijskoj liniji koja je sposobna za replikaciju i ekspresiju kompatibilnog vektora, na primjer, ćelijske linije W138, BHK, 3T3, CHO, VERO i HeLa. Osim toga, ekspresijski vektor mora imati porijeklo replikacije i promotor lociran uzvodno od gena koji će biti eksprimiran, zajedno sa potrebnim mjestima vezivanja ribosoma, mjestima spajanja RNA, poliadenilacijskim mjestima i terminatorima transkripcije. Iako su ovi važni elementi SV40 korišćeni ovde, treba imati na umu da pronalazak, iako je ovde opisan u smislu njegovog poželjnog ostvarenja, ne treba smatrati ograničenim samo na ove sekvence. Na primjer, mogu se koristiti izvori replikacije drugih virusa (na primjer, Polyoma, Adeno, VSV, BPV, itd.). ) vektori, kao i ćelijski izvori replikacije DNK koji mogu funkcionirati u neintegriranom stanju. B. Ekspresija u kulturi ćelija sisara. Strategija za sintezu imunog interferona u kulturi ćelija sisara zasniva se na razvoju vektora sposobnog za autonomnu replikaciju i ekspresiju stranog gena pod kontrolom heterolognog transkripcionog fragmenta. Replikacija ovog vektora u kulturi tkiva postignuta je stimulacijom inicijatora replikacije DNK (izveden iz virusa SV 40) i stimulacijom akcesorne funkcije (T antigen) uvođenjem vektora u ćelijsku liniju koja endogeno eksprimira ovaj antigen (23 i 29) . Kasni promotor virusa SV 40 prethodi strukturnom interferonskom genu i osigurava transkripciju gena. Vektor koji je korišćen za generisanje ekspresije sastojao se od sekvenci pBR 322, koji obezbeđuje marker pogodan za selekciju u E. coli (otporan na ampicilin) kao i inicijator replikacije DNK. Ove sekvence su dobijene iz plazmida pML - 1 (28) i predstavljaju region koji sadrži restrikciona mesta ECo RI i Bam HI. SV 40 inicijator je dobijen kao dio PVu II - Hind III fragmenta veličine 342 bp, uključujući ovu regiju (30 i 31) (sa oba kraja pretvorena u Eco RI krajeve). Ove sekvence, pored toga što sadrže virusni inicijator replikacije DNK, kodiraju promotor i za ranu i za kasnu transkripcionu jedinicu, orijentacija inicijacionog mesta od SV-40 je bila takva da je promotor kasne transkripcione jedinice bio lociran proksimalno od gen koji kodira interferon. Na sl. Slika 1 prikazuje centrifugiranje poli(A) + RNK stimuliranih limfocita periferne krvi u gradijentu saharoze. Postoje dva maksimuma aktivnosti interferona (prikazana zasjenjenim pravokutnicima) veličina 12S i 16S. Lokacija rRNA markera (centrifugiranih nezavisno) označena je iznad konture apsorpcije. Na sl. Slika 2 prikazuje elektroforezu poli(A)+RNA stimuliranih PBL na kiselo-urea-agarozi. Uočen je samo jedan maksimum aktivnosti, koji migrira zajedno sa 18S RNK. Položaj ribosomskih RNK markera koji su podvrgnuti elektroforezi u susjednoj stazi i razvijeni bojenjem etidij bromidom označen je iznad konture aktivnosti. Na sl. Slika 3 prikazuje obrasce hibridizacije 96 kolonija sa indukovanim i neindukovanim 32 P-obilježene cDNK sonde. 96 pojedinačnih transformanata uzgajano je na mikrotitarskoj ploči, replicirano na dvije nitrocelulozne membrane, a zatim su filteri hibridizirani sa 32 uzorka P-cDNA izvedena iz bilo induciranih mRNA (gore) ili mRNA izoliranih iz neinduciranih pBL kultura (neinducirana, donja). Filteri su isprani kako bi se uklonila nehibridizirana RNK, a zatim izloženi rendgenskom filmu. Ova serija filtera predstavlja 86 takvih serija (8300 nezavisnih kolonija). Primjer induciranog klona označen je s H12. Fig. 4 je restrikciona mapa cDNK inserta klona 69. cDNK insert je povezan sa PstI mestima (tačke na oba kraja) i oligo-dC-dG repovima (ravne linije). Broj i veličina fragmenata dobijenih digestijom restrikcijskim nukleazama određivani su elektroforezom u 6% akrilamidnom gelu. Položaji lokacija su potvrđeni sekvenciranjem (prikazano na slici 5). Kodirajuća regija najvećeg otvorenog okvira čitanja je zaokružena, zasjenjena regija predstavlja 20 ostataka signalne peptidne sekvence, dok tačkasta regija predstavlja zrelu IEN sekvencu (46 aminokiselina); Kraj mRNA od 5" je na lijevoj strani, a kraj od 3" je na desnoj strani. Na sl. Slika 5 prikazuje nukleotidnu sekvencu cDNK inserta plazmida p69. Prikazana je i „izvedena“ aminokiselinska sekvenca najduže otvorene regije čitanja. Pretpostavljena signalna sekvenca je predstavljena ostacima označenim od S1 do S20. Na sl. Slika 6 prikazuje dijagram plazmida pSV69 koji se koristi za ekspresiju IFN-γ u ćelijama majmuna. Fig. Slika 7 prikazuje Southern hibridizaciju 8 različitih EcoRI digestiranih ljudskih genomskih DNK hibridiziranih sa 32 P-obilježenim 600 bp DdeI fragmentom. sa p69 cDNK umetka. Dva Eco RI fragmenta jasno su hibridizirana sa sondom u svakom uzorku DNK. Na sl. 8 prikazuje Southern hibridizaciju ljudske genomske DNK digestirane sa 6 različitih restrikcijskih endonukleaza hibridiziranih sa 32 P-obilježenom sondom iz p69. A. Izvor IFN-mRNA
Limfociti periferne krvi (PBL) su dobijeni od humanih donora pomoću leukoforeze. PBL su dalje pročišćeni gradijentnim centrifugiranjem u mješavini Ficoll-heparin, a zatim su kultivirani u koncentraciji od 510 6 ćelija/ml u RPMI 164 sa 1% L-glutamina, 25 mM HEPS i 1% otopinom penicilin-streptomicina (Gibco Jrand gsland, Ny) . Ove ćelije su inducirane da proizvode IFN-γ sa mitogenim stafilokoknim enterotoksinom B (N μg/ml) i kultivisane su 34-48 sati na 37°C u 5% CO. Desacetiltimozin (0,1 μg/ml) je dodat u PBL kulturu da bi se povećao relativni prinos aktivnosti IFN. B. Izolacija glasničke RNK. Ukupna RNK iz PBL kultura ekstrahirana je u suštini kako je izvijestio Bergen, S.L. et al. (33). Ćelije su izolovane centrifugiranjem i zatim resuspendovane u 10 mM NaCl, 10 mM TrCS-HCl (pH 7,5), 1,5 mM MgCl 2 i 10 mM ribonukleozid-vanadil kompleksu. Ćelije su lizirane dodavanjem NP-40 (1% konačne koncentracije), a jezgra su izolovana centrifugiranjem. Supernatant je sadržavao ukupnu RNK, koja je dalje pročišćena višestrukim ekstrakcijama fenolom i hloroformom. Vodena faza je podešena na 0,2 M NaCl, a zatim je sva RNK istaložena dodavanjem dvije zapremine etanola. Na isti način je izolirana RNK iz neindukovanih (nestimuliranih) kultura. Oligo-dT celulozna hromatografija je korištena za pročišćavanje mRNA od drugih RNK vrsta (34). Tipični prinosi od 1-2 L uzgajanog PBL-a bili su 5-10 mg ukupne RNK i 50-200 μg poli(A) + RNK. C. Frakcioniranje mRNA prema veličini. Za frakcioniranje preparata mRNA korištene su dvije metode. Ove metode su korištene nezavisno (a ne zajedno) i svaka je rezultirala značajnim obogaćivanjem IFN - mRNA. Centrifugiranje sa gradijentom saharoze u prisustvu denaturantnog formamida korišteno je za frakcioniranje mRNA. Gradijent od 5 do 25% saharoze u 70% foramidu (32) centrifugirani su na 154.000 g 19 h na 20 o C. Uzastopne frakcije (0,5 ml) su zatim izolovane sa vrha gradijenta, taložen etanol, a zatim su alikvoti ubrizgan u Xenopus laevis socites za translaciju mRNA (35). Nakon 24 h na sobnoj temperaturi, inkubacijski medij je testiran na antivirusnu aktivnost standardnom metodom inhibicije citopatskog efekta korištenjem virusa vezikularnog stomatitisa (soj Indiana) ili virusa eucepholomycarditisa na WISH (humani amnion) stanicama kako je opisao Stewart (36), osim što je uzorci su inkubirani sa ćelijama 24 sata (umjesto 4) prije infekcije virusom. U skladu s tim, uočena su dva vrha aktivnosti za RNK frakcionisanu na gradijentu saharoze (slika 1). Jedan vrh se sedimentirao na izračunatoj veličini 12S i sadržavao je 100-400 U/ml antivirusne aktivnosti (u