Sve žive ćelije reaguju na povišenu temperaturu i neke druge stresore sintezom specifičnog skupa proteina koji se nazivaju proteini toplotnog šoka (HSP). HSP uključuju proteine koje sintetiziraju stanice kao odgovor na toplotni šok, kada je ekspresija glavnog skupa proteina uključenih u normalan metabolizam potisnuta. Porodica 70 kDa HSP (HSP-70 eukariota i DnaK prokariota) uključuje proteine toplotnog šoka, koji igraju značajnu ulogu kako u osiguravanju opstanka ćelija u uslovima stresa tako iu normalnom metabolizmu. Nivo homologije između prokariotskih i eukariotskih proteina prelazi 50% sa potpunim identitetom pojedinačnih domena. 70 kDa HSP-ovi su jedna od najkonzerviranijih grupa proteina u prirodi (Lindquist Craig, 1988; Yura et al., 1993), što je vjerovatno zbog funkcija pratioca koje ovi HSP-ovi obavljaju u stanicama.
Indukcija gena proteina toplotnog šoka (HSP) kod eukariota nastaje pod uticajem faktora toplotnog šoka HSF. U ćelijama bez stresa, HSF je prisutan i u citoplazmi i u jezgru kao monomerni oblik vezan za Hsp70 i nema aktivnost vezanja DNK. Kao odgovor na toplotni šok ili drugi stres, Hsp70 se odvaja od HSF-a i počinje savijati denaturirane proteine. HSF se sastavlja u trimere, razvija aktivnost vezivanja DNK, akumulira se u jezgru i veže se za promotor. U ovom slučaju, transkripcija pratioca u ćeliji se višestruko povećava. Nakon što stres prođe, oslobođeni Hsp70 se ponovo pridružuje HSF-u, koji gubi svoju aktivnost vezanja DNK i sve se vraća u normalu [Morimoto ea 1993] Proteini toplotnog šoka pojavljuju se na površini sinovijalnih ćelija tokom bakterijskih infekcija.
Većina ovih proteina toplotnog šoka također se proizvodi kao odgovor na druge štetne podražaje. Možda pomažu ćeliji da preživi stresne situacije. Postoje tri glavne porodice proteina toplotnog šoka: mol. težine 25, 70 i 90 kDa (hsp25, hsp70 i hsp90. U normalnim ćelijama, pronađeno je mnogo vrlo sličnih proteina iz svake porodice. Proteini toplotnog šoka pomažu u rastvaranju i ponovnom savijanju denaturiranih ili pogrešno presavijenih proteina. Imaju i druge funkcije.
Proteini iz porodice hsp70 su najbolje proučeni. Ovi proteini se vezuju za neke druge proteine, kao i za abnormalne proteinske komplekse i agregate, iz kojih se zatim oslobađaju vezivanjem ATP-a. Oni pomažu u rastvaranju i ponovnom savijanju agregiranih ili pogrešno savijenih proteina kroz više ciklusa dodavanja i hidrolize ATP-a. Abnormalni proteini su prisutni u svakoj ćeliji, ali pod određenim uticajima, kao što je toplotni šok, njihov broj u ćeliji se naglo povećava, te se shodno tome javlja potreba za velikim brojem proteina toplotnog šoka. Osigurava se aktivacijom transkripcije određenih gena toplotnog šoka.
Proteini toplotnog šoka (Hsp - proteini toplotnog šoka), formirajući kompleks sa rastućim polipeptidnim lancem, sprečavaju njihovu nespecifičnu agregaciju i degradaciju pod dejstvom intracelularnih proteinaza, promovišući njihovo pravilno savijanje, što se dešava uz učešće drugih pratilaca. Hsp70 učestvuje u ATP-zavisnom odvijanju polipeptidnih lanaca, čineći nepolarne regione polipeptidnih lanaca dostupnim delovanju proteolitičkih enzima.
vidi i FAKTORI TRANSKRIPCIJE: KLASA: TF 3.4 faktori toplotnog šoka - http://humbio.ru/humbio/transcription/0002df25.htm
Alexander Sapozhnikov se ne slaže sa ovim teorijskim opravdanjem mehanizma djelovanja lijeka. Prema njegovim riječima, HSP70 može djelovati na drugačiji način, što tek treba proučiti, ali ostaje činjenica da u ćelijskim kulturama i nizu tumora u dvije linije štakora u koje su inokulirane "ljudske" tumorske stanice, protein zapravo pokazuje aktivnost.
Prema riječima autora rada, temperatura na kojoj rade sa HSP70 u ćelijskim kulturama je 43°C, i previsoka je za žive organizme, međutim, čini se da su uključeni i drugi mehanizmi, koji također tek treba razumjeti. Ovo se također odnosi na djelovanje egzogenog nećelijskog proteina toplotnog šoka unutar tijela. “Svako od nas ima prilično visok nivo HSP70 u krvotoku - do 900 nanograma po mililitru. Ubrizgali smo ga životinji i pokušali da vidimo šta se dalje dešava sa proteinom. U roku od 40 minuta vidjeli smo tragove HSP70 u krvi, a onda je nestao. Postoji mišljenje da se protein razgrađuje, ali mi ne mislimo tako.”
Impresivni rezultati čekaju provjeru
Irina Guzhova je također govorila o daljnjem testiranju lijeka: „Ovaj mehanizam smo testirali na mišjem melanomu B16, koji raste potkožno, i koristili ga u obliku gela koji se nanosi na površinu kože. Rezultat je bio impresivan: stopa preživljavanja miševa bila je mnogo veća od one u kontrolnoj grupi koja je tretirana gelom bez aktivne tvari ili uopće nije tretirana. Razlika je bila desetak dana. Za miševe i ovu vrstu tumora, ovo je vrlo dobro odlaganje. Slični rezultati su pokazali i kod pacova C6 glioma (ovo je tumor koji raste direktno u mozgu).
