Uvod.
Karcinogeneza je višefazni proces nakupljanja mutacija i drugih genetskih promjena koje dovode do poremećaja ključnih staničnih funkcija, kao što su regulacija proliferacije i diferencijacije, prirodna stanična smrt (apoptoza), morfogenetske reakcije stanice, a vjerojatno i neučinkovito djelovanje specifičnih i nespecifičnih čimbenika antitumorske imunosti. Samo kombinacija takvih promjena, stečenih, u pravilu, kao rezultat prilično duge evolucije neoplastičnih klonova, tijekom kojih dolazi do odabira stanica s potrebnim karakteristikama, može osigurati razvoj maligne neoplazme. Vjerojatnost da se u jednoj stanici dogodi nekoliko genetskih promjena naglo se povećava kada se poremete sustavi koji kontroliraju cjelovitost genoma. Stoga su mutacije koje dovode do genetske nestabilnosti također sastavni stadij progresije tumora. Štoviše, neke kongenitalne anomalije genetskih kontrolnih sustava faktor su koji unaprijed određuju neizbježnu pojavu neoplazme: one toliko povećavaju vjerojatnost pojave raznih onkogenih mutacija u svakoj stanici tijela da pojedinac, prije ili kasnije, u nekoj od stanice proliferirajućeg klona, pod selekcijskim pritiskom, nužno će akumulirati potrebnu kombinaciju promjena i formirat će se tumor.
Značajan napredak u razumijevanju mehanizama karcinogeneze povezan je s otkrićem najprije onkogena i protonkogena, a zatim - supresori tumora I mutatorski geni. Onkogeni su stanični ili virusni (koje virus unosi u stanicu) geni čija ekspresija može dovesti do razvoja tumora. Protoonkogeni su normalni stanični geni, čije ih poboljšanje ili modifikacija funkcije pretvara u onkogene. Supresori tumora (antionkogeni, recesivni tumorski geni) su stanični geni, čija inaktivacija naglo povećava vjerojatnost tumora, a obnova funkcije, naprotiv, može suzbiti rast tumorskih stanica. Treba napomenuti da su takozvani geni "mutatori" klasificirani kao supresori tumora, tj. geni čija disfunkcija na ovaj ili onaj način povećava stopu pojavljivanja mutacija i/ili drugih genetskih promjena ne moraju utjecati na rast neoplastičnih stanica. Međutim, njihova inaktivacija toliko povećava vjerojatnost raznih onkogenih mutacija da nastanak tumora postaje samo pitanje vremena.
Pripadnost onkogenima ili tumor supresorima određuje nekoliko kriterija: a) prirodna priroda promjena u strukturi i/ili ekspresiji određenog gena u stanicama pojedinih ili različitih neoplazmi; b) pojava u mladoj ili mladoj dobi određenih oblika tumora kod pojedinaca s nasljednim germinalnim (tj. koje se javljaju u zametnim stanicama) mutacijama određenog gena; c) naglo povećanje učestalosti tumora u transgenih životinja, bilo da izražavaju aktivirani oblik danog gena - u slučaju onkogena, ili nose inaktivirajuće mutacije ("nokaute") danog gena - u slučaju supresora tumora ; d) sposobnost izazivanja morfološke transformacije i/ili neograničenog rasta (onkogeni) u stanicama uzgojenim in vitro, ili supresije rasta stanica i/ili težine znakova transformacije (supresori tumora).
Posljednja dva desetljeća obilježena su brzim otkrivanjem sve više i više novih onkogena i supresora tumora. Do danas je poznato stotinjak potencijalnih onkogena (staničnih i virusnih) i oko dvadesetak tumorskih supresora. Opisani su genetski događaji koji dovode do aktivacije protoonkogena ili inaktivacije tumorskih supresora. Otkriveno je da je mehanizam djelovanja virusnih onkogena povezan s aktivacijom staničnih protoonkogena (retrovirusa) ili inaktivacijom tumorskih supresora ( DNA virusi) . Utvrđene su promjene u onkogenima i tumor supresorima, karakterističnim za pojedine oblike humanih tumora, uključujući i vrlo specifične anomalije koje se koriste za dijagnozu (tablice 1, 2).
Stol 1.