poređenju sa standardom IFN-α) po μg ulazne RNK. Drugi vrh aktivnosti sedimentirao je na 16S i sadržavao je oko polovinu aktivnosti sporijeg sedimentiranog vrha. Čini se da je svaki od ovih vrhova aktivnosti uzrokovan IFN-α, budući da nije uočena aktivnost za iste frakcije testirane u liniji ćelija goveda (MDBK), koja nije zaštićena humanim IFN-α. I aktivnost IFN-γ i IFN-γ može se lako odrediti ispitivanjem MDVC (5). Frakcionisanje mRNA (260 μg) je takođe sprovedeno elektroforezom kroz kiselo-urea agarozne gelove. Viskozni agarozni gel (37 i 38) sastojao se od 1,75% agaroze. O.025 M natrijum citrat, pH 3,8 i 6 M urea. Elektroforeza je vršena 7 sati na 25 mA i 4 o C. Gel je zatim izrezan žiletom. Pojedinačne kriške su otopljene na 70°C i zatim ekstrahovane dva puta fenolom i jednom hloroformom. Frakcije su precipitirane etanolom, sekvencijalno analizirane na sadržaj IFN-γ mRNA ubrizgavanjem Xenopus laevis societes, a zatim podvrgnute antivirusnoj analizi. Za uzorke frakcionisane gelom, uočen je samo jedan vrh aktivnosti (slika 2). Ovaj pik se pojavljuje sa 18S i ima aktivnost od 600 U/ml po mikrogramu ulazne RNK. Čini se da je ova aktivnost specifična i za IFN-γ, jer ne štiti MDVK ćelije. Neusklađenost veličine uočena na gradijentima saharoze (12S i 16S) i kiselo-urea gelovima (18S) može se objasniti činjenicom da su ove nezavisne metode frakcionisanja sprovedene pod različitim uslovima potpune denaturacije. D. Dobijanje biblioteke kolonija,
Sadrže IFN sekvence. 3 mg gel-frakcionisane mRNA je korišteno za dobijanje dvolančane cDNK prema standardnim metodama (26 i 39)); cDNK je frakcionisana po veličini na 6% poliakrilamidnom gelu. Frakcije dvije veličine su elektroeluirane, 800 - 1500 bp. (138 ng) i > 1500 bp (204 ng). Dijelovi od 35 ng svake cDNK veličine su produženi deoksi C ostacima korištenjem terminalne deoksinukleotid transferaze (40) i žareni na 300 ng plazmida pBK 322 (41), koji je na sličan način vezan za deoksi ostatke na mjestu Pst I (40). Svaka renaturisana smeša je zatim transformisana u E. coli K12 soj 294. Dobijeno je približno 8000 transformanata sa 800-1500 bp cDNK. i 400 cDNK transformanata > 1500 bp. E. Izolacija kolonija iz biblioteke,
Indukovane cDNK. Dobijene kolonije su odvojeno inokulirane u jažice mikrotitarskih ploča koje sadrže LB (58) + 5 mg/ml tetraciklina i čuvane na -20 o C nakon dodavanja ZhDMSO do 7%. Dvije kopije biblioteke kolonija uzgajane su na nitroceluloznim filterima, a DNK iz svake kolonije je fiksiran na filter primjenom Gruushtein-Hogness metode (42). 32 P-obilježene cDNK sonde su pripremljene korištenjem gel frakcioniranih 18S mRNA iz induciranih i neinduciranih PBL kultura. Oligo-d T 12-18 je korišten kao prajmer; korišćeni su reakcioni uslovi koji su prethodno opisani (I). Filteri koji sadrže 8000 transformanata sa cDNK veličinom od 600-1500 bp. i 400 transformanata sa cDNK veličinom većom od 1500 bp. hibridizirano sa 2010. 6 cpm induciranih 30 P cDNK. Duplikat skupa filtera je hibridizovan sa 2010 6 cpm neindukovanih 32 P cDNK. Hibridizacija je sprovedena 16 h u uslovima opisanim od strane Fritsch et al (43). Filteri su temeljito isprani (43) i zatim izloženi Kodakov XR-5 rendgenskom filmu koristeći Du Pont Lighitning-Plus. 16-48 sati Hibridizacijski obrazac za svaku koloniju je upoređen sa dva uzorka. Približno 40% kolonija je bilo jasno hibridizovano sa obe sonde, dok približno 50% kolonija nije hibridizovano ni sa jednom sondom (videti sliku 3). 124 kolonije su se uočljivo hibridizirale sa pojedinačnom sondom, ali nedetektirano ili vrlo slabo sa neindukovanom sondom. Ove kolonije su pojedinačno inokulirane u jažice mikrotitarskih ploča, uzgajane i prebačene u nitrocelulozne filtere, a zatim hibridizirane s iste dvije sonde kao što je gore opisano. Plazmidna DNK izolovana iz svake od ovih kolonija brzom metodom (44) je takođe vezana za nitrocelulozne filtere i hibridizovana (45) sa stimulisanim sondama. DNK iz 22 kolonije koje su se hibridizirale samo sa indukcijskim sondama nazvane su "indukovane" kolonije. F. Karakteristike induciranih kolonija. Plazmidna DNK je dobijena iz 5 indukovanih kolonija (46) i korištena za karakterizaciju cDNK inserta. Restrikciono obeležavanje pet indukovanih plazmida (p67, p68, p69, p70 i p71) pokazalo je da četiri od njih imaju slične restrikcione mape. Ova četiri plazmida (p67, p69, p71 i p72) svaki imaju četiri Dde mjesta, 2 Hinf 1 mjesta i jednu Rsa 1 regiju u cDNK insertu. Peti plazmid (p68) sadrži uobičajeni Dde 1 fragment i čini se da je kratak cDNK klon povezan sa ostala četiri. Homologija predložena mapiranjem restrikcijskih nukleaza potvrđena je hibridizacijom. 32 P-obilježena DNK sonda (47) pripremljena je od 600 bp DdeI fragmenta. p67 plazmida i korišćeni su za hibridizaciju (42) sa preostalim indukovanim kolonijama. Svih pet kolonija mapiranih restrikcijskim nukleazama unakrsno je hibridizirano s ovom sondom, kao i 17 drugih kolonija od 124 pregledane. Dužina cDNA inserta u svakom od ovih unakrsnih hibridizujućih plazmida određena je PstI digestijom i gel elektroforezom. Čini se da je klon sa najdužim umetkom cDNK klon 69 sa veličinom umetanja od 1200-1400 bp. Ova DNK je korištena u svim daljnjim eksperimentima; njena restrikcijska mapa je prikazana na Sl. 4. Pokazalo se da je umetak p69 cDNK IFN-γ cDNK od proizvoda dobijenih u tri nezavisna ekspresiona sistema da bi pokazao antivirusnu aktivnost, kao što je detaljnije opisano dole. G. Sekvencijalna analiza umetanja cDNK p69. Kompletna nukleotidna sekvenca plazmida p69 cDNA inserta određena je metodom terminacije dideoksinukleotidnog lanca (48) nakon subkloniranja fragmenata u M 13 vektor m 7 (49) i hemijskom metodom Maxama i Gilberta (52). Najduži otvoreni okvir čitanja kodira protein od 166 aminokiselina prikazan na Sl. 5. Prvi ostatak kodira prvi metionin kodon uključen na 5" kraju cDNK. Prvih 20 ostataka na amino terminusu vjerovatno će služiti kao signalna sekvenca za izlučivanje preostalih 146 aminokiselina. Ova navodna signalna sekvenca dijeli zajedničke karakteristike s drugim poznatim signalnim sekvencama, kao što su veličina i hidrofobnost Osim toga, četiri aminokiseline pronađene na pretpostavljenoj sekvenci cijepanja (ser-leu-glu-cys) bile su identične sa četiri ostatka pronađena na tački cijepanja nekoliko interferona leukocita (LeIF B, C, D, F i H (2)). Kodirana zrela aminokiselinska sekvenca od 146 aminokiselina (u daljem tekstu “rekombinantni humani imunointerferon”) ima molekulsku težinu od 17140. Postoje dvije potencijalne pozicije glikozilacije (50 ) u kodiranoj proteinskoj sekvenci, aminokiseline 28 do 30 (asn-gly-thr) i aminokiseline 100 do 102 (asn-tyr-ser) Postojanje ovih pozicija je u skladu sa uočenom glikozilacijom humanog IFN-α (6 i 51). Osim toga, jedina dva cisteinska ostatka (položaji 1 i 3) su sterički preblizu da bi formirali disulfidni most, što je u skladu s uočenom stabilnošću IFN-γ u prisustvu redukcijskih agenasa kao što je IFN-γ-merkaptoetanol (51). Izvedena zrela aminokiselinska sekvenca je općenito bazična, sa ukupno 30 ostataka lizina, arginina i histidina i ukupno 19 ostataka asparaginske i glutaminske kiseline. Struktura IFN-α mRNA, kako je određena iz DNK sekvence plazmida p69, značajno se razlikuje od IFN-(1,2) ili IFN-(5) mRNA. Dakle, kodirajući region IFN-a je kraći, iako su 5" neprevedeni i 3" neprevedeni regioni mnogo duži nego u IFN-FN- i IFN-. H. Struktura kodirajuće sekvence IFN-α gena. Hibridizacijom je analizirana struktura gena koji kodira IFN-α. U ovoj proceduri (54), 5 μg ljudske DNK visoke molekularne težine (dobivene metodom 55) se do kraja razgradi različitim restrikcijskim endonukleazama, podvrgne se elektroforezi na 1,0% agaroznom gelu (56) i prenese u nitrocelulozni filter (54) . 