Životinje koje su liječene jednom injekcijom u mozak dobile su dodatnih deset dana života, dok je životinjama koje su dobivale protein kontinuirano tri dana putem pumpe to trajanje produženo za dodatnih deset dana kako je tumor rastao sporije. Pokazali smo da ako iscrpite populaciju T ćelija kod miša koji je imao tumor i uklonite već „naučene“ NK ćelije ili CD8-pozitivne limfocite, ni oni neće prepoznati tumor. Možemo zaključiti da je glavna funkcija HSP70 u ovom procesu aktivacija specifičnog imuniteta."
Ovi podaci su podstakli naučnike da sprovedu ograničeno istraživanje na klinici Polenov (Istraživački institut za neurohirurgiju u Sankt Peterburgu). „U ovom trenutku u našem timu je bio neurohirurg Maksim Ševcov, koji je uporedo sa postdiplomskim studijama Borisa Aleksandroviča (Margulis, - bilješka na web stranici) završio specijalizaciju na ovom istraživačkom institutu. Uvjerio je svog supervizora, profesora Khachaturiana, da testira ovaj lijek. Prema tadašnjem zakonodavstvu, odluka naučnog vijeća i informirani pristanak pacijenata bili su dovoljni, a dodijeljeno nam je 25 pacijenata. Svi su imali razne tumore na mozgu, i svi su dobili ono na šta su imali pravo iz osiguranja, ali plus, nakon hirurškog uklanjanja tumora, Maxim je u operacijski krevet ubrizgao rastvor HSP70.
Problem je što je tumore na mozgu teško potpuno ukloniti. Uvijek ostaju sitni komadići koje je opasno ukloniti, jer se uz njih može ukloniti i ličnost, a ti komadići izazivaju recidive. Ali rezultati su se pokazali apsolutno nevjerovatnim: nakon operacije se povećao broj specifičnih imunoloških stanica kod pacijenata, smanjio se broj protumorskih („prešli na tumorsku stranu“) T-limfocita i količina interleukina. 10 (informacioni molekul imunog sistema) se smanjio.
Studija je bila samo pilot, nije randomizirana, nije postojala kontrolna grupa, a sprovedena je 2011. godine. Iste godine donesen je zakon koji zabranjuje takve testove, koji su morali biti obustavljeni čim su počeli. Ostalo nam je 12 operisanih pacijenata. Svako ko je upoznat s kliničkim dijelom istraživanja ima ideju koliko je teško pratiti sudbinu pacijenata nakon što svaki od njih napusti kliniku. Dakle, znamo samo za osmoro koji su ostali u kontaktu, a svi su još živi. Početkom jeseni prošle godine bili su prilično zdravi, a oni koji su nastavili da studiraju krenuli su u školu na jesen, iako je prosječna prognoza za životni vijek sa otkrivenim gliomom 14 mjeseci.”
Sada se, prema riječima govornika, pretklinička ispitivanja privode kraju, a lijek zahtijeva višestepeno testiranje na pacijentima, koje će potrajati nekoliko godina (zbog toga je članak Izvestia uključivao tako nevjerovatno kratak period prije nego što lijek uđe u promet tržište - 3-4 godine).
Aleksandar Sapožnikov je takođe naglasio važnost kliničkih ispitivanja: „Tumor kalemljen na miševe i ljudski tumor su nebo i zemlja. Lijek može djelovati na ovaj tumor, ali biti neefikasan ni na normalni tumor miša ni na ljudski. Uvjerite svoje kolege, ne postoji lijek za sve bolesti odjednom.”
Tako misle i sami istraživači. „U ovim fazama sve funkcioniše (i veoma dobro), ali, naravno, ovo nije lek koji podiže Lazara“, kaže Irina Gužova, „međutim, prilično je efikasan i vredan kliničkih ispitivanja. I nadamo se da će se to dogoditi."
Jednostavno prostor
Čitalac može imati razumno pitanje: odakle je došao prostor? Irina Gužova objašnjava: „Činjenica je da su se ispitivanja odvijala na bazi Instituta za visoko čiste preparate, čiji zaposleni imaju dobro iskustvo u registraciji patenata i pisanju papira, pa smo im dali ovu stvar. U isto vrijeme su počeli proizvoditi ovaj protein, a mi smo radili eksperimente na životinjama. Ali pri tom im je prišao predstavnik Roskosmosa i pitao da li imamo neku vrstu nekristalizovanog proteina koji bi mogao da se kristališe u svemiru, u orbiti. I dobili su HSP70, pokušali su uzgajati kristale u orbiti, ali ništa nije uspjelo.”
Ispostavilo se da je problem u strukturi proteina. Vrlo pokretljiv dio u strukturi proteina ometao je kristalizaciju, pa su počeli pokušavati da ga kristaliziraju u komadiće, da posebnom molekulom vežu pokretni dio kako bi ga "držao". I dalje pokušavaju. "Ovdje je nastala priča o ćelijama koje rastu u svemiru i liječe sve od raka", komentira Irina Guzhova.
Ona je takođe rekla da je za testiranje u svemiru i na miševima protein bio podvrgnut veoma visokom stepenu prečišćavanja - oko 99%. Što se tiče sumnje da imunološki sistem ne aktivira šaperon, već lipopolisaharid (LPS) – komponenta ćelijskog zida bakterije u kojoj se proizvodi ovaj protein – takva je vjerovatnoća mala. Iako se LPS veoma snažno „lepi“ za HSP, i prilično je teško pročistiti protein od njegovih najsitnijih nečistoća. Naučnici su postavili dodatne kontrole kako bi pokazali da nije on, već pratilac, uzrok djelovanja lijeka. Na primjer, lijek se može prokuhati, što ne utječe na LPS, ali uništava strukturu proteina. Tada se gube njegova HSP svojstva i lijek prestaje djelovati, što se ne bi dogodilo da je u njemu djelovao uglavnom bakterijski LPS.
Osim toga, istraživači su upoređivali učinak uvođenja komponenti bakterijskog ćelijskog zida s učinkom HSP70, a ova poređenja su jasno dala prednost ovom drugom.