Neke promjene u protoonkogenima karakteristične za ljudske tumore
| Protoonkogen | Funkcija proteina | Promjene | Neoplazme* |
| ERBB1 (EGF-R) | receptor tirozin kinaze | pojačanje i prekomjerna ekspresija gena | glioblastoma i drugih neurogenih tumora |
| ERBB2 (HER2) | receptor tirozin kinaze | rak dojke | |
| PDGF-Rb | receptor tirozin kinaze | kromosomske translokacije koje tvore kimerne gene TEL/PDGF-Rb, CVE6/PDGF-Rb, koji kodiraju trajno aktivirane receptore | kronična mijelomonocitna leukemija, akutna mijeloblastična leukemija |
| SRC | nereceptorska tirozin kinaza | mutacije u kodonu 531 koje ukidaju negativnu regulaciju aktivnosti kinaze | dio tumora debelog crijeva u kasnim stadijima |
| K-RAS, N-RAS, H-RAS | sudjeluje u prijenosu mitogenih signala i regulaciji morfogenetskih reakcija | mutacije na kodonima 12,13,61 uzrokujući stvaranje trajno aktiviranog GTP vezanog oblika Ras | 60-80% slučajeva raka gušterače; 25-30% raznih solidnih tumora i leukemija |
| PRAD1/ciklinD1 | regulira stanični ciklus | pojačanje gena i/ili prekomjerna ekspresija | rak dojke i žlijezda slinovnica |
| C-MYC | transkripcijski faktor, regulira stanični ciklus i aktivnost telomeraze | a) kromosomske translokacije koje pomiču gen pod kontrolom regulatornih elemenata imunoglobulinskih gena; b) amplifikacija i/ili prekomjerna ekspresija gena; mutacije koje stabiliziraju proteine |
a) Burkittov limfom b) mnogi oblici neoplazmi |
| CTNNB1 (beta-katenin) | a) transkripcijski faktor koji regulira c-MYC i ciklin D1; b) vezanjem za kadherin sudjeluje u stvaranju adhezivnih kontakata |
mutacije koje povećavaju količinu beta-katenina koji nije povezan s E-kadherinom, koji funkcionira kao faktor transkripcije | nasljedna adenomatozna polipoza debelog crijeva; |
| BCL2 | potiskuje apoptozu reguliranjem propusnosti mitohondrijskih i nuklearnih membrana | kromosomske translokacije koje pomiču gen pod kontrolom regulatornih elemenata imunoglobulinskih gena | folikularni limfom |
| ABL | regulira stanični ciklus i apoptozu | kromosomske translokacije koje dovode do stvaranja himernih BCR/ABL gena, čiji produkti stimuliraju staničnu proliferaciju i potiskuju apoptozu | sve kronične mijeloične leukemije, neke akutne limfoblastične leukemije |
| MDM2 | inaktivira p53 i pRb | pojačanje gena i/ili prekomjerna ekspresija | neki osteosarkomi i sarkomi mekih tkiva |
* Kurzivom su označeni nasljedni oblici bolesti koji nastaju mutacijama zametnih stanica. U drugim slučajevima dolazi do mutacija u somatskim stanicama koje stvaraju tumore
Tablica 2.
Oblici ljudskih tumora koji nastaju inaktivacijom određenih tumorskih supresora i mutatorskih gena
| Gen | Funkcija proteina | Neoplazme* |
| p53 | faktor transkripcije; regulira stanični ciklus i apoptozu, kontrolira cjelovitost genoma | Li-Fraumenijev sindrom a većina oblika sporadičnih tumora |
| INK4a-ARF | inhibicija Cdk4**, aktivacija p53** | nasljedni melanomi I |
| Rb | kontrolira ulazak u S fazu reguliranjem aktivnosti transkripcijskog faktora E2F | nasljedniretinoblastom |
| TbR-II | receptor tipa 2 za citokin TGF-b | nasljedni i sporadični karcinom debelog crijeva |
| SMAD2, SMAD 3 | prenose signal od aktiviranih TGF-b receptora do Smad4 | rak debelog crijeva, pluća, gušterače |
| SMAD4/DPC4 | faktor transkripcije; posreduje u djelovanju citokina TGF-b, što dovodi do aktivacije Cdk inhibitora - p21WAF1, p27KIP1, p15INK4b | juvenilna hamartomatozna polipoza želuca i crijeva; razni oblici sporadičnih tumora |
| E-kadherin | sudjeluje u međustaničnim interakcijama; inicira signalizaciju koja aktivira p53, p27KIP1 | nasljedni karcinom želuca te mnogi oblici sporadičnih tumora |
| Oklopni transporter | veže i uništava citoplazmatski beta-katenin, sprječava stvaranje beta-katenin/Tcf transkripcijskih kompleksa | nasljedna adenomatozna polipoza i sporadični tumori debelog crijeva |
| VHL | potiskuje ekspresiju gena VEGF (faktor rasta vaskularnog endotela) i drugih gena koji se aktiviraju tijekom hipoksije | von Hippel-Lindauov sindrom (višestruki hemangiomi); svijetlostanični karcinomi bubrega |
| WT1 | faktor transkripcije; vežući se za p53, modulira ekspresiju gena koji reagiraju na p53 | nasljedni nefroblastomi (Wilmsov tumor) |
| PTEN/MMAC1 | fosfataza; stimulira apoptozu suzbijanjem aktivnosti signalnog puta PI3K-PKB/Akt | Cowdenova bolest (višestruki hamartomi); mnogi sporadični tumori |
| NF1 (neurofibromin) | protein iz obitelji GAP; pretvara ras onkogen iz aktivnog u neaktivni oblik | neurofibromatoza tip 1 |
| NF2 (merlin) | sudjeluje u interakcijama između membrane i citoskeleta | neurofibromatoza tipa 2; sporadični meningeomi, mezoteliomi i drugi tumori |
| BRCA1 | povećava aktivnost p53 i drugih faktora transkripcije vezanjem na RAD51 uključen je u prepoznavanje i/ili popravak oštećenja DNA | razni oblici sporadičnih tumora |
| BRCA2 | faktor transkripcije s aktivnostima histon acetil transferaze; vezanjem na RAD51 sudjeluje u popravku DNA | nasljedni tumori dojke i jajnika; razni oblici sporadičnih tumora |
| MSH2, MLH1, PMS1, PMS2 | popravak nesparenih dijelova DNA (popravak mismatch-a) | nepolipozni rak debelog crijeva i jajnika; mnogi sporadični tumori |
*
Kurzivom su označeni nasljedni oblici bolesti koji nastaju mutacijama zametnih stanica.