32 P-obilježena DNK sonda je pripremljena (47) od 600 bp DdeI fragmenta. cDNK inserti p69 i hibridizovani (43) sa DNK tačkom na filteru. Pri 10 7 cpm, uzorci su hibridizirani 16 h, a zatim isprani kako je opisano (43). Osam uzoraka genomske DNK od različitih humanih donora je digestirano sa EcoRI i hibridizovano sa p69 32 P-obilježenom sondom. Kao što je prikazano na Sl. 7, uočena su dva jasna hibridizacioni signala veličine 8,8 mb. i 2,0 mb, što je određeno poređenjem mobilnosti sa Hind III digestiranom DNK. Ovo može biti rezultat prisustva ili dva gena IFN-γ ili jednog gena koji je pocijepan na mjestu Eco RI. Budući da p69 cDNK ne sadrži Eco RI mjesta, da bi se objasnilo njeno prisustvo u genu biće potrebno pretpostaviti međusekvenciju (intron) sa internim Eco RI mjestom. Da bi se razlikovale ove dvije mogućnosti, izvršena je još jedna Southern hibridizacija sa istom sondom i pet drugih digestija endonukleaze iste ljudske DNK (slika 8). Dva fragmenta DNK koja se mogu hibridizirati su uočena za druge digestije endonukleaze, PVUII - 6,7 kb. i 4.0 i Hinc II (2,5 kb i 2,2 kb). Međutim, ostala tri obrasca digestije endonukleaze proizvode samo jedan hibridizirajući DNK fragment: Hind III (9,0 kb), Bdl II (11,5 kb) i BamHI (9,5 kb). o.) Dva IFN gena moraju biti povezana na neobično maloj udaljenosti (manje od 9,0 kbp) da se pojavi u istom Hihd III fragmentu. Ovaj rezultat sugerira da je samo jedan homologni IFN-γ gen (za razliku od mnogih gena povezanih s IFN-γ) prisutan u ljudskoj genomskoj DNK i da je ovaj gen odvojen jednim ili više introna koji sadrže Eco RI, PVU II i Hind II mjesta . Ova pretpostavka je potvrđena hibridizacijom 32 P-obilježenog (47) fragmenta dobijenog iz 3" neprevedenog regiona cDNK sa p69 (130 bp Dde I fragmenta od položaja 860 do položaja 990 na slici 5) sa Eco RI digest od ljudska genomska DNK: Samo 2,0 kb EcoRI fragment hibridizira sa ovom sondom, što ukazuje da ovaj fragment sadrži 3" neprevedene sekvence, dok 3,8 kb Eco RI fragment sadrži 5" sekvence. Struktura IFN-gena (jedan gen sa najmanje jednim intronom) značajno se razlikuje od IFN- (mnogo gena (2) bez introna (56)) ili IFN- (jedan gen bez introna). introni (57) J. Konstrukcija vektora stanične kulture pSV69. Fragment HindIII-PVUIII od 342 para uključujući i inicijator SV 40 pretvoren je u fragment vezan za restrikcijsko mjesto EcoR I. HindIII mjesto je pretvoreno dodavanjem sintetičkog oligomera ( 5d AGCTGAATTC) i PVU II mjesto je pretvoreno tupim povezivanjem u Eco RI mjesto, komplementirano korištenjem polimeraze I (Klenow fragment). Rezultirajući Eco RI fragment je umetnut u Eco RI mjesto pML - (28). Plazmid sa SV 40 kasnim promotorom orijentiranim dalje od amp R gena je dalje modificiran uklanjanjem Eco R I mjesta proksimalno od amp R gena pML - 1 (27). Fragment od 1023 bp HpaI - BglII izolovan je iz klonirane HBV DNK (60 ), a HpaI mjesto virusa hepatitisa B (HBV) je pretvoreno u Eco RI mjesto sa sintetičkim oligomerom (5"dGGGAATTCGC). Ovaj Eco RI-Bgl II fragment je direktno kloniran u Eco RI - BamH I mjesta prethodno opisanog plazmida i nosi inicijator SV 40. Kodirajuća sekvenca IFN na 1250 bp Pst I fragmenta p69 je umetnuta u preostali Eco RI site. nakon konverzije PstI završava u Eco R I završava. Izolovani su oni klonovi u kojima je kasni promotor SV 40 prethodio IFN-β genu. Dobijeni plazmid pSV69 (slika 6) je zatim uveden u ćelije kulture tkiva (29), posebno ćelije COS-7, koristeći DEAE-dekstran tehniku (61), modifikovan tako da je izvršena transfekcija u prisustvu DEAE-dekstrana 8 h. Ćelijski medijum se menjao svaka 2-3 dana. Sakupljeno je 200 μl dnevno za biotest interferona. Tipični prinosi su bili 50-100 U/ml u uzorcima analiziranim tri ili četiri dana nakon transfekcije. Analiza je pokazala da produkt ekspresije nema cys-tyr-cys-N-terminalni dio rekombinantnog humanog imunointerferona (vidi sliku 5), što ukazuje da se fenomen cijepanja signalnog peptida dogodio na cys-GLN vezi (aminokiseline 3 i 4 na sl. 5) i da se zreli polipeptit zapravo sastoji od 143 aminokiseline (ge3-cys-Tyr-cys-imuni interferon). J. Djelomično pročišćavanje rekombinantnog humanog gez-cys-Tyr-cys-imunog interferona. Da bi se dobile velike količine humanog interferona IFN-γ koji luče ćelije majmuna, svježi monoslojevi ćelija COS-7 u deset ploča od 10 cm transficirani su sa ukupno 30 μg pDL 1 3 u 110 ml DEAE-dekstrana (200 μg/ml DEAE). dekstran 500 000 MW; 0,05 M Tris pH 7,5 u DMEM). Nakon 16 sati na 37°C, ploče su dva puta isprane sa DMEM. 15 ml svježeg DMEM dopunjenog sa 10% f.b.s., 2 mM glutamina, 50 μg/ml penicilina G i 50 mg/ml streptomicina je zatim dodano u svaku ploču. Podloga je zamijenjena DMEM-om bez seruma. Zatim je svakodnevno dodavan svježi medij bez seruma. Sakupljeni medij je čuvan na 4 o C dok se ne koristi za analizu ili nije povezan sa CPG. Utvrđeno je da frakcije prikupljene 3 i 4 dana nakon transfekcije zadržavaju gotovo svu aktivnost. 0,5 g CPG-a (Electonucleonics CPG 350 kontrolirano porozno staklo veličine 120/200 vrećica) dodano je u 100 ml ćelijskog supernatanta i dobivena smjesa je miješana 3 sata na 4 o C. Nakon kratkog centrifugiranja u beuch top centrifugi, taloženo je kuglice su upakovane u kolonu i temeljno isprane puferom od 20 mM NaPO 4, 1 M NaCl, 0,1% merkaptoetanola, pH 7,2. Aktivnost je zatim eluirana istim puferom koji sadrži 30% etilen glikola, a zatim gornjim puferom koji sadrži 50% etilen glikola. Gotovo sve aktivnosti vezane su za CPG. 75% eluirane aktivnosti nađeno je u frakcijama eluiranim sa 30% etilen glikola. Ove frakcije su sakupljene i razrijeđene sa 20 mM NaPO 4 1 M NaCl, pH 7,2 do konačne koncentracije od 10% etilen glikola i direktno ubrizgane u kolonu od 10 mL Con A Sepharose (Pharmacia). Nakon temeljnog ispiranja sa 20 mM NaPO 4 - 1 M NaCl, pH 7,2, aktivnosti su eluirane sa 20 mM NaPO 4 - 1 M NaCl - 0,2 M -metil-D-manozida. Značajna količina aktivnosti (55%) nije povezana sa ovim lektinom, 45% aktivnosti je eluirano -metil-D-manozidom. K. Farmaceutske kompozicije. Jedinjenja ovog pronalaska mogu se formulisati prema poznatim metodama u farmaceutski prihvatljive kompozicije u kojima je ljudski imuni interferon kombinovan sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Pogodni nosači i njihovi sastavi su opisani u Pemington's Pharmaceutical Science, koja je uključena kao referenca.Takvi sastavi će sadržavati efikasnu količinu proteina interferona iz ovog pronalaska zajedno sa odgovarajućom količinom nosača kako bi se obezbijedila farmaceutski prihvatljiva kompozicija pogodna za efikasnu primjenu pacijentu. Parenteralna primjena. Ljudski imuni interferon ovog pronalaska može se parenteralno davati pacijentu kojem je potrebno antitumorsko ili antivirusno liječenje, kao i onima koji su u imunosupresivnom stanju. Doze i učestalost doziranja mogu biti slične onima koje se obično koriste u kliničkim studijama drugih humanih interferona; odnosno oko (1-10)10 6 jedinica dnevno, au slučaju materijala čistoće iznad 1%, očigledno do 5010 6 jedinica. čisti interferon, pogodan za parenteralnu primjenu. Ampule je poželjno čuvati na hladnom (-20 o C) prije upotrebe. Podaci o biološkom istraživanju. 