“Nismo rekli ništa glupo. I šta? “Nula emocija!”
Irina izvještava da naučnici još nisu otkrili nikakve neželjene reakcije tokom testova, ali bi mogle biti odgođene. “Smatram da istraživač treba prije svega sve isprobati na sebi, a završila sam dva kursa chaperone terapije. Nije bilo nuspojava, naprotiv, činilo se da manje čireve nestaju i da mi rastu krila iza leđa.”
“S druge strane, sve što je bilo u medijima bila je prava sramota”, napominje istraživač. - Ali, kako kažu, sreće ne bi bilo, nego bi pomogla nesreća: Institutu za visokočiste preparate već stižu pozivi sa ponudama za pomoć u kliničkim ispitivanjima. Govorili smo na konferencijama iu raznim skromnijim medijima, pričali o istome, ali provjeravali riječi i ne govorili ništa glupo. I šta? - Nema emocija! A onda je ova vrsta taloga bljesnula po ekranima, i molim vas! Tako zanimljivo društvo, tako zanimljiva zemlja.”
Međutim, prema izvorima na sajtu, Simbircev je bio primoran da da intervju kojim je sve počelo. ponudio da da intervju kako bi se podstaklo interesovanje za probleme Instituta i privukla dodatna sredstva za klinička ispitivanja. Osim toga, kruže glasine o mogućem gubitku pravnog lica od strane instituta zbog spajanja naučnih organizacija širom zemlje. Očigledno, naučnik nije bio spreman da novinama detaljno i popularno ispriča šta se dešava. "Ovaj put je pogrešno shvaćeno sve što je moglo biti pogrešno shvaćeno", napominje izvor.
Kao rezultat toga, situacija sve više liči na poznatu bajku, kada Roskosmos i vladine agencije koje dijele grantove jure u oblake, očekujući trenutne rezultate fundamentalne nauke, rak se vraća unazad, novinari prosipaju strukturiranu vodu. I ruska nauka se ponovo nalazi u nezavidnom položaju, prinuđena da se pravda za zločine koje nije počinila.
07. jun 2010Kako izgleda molekularni termometar? Ovo pitanje je mnogo komplikovanije nego što se čini na prvi pogled. Očigledno, "termometar" koji koristi ćelija, a koji igra jednu od najvažnijih uloga u održavanju stabilnosti ćelijskog proteoma, je sistem transkripcionih faktora i specijalizovanih proteina - šaperona, uklj. proteini toplotnog šoka, koji ne reaguju samo na povišenu temperaturu (ovo je tek prva otkrivena funkcija ove klase proteina), već i na druge fiziološke uticaje koji oštećuju ćeliju.
Šaperoni su klasa proteina čija je glavna funkcija obnavljanje ispravne tercijarne strukture oštećenih proteina, kao i formiranje i disocijacija proteinskih kompleksa.
Sistem šaperona reaguje na oštećenja koja se javljaju tokom života ćelije i osigurava ispravan prolaz savijanja - savijanja lanaca aminokiselina koji izlaze iz ribosomske „linije sklapanja“ u trodimenzionalne strukture. Uprkos očiglednoj važnosti ovog sistema, dugo vremena niko od stručnjaka koji su ga proučavali nije ni zamišljao da je ovaj molekularni termometar i neka vrsta „izvora mladosti“ ćelije, a njegovo proučavanje pruža priliku da se pogleda niz bolesti sa nove, do sada nepoznate strane.
Proteini, koji su glavni proizvod funkcioniranja genoma, ne samo da formiraju strukturu, već i osiguravaju funkcioniranje svih stanica, tkiva i organa. Nema poremećaja u sintezi sekvenci aminokiselina; Formiranje, sastavljanje i transport proteinskih molekula, kao i uklanjanje oštećenih proteina, kritičan je aspekt održavanja zdravlja kako pojedinačnih ćelija tako i cijelog tijela. Proteini su takođe materijal neophodan za formiranje i efikasno funkcionisanje „molekularnih mašina“ koje obezbeđuju procese biosinteze, proces koji je ključan za obezbeđivanje dugovečnosti organizma. Mnogi problemi su uzrokovani poremećajima u fundamentalnom procesu savijanja proteina. Poremećaji u funkcionisanju „OTK-a“, koje predstavljaju proteini toplotnog šoka i pratioci, dovode do pojave i gomilanja grešaka. Ove greške remete funkcionisanje molekularnih mehanizama, što može dovesti do razvoja raznih bolesti. Pojava ovakvih grešaka u neuronima bremenita je zaista strašnim posljedicama, koje se manifestiraju razvojem neurodegenerativnih bolesti poput multiple skleroze, kao i Huntingtonove, Parkinsonove i Alchajmerove bolesti.
Otkrio ga je 1962. godine Ferruccio Ritossa, reakcija toplotnog šoka opisana je kao temperaturno izazvana promjena u organizaciji čvrsto zbijenih hromozoma u ćelijama pljuvačnih žlijezda muva Drosophila, što dovodi do formiranja takozvanih "izbočina". Takve otekline, koje pod mikroskopom izgledaju kao kuglice vate, stisnute između čvrsto zbijenih dijelova hromozoma, također se pojavljuju kada su izložene dinitrofenolu, etanolu i solima salicilne kiseline.
Ispostavilo se da su otekline hromozoma nove transkripcione regije koje započinju sintezu novih glasničkih RNK u roku od nekoliko minuta od njihovog nastanka. Proteinski proizvodi ovog procesa danas su poznati kao proteini toplotnog šoka, od kojih su najbolje proučeni Hsp90 i Hsp70. Proteini ove porodice regulišu savijanje lanaca aminokiselina i sprečavaju pojavu nepravilno formiranih proteinskih molekula u ćelijama svih živih organizama.