**
INK4a/ARF lokus kodira dva proteina: p16 INK4a - inhibitor kinaza ovisnih o ciklinu Cdk4/6 i p19 ARF (Alternative Reading Frame) - produkt alternativnog okvira za čitanje koji, vezanjem p53 i Mdm2, blokira njihovu interakciju i sprječava degradaciju p53. Delecije i mnoge točkaste mutacije u INK4a/ARF lokusu istovremeno deaktiviraju supresorske aktivnosti oba ova proteina.
Međutim, dugo se vremena činilo da je znanje o svakom od onkogena ili supresora tumora diskretno, uglavnom nepovezano. Tek se posljednjih godina počela pojavljivati opća slika koja pokazuje da je velika većina poznatih protoonkogena i tumorskih supresora sastavni dio nekoliko zajedničkih signalnih putova koji kontroliraju stanični ciklus, apoptozu, cjelovitost genoma, morfogenetske reakcije i diferencijacija stanica. Očito, promjene u tim signalnim putovima u konačnici dovode do razvoja malignih tumora. pruža informacije o glavnim ciljevima onkogena i supresora tumora.
Antionkogeni (ili tumor supresorski geni) su geni koji kodiraju ključne regulatorne proteine, čiji gubitak dovodi do poremećaja kontrole stanične proliferacije. Većina identificiranih antionkogena u normalnim stanicama su regulatori (čimbenici) procesa stanične transkripcije gena, vjerojatno djelujući tako da pojačaju programe stanične diferencijacije za razliku od programa proliferacije.
Proteini kodirani skupinom supresorskih gena (p53, KB, C-LR! (p21), p15, p16, itd.) izravno su uključeni u proces stanične diobe, kontrolirajući njihov ulazak u jednu ili drugu fazu staničnog ciklusa. Gubitak Aktivnost takvih gena u konačnici izaziva nereguliranu staničnu proliferaciju.
Dakle, uz aktivaciju onkogena, poremećaji u funkcioniranju tumor supresorskih gena odlučujući su u pokretanju tumorogenih procesa, utječu na napredovanje staničnog ciklusa, regulaciju diferencijacije i programirane stanične smrti, tj. prirodni proces njihove smrti, tzv. apoptoza. Ako većina promijenjenih protoonkogena djeluje kao dominantni čimbenik s genetske točke gledišta, tumor supresorski geni obično djeluju recesivno.
Strukturne i funkcionalne promjene kod tumor supresora, kao i kod onkogena, mogu biti rezultat točkastih mutacija u kodirajućim i regulatornim regijama gena, insercija ili delecija koje uzrokuju poremećaje u procesu čitanja proteina, promjena u njihovoj konfiguraciji ili modulacije ekspresije proteina (stvaranje proizvoda tijekom stanične sinteze). Gubitak funkcija anti-^ncogena u tumorskim stanicama javlja se kao
obično kao rezultat inaktivacije oba alela. Pretpostavlja se da gubitak jednog alela kao rezultat delecije stvara mogućnost fatalnih recesivnih mutacija u preostalom (Knudsenova teorija). Ali postoje iznimke od ovog pravila: na primjer, za p53 je pokazano postojanje mutacija s dominantnim svojstvima. Germinalne (nasljedne) recesivne mutacije jednog od dva antionkogena alela mogu biti osnova nasljedne sklonosti za rak.
Eksperimentalne studije su utvrdile da se inaktivacija antionkogena kao rezultat istovremenih poremećaja u odgovarajućim lokusima uparenih kromosoma (mutacije u jednom i delecije u drugom) može eliminirati uvođenjem alela divljeg tipa (tj. strukturno nepromijenjenog, netaknutog) , koji je osnova za znanstvena dostignuća u području genskih _terall_n tumora_.
Uz gubitak funkcije gena kao rezultat mutacije ili brisanja, može doći do inaktivacije α-supresorskog gena zbog hipermetilacije sekvence DNA koja kodira gen. Ovo je karakteristična metoda inaktivacije određenih gena iz skupine inhibitora kinaza koji reguliraju slijed i brzinu faza staničnog ciklusa, primjerice p/6 i p15.
Trenutačno je vrlo raširena potraga za tumor supresorskim genima.
Specifične delecije određenih kromosomskih regija identificirane su u različitim vrstama tumora. Odnos takvih brisanja s razvojem tumora često se naziva "funkcionalni gubitak gena supresora tumora".
Za identifikaciju kromosomskih regija za koje se tvrdi da su potencijalni anti-onkogeni, naširoko se koristi probir heterozigotnih delecija. Brisanje jednog od heterozigotnih alela može se otkriti tijekom komparativne analize RSC proizvoda (po!utegave
cNat geasTtp) ili KET.P (gea^psIop Gga^tep! 1en§Y ro1utogPet) normalne i tumorske DNA tijekom elektroforetskog odvajanja. Gubitak heterozigotnosti (1oz8 o!" be1er21205Yu - bOH) smatra se gubitkom jednog od dva alela u DNK tumora u usporedbi s DNK normalne somatske stanice.