1. Karakteristike antivirusnog djelovanja. Za neutralizaciju antitijela, uzorci su po potrebi razrijeđeni do koncentracije od 500 - 1000 jedinica/ml dodavanjem PBS - BSA. Jednake količine uzorka inkubirane su 2-12 sati na 4°C sa nizom razblaženja zečjih anti-humanih leukocita, fibroblasta ili antiseruma imunog interferona. Anti-IFN- i dobijen je od Nacionalnog instituta za alergije i infektivne bolesti. Anti-IFN-α je pripremljen korišćenjem autentičnog IFN-α (5-20% čistoće) prečišćenog iz stimulisanih limfocita periferne krvi. Uzorci su centrifugirani 3 min na 1200 xg 3 min prije testiranja. Da bi se provjerila stabilnost pH 2, uzorci su dovedeni na pH 2 dodavanjem 1 N. HCl, inkubirano 2-12 sati na 4 o C i neutralizirano dodavanjem 1 N. NaOH prije testiranja. Za ispitivanje osetljivosti na natrijum dodecil sulfat (SDS), uzorci su inkubirani sa jednakom zapreminom od 0,2% SDS tokom 2-12 sati na 4 o C neposredno pre analize. Karakteristike IFN-γ proizvedenog u ćelijama COS-7 date su u tabeli. Izvori informacija. 1. Goeddel et al., Nature 287, 411 (1930). 2. Goeddel et al., Nature 290. 20 (1981). 3. Yelverton et al., Nucleic Aceds Research 9. 731 (1981). 4. Gutterman et al., Annals of Int. Med. 93, 399 (1980). 5. Goeddel et al., Nucleic Acids Reseach 8, 4057 (1980). 6. Yip et al., Proc. Natl. Akad. Sci. (SAD) 78, 1601 (1981). 7. Taniguchi et al., Proc. Natl. Akad. Sci. (SAD) 78, 3469 (1981). 8. Bloom, Nature 289, 593 (1980). 9. Sonnenfeld et al., Cellular Immunol. 40, 285 (1978). 10. Fleischmann et al., Infection and Immunity 26, 248 (1979). 11. Blalock et al., Cellular Immunology 49, 390 (1980). 12. Rudin et al., Proc. Natl. Akad. Sci. (SAD) 77, 5928 (1980). 13. Crane et al., J. Natl. Cancer Inst. 61, 871 (1978). 14. Stinchcomb et al. , Nature 282, 39 (1979). 15. Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979). 16. Tschumper el al.,. Gene 10, 157 (1980). 17. Mortimer et al., Microbiological Reviews 44, 519 (198). 18. Miozzari et al., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978). 19. Jones, Genetics 85, 23 (1977). 20. Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980). 21. Hess et al., J. Adv. Enzim Regul. 7, 149 (1968). 22. Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978). 23. Bostian et al., Proc. Natl. Akad. Sci. (SAD) 77, 4504 (1980). 24. Molekularna biologija kvasca (11-18. avgust 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 25. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44, 613 (1975). 25a. Gluzman, ćelija 23. 175 (1981). 26. Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979). 27. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977). 28. Lusky et al., Nature 293, 79 (1981). 29. Gluzman et al. , Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 44, 293 (1980). 30. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978). 31. Reddy et al., Science 200, 494 (1978). 32. Boedtker et al. ,Prog. u Nukleinskim kiselinama Res. Mol. Biol. 19, 253 (1976). 33. Berger et al., Biochemistry 18, 5143 (1979). 34. Aviv et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 69, 1408 (1972). 35. Gurdon et al., J. Molec. Biol. 80, 539 (1975). 36. Stewart, The Interferon System. Springer, Nova viljuška, str. 13-26 (1979). 37. Lehrach et al., Biochemistry 16, 4743 (1977). 38. Lynch el., Virology 98, 251 (1979). 39. Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978). 40. Chang et al., Nature 275, 617 (1978). 41. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977). 42. Grunstein et al., Proc. Natl. Akad. Sci. SAD. 72, 3961 (1975). 43. Fritsch et al., Cell 19, 959 (1980). 44. Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979). 45. Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7, 1541 (1979). 46. Clewel et al., Biochemistry 9, 4428 (1970). 47. Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442, 324 (1976). 48. Smith, Methods Enzymol. 61, 560 (1980). 49. Messing et al., Nukleinske kiseline Res. 9, 309 (1981). 50. Winzler, Hormonal Proteins and Peptides (ur. Li) Academic Press, New York, str. 1 (1973). 51. Mathan et al., Nature 292, 842 (1981). 52. Maxam et al., Methods in Enzymol. 65, 490 (1980). 53. Crea et al., Proc. Natl. Akad. Sci. (SAD) 75, 5765 (1978). 54. Southern, J. Molec. Biol. 98, 503 (1975). 55. Blin et al., Nucleic Acids Res. 3, 2303 (1976). 56. Lawn et al., Science 212, 1159 (1981). 57. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 1045 (1981). 58. Miller, Eksperimenti u molekularnoj genetici, str. 431-3, Cold Spring Harbor Lab. , Cold Spring Harbor, New York (1972). 59. Beggs, Nature 275, 104 (1978). 60. Valenzuela et al., Animal Virus Genetics (ur. Fields, Jaenisch i Fox) str. 57, Academic Press, New York (1980). 61. McCuthan et al., J. Natl. Cancer Inst. 41, 351 (1968).
TVRDITI
Metoda za proizvodnju humanog imunog interferona, koja uključuje kultivaciju životinjske ćelijske linije, izolaciju i pročišćavanje ciljnog proizvoda, naznačena time što se kultiviše ćelijska linija COS-7 transformirana sa rekombinantnom plazmidnom DNK pSVj69, a interferon des-Cys-Tyr-Cys je izolovan.10267 0
Biosinteza somatotropina i drugih humanih hormona
Ljudski hormon rasta, ili somatotropin, sintetizira se u ljudskom mozgu u prednjoj hipofizi. Prvi put je izolovan iz kadaveričnih materijala i pročišćen 1963. Uz nedostatak somatotropina razvija se hipofizni patuljastost, čija se učestalost procjenjuje na 7 do 10 slučajeva na milion ljudi.Hormon je specifičan za vrstu, odnosno, za razliku od inzulina, životinjski hormoni rasta nemaju aktivnost u ljudskom tijelu. Shodno tome, jedini lijek za hipofizni patuljastost je hormon hipofize, koji je izoliran iz leševa. Istraživanja su pokazala da intramuskularna primjena somatotropina u dozama od 10 mg po 1 kg tjelesne težine tijekom godine, tri injekcije tjedno, povećava visinu za otprilike 8-18 cm godišnje.
Bolesna djeca od četiri do pet godina, uz kontinuirano liječenje, do puberteta sustigla rast sa svojim vršnjacima (14-16 godina). Ako uzmemo u obzir činjenicu da se iz jednog leša može dobiti 4-6 mg somatotropina, onda možemo shvatiti da je liječenje ove bolesti prirodnim somatotropinom potpuno beznadežno. Osim nedostatka lijeka, pojavili su se i drugi problemi vezani za heterogenost hormona koji se oslobađa iz trupnog materijala.
Postojala je i opasnost da materijal hipofize bude inficiran spororastućim virusima. Takvi virusi imaju neuobičajeno dug period inkubacije, pa su djeca koja su primala lijek zahtijevala višegodišnji medicinski nadzor.
Ljudski hormon rasta, sintetiziran u posebno dizajniranim bakterijskim ćelijama, ima očigledne prednosti: dostupan je u velikim količinama, njegovi preparati su biohemijski čisti i bez virusnih kontaminanata.
Biosintezu somatotropina (koji se sastoji od 191. aminokiselinskog ostatka) od strane posebno dizajniranih bakterija na bazi Escherichia coli izveo je Genentech. Budući da sinteza DNK u mRNA proizvodi gen koji kodira prekursora somatotropina, koji se ne cijepa u bakterijskim stanicama da bi nastao aktivni hormon, postupili smo na sljedeći način: u 1. fazi klonirali smo dvolančanu DNK kopiju mRNA i, cijepanjem restrikcijskim endonukleazama, dobio sekvencu koja kodira cjelokupnu sekvencu aminokiselina hormona, osim prve 23 aminokiseline. Zatim je kloniran sintetički polinukleotid koji odgovara aminokiselinama 1 do 23. Zatim su dva fragmenta spojena zajedno i "prilagođena" u plazmid E. coli, nakon čega su bakterijske ćelije počele sintetizirati ovaj hormon.