Krajem 1970-ih i ranih 1980-ih, koristeći originalnu tehniku ćelijske biohemije za povećanje broja glasnih RNK koje kodiraju sekvence odgovarajućih proteina, naučnici su uspjeli klonirati prve gene toplotnog šoka voćne mušice. Stručnjaci su tada bili mišljenja da je reakcija toplotnog šoka karakteristična isključivo za organizam drozofile. U ovoj fazi, Richard Morimoto je dao svoj prvi doprinos proučavanju proteina toplotnog šoka. Sakupio je opsežnu kolekciju DNK iz višećelijskih organizama i, koristeći Southern bloting, pokazao da svi sadrže analoge gena Hsp70 koji su bili gotovo identične strukture. Otprilike u isto vrijeme, Jim Bardwell i Betty Craig sa Univerziteta Wisconsin u Madisonu identificirali su dnaK gen, također analog Hsp70, u genomu Escherichia coli. Rezultat daljeg detaljnog proučavanja ovog pitanja bilo je shvatanje da su geni toplotnog šoka, praktično nepromenjeni tokom evolucije, zastupljeni u genomima predstavnika svih pet kraljevstava živog sveta.
Sljedeći napredak u lancu događaja koji je uslijedio bila je identifikacija porodice transkripcijskih faktora koji kontroliraju inicijaciju prve faze odgovora na toplotni šok. U ovom radu učestvovalo je nekoliko istraživačkih grupa sa različitih univerziteta, uključujući Morimotovu grupu. Naučnici su dokazali da povećanje ćelijske temperature uzrokuje promjenu oblika ovih transkripcijskih faktora, što pospješuje njihovo vezivanje za promotore gena toplotnog šoka, koji iniciraju sintezu proteina toplotnog šoka. Štaviše, pokazalo se da za razliku od kvasca, voćnih mušica i nematode Caenorhabditis elegans, koji imaju samo jedan faktor transkripcije za gene toplotnog šoka, ljudske ćelije imaju čak tri takva faktora. Ovako složena shema za regulaciju ekspresije gena koji se proučavaju navela je naučnike na razmišljanje o njihovoj multifunkcionalnosti, što zahtijeva dodatno istraživanje.
Dalja istraživanja su pokazala da sami proteini toplotnog šoka regulišu funkcionisanje transkripcionog faktora koji pokreće njihovu proizvodnju u jezgri ćelije. Također je postalo očito da proteini toplotnog šoka obavljaju funkciju molekularnih pratilaca - kontroliraju savijanje lanaca aminokiselina, osiguravajući formiranje ispravnih prostornih konformacija proteinskih molekula, a također identificiraju i eliminiraju kvarove u ovom procesu. Tako se pokazalo da ćelijski termometar ne samo da mjeri temperaturu, već prati i pojavu deformiranih i oštećenih proteina u ćeliji. Toplotni šok i drugi stresori preplavljuju ćeliju abnormalnim proteinima, na koje pratioci reaguju vezivanjem ovih proteina i oslobađanjem faktora transkripcije toplotnog šoka 1 (Hsf1). Molekuli ovog faktora spontano formiraju trimere (kompleks od tri molekula) koji se vezuju za odgovarajuće regije genoma, koji zauzvrat pokreću sintezu proteina toplotnog šoka. Naknadno povećanje koncentracije proteina toplotnog šoka do potrebnog nivoa, prema principu povratne sprege, potiskuje transkripcionu aktivnost Hsf1 faktora transkripcije.
Proučavanje funkcionisanja proteina toplotnog šoka na ćelijskim linijama uveliko je ograničilo mogućnosti istraživača, jer nije davalo informacije o pratećim promenama koje se dešavaju u celom telu. Tako su oko 1999. Morimoto i njegove kolege odlučili da pređu na novi model: okrugli crv C.elegans. Posebno ih je inspirisao rad Maksa Perutza, objavljen 1994. godine, koji je otkrio da je uzrok ozbiljne neurodegenerativne bolesti Huntingtonova bolest specifična mutacija gena zvanog huntingtin. Ova mutacija rezultira sintezom varijantnog proteina koji sadrži dodatni fragment iz dugog lanca aminokiseline glutamina, očito narušavajući normalan proces savijanja. Agregacija takvih abnormalnih proteinskih molekula u neuronima dovodi do razvoja Huntingtonove bolesti. Istraživači su predložili da bi proučavanje proteina čija je molekularna formacija poremećena zbog ekspresije poliglutamina ili sličnih razloga pomoglo razumjeti rad molekularnog termometra.
Radeći na stvaranju životinjskih modela ekspresije proteina koji sadrže višak poliglutaminskih sekvenci u neuronima i mišićnim ćelijama, istraživači su otkrili da je stepen agregacije i povezana toksičnost takvih proteina proporcionalan njihovoj dužini i starosti organizma. To ih je navelo da vjeruju da supresija signalnog mehanizma posredovanog inzulinom koji regulira životni vijek može utjecati na agregaciju proteina koji sadrže poliglutamin. Rezultati daljih studija potvrdili su postojanje predložene veze i takođe pokazali da je efekat funkcionisanja Hsf1 transkripcionog faktora na životni vek organizma posredovan signalnim mehanizmom zavisnim od insulina. Ova zapažanja su jasno pokazala da je reakcija toplotnog šoka podjednako važna kako za opstanak organizma u uslovima akutnog stresa, tako i za kontinuiranu neutralizaciju toksičnih efekata proteina koji negativno utiču na funkcionisanje i životni vek ćelija.
Upotreba živih organizama kao eksperimentalnog modela omogućila je naučnicima da istraživanja podignu na kvalitativno novi nivo. Počeli su da obraćaju pažnju na mehanizme pomoću kojih telo percipira i integriše informacije koje dolaze spolja na molekularnom nivou. Ako stres utiče na proces starenja, logično je pretpostaviti da su proteini toplotnog šoka, koji detektuju pojavu i sprečavaju nakupljanje oštećenih proteina u ćeliji, sasvim sposobni da uspore razvoj efekata starenja.