Trenutno je poznato nešto više od deset antionkozena. Poremećaji u antionkogenima javljaju se u približno 90% ljudskih tumora. Za svaki specifičan tumor, spektar genetskih promjena je individualne prirode, ali ipak se uočavaju određeni obrasci u kršenjima pojedinih gena ili njihovih skupina, što daje razloge za njihovo povezivanje s razvojem ili prirodom progresije određene patologije. Jedan od preduvjeta za rast tumora je poremećaj regulacije diobe stanica. Treba naglasiti da se promjene u složenom lancu kontrole staničnog ciklusa, posredovane sudjelovanjem jednog ili drugog tumorskog supresora, mogu pojaviti u različitim fazama ciklusa i biti povezane s razvojem različitih histoloških tipova tumora.
U ovom poglavlju govori se o trenutno najpoznatijim tumor supresorskim genima, mogućim mehanizmima njihova djelovanja i sudjelovanju u proliferativnim procesima.
Gen p53 jedan je od najproučavanijih predstavnika skupine supresorskih gena koji trenutno igraju važnu ulogu u indukciji i progresiji tumorskog rasta. Multipotentni gen p53 uključen je u niz važnih procesa u životu stanice. Lokaliziran je na kromosomu 17 (17p13) i kodira transkripcijski faktor koji osigurava proizvodnju i funkcioniranje proteina koji kontroliraju diobu stanica. U proteinu p53 mogu se razlikovati tri regije: I-terminalna regija koja sadrži transkripcijsku aktivacijsku domenu, središnja regija koja sadrži specifičnu DNA-veznu domenu i C-terminalna regija koja sadrži multifunkcionalnu domenu [19].
Tijekom rasta i diobe normalnih stanica postoji stalna akumulacija kršenja primarne strukture DNA kao rezultat prirodne mutageneze ili grešaka u procesu njezinog udvostručavanja (replikacija DNA). Poseban sustav za njihovo uklanjanje, uključujući lanac proteina za popravak, djeluje u određenim fazama staničnog ciklusa. Indukcija p53 uzrokuje zaustavljanje staničnog ciklusa nakon čega slijedi popravak oštećenja ili prirodna stanična smrt, čime se sprječava narušavanje integriteta genoma i stjecanje fenotipa tumora.
Protein p53 kontrolira ispravno napredovanje staničnog ciklusa na nizu kontrolnih točaka (slika 3.1). Put koji vodi do kašnjenja staničnog ciklusa u fazi 01, gdje jedna od središnjih uloga pripada genu IUAP1 (p21), više je proučavan. Gen p53 aktivira transkripciju proteina p21 koji je jedan od inhibitora kompleksa ciklinaza kinaze (CKA) - regulatora staničnog ciklusa. U ovom slučaju p53 ne samo da je uključen u regulaciju faze 01, već također sudjeluje u regulaciji faze 02 i same mitoze. Kao odgovor na poremećaje u procesu dupliciranja DNA na kontrolnoj točki ulaska u fazu 02 ili kao odgovor na poremećaje u formiranju mitotskog vretena na kontrolnoj točki mitoze, dolazi do indukcije p53.
Osim toga, sam p53 regulira popravak i replikaciju DNA izravnim vezanjem na niz proteina uključenih u procese DNA. Točan put koji povezuje oštećenje DNK i aktivaciju p53 nije poznat. Pretpostavlja se da uključuje produkte supresorskog gena BKCA1 (Lgeas! kanser azoaaGec! §epe I), kao i ATM protein (a(ax1a 1e1an§]ec:a5]a &epe), koji "prepoznaje" oštećenje u DNA i aktivira p53 (Slika, 3.2).
Druga posljedica aktivacije p53 je prirodna, programirana stanična smrt ili aptoza. Gen p53 može izazvati apoptozu, povezanu ili nepovezanu s aktivacijom transkripcije ciljnih gena. U prvom slučaju p53 aktivira transkripciju gena BAX i sličnih gena koji inhibiraju proteine koji imaju antiapoptotski učinak (primjerice, onkogen BCL-2). Osim toga, p53 aktivira transkripciju gena MBM2, čiji produkt, vezanjem na protein p53, inhibira njegovu sposobnost da aktivira transkripciju drugih ciljnih gena, čime osigurava negativnu samoregulaciju. Pokazalo se da indukcija p53 uzrokuje zaustavljanje staničnog ciklusa na 01 ili apoptozu ovisno o nizu čimbenika od kojih su najvažniji vrsta stanice, koncentracija faktora rasta, razina ekspresije supresorskih gena KB, AIR i (ili) faktor transkripcije E2P, ekspresija niza virusnih proteina, itd. .
Inaktivacija p53 daje stanicama veću selektivnu prednost u proliferaciji. Poremećena funkcija p53 kao rezultat točkastih mutacija, delecija, stvaranja kompleksa s drugim staničnim regulatorom ili promjena unutarstanične lokalizacije dovodi do gubitka supresivnih svojstava i potiče tumorski proces. Proučavajući tumore različite histogeneze, utvrđeno je da su u velikom postotku slučajeva oba p53 alela inaktivirana - jedan kao rezultat točkastih mutacija, drugi kao rezultat delecija.
mutacije p53 najčešći su genetski poremećaj zabilježen kod raznih tumora
| VKSA1 |
| bankomat |
| r27K!R1 |
| Ts1SH1IN [>-Ss1K4/6 Ciklin E-S |
Genom sadrži gene koji inhibiraju proliferaciju stanica i imaju antionkogeni učinak. Gubitak takvih gena u stanici može dovesti do razvoja raka. Najviše proučavani antionkogeni su p53 i Rb.