Do 1980. godine završena su klinička ispitivanja lijekova i testova toksičnosti i započeli su masovni eksperimenti na djeci blizu puberteta. Rezultati su bili ohrabrujući, a sintetički somatotropin je počeo da se proizvodi u industrijskim razmjerima 1982. godine.
Drugi hormon, β-endorfin, moždani opijat koji se sastoji od 31. aminokiseline, sintetiziran je u genetski modifikovanim ćelijama E. coli. Godine 1980. australski naučnik Shine i američki naučnici Fettes, Len i Baxter uspješno su klonirali DNK koja kodira β-endorfin u ćelijama E. ooli i dobili ovaj polipeptid kao fuzioni protein sa enzimom β-galaktozidazom. U prvoj fazi, klonirali su fragment DNK dobijen kao rezultat reverzne transkripcije mRNA koja kodira β-endorfin, a zatim ga ubacili u plazmid E. coli iza gena β-galaktozidaze, čime su dobili hibridni protein koji se sastoji od β- galaktozidaza i β-endorfin; zatim je β-galaktozidaza enzimski cijepana, čime se dobija biološki aktivan β-endorfin.
Dobijanje interferona
Još jedno izuzetno dostignuće genetskog inženjeringa je sinteza interferona.Interferon je prvi put nabavljen 1957. godine na Nacionalnom institutu za medicinska istraživanja u blizini Londona. Ovo je protein koji u vrlo malim količinama oslobađaju životinjske i ljudske ćelije kada virusi uđu u tijelo i usmjeren je na borbu protiv njih. Prve studije su otkrile visoku biološku aktivnost interferona u liječenju gripe, hepatitisa, pa čak i raka (suzbija proliferaciju abnormalnih stanica).
Interferon, kao i somatotropin, ima specifičnost vrste: životinjski interferoni su neaktivni u ljudskom tijelu, pa ih čak i odbija.
Ljudsko tijelo proizvodi nekoliko vrsta interferona: leukocit (a), fibroblast (P) i imunološki (y) (T-limfocit).
Prirodni interferoni se dobijaju iz ljudske krvi sa izuzetno malim prinosom: 1978. godine u Centralnoj zdravstvenoj laboratoriji u Helsinkiju (u to vreme svetski lider u proizvodnji leukocitnog interferona) iz 50 hiljada litara krvi dobijeno je 0,1 g čistog interferona. .
Proces proizvodnje interferona bio je u osnovi isti za sve vrste ćelija koje se uzgajaju u kulturama i proizvode interferon. Krvne ćelije su inficirane Sendai virusom i filtrirane u supercentrifugi nakon 24 h. Supernatant je sadržavao sirovi pripravak interferona koji je podvrgnut hromatografskom prečišćavanju.
Cijena lijeka bila je vrlo visoka - 400 g interferona koštalo je 2,2 milijarde dolara. Međutim, izgledi za njegovu farmakološku upotrebu (uključujući i protiv četiri vrste raka) natjerali su nas da tražimo nove načine da ga dobijemo, prvenstveno putem genetskog inženjeringa.
U januaru 1980. ljudski interferon je proizveden u genetski modifikovanim ćelijama E. coli. Početna poteškoća s ovim metodama bila je u tome što je mRNA interferona niska čak i u leukocitima stimuliranim virusnom infekcijom i da su prinosi bili vrlo niski: prijavljena su 1-2 molekula interferona po bakterijskoj ćeliji.
Godine 1981. Genentech je uspio konstruirati rekombinantnu DNK koja kodira γ-interferon i uvesti ga u genom bakterija, kvasca, pa čak i stanica sisara, te su postali sposobni da sintetiziraju interferon sa visokim prinosom - 1 litar ćelijske kulture kvasca sadržavao je 1 milion jedinica interferona. (jedinica interferona odgovara količini koja štiti 50% ćelija u kulturi od infekcije virusom). Proces je sproveden na sledeći način: istraživači su izolovali mešavinu mRNA molekula iz ljudskih limfocita, dobili molekule odgovarajućih kopija DNK i uveli ih u ćelije E. coli. Zatim su odabrane bakterije koje proizvode interferon.
Dobijanje imunogenih lijekova i vakcina
Još jedno područje primjene genetskog inženjeringa odnosi se na proizvodnju novih učinkovitih, sigurnih i jeftinih vakcina.Vakcine su jedno od najznačajnijih dostignuća u medicini, a njihova upotreba je i sa ekonomskog aspekta izuzetno efikasna. Poslednjih godina posebna pažnja posvećena je razvoju vakcina. To je zbog činjenice da do sada nije bilo moguće dobiti visoko efikasne vakcine za prevenciju mnogih uobičajenih ili opasnih zaraznih bolesti.
Povećano interesovanje za vakcine nastalo je nakon utvrđivanja uloge patogenih mikroorganizama u razvoju bolesti koje se ranije nisu smatrale zaraznim. Na primjer, gastritis, čir na želucu i dvanaestopalačnom crijevu, maligni tumori jetre (virusi hepatitisa B i C).
Stoga su u proteklih 10-15 godina vlade mnogih zemalja počele da preduzimaju mere usmerene na intenzivan razvoj i proizvodnju fundamentalno novih vakcina.
Vakcine koje se danas koriste mogu se podijeliti u sljedeće vrste u zavisnosti od načina njihove proizvodnje:
- žive atenuirane vakcine;
- inaktivirane vakcine;
- vakcine koje sadrže prečišćene komponente mikroorganizama (proteine ili polisaharide);
- rekombinantne vakcine koje sadrže komponente mikroorganizama dobijene genetskim inženjeringom
Rekombinantna DNK tehnologija se također koristi za stvaranje novih tipova živih atenuiranih vakcina, postižući slabljenje ciljanom mutacijom gena koji kodiraju proteine virulencije patogena bolesti. Ista tehnologija se također koristi za proizvodnju živih rekombinantnih vakcina umetanjem gena koji kodiraju imunogene proteine u žive nepatogene viruse ili bakterije (vektore), koje se ubrizgavaju u ljude.
Princip korištenja DNK vakcina je da se u tijelo pacijenta unese molekul DNK koji sadrži gene koji kodiraju imunogene proteine patogenog mikroorganizma. DNK vakcine se nazivaju i genske ili genetske vakcine.
Da bi se dobile DNK vakcine, gen koji kodira proizvodnju imunogenog proteina iz mikroorganizma se ubacuje u bakterijski plazmid. Pored gena koji kodira protein vakcine, genetski elementi koji su neophodni za ekspresiju („uključivanje“) ovog gena u eukariotskim ćelijama, uključujući ljude, ubacuju se u plazmid kako bi se osigurala sinteza proteina. Takav plazmid se unosi u kulturu bakterijskih ćelija kako bi se dobio veliki broj kopija.
Plazmidna DNK se zatim izoluje iz bakterija i pročišćava od drugih molekula DNK i nečistoća. Pročišćeni molekul DNK služi kao vakcina. Uvođenje DNK vakcine osigurava sintezu stranih proteina od strane ćelija vakcinisanog organizma, što dovodi do naknadnog razvoja imuniteta protiv odgovarajućeg patogena. U ovom slučaju, plazmidi koji sadrže odgovarajući gen nisu integrirani u DNK ljudskih hromozoma.
DNK vakcine imaju niz prednosti u odnosu na tradicionalne vakcine:
- podstiču proizvodnju antitijela na nativnu molekulu virusnih proteina;
- podstiču proizvodnju citotoksičnih T-limfocita;
- može selektivno utjecati na različite subpopulacije T-limfocita;
- doprinose formiranju dugotrajnog imuniteta;
- eliminirati rizik od infekcije.
L.V. Timoschenko, M.V. Chubik
Interferon je važan zaštitni protein imunog sistema. Otkriven tokom proučavanja virusne interferencije, odnosno fenomena kada životinje ili ćelijske kulture zaražene jednim virusom postanu neosjetljivi na infekciju drugim virusom. Ispostavilo se da je smetnja posljedica nastalog proteina, koji ima zaštitna antivirusna svojstva. Ovaj protein se zvao interferon.
Interferon je porodica glikoproteinskih proteina koje sintetišu ćelije imunog sistema i vezivnog tkiva. U zavisnosti od toga koje ćelije sintetišu interferon, postoje tri tipa: α, β i γ-interferoni.
Alfa interferon proizvode leukociti i naziva se leukocit; beta interferon se naziva fibroblastnim, jer ga sintetiziraju fibroblasti - ćelije vezivnog tkiva, a gama interferon se naziva imunim, jer ga proizvode aktivirani T limfociti, makrofagi, prirodne ćelije ubice, odnosno imune ćelije.