Činjenica da se mnoge bolesti povezane s nakupljanjem proteina sklonih agregaciji karakteriziraju simptomima starenja, a sve bolesti koje se temelje na poremećajima u formiranju proteinskih molekula su povezane sa starenjem, sugerira da temperaturno osjetljivi metastabilni proteini gube svoju funkcionalnost zbog kako telo stari. Zaista, eksperimenti na C.elegans-u su pokazali da funkcionisanje mehanizma pokrenutog faktorom transkripcije Hsf1, kao i drugih odbrambenih sistema ćelije, počinje da bledi skoro odmah nakon što organizam sazre. Međutim, pokazalo se da aktivacija faktora transkripcije Hsf1 u ranim fazama razvoja može spriječiti narušavanje stabilnosti proteinskih molekula (proteostazu).
Ova intrigantna mogućnost se možda ne odnosi na složenije višećelijske organizme, ali sva živa bića su napravljena od proteina, tako da će rezultati dobijeni eksperimentima na okruglim crvima vjerovatno pomoći naučnicima da shvate mehanizme ljudskog starenja.
Međutim, ovo nije kraj priče. Rezultati nedavno obavljenog rada pod vodstvom profesora Morimotoa ukazuju na postojanje mehanizama za podešavanje proteostaze koji ne zahtijevaju direktnu interferenciju s funkcionisanjem Hsf1 faktora transkripcije. Istraživači su odlučili provesti klasični genetski skrining C.elegans mutanata koji pokazuju poremećaje u formiranju proteinskih molekula u mišićnim stanicama. Kao rezultat toga, otkrili su da se mutacija koja utječe na ovaj proces nalazi u genu za faktor transkripcije koji kontrolira proizvodnju neurotransmitera gama-aminobuterne kiseline (GABA). GABA kontroliše rad ekscitatornih neurotransmitera i reguliše tonus mišića. Zanimljiva je činjenica da svaki poremećaj stabilnosti GABA-posredovanih mehanizama dovodi do hiperstimulacije, uzrokujući da postsinaptičke mišićne ćelije reaguju na nepostojeći stres, što dovodi do poremećaja formiranja proteinskih molekula. Drugim riječima, pokazalo se da aktivnost neurona može utjecati na funkcioniranje molekularnih termometara drugih ćelija u tijelu, što je dodatno zakomplikovalo sliku koja se pojavila.
Ako se ovaj mehanizam proširi i na ljude, onda će možda znanstvenici uspjeti razviti metodu utjecaja na neurone koja dovodi do aktivacije proteina toplotnog šoka u stanicama skeletnih mišića i pomaže u uklanjanju simptoma mišićne distrofije i drugih bolesti motornih neurona. Možda će manipulacija ovim mehanizmima omogućiti i kontrolu procesa nakupljanja oštećenih proteina povezanih sa starenjem. Međutim, nažalost, nije sve tako jednostavno kako bismo željeli. Kod C.elegansa, razvoj reakcije toplotnog šoka u svim odraslim somatskim ćelijama kontroliše jedan par neurona. Čini se da aktivnost ovih neurona i mehanizam povratne sprege omogućavaju ćelijama i tkivima da aktiviraju proteine toplotnog šoka u skladu sa svojim specifičnim potrebama. Činjenica je da različita tkiva karakterizira različita aktivnost biosinteze proteina, kao i različita težina i priroda vanjskih utjecaja. Stoga je univerzalni pristup upravljanju reakcijom toplotnog šoka u principu nemoguć.
Naoružani svojim radom i obećavajućim idejama, Morimoto i nekoliko njegovih kolega osnovali su Proteostasis Therapeutics, čiji je cilj identificirati terapeutske male molekule koji mogu ispraviti patološke efekte akumulacije deformiranih proteinskih molekula. Ovaj pristup je povezan s prilično velikim udjelom rizika, budući da se nivo proteina toplotnog šoka povećava kod mnogih malignih bolesti. Međutim, Morimoto i njegovi saradnici vjeruju da smjer u kojem se razvijaju ima previše potencijala da ga ignorišu.
o autoru
Profesor Richard Morimoto je nakon odbrane doktorske disertacije cijeli svoj rad posvetio proučavanju funkcionisanja proteina toplotnog šoka i njihove uloge u starenju organizma. Morimoto je napravio prve korake u svom odabranom pravcu na Univerzitetu Harvard pod vodstvom dr. Matta Meselsona. Richard Morimoto je trenutno direktor Rice instituta za biomedicinska istraživanja na Univerzitetu Northwestern u Evanstonu, Illinois, i suosnivač Proteostasis Therapeutics (Cambridge, Massachusetts).
Evgenia Ryabtseva
Portal “Vječna mladost” zasnovan na materijalima iz The Scientist: Richard Morimoto,
Strukturne i funkcionalne promjene pod utjecajem visokih temperatura. Izlaganje visokim temperaturama prvenstveno utiče na fluidnost membrana, što rezultira povećanjem njihove permeabilnosti i oslobađanjem supstanci rastvorljivih u vodi iz ćelije. Kao rezultat, dolazi do dezorganizacije mnogih ćelijskih funkcija, posebno do njihove podjele. Dakle, ako na temperaturi od 20 °C sve ćelije prolaze kroz proces mitotičke diobe, na 38 °C - svaka sedma ćelija, a na 42 °C - samo svaka petstota ćelija.
Povećana fluidnost membranskih lipida, uzrokovana promjenama u sastavu i strukturi membrane tokom pregrijavanja, dovodi do gubitka aktivnosti enzima vezanih za membranu i poremećaja ETC aktivnosti. Od glavnih procesa proizvodnje energije - fotosinteze i disanja, ETC fotosinteze je najosetljiviji, posebno fotosistem II (PSII). Što se tiče enzima fotosinteze, glavni enzim fotosinteznog ciklusa C3, RuBP karboksilaza, prilično je otporan na pregrijavanje.
Pregrijavanje ima primjetan učinak na vodni režim biljke, brzo i značajno povećavajući brzinu transpiracije. Kao rezultat toga, biljka doživljava nedostatak vode. Kombinacija suše sa toplotom i velikom sunčevom insolacijom ima najveći negativan uticaj na useve, remeteći, uz fotosintezu, disanje i vodni režim, apsorpciju elemenata mineralne ishrane.