Rb gen se može izgubiti kod retinoblastoma (učestalost retinoblastoma je jedan slučaj na 20 tisuća djece). 60% retinoblastoma razvija se sporadično, a 40% je klasificirano kao nasljedni tumori s autosomno dominantnim tipom nasljeđivanja. S nasljednim Rb defektom, drugi alel je normalan, pa je razvoj tumora moguć samo uz istodobno oštećenje drugog (normalnog) Rb gena. Kod spontano razvijenog retinoblastoma, gubitak Rb utječe na oba alela odjednom.
P53 supresorski gen nazvan je molekulom 1995. Postoje "divlji" (nepromijenjeni) i mutirani oblici p53 antionkogena. U tumorskim stanicama mnogih vrsta karcinoma nalazi se nakupljanje jednog od ovih oblika p53 u prekomjernim količinama, što remeti regulaciju staničnog ciklusa i stanica dobiva sposobnost ubrzane proliferacije.
Regulacija stanične proliferativne aktivnosti primjenom str 53 nastaje pojačavanjem ili slabljenjem apoptoze. Aktivacija str 53 na pozadini aktivacije staničnih onkogena c-fos I c-myc uzrokuje smrt tumorskih stanica, što se opaža kada je tumor izložen kemoterapiji i zračenju. Mutacije str 53 ili njegovu inaktivaciju drugim sredstvima u pozadini povećane ekspresije c-fos, c-myc I bcl 2, naprotiv, dovode do povećane proliferacije stanica i maligne transformacije.
TUMORSKI MARKERI
Tradicionalne morfološke studije, u pravilu, omogućuju točnu dijagnozu diferenciranih tumora i njihovih metastaza. Za slabo diferencirane i nediferencirane maligne tumore koriste se metode istraživanja koje omogućuju dijagnosticiranje promjena na ultrastrukturnoj i molekularno genetskoj razini. U tu svrhu koriste se različite molekularno biološke i morfološke metode (PCR, hibridizacija in situ, blot i citogenetička analiza, imunohistokemijske metode, elektronska mikroskopija), omogućujući identificiranje biomolekularnih markera tumora.
Tumorski markeri su kromosomske, genske i epigenomske pregradnje u tumorskim stanicama koje omogućuju dijagnosticiranje tumora, određivanje stupnja rizika te predviđanje tijeka i ishoda bolesti. Biomolekularni tumorski markeri su uži pojam koji objedinjuje samo markere proteinske prirode.
Među biomolekularnim markerima izdvajaju se markeri stanične diferencijacije (histo- i citogenetski) te markeri tumorske progresije (proliferacija, apoptoza, invazivni rast i metastaze).
Markeri stanične diferencijacije. Različiti tipovi stanica imaju različite skupove diferencijacijskih antigena ili imunoloških fenotipova. Ekspresija mnogih diferencijacijskih antigena ovisi o stupnju zrelosti (diferencijacije) tumorske stanice. Dakle, markeri diferencijacije stanica omogućuju procjenu ne samo histo- i citogeneze tumora, već i razine njegove diferencijacije i funkcionalne aktivnosti tumorskih stanica. Većina poznatih markera diferencijacije pripada strukturnim proteinima (proteini citoskeleta), enzimima, produktima sekrecije (hormoni, imunoglobulini, mucini), antigenima stanične površine i komponentama međustaničnog matriksa. Poznati su i proteinski tumorski markeri koje sintetizira samo embrionalno tkivo (α-fetoprotein) i specifični tumorski antigeni (na primjer, antigeni melanoma).
Markeri progresije tumora. Markeri stanične proliferacije naširoko se koriste za dijagnozu, prognozu i liječenje tumora. Postoje mnoge morfološke metode koje omogućuju identifikaciju stanica u različitim fazama mitotskog ciklusa.
◊ Brojanje broja mitoza svjetlosnom mikroskopijom DNA cito- i histopotometrijom, kao i protočnom fotometrijom - određivanje postotka stanica u mitotskoj fazi (mitotski indeks M).
◊ Korištenje radioaktivne oznake (timidin, bromoksiuridin) - identificiranje stanica u S, G 2, M fazama.
◊ Nedavno se koristi imunohistokemijska detekcija antigena mitotskog ciklusa: Ki-67 (OMIM *176 741, antigen proliferirajućih stanica MKI67, određen komercijalnim monoklonskim antitijelima KIA), PCNA (OMIM *176 740, nuklearni antigen proliferirajućih stanica PCNA, također poznat kao dodatne protein d DNA polimeraze), str 105, CDK-2, cdE. PCNA ima najveći raspon, omogućujući detekciju stanica u gotovo svim fazama mitotskog ciklusa. Nasuprot tome, selektin (CD62) označava samo stanice koje se ne dijele.
◊ Mogućnost apoptoze u tumorskim stanicama dokazuje ekspresija mnogih markera: CD95, receptori za TNF-α, TGF-β, kaspaze, Apaf-1, proapoptotični članovi obitelji bcl 2, citokrom C, str 53. Međutim, o završenoj apoptozi možemo govoriti samo uz karakterističnu fragmentaciju DNA, detektiranu metodom označavanja in situ(TUNEL test) Mjesta loma DNA, kao i fragmentacija PARP(poli-ADP-riboza polimeraza, poli-ADP-riboza polimeraza) ili detekcija fosfatidilserina na vanjskoj površini stanične membrane apoptotičkih tjelešaca (Anexin test).