Interferon se konstantno sintetizira u tijelu, a njegova koncentracija u krvi se održava na približno 2 IU/ml (1 međunarodna jedinica - IU - je količina interferona koja štiti ćelijsku kulturu od 1 CPD50 virusa). Proizvodnja interferona se naglo povećava tokom infekcije virusima, kao i kada je izložena induktorima interferona, kao što su RNK, DNK i složeni polimeri. Takvi induktori interferona nazivaju se interferonogeni.
Osim antivirusnog djelovanja, interferon ima i antitumorsku zaštitu, jer usporava proliferaciju (razmnožavanje) tumorskih stanica, kao i imunomodulatorno djelovanje, stimulira fagocitozu, prirodne stanice ubice, reguliše stvaranje antitijela od B stanica, aktivira ekspresiju glavnih kompleks histokompatibilnosti.
Mehanizam djelovanja interferona je složen. Interferon ne utiče direktno na virus izvan ćelije, već se vezuje za posebne ćelijske receptore i utiče na proces reprodukcije virusa unutar ćelije u fazi sinteze proteina.
Upotreba interferona. Djelovanje interferona je efikasnije što se ranije počinje sintetizirati ili ulaziti u tijelo izvana. Stoga se koristi u profilaktičke svrhe kod mnogih virusnih infekcija, kao što je gripa, kao i u terapeutske svrhe kod kroničnih virusnih infekcija, kao što su parenteralni hepatitis (B, C, D), herpes, multipla skleroza itd. Interferon daje pozitivan rezultira u liječenju malignih tumora i bolesti povezanih s imunodeficijencijama.
Interferoni su specifični za vrstu, odnosno ljudski interferon je manje efikasan za životinje i obrnuto. Međutim, specifičnost ove vrste je relativna.
Primanje interferona. Interferon se dobija na dva načina: a) inficiranjem ljudskih leukocita ili limfocita sigurnim virusom, usled čega zaražene ćelije sintetišu interferon, koji se potom izoluje i od njega se konstruišu preparati interferona; b) genetski modifikovani - uzgojem rekombinantnih sojeva bakterija sposobnih da proizvode interferon u proizvodnim uslovima. Obično se koriste rekombinantni sojevi pseudomonas i Escherichia coli sa interferonskim genima ugrađenim u njihovu DNK. Interferon dobijen genetskim inženjeringom naziva se rekombinantnim. U našoj zemlji rekombinantni interferon je dobio službeni naziv “Reaferon”. Proizvodnja ovog lijeka je na mnogo načina efikasnija i jeftinija od lijeka za leukocite.
Rekombinantni interferon je pronašao široku upotrebu u medicini kao preventivno i terapeutsko sredstvo za virusne infekcije, neoplazme i imunodeficijencije.
23. Faktori specifičnog imuniteta kod virusnih bolesti. Uloga ćelijskog imuniteta u zaštiti organizma od virusa
Specifični imuni sistem ima svoje centralne (koštana srž, timus, Fabricijeva burza kod ptica, jetra kod sisara) i periferne organe (slezena, limfni čvorovi, limfoidna tkiva gastrointestinalnog trakta, kao i krv i limfa, koji ulaze i kontinuirano cirkulišu sve imunokompetentne ćelije).
Organ imuniteta je limfoidno tkivo, a njegovi glavni nosioci su makrofagi (kao i druge ćelije koje predstavljaju antigen), različite populacije i subpopulacije T- i B-limfocita.
Glavna meta imunog sistema su antigeni, od kojih je velika većina proteinske prirode.
Limfociti su predstavljeni sa dvije velike populacije - B i T ćelijama, koje su odgovorne za specifično prepoznavanje antigena. Nastali iz zajedničkog izvora, takozvane matične ćelije, i nakon što su prošli odgovarajuću diferencijaciju u centralnim organima imunog sistema, T- i B-limfociti stiču imunokompetentnost, ulaze u krv i kontinuirano cirkulišu po telu, igrajući tu ulogu. njenih efektivnih branilaca.
T limfociti pružaju ćelijski tip imunološkog odgovora, a B limfociti pružaju humoralni tip imunološkog odgovora.
Diferencijacija prekursora T-limfocita u imunokompetentne ćelije (“trening”) se dešava u timusu pod uticajem humoralnih faktora koje luči timus; sazrijevanje B limfocita - kod ptica u bursi, kod sisara, prvo u fetalnoj jetri, a nakon rođenja u koštanoj srži.
Zreli B i T limfociti stiču sposobnost prepoznavanja stranih antigena. Oni napuštaju koštanu srž i timus i koloniziraju slezinu, limfne čvorove i druge kolekcije limfnih stanica. Velika većina T i B limfocita cirkulira u krvi i limfi. Ova stalna cirkulacija osigurava da što više relevantnih limfocita dođe u kontakt sa antigenom (virusom).
Svaka B ćelija je genetski programirana da proizvodi antitijela na jedan specifični antigen. Nakon što se susreću i prepoznaju ovaj antigen, B ćelije se umnožavaju i diferenciraju u aktivne plazma ćelije koje luče antitela na ovaj antigen. Drugi dio B-limfocita, koji je prošao kroz 2-3 ciklusa diobe, pretvara se u memorijske ćelije koje nisu sposobne proizvoditi antitijela. Mogu živjeti mnogo mjeseci, pa čak i godina bez podjele, cirkulirajući između krvi i sekundarnih limfoidnih organa. Oni brzo prepoznaju antigen kada ponovo uđe u tijelo, nakon čega memorijske ćelije stječu sposobnost podjele i pretvaranja u plazma ćelije koje luče antitijela.
Memorijske ćelije se formiraju od T limfocita na isti način. Ovo se može nazvati "rezervom" imunokompetentnih ćelija.
Memorijske ćelije određuju trajanje stečenog imuniteta. Nakon ponovnog kontakta sa ovim antigenom, brzo se pretvaraju u efektorske ćelije. Istovremeno, memorijske B ćelije obezbeđuju sintezu antitela u kraćem vremenskom periodu, u većim količinama i to uglavnom IgG. Utvrđeno je da postoje T pomoćne ćelije koje određuju promjenu klasa imunoglobulina.
Postoje dvije opcije za izdavanje imunološkog odgovora u obliku biosinteze antitijela:
primarni odgovor - nakon prvog susreta organizma sa anti-1 spavanjem;
sekundarni odgovor - nakon ponovnog kontakta sa antigenom, nakon 2-3 sedmice.
Razlikuju se u sljedećim pokazateljima: trajanje latentnog perioda; brzina povećanja titra antitijela, ukupna količina sintetiziranih antitijela; sekvenca sinteze imunoglobulina različitih klasa. Ćelijski mehanizmi primarnog i sekundarnog imunološkog odgovora se također razlikuju.
Tokom primarnog imunološkog odgovora primjećuje se: biosinteza antitijela nakon latentnog perioda traje 3-3 dana; stopa sinteze antitijela je relativno niska; titar antitela ne dostiže maksimalne vrednosti; Prvo se sintetiše IgM, zatim IgG, a kasnije IgA i IgE. Sekundarni imuni odgovor karakteriše: latentni period - u roku od nekoliko sati; brzina sinteze antitijela je logaritamska; titar antitela dostiže maksimalne vrednosti; IgG se odmah sintetiše.
Sekundarni imunološki odgovor uzrokovan je imunološkim memorijskim stanicama.
T ćelije imaju više populacija s različitim funkcijama. Neki stupaju u interakciju s B stanicama, pomažući im da se razmnožavaju, sazrijevaju i formiraju antitijela, a također aktiviraju makrofage - pomoćne T ćelije (Tx); drugi potiskuju imune odgovore - supresorske T ćelije (Tc); treća populacija T ćelija uništava tjelesne ćelije inficirane virusima ili drugim agensima. Ova vrsta aktivnosti naziva se citotoksičnost, a same ćelije se nazivaju citotoksične T ćelije (Tc) ili T ćelije ubice (Tk).
Budući da pomoćne T ćelije i supresorske T ćelije deluju kao regulatori imunološkog odgovora, ove dve vrste T ćelija nazivaju se regulatornim T ćelijama.
Makrofagi su bitan faktor u antivirusnom imunitetu. Oni ne samo da uništavaju strane antigene, već i daju antigene determinante za pokretanje lanca imunoloških reakcija (prisutnih). Antigeni koje apsorbiraju makrofagi cijepaju se na kratke fragmente (antigenske determinante) koji se vežu za molekule proteina glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC I, II) i transportuju se na površinu makrofaga, gdje ih prepoznaju T limfociti (Tx, Tk) i B limfocita, što dovodi do njihove aktivacije i reprodukcije.
T-pomagači, kada se aktiviraju, sintetiziraju faktore (medijatore) za stimulaciju B- i T-limfocita. Aktivirane T ćelije ubice se umnožavaju i formira se skup citotoksičnih T limfocita koji mogu osigurati smrt ciljnih stanica, odnosno stanica inficiranih virusom.