Molekularni aspekti oštećenja toplotnog šoka. Toplota prvenstveno oštećuje proteine u ćeliji, posebno enzime, remeteći proces de novo biosinteze proteina, inhibirajući aktivnost enzima i izazivajući degradaciju postojećih proteina. Kao rezultat toga, skupovi enzima koji su važni za funkcionisanje ćelija i tokom perioda stresa i naknadne popravke mogu nestati. Većina ključnih biljnih enzima je termolabilna, uključujući Rubisco, katalazu i SOD. Rubisco inhibicija je glavni razlog za smanjenje IF na visokoj temperaturi. Toplota takođe inhibira sposobnost pretvaranja saharoze u skrob u ječmu, pšenici i krompiru, što ukazuje da je jedan ili više enzima u lancu konverzije snažno inhibirano toplotom. Direktan uticaj toplote na aktivnost rastvorljive skrob sintaze u endospermu pšenice, kako in vitro tako i in vivo, izaziva supresiju akumulacije skroba.
Visoke temperature inhibiraju aktivnost katalaze kod nekoliko biljnih vrsta, dok aktivnost drugih antioksidativnih enzima nije inhibirana. Kod raži su promjene aktivnosti katalaze bile reverzibilne i nisu ostavljale vidljiva oštećenja nakon prestanka topline, dok je kod krastavca oporavak aktivnosti katalaze bio usporen (inhibiran) i praćen promjenom boje hlorofila, što ukazuje na značajnije oksidativno oštećenje. Kod sadnica kukuruza uzgojenih na povišenim temperaturama (35°C), aktivnost SOD je bila niža nego na relativno niskim temperaturama (10°C).
Toplota je poremetila integritet membrana, što je dovelo do njihove povećane propusnosti za jone i rastvore. Istovremeno je poremećena aktivnost membranskih enzima fotosinteze, disanja i transporta asimilata. Toplota je povećala stepen zasićenosti masnih kiselina u membranskim fosfolipidima ER. U uslovima ekstremne vrućine, njegove membrane su selektivno oštećene, uzrokujući degradaciju mRNK (3-amilaze. Istovremeno, toplotno indukovano curenje supstanci kroz membrane utiče na redoks potencijal glavnih ćelijskih kompartmana, koji zauzvrat, remeti tok metaboličkih procesa sve do smrti ćelije.
Oksidativni stres je nedavno prepoznat kao jedan od najvažnijih negativnih učinaka topline na biljke. Toplina uzrokuje neravnotežu između količine sunčevog zračenja koje apsorbiraju pigmenti i transporta elektrona kroz citokrome, proces koji se naziva fotoinhibicija. Višak energije može se prenijeti na kisik, što dovodi do stvaranja ROS. Glavna područja oksidativnog oštećenja u stanicama su mitohondriji i hloroplasti, gdje je poremećen transport elektrona. U hloroplastima stres visoke temperature uzrokuje fotoinhibiciju fotosinteze i inaktivaciju katalaze, što dovodi do nakupljanja ROS i izbjeljivanja klorofila. Fotosistem II je prepoznat kao najosetljiviji na toplotu, što dovodi do raspada funkcionalnih komponenti kompleksa PS II i, shodno tome, poremećaja transporta elektrona između PS I i PS II, povećanja protoka elektrona do molekularnog kiseonika i formiranje ROS-a. Kao rezultat, FI se smanjuje, što je glavni uzrok gubitka usjeva zbog topline.
Proteini toplotnog šoka. Sinteza proteina toplotnog šoka (HSP) kao odgovor na povišenu temperaturu otkrivena je 1974. godine. Karakteristična je za sve vrste živih organizama, uključujući više i niže biljke. HSP u svim organizmima je predstavljen velikim skupom polipeptida, koji se obično nazivaju prema njihovoj molekularnoj težini, izraženoj u kilodaltonima (kDa). Na primjer, HSP sa molekulskom težinom od 70 kDa naziva se HSP 70. Na značajnu ulogu HSP u životu ćelija ukazuje visoka očuvanost njihove evolucije. Dakle, pojedinačne regije u evoluciji HSP 70 zadržavaju preko 90% homologije kod bakterija i ljudi. Biljni HSP su predstavljeni grupom proteina visoke molekularne težine (110-60 kDa) i niske molekularne težine (35-15 kDa). Posebne karakteristike biljaka su mnoštvo HSP niske molekularne težine i visok intenzitet njihove sinteze tokom toplotnog šoka (HS).
Sinteza HSP je stresni program koji se pokreće toplotnim šokom i događa se kada temperatura poraste 8-10 °C iznad normalne. Tako se u listovima ječma maksimalna sinteza HSP-a postiže na 40 °C, a u listovima pirinča - na 45 °C. Prebacivanje normalnog života ćelije na stresni program uključuje reprogramiranje genoma povezano sa inhibicijom ekspresije gena čija je aktivnost karakteristična za život u normalnim uslovima i aktivacijom TS gena. U biljnim ćelijama, mRNA koja kodira HSP se otkriva 5 minuta nakon početka stresa. Osim toga, dolazi do raspada polisoma koji sintetiziraju proteine tipične za normalna stanja i formiranja polisoma koji sintetiziraju HSP. Brza aktivacija sinteze HSP-a na nivou ne samo transkripcije (sinteza RNK na DNK), već i translacije (sinteza proteina na mRNA) postiže se kao rezultat koordinacije mnogih događaja. Toplotni šok uzrokuje promjene u mRNA sintetiziranoj u ćeliji prije šoka, povezane s modifikacijom faktora translacije proteina i ribosomskih proteina. Osim toga, HSP mRNA se razlikuju od mRNA običnih proteina. Kao rezultat HS, sinteza konvencionalnih proteina je oslabljena, a zatim zaustavljena i aparat za sintezu proteina prelazi na sintezu HSP-a, koji se detektiraju u ćeliji već 15 minuta nakon početka HS. Maksimalna sinteza se opaža nakon 2-4 sata, a zatim se smanjuje.