Za nastanak tumora kod ljudi nije dovoljna samo aktivacija onkogena, jer nekontroliranu diobu stanica sprječavaju supresorski geni (Rb, p-53, APC geni) koji osiguravaju zaustavljanje stanične mitoze na kontrolnim točkama. Na prvoj kontrolnoj točki dolazi do popravka oštećenja DNK jer kontrolni mehanizam G1/S blokira replikaciju DNK. Kada su procesi popravka poremećeni, inducira se apoptoza. Na drugoj kontrolnoj točki, kontrolni mehanizam G2/M inhibira mitozu dok replikacija ne završi.
To osigurava stabilnost genoma. U slučaju mutacija, supresorski geni dobivaju recesivnu osobinu na oba alela, aktivnost njihovih proteina naglo se smanjuje, stanica s genetskim oštećenjem ostvaruje svojstvo nekontrolirane reprodukcije i stvara klon sličnih potomaka. Objašnjenje za nastanak recesivnih supresorskih gena dao je Knudson, koji je predložio hipotezu karcinogeneze poznatu kao teorija “dva udarca”. Njegova suština je sljedeća: jedan alel recesivnog supresorskog gena naslijeđen je od roditelja ("prvi udarac"), a drugi je rezultat mutacije ("drugi udarac"). Knudsonovu hipotezu potvrđuju citogenetske ili molekularne studije nekih tumora.
7. Uloga u karcinogenezi gena koji reguliraju popravak DNA i apoptozu.
Tijekom karcinogeneze, mutacije gena odgovornih za popravak DNA i apoptozu, dovodeći do smanjenja aktivnosti odgovarajućih enzima, doprinose povećanju nestabilnosti genoma tumorske stanice. Osim toga, uz nekontrolirano razmnožavanje, zbog niske aktivnosti ili nestanka gena,
regulirajući apoptozu (bcl-2, bac), dolazi do naglog porasta broja tumorskih stanica.
8. Odnos tumora i tijela. Paraneoplastični sindrom. Mehanizmi antitumorske rezistencije organizma.
Odnos između tumora i tijela vrlo je raznolik i kontradiktoran. S jedne strane, organizam, koji je vanjska sredina za tumor, stvara potrebne uvjete za njegovo postojanje i rast (osiguravajući npr. opskrbu krvlju), as druge strane, suprotstavlja se njegovom razvoju većim ili manji uspjeh.
Razvoj tumora je interaktivan proces (akcije "agresije" tumora izmjenjuju se s reaktivnim "protumjerama" tijela). Ishod ove borbe predodređen je ogromnim potencijalom "agresivnosti" tumora, s jedne strane, i ograničenim zaštitnim resursima tijela, s druge strane.
Imunološka zaštita. Ne pretvara se svaki klon tumorskih stanica koji nastane u tijelu u maligni tumor. Tijelo ima određena, iako ograničena, sredstva protudjelovanja. U prvim fazama djeluje sustav takozvane prirodne nespecifične otpornosti, sposoban eliminirati mali broj (od 1 do 1000) tumorskih stanica. To uključuje prirodne stanice ubojice - velike zrnate limfocite, koji čine 1 do 2,5% ukupne populacije perifernih limfocita, te makrofage. Specifična antitumorska imunost obično se razvija prekasno i nije jako aktivna. Spontani tumori kod životinja i ljudi slabo su antigeni i lako svladavaju ovu barijeru. Međutim, čini se da u nekim slučajevima može igrati značajnu ulogu.
Paraneoplastični sindrom je manifestacija generaliziranog učinka tumora na tijelo. Njegovi oblici su različiti - stanje imunosupresije (povećana sklonost zaraznim bolestima), sklonost povećanom zgrušavanju krvi, kardiovaskularno zatajenje, mišićna distrofija, neke rijetke dermatoze, smanjena tolerancija glukoze, akutna hipoglikemija kod velikih tumora i drugo. Jedna od manifestacija paraneoplastičnog sindroma je tzv
rak kaheksija (opća iscrpljenost tijela), koja se javlja u razdoblju blizu terminalnog stadija i često se opaža kod raka želuca, gušterače i jetre
Karakterizira je gubitak tjelesne težine, uglavnom zbog pojačane razgradnje bjelančevina skeletnih mišića (djelomično miokarda, kao i iscrpljivanje masnih depoa, praćeno odbojnošću prema hrani (anoreksija) i promjenama okusa. Jedan od uzroka kaheksije je povećana (ponekad za 20-50 %) potrošnja energije, očito zbog hormonske neravnoteže.
Mehanizmi antitumorske rezistencije mogu se uvjetno podijeliti prema stadiju i faktoru karcinogeneze u tri glavna generalizirana tipa:
1. Antikancerogeno, usmjereno na stupanj interakcije kancerogenog (uzročnog) faktora sa stanicama, organelama, makromolekulama.