Glavno svojstvo svih ćelija ubica je da se pod njihovim uticajem i na ciljnu ćeliju pokreću mehanizmi aloptoze (programirana ćelijska smrt). Liza ćelija se dešava nakon što se ćelija ubica odvoji, omogućavajući jednoj ćeliji ubici da vodi više ciljnih ćelija. Proces lize uključuje perforine i granzime koje luče limfociti. Perforin, koji je ugrađen u ćelijsku membranu, u njoj formira kanal kroz koji mahuna prodire u ćeliju. Ćelija bubri i lizira. Vjeruje se da granzimi posreduju u indukciji apoptoze.
Aktivirani B limfociti se umnožavaju i diferenciraju u plazma ćelije, koje sintetiziraju i luče antitijela odgovarajuće klase (IgM, IgG, IgA, IgD, IgE).
Koordinirana interakcija makrofaga, T- i B-limfocita pri susretu s antigenom osigurava humoralni i ćelijski imuni odgovor. Svi oblici imunog odgovora zahtevaju koordiniranu interakciju glavnih faktora imunog sistema: makrofaga, T-, B-limfocita, NK ćelija, interferonskog sistema, komplementa, glavnog sistema histokompatibilnosti. Interakcija između njih se provodi korištenjem raznih sintetiziranih i izlučenih medijatora.
Medijatori koje proizvode ćelije imunog sistema i koji su uključeni u regulaciju njegove aktivnosti zajednički se nazivaju citokini (od grčkog cytos - ćelija i kineo - pokrenuti). Dijele se na monokine - medijatore koje proizvode monociti i makrofagi; limfokini - medijatori koje luče aktivirani limfociti; limfokini koji su hemijski identifikovani i dobijeni u čistom obliku. Godine 1979. predloženo je da se nazovu interleukini. Označeni su brojevima - 1, 2, 3, 4, 5, itd. Porodica interleukina je popunjena novim predstavnicima koji provode međusobnu regulaciju imunološkog, nervnog i endokrinog sistema. Sve imunokompetentne stanice nose jedinstvene receptore na svojim membranama, uz pomoć kojih prepoznaju i percipiraju signale drugih imunoloških stanica, preuređuju svoj metabolizam, sintetiziraju ili eliminišu vlastite receptore. Zahvaljujući tome, sve ćelije imunog sistema funkcionišu kao dobro podmazan sistem.
24. Virusni proteini, njihova uloga u serodijagnostici. Specifična antitela. Karakteristike imunoglobulina.
Virusni proteini
Lokalizacija virusnih proteina
Proteini povezani sa životnim ciklusom virusa dijele se na proteine određene virusnim genomom i proteine ćelijskog porijekla. Primjeri ćelijskih proteina koji se nalaze u nekim virionima uključuju citoskeletni protein aktin i nuklearne proteine histone. Proteini ćelijskog porijekla uključeni u proces replikacije virusa će biti razmatrani u dijelu o interakciji virus-ćelija.
Na osnovu svoje lokacije, proteini određeni virusnim genomom dijele se u dvije grupe:
1) strukturnih proteina- to su proteini koji čine HF, oni su označeni kao VP;
2) nestrukturnih proteina- to su prekursori strukturnih proteina, regulatornih proteina i enzima koji služe procesu intracelularne reprodukcije virusa i nisu dio HF. Oni su označeni kao NS proteini (šema).
Osobine virusnih proteina
Virioni sadrže proteine različite molekularne težine (od 4 do 100 kDa), koji se sastoje od jednog ili više polipeptidnih lanaca. Količina ovih proteina također varira između virusa. TMV nukleokapsid sadrži jedan protein. Za druge viruse, virion može sadržavati nekoliko desetina proteina koji imaju različita fizičko-hemijska svojstva. Proteini koji formiraju kapsid, nukleokapsid i ljusku jezgre imaju jedno zajedničko svojstvo - sposobnost samosastavljanja.
Sastav HF može uključivati proteine male molekularne težine koji nisu uključeni u formiranje kapsida. Na primjer, genomski proteini picornavirusi i adenovirusi. Genomski protein je kovalentno povezan sa nukleinskom kiselinom i učestvuje u njenoj replikaciji.
Lokalizacija virusnih proteina
Predstavljeni kompleksni proteini glikoproteini(označeno kao gp) i lipoproteini. Prisustvo glikoproteina određuje prisustvo ugljikohidratne komponente u virionu, koja može biti predstavljena oligosaharidima tipa manoza, galaktozom, N-acetilglukozaminom ili neuraminskom kiselinom. Virusni glikoproteini su, u pravilu, izloženi na vanjskoj površini virusa i obavljaju tri glavne funkcije: osiguravaju vezivanje viriona na ćelijski receptor (funkcija proteina vezivanja), imaju fuzijsku aktivnost (omogućuju fuziju membrane) i odrediti antigena svojstva virusa. Istovremeno, virusni glikoproteini mogu biti i nestrukturni proteini i, ostajući u integralnom obliku u membrani grubog endoplazmatskog retikuluma (RER), obavljaju funkcije translokaza, osiguravajući transport virusnih komponenti u njegov lumen.
Virusno lipoproteini predstavljeni su proteinima aciliranim, po pravilu, miristinskom kiselinom. Ostaci masnih kiselina povezani s proteinskim molekulom djeluju kao lipofilno sidro.
Virusno enzimskih proteina mogu biti dio virusne čestice ili biti nestrukturni proteini i pojaviti se u ćeliji nakon ekspresije virusnog genoma. Najsnažniji enzimima je virion virusa velikih boginja, koji ima gotovo kompletan set enzima neophodnih za nezavisnu intracelularnu replikaciju virusa. U isto vrijeme, mali, jednostavno organizirani izometrijski virusi s pozitivnim RNA genomom možda nemaju enzime u virionu.
Funkcionalno aktivne virusne proteine predstavljaju, prije svega, enzimi metabolizma nukleinskih kiselina, koji obezbjeđuju složene mehanizme replikacije/transkripcije virusnog genoma; enzimi koji provode posttranslacijsku obradu i modifikaciju proteina, te enzimi uključeni u prodor viriona u ćeliju domaćina.
Prva grupa enzima je najbrojnija i uključuje analoge staničnih enzima i enzime specifične za virus.
DNK-ovisna DNK polimeraza - vrši sintezu DNK na DNK matriksu (virus malih boginja).
DNK-ovisna RNA polimeraza - vrši sintezu mRNA na DNK matriksu (virus malih boginja).
RNK-ovisna RNA polimeraza - vrši sintezu RNK na RNK šablonu. Obavlja funkcije transkriptaze i replikaze. Prvi put otkriven 1970. godine od strane Baltimorea u virusu vezikularnog stomatitisa. Dio je viriona ili je NS protein virusa koji sadrže RNK.
Reverzna transkriptaza ili revertaza ili DNK polimeraza zavisna od RNK
vrši sintezu DNK na RNK šablonu. Prvi put otkriven 1970. u retrovirusima od strane Temina i Mizutanija.
Helicase- odmotava dvolančanu DNK strukturu. Osim toga, helikaze imaju aktivnost RNK helikaze zavisnu od nukleotid trifosfata, što uključuje tri procesa: vezivanje deoksinukleotid trifosfata, njegovu hidrolizu i, zbog te energije, odmotavanje dvolančane RNK.
enzimi koji modifikuju mRNA : poli-A polimeraza - adenilira 3" kraj RNK koristeći energiju ATP-a; Cap enzim i kompleks metiltransferaze - katalizira formiranje strukture kapice na 5" kraju.
ATPaza, GTPaza - izvršiti hidrolizu odgovarajućih energetskih supstrata.
Ribonukleaza H - uništava RNK koja je u dupleksu sa DNK. Druga grupa virusnih enzima su enzimi metabolizma proteina.
Ovdje predstavljamo samo neke od njih:
Proteinaze - enzimi uključeni u posttranslacijsku obradu poliproteina. Oni su NS proteini RNA virusa;
Protein kinaze - enzimi koji fosforiliraju strukturne proteine viriona. Nalazi se u virusu vezikularnog stomatitisa, virusu bjesnila, alfavirusima i retrovirusima.
Primjeri enzima uključenih u prodiranje virusa u stanice su lizozim bakteriofagi i neuraminidaza virusa gripa.
U procesu formiranja stečenog infektivnog imuniteta važnu ulogu imaju antitela (anti - protiv, telo - ruska reč, tj. supstanca). I iako je strani antigen blokiran od strane specifičnih ćelija tijela i podvrgava se fagocitozi, aktivni učinak na antigen moguć je samo u prisustvu antitijela.
Antitijela su specifični proteini, imunoglobulini, koji nastaju u tijelu pod utjecajem antigena i imaju svojstvo specifičnog vezivanja za njega i razlikuju se od običnih globulina po prisutnosti aktivnog centra.
Antitela su važan specifični faktor u odbrani organizma od patogena i genetski stranih supstanci i ćelija.
Antitela nastaju u organizmu kao rezultat infekcije (prirodna imunizacija), ili vakcinacije ubijenim i živim vakcinama (veštačka imunizacija), ili kontakta limfnog sistema sa stranim ćelijama, tkivima (transplantati) ili sa sopstvenim oštećenim ćelijama koje imaju postaju autoantigeni.
Antitijela pripadaju specifičnoj proteinskoj frakciji, uglavnom a-globulinima, označenim kao IgY.
Antitijela su podijeljena u grupe:
- prvi su mali molekuli sa konstantom sedimentacije 7S (a-globulini);
- drugi su veliki molekuli sa konstantom sedimentacije od 19 S (a - globulini).
 |
Molekul antitijela uključuje četiri polipeptidna lanca koji se sastoje od aminokiselina. Dva od njih su teška (mm 70.000 daltona) i dva su laka (mm 20.000 daltona). Laki i teški lanci su međusobno povezani disulfidnim mostovima. Laki lanci su zajednički za sve klase i podklase. Teški lanci imaju karakteristične strukturne karakteristike za svaku klasu imunoglobulina.
Molekul antitijela sadrži aktivne centre smještene na krajevima polipeptidnih lanaca i specifično reagiraju s antigenom. Nepotpuna antitijela su monovalentna (jedna antideterminanta), kompletna imaju dva, a rjeđe su više antideterminantna.
Razlika između specifičnih imunoglobulina je u strukturi teških lanaca i u prostornom obrascu antideterminanata. Prema klasifikaciji Svjetske zdravstvene organizacije (WHO), postoji pet klasa glavnih imunoglobulina: IgG cirkuliše u krvi i čini 80% svih antitijela. Prolazi kroz placentu. Molekulska težina 160000. Veličina 235 x 40A o. Važan kao specifičan faktor imuniteta. Oni neutraliziraju antigen njegovom korpuskularizacijom (precipitacija, sedimentacija, aglutinacija), što olakšava fagocitozu, lizu i neutralizaciju. Promoviše nastanak odgođenih alergijskih reakcija. U poređenju sa drugim imunoglobulinima, IgG je relativno otporan na toplotu – može da izdrži zagrevanje na 75 o C 30 minuta.
Ig M - cirkuliše u krvi, čineći 5-10% svih antitijela. Molekularna težina 950000, konstanta sedimentacije 19 S, funkcionalno petovalentna, prvi put se pojavljuje nakon infekcije ili vakcinacije životinje. Ig M nije uključen u alergijske reakcije i ne prolazi kroz placentu. Djeluje na gram-pozitivne bakterije, aktivira fagocitozu. Ig M klasa uključuje antitijela ljudskih krvnih grupa - A, B, O.
Ig A - uključuje dva tipa: serumski i sekretorni. Serum Ig A ima molekulsku težinu od 170.000, konstantu sedimentacije 7 S. Nema sposobnost taloženja rastvorljivih antigena, učestvuje u reakciji neutralizacije toksina, toplotno je stabilan, sintetiše se u slezeni, limfnim čvorovima i sluzokože i ulazi u sekret - pljuvačku, suznu tečnost, bronhijalni tečni sekret, kolostrum.
Sekretorni Ig A (S Ig A) karakteriše prisustvo strukturne dodatne komponente, polimer je, konstante sedimentacije 11 S i 15 S, molekulske težine 380.000, sintetizovan je u sluzokoži. Biološka funkcija S Ig A je uglavnom lokalna zaštita sluzokože, na primjer kod bolesti gastrointestinalnog ili respiratornog trakta. Imaju baktericidno i opsonično djelovanje.
Ig D - koncentracija u krvnom serumu nije veća od 1%, molekulska težina 160000, konstanta sedimentacije 7 S. Ig D ima aktiviranu aktivnost i ne vezuje se za tkiva. Povećanje njegovog sadržaja zabilježeno je kod humanog mijeloma.
Ig E - molekulska težina 190.000, konstanta sedimentacije 8,5 S. Ig E je termolabilan, snažno se vezuje za ćelije tkiva, za tkivne bazofile i učestvuje u neposrednoj reakciji preosetljivosti. Ig E ima zaštitnu ulogu kod helmintioza i protozoalnih bolesti i pojačava fagocitnu aktivnost makrofaga i eozinofila.
Antitijela su labilna na temperature od 70 0 C, a alkoholi ih denaturiraju. Aktivnost antitijela se poremeti kada se pH okoline, elektrolita itd. promijeni (isključi).
Sva antitijela imaju aktivni centar - površinu od 700 A o, što je 2% površine antitijela. Aktivni centar se sastoji od 10-20 aminokiselina. Najčešće sadrže tirozin, lizin i triptofan. Za pozitivno nabijene haptene, antitijela imaju negativno nabijenu grupu - COOH -. Negativno nabijenim haptenima pridružuje se NH 4 + grupa.
Antitijela imaju sposobnost razlikovanja jednog antigena od drugog. Oni stupaju u interakciju samo s onim antigenima (uz rijetke izuzetke) protiv kojih su razvijeni i uklapaju ih prema njihovoj prostornoj strukturi. Ova sposobnost antitijela naziva se komplementarnost.
Specifičnost antitijela određena je hemijskom strukturom i prostornim uzorkom antideterminanata. Povezan je sa primarnom strukturom (izmjenom aminokiselina) proteinske molekule antitijela.
Teški i laki lanci imunoglobulina određuju specifičnost aktivnog mjesta.
Nedavno je otkriveno da postoje antitijela protiv antitijela. Zaustavljaju djelovanje normalnih antitijela. Na osnovu ovog otkrića, pojavljuje se nova teorija - mrežna regulacija imunološkog sistema tijela.
Teorija stvaranja antitijela dotiče se brojnih pitanja iz različitih srodnih disciplina (genetika, biohemija, morfologija, citologija, molekularna biologija), koja su trenutno isprepletena s imunologijom. Postoji nekoliko hipoteza za sintezu antitijela. Najveće priznanje dobila je hipoteza klonske selekcije F. Burneta. Prema njemu, tijelo sadrži više od 10.000 klonova limfoidnih i imunološki kompetentnih stanica sposobnih da reagiraju s različitim antigenima ili njihovim determinantama i proizvode antitijela. Pretpostavlja se da su klonovi takvih ćelija sposobni da reaguju sa sopstvenim proteinima, usled čega su uništeni. Tako umiru stanice koje stvaraju anti-aglutinine protiv A-antigena u organizmima s krvnom grupom A i anti-B-aglutinine s krvnom grupom B.
Ako se bilo koji antigen unese u embrij, onda na sličan način uništava odgovarajući klon stanica, a novorođenče će biti tolerantno na ovaj antigen tijekom svog daljnjeg života. Sada novorođenče ima samo „svoju” ili „stranu” koja je došla izvana, a koju prepoznaju mezenhimske ćelije, na čijoj površini se nalaze odgovarajući receptori „zastavice” - antideterminante. Prema F. Burnetu, mezenhimska ćelija koja je primila stimulaciju antigenom stvara populaciju ćelija kćeri koje proizvode specifična (koja odgovaraju antigenu) antitela. Specifičnost antitela zavisi od stepena njihove interakcije sa antigenom.
Formiranje kompleksa antigen-antitijelo uključuje Coulombove i Van Der Waalsove sile privlačenja između jonskih grupa, polarnih i Londonskih sila i međuatomskih kovalentnih veza.
Poznato je da međusobno djeluju kao cijeli molekuli. Stoga postoji značajan broj molekula antitijela po molekulu antigena. Oni stvaraju sloj debljine do 30 A o. Kompleks antigen-antitijelo može se odvojiti uz zadržavanje originalnih svojstava molekula. Prva faza povezivanja antitela sa antigenom je nespecifična, nevidljiva, a karakteriše je apsorpcija antitela na površini antigena ili haptena. Nastaje na temperaturi od 37 o C za nekoliko minuta. Druga faza je specifična, vidljiva i završava se fenomenom aglutinacije, precipitacije ili lize. Ova faza zahtijeva prisustvo elektrolita, au nekim slučajevima i komplementa.
Unatoč reverzibilnosti procesa, stvaranje kompleksa između antigena i antitijela igra pozitivnu ulogu u zaštiti organizma, koja se svodi na opsonizaciju, neutralizaciju, imobilizaciju i ubrzanu eliminaciju antigena.
Antitijela se klasificiraju prema prirodi njihovog djelovanja na antigen:
- koaguliraju (precipitini, aglutinini), olakšavaju fagocitozu;
- liziranje (fiksiranje komplementa: bakterioliza, citoliza, hemoliza), uzrokuju otapanje antigena;
- neutraliziraju (antitoksini), lišavaju antigen toksičnosti.
Reakcija antigen-antitijelo može biti korisna, štetna ili indiferentna za tijelo. Pozitivan učinak reakcije je da neutralizira otrove, bakterije, olakšava fagocitozu, precipitira proteine, lišava ih toksičnosti, lizira treponemu, leptospiru, životinjske stanice
Kompleks antigen-antitijelo može uzrokovati groznicu, poremećaj ćelijske permeabilnosti, intoksikaciju.Može se javiti hemoliza, anafilaktički šok, urtikarija, peludna groznica, bronhijalna astma, autoimuni poremećaj, odbacivanje transplantata, alergijske reakcije.
Imuni sistem nema gotove strukture koje proizvode antitela i sprovode imunološke reakcije.Antitela se formiraju tokom imunogeneze.