Sinteza različitih HSP-a odvija se na različitim temperaturama. U hloroplastima, sinteza HSP visoke molekularne težine aktivirana je u rasponu od 34-42 °C, oslabljena na 44 °C, a naglo smanjena na 46 °C. Indukcija sinteze HSP niske molekularne mase bila je posebno uočljiva na 40-42 °C. Značajna inhibicija Rubisco sinteze dogodila se samo na temperaturama iznad 44 °C. Gotovo svi otkriveni HSP-ovi hloroplasta su kodirani u jezgru, sintetizirani u citoplazmi, a zatim transportirani u hloroplast, gdje obavljaju zaštitnu funkciju tokom HS. Nakon završetka toplotnog šoka, sinteza HSP se zaustavlja i nastavlja se sinteza proteina karakterističnih za ćeliju u normalnim temperaturnim uvjetima. U ovom slučaju, HSP mRNA se brzo uništava u stanicama na normalnim temperaturama, dok sami proteini mogu opstati mnogo duže, očito osiguravajući povećanje otpornosti stanice na toplinu. Produžena izloženost ćelija uslovima HSP obično takođe dovodi do slabljenja i prestanka sinteze HSP. U ovom slučaju, mehanizmi regulacije ekspresije HSP gena se aktiviraju prema principu povratne sprege. Akumulacija HSP-a u ćelijama smanjuje aktivnost njihovih gena. Možda na taj način ćelija održava količinu HSP-a na potrebnom nivou, sprečavajući njihovu prekomernu proizvodnju.
U pravilu, kao odgovor na povećanje temperature, sintetiziraju se odgovarajući proteini, što pomaže u povećanju toplinske otpornosti tijela. Zaštitna uloga HSP-a opisana je modelom molekularnog pratioca (u prijevodu s engleskog - vodič, mentor mladoj osobi). U ekstremnim uslovima, HSP „čuvaju“ funkcionisanje specifičnih makromolekula i ćelijskih struktura, oslobađajući ćelije od oštećenih komponenti, što omogućava održavanje ćelijske homeostaze. Interakcija HSP 70 sa drugim proteinima zavisi od odnosa ATP/ADP. Vjeruje se da HSP 70, u kompleksu sa ADP, zadržava netkani protein, a zamjena ADP sa ATP dovodi do oslobađanja ovog proteina iz kompleksa sa HSP 70.
U skladu sa ovim modelom, HSP povećavaju termičku stabilnost ćelija, obezbeđujući sledeće procese: energetski zavisnu stabilizaciju prirodne strukture proteina; pravilno sklapanje oligomernih struktura u uslovima hipertermije; transport tvari kroz membrane organela; dezagregacija neispravno sastavljenih makromolekularnih kompleksa; oslobađanje ćelije od denaturiranih makromolekula i recikliranje monomera koji su u njima uključeni uz pomoć ubikvitina. Ubikvitini su proteini toplotnog šoka niske molekularne težine, čije vezivanje za polipeptid ga čini metom za proteaze. Ovo je neka vrsta "smrtnog traga" za proteine. Uz njihovu pomoć odstranjuju se i uklanjaju proteini koji su oštećeni i nedovršeni kao rezultat djelovanja HS.
Brojne činjenice podržavaju zaštitnu funkciju HSP u HS. Posebno se pokazalo da isključivanje sinteze proteina sa specifičnim inhibitorima tokom HS, kada dođe do sinteze HSP, dovodi do smrti ćelije. Ćelije se mogu očvrsnuti, povećavajući njihovu termičku stabilnost tako što se prvo kratko izlažu povišenim temperaturama. Uslovi za takvo stvrdnjavanje poklapaju se sa uslovima za indukciju sinteze HSP. Zanimljivo je da sintezu HSP-a u biljkama induciraju ne samo HSP-ovi, već i, na primjer, kadmijuve soli i arsenit, tretman kojim se povećava otpornost stanica na toplinu. Također je važno naglasiti da promjene u strukturi gena (mutacije) koje remete sintezu HSP dovode do gubitka otpornosti ćelije na zagrijavanje. Dalja istraživanja specifične funkcije svakog HSP-a pod stresom će omogućiti da se razjasne molekularni mehanizmi formiranja i funkcionisanja zaštitnih svojstava tokom HSP-a.
Većina HS proteina ima srodne proteine u ćelijama, koji se sintetiziraju na normalnim temperaturama stalno ili tokom određenih faza ontogeneze. Ispostavilo se da se ovi proteini, posebno HSP 70, vežu za druge proteine, uzrokujući njihovo odvijanje i sprečavajući njihovu agregaciju. Ovo posljednje može spriječiti protein da stekne nativnu konformaciju neophodnu za njegovu funkcionalnu aktivnost. Razmatranje proteina pomoću HSP-a neophodno je za njihovo prodiranje kroz membranu hloroplasta, mitohondrija i ER. Budući da se agregacija proteina naglo povećava s povećanjem temperature, aktivacija sinteze HSP 70 u ovim uvjetima treba zaštititi proteine od nepovratnih oštećenja. HSP su prisutni u svim ćelijskim odjeljcima, posebno u jezgru i nukleolima, gdje se akumuliraju tokom HS. HSP 70 podstiče prolaz prekursora hloroplasta i mitohondrijalnih proteina sintetizovanih u citoplazmi kroz membranu, igrajući ulogu u biogenezi ovih organela. HSP 60, takođe povezan sa šaperonima, naziva se i šaperonini. Ovi proteini osiguravaju ispravan sklop kvartarne strukture ćelijskih proteina, kao što je ključni fotosintetski enzim Rubisco, koji se sastoji od osam velikih i osam malih podjedinica. U grupu šaperona spada i HSP 90, koji igra važnu ulogu u formiranju kompleksa steroidnih hormona sa njihovim receptorima. Osim toga, HSP 90 formira komplekse s nekim protein kinazama, kontrolirajući njihovu aktivnost. Poznato je da protein kinaze fosforiliraju različite ćelijske proteine, regulišući njihovu aktivnost.
Više od 30 HSP niske molekularne težine (15-35 kDa) pronađeno je u biljkama, lokalizovanih uglavnom u citoplazmatskim granulama toplotnog šoka koje se pojavljuju tokom HS i nestaju nakon njega. Njihova glavna funkcija je zaštita mRNA prije šoka, što omogućava da se potonji koriste za sintezu proteina nakon završetka šoka. HSP niske molekularne težine se također nalaze u drugim dijelovima, posebno u hloroplastima. Vjeruje se da štite tilakoidne membrane, gdje su lokalizirani procesi svjetlosne faze fotosinteze, od HS.
U nekim biljkama otkrivena je konstitutivna (neindukovana) sinteza HSP tokom formiranja, posebno polena. Moguće je da HSP pred šokom osiguravaju njegovu termičku stabilnost tokom HS. Pored HSP-a, toplota indukuje ekspresiju drugih klasa proteina, posebno kalmodulina.
Metabolizam u uslovima toplotnog šoka. Vrlo je malo ciljanih studija metabolizma biljaka pod utjecajem HS, a u tim eksperimentima i HS i suša često su djelovali istovremeno. Ovo je vrlo važna stvar, budući da je odgovor biljaka na kombinaciju suše i HS različit od odgovora na pojedinačne stresore. Dakle, pod kombinacijom stresa, biljke su akumulirale nekoliko topljivih šećera, uključujući saharozu, maltozu, trekalozu, fruktozu i glukozu. Pod uticajem suše dolazi do akumulacije prolina, ali se pod uticajem HS, kao i kombinacijom HS i suše, prolin nije akumulirao u biljkama. U uslovima HS, prolin ili njegov intermedijer (pirolin-5-karboksilat) je toksičan, tako da prolin nije prikladan kao kompatibilan osmolit. Uz istodobno djelovanje HS i suše, sadržaj glutamina naglo raste. Očigledno, kada je biosinteza prolina inhibirana, glutamat se transformiše u glutamin. Istovremeno se aktiviraju geni koji kodiraju razgradnju škroba i biosintezu lipida, a povećava se i ekspresija gena koji kodiraju heksokinazu, glukozo-6-fosfat dehidrogenazu, fruktokinazu i saharoza-UDP-glukoziltransferazu. Upravo promjene u ekspresiji gena na nivou transkripcije predstavljaju glavni faktor u reprogramiranju metabolizma ugljikohidrata.
Pod uticajem HS na sadnice Arabidopsis ustanovljeno je sinhrono povećanje veličine bazena niza aminokiselina i amida (asparagin, leucin, izoleucin, treonin, alanin i valin) dobijenih iz AP i PVA. Osim toga, povećan je sadržaj ugljikohidrata: maltoze, saharoze, galaktinola, mioinozitola, rafinoze i monosaharida, prekursora ćelijskog zida. Već nakon 6 sati povećane su koncentracije b-alanina, glicerola, maltoze, saharoze i trekaloze.
Fotosinteza, transpiracija i disanje. Indikator koji je usko povezan sa regulacijom metabolizma CO2 i H2O u biljkama je stomatalna provodljivost. Opsežni dokazi sugeriraju da visoke temperature izazivaju zatvaranje stomata, što se može smatrati indirektnim odgovorom na temperaturnu ovisnost deficita tlaka vodene pare i disanja listova. Dakle, djelomično zatvaranje stomata je posljedica povećanja intracelularne koncentracije CO2. Međutim, željeno zatvaranje stomata ne dovodi do smanjenja fotosinteze, jer se temperaturne ovisnosti stomatalne provodljivosti i IF ne poklapaju. Stoga se provodljivost stomata povećava na temperaturama gdje je fotosinteza nepovratno inhibirana.
Iako se čini da stomatalna provodljivost ne utječe direktno na IF, ona pomaže u regulaciji transpiracije, koja kontroliranjem temperature listova utječe na toplotnu toleranciju fotosinteze. U usjevima nekih usjeva, sa dovoljnom vlagom, temperatura zraka zbog termoregulacije može biti skoro 8 °C niža od temperature zraka iznad usjeva. Istovremeno, kada postoji manjak vlage u zemljištu, može se uočiti suprotna slika - temperatura listova u usjevu premašuje temperaturu okolnog zraka za skoro 15 °C, što pojačava negativan uticaj nedostatka vode na IF.
Stopa neto fotosinteze pšenice i većine C3 useva je prilično stabilna u rasponu od 15-30 °C. Ispod i iznad ovog temperaturnog opsega, IF se smanjuje za 5-10% za svaki stepen (slika 3.1). Relativno mala promjena neto fotosinteze u rasponu od 15-30 °C ne bi trebala sakriti činjenicu da se bruto fotosinteza zapravo povećava s povećanjem temperature. Međutim, zbog istovremenog povećanja ID-a cijele biljke, a posebno fotorespiracije, intenzitet neto fotosinteze se malo mijenja.
Primjetne su razlike između C3 i C4 usjeva u tom pogledu, pri čemu je optimalan intenzitet neto fotosinteze kod C4 vrsta uočen na višim temperaturama (30-40 °C). Njihova fotorespiracija je beznačajna, zbog čega povećanje fiksacije CO2 s porastom temperature nije maskirano fotorespiratornim troškovima. Zaista, viši temperaturni optimum za neto fotosintezu kod C4 vrsta u poređenju sa C3 vrstama objašnjava se nižim respiratornim troškovima na povišenim temperaturama u prvim vrstama. Nepovratne promjene u njihovom fotosintetskom aparatu uočavaju se tek kada temperatura pređe 40 °C, uglavnom zbog oštećenja PS II koje nastaje u roku od nekoliko minuta nakon početka djelovanja HS, što presudno utiče na prinos.