2. Antitransformacija, usmjerena na fazu transformacije normalne stanice u tumorsku stanicu i njezinu inhibiciju.
3. Anticelularni, usmjeren na fazu transformacije formiranja pojedinačnih tumorskih stanica u staničnu koloniju - tumor.
Antikarcinogeni mehanizmi predstavljeni su u tri skupine. Grupa 1 uključuje antikarcinogene mehanizme koji djeluju protiv kemijskih kancerogenih čimbenika:
1. Reakcije inaktivacije karcinogena: a) oksidacija pomoću nespecifičnih oksidaza mikrosoma, na primjer policikličkih ugljikovodika; b) redukcija pomoću mikrosomalnih reduktaza, na primjer aminoazo bojila - dimetilaminoazobenzen, o-aminoazotoluen; c) dimetilacija - enzimska i neenzimska; d) konjugacija s glukuronskom ili sumpornom kiselinom pomoću enzima (glukuronidaza sulfataza);
2. Eliminacija ezo- i endogenih kancerogenih agenasa iz tijela u sastavu žuči, fecesa, urina;
3. Pinocitoza i fagocitoza kancerogenih agenasa, praćena njihovom neutralizacijom;
4. Stvaranje antitijela protiv karcinogena kao haptena;
5. Inhibicija slobodnih radikala antioksidansima.
2. skupina uključuje antikarcinogene mehanizme koji djeluju protiv bioloških etioloških čimbenika - onkogenih virusa:
1. Inhibicija onkogenih virusa interferonima;
2. Neutralizacija onkogenih virusa specifičnim antitijelima. Treću skupinu antikarcinogenih mehanizama predstavljaju mehanizmi koji djeluju protiv fizičkih kancerogenih čimbenika - ionizirajućeg zračenja. Glavne među njima su reakcije inhibicije stvaranja i inaktivacije slobodnih radikala (antiradikalne reakcije) te lipida i vodikovih peroksida (antiperoksidne reakcije), koji su, očito, “posrednici” preko kojih ionizirajuće zračenje, barem dijelom, ostvaruje svoj učinak izazivanja tumora.utjecaj. Antiradikalne i antiperoksidne reakcije osiguravaju vitamin E, selen, glutation-disulfidni sustav (koji se sastoji od reduciranog i oksidiranog glutationa), glutation peroksidaza (razgrađuje lipide i vodikov peroksid), superoksid dismutaza koja inaktivira superoksidni anionski radikal, katalaza koja razgrađuje vodikov peroksid.
Antitransformacijski mehanizmi
Zbog ovih mehanizama, transformacija normalne stanice u tumorsku stanicu je inhibirana.
To uključuje:
1. Antimutacijski mehanizmi, koji su funkcija staničnih enzimskih sustava za popravak DNA, eliminaciju oštećenja, “grešaka” DNA (gena) i time održavanje homeostaze gena; 2. Antionkogeni mehanizmi, koji su funkcija posebnih staničnih gena – antagonista onkogena te se stoga nazivaju antionkogeni. Njihovo djelovanje svodi se na suzbijanje reprodukcije stanica i poticanje njihove diferencijacije. O prisutnosti antionkogena u normalnim stanicama svjedoče pokusi skupine E. Stanbridgea i suradnika. Uveli su normalni kromosom (11. par iz ljudske stanice) u stanicu Williamsovog tumora. Kao rezultat toga, tumorske stanice su se transformirale u normalne stanice. Neizravni argument u korist antionkogena je nepostojanje takvog gena (tzv. Rb gena) u 13. paru kromosoma u stanicama retinoblastoma iu njihovim normalnim prekursorima - stanicama mrežnice.
Anticelularni mehanizmi
Ti se mehanizmi aktiviraju od trenutka kada nastaju prve stanice blastoma. Oni su usmjereni na inhibiciju i uništavanje pojedinačnih tumorskih stanica i tumora u cjelini. Čimbenici koji uključuju anticelularne antitumorske mehanizme su antigena i “stanična” stranost tumora. Postoje dvije skupine anticelularnih mehanizama: imunogeni i neimunogeni
1. Imunogeni anticelularni mehanizmi su funkcije imunološkog sustava, koji provodi tzv. imunološki nadzor stalnosti antigenskog sastava tkiva i organa u tijelu. Dijele se na specifične i nespecifične.
Specifični imunogeni mehanizmi uključuju citotoksično djelovanje, inhibiciju rasta i uništavanje tumorskih stanica: a) imunološki T-killer limfociti; b) imunološki makrofagi uz pomoć čimbenika koje izlučuju: makrofag-lizin, lizosomalni enzimi, čimbenici komplementa, komponenta inhibicije rasta interferona, faktor nekroze tumora; c) K-limfociti, koji imaju Fc receptore za imunoglobuline i zbog toga pokazuju afinitet i citotoksičnost za tumorske stanice koje su obložene IgG. Nespecifični imunogeni mehanizmi. To uključuje nespecifične citotoksične učinke, inhibiciju i lizu tumorskih stanica: a) prirodne stanice ubojice (NK stanice), koje su, poput K-limfocita, vrsta limfocita kojima nedostaju karakteristični markeri T- i B-limfocita; b) nespecifično aktiviran (na primjer, pod utjecajem mitogena, PHA, itd.); c) nespecifično aktivirani makrofagi (npr. pod utjecajem BCG-a ili bakterija, endotoksina, osobito lipopolisaharida iz gamonegativnih mikroorganizama) uz pomoć čimbenika nekroze tumora (TNF), interleukina-1, interferona i dr. koje luče; d) “križna” antitijela.
2. Neimunogeni anticelularni čimbenici i mehanizmi.
Tu spadaju: 1) čimbenik nekroze tumora, 2) alogena inhibicija, 3) interleukin-1, 4) inhibicija keylona, 5) lipoprotein-inducirana karcinoliza, 6) kontaktna inhibicija, 7) labrocitoza, 8) regulacijski utjecaj hormona.
Faktor nekroze tumora. Proizvode ga monociti, tkivni makrofagi, T- i B-limfociti, granulociti, mastociti. Uzrokuje uništenje i smrt tumorskih stanica. Interlekin-1 (IL-1). Mehanizam djelovanja IL-1 protiv blastoma povezan je sa stimulacijom K-limfocita, T-limfocita ubojica, sintezom IL-2, što zauzvrat stimulira reprodukciju i rast T-limfocita (uključujući T-limfocite ubojice -limfociti), aktivacija makrofaga, stvaranje γ-interferona i , možda dijelom kroz pirogeno djelovanje. Alogena inhibicija. U odnosu na tumorske stanice, to je suzbijanje vitalne aktivnosti i njihovo uništavanje okolnim normalnim stanicama. Pretpostavlja se da je alogena inhibicija posljedica citotoksičnog učinka antigena histoinkompatibilnih metabolita i razlika u površini membrane Keylonova inhibicija. Keyloni su tkivno specifični inhibitori stanične proliferacije, uključujući tumorske stanice. Karcinoliza izazvana lipoproteinima. Karcinoliza je otapanje tumorskih stanica. Frakcija n-lipoproteina ima specifičan onkolitički učinak. Ova frakcija nema litički učinak na auto-, homo- i heterologne normalne stanice.
Kontaktno kočenje. Vjeruje se da su ciklički nukleotidi - ciklički adenozin-3,5-monofosfat (cAMP) i ciklički gvanozin-3,5-monofosfat (cGMP) - uključeni u provedbu fenomena kontaktne inhibicije.
Povećanje koncentracije cAMP aktivira kontaktnu inhibiciju. Protiv,
cGMP inhibira kontaktnu inhibiciju i potiče diobu stanica. Labrocitoza. Karcinogeneza je praćena povećanjem broja mastocita (mastocita) koji proizvode heparin, koji inhibira stvaranje fibrina na površini tumorskih stanica (fiksiranih i cirkulirajućih u krvi). To sprječava razvoj metastaza inhibiranjem transformacije embolusa stanica raka u stanični tromboembolus. Regulacijski utjecaj hormona. Hormoni imaju regulacijski učinak na otpornost tijela na antiblastome. Karakteristična značajka ovog učinka je njegova raznolikost, ovisno o dozi hormona i vrsti tumora. Postavlja se pitanje: zašto, unatoč tako moćnim anticelularnim mehanizmima usmjerenim protiv tumorske stanice, potonja često ustraje i pretvara se u blastom? To se događa jer uzročnici tumora istodobno (mnogo prije razvoja tumora) uzrokuju imunosupresiju. Nastali tumor, zauzvrat, sam potencira imunosupresiju. Treba napomenuti da imunosupresija koja je nastala izvan veze s djelovanjem karcinogena, na primjer, nasljedni T-imuni nedostatak (s Wiskott-Aldrichovim sindromom, itd.), kao i stečena (korištena tijekom transplantacije organa ili koja se razvija tijekom organa transplantacije ili razvoja tijekom liječenja citostaticima) naglo povećava rizik od razvoja tumora. Dakle, imunosupresija tijekom transplantacije organa povećava rizik od razvoja tumora za 50-100 puta. Brojni drugi fenomeni također sprječavaju uništenje i, naprotiv, potiču očuvanje tumorskih stanica: antigensko pojednostavljenje; reverzija antigena - pojava embrionalnih antigenskih proteina na koje tijelo ima urođenu toleranciju; pojava posebnih protutijela koja štite tumorske stanice od T-limfocita i nazivaju se "blokirajućim" protutijelima.
Ako proteini kodirani onkogenima pridonose razvoju, onda mutacije u tumor supresorski geni promiču malignost kroz drugačiji mehanizam i uz gubitak funkcije oba alela gena.
Tumor supresorski geni vrlo heterogena. Neki od njih zapravo suzbijaju tumore reguliranjem staničnog ciklusa ili izazivanjem inhibicije rasta kroz međustanični kontakt; Tumor supresorski geni ovog tipa su CCC, budući da izravno reguliraju rast stanica.
ostalo tumor supresorski geni, geni “domara”, uključeni su u popravak lomova DNK i održavaju cjelovitost genoma. Gubitak oba alela gena uključenih u popravak DNK ili kromosomski lom neizravno dovodi do raka, dopuštajući akumulaciju naknadnih sekundarnih mutacija, kako u protoonkogenima tako i u drugim genima za supresor tumora.
Većina proizvoda tumor supresorski geni istaknuto i opisano. Budući da geni supresori tumora i njihovi proizvodi štite od raka, nada se da će njihovo razumijevanje u konačnici dovesti do poboljšanih terapija protiv raka.
Tumor supresorski geni:
1. Tumor supresorski gen RB1: funkcije gena: sinteza p110, regulacija staničnog ciklusa. Tumori s genskom patologijom: retinoblastom, karcinom pluća malih stanica, rak dojke.
2.: funkcije gena: sinteza p53, regulacija staničnog ciklusa. Bolesti uzrokovane genskom patologijom: Li-Fraumeni sindrom, rak pluća, rak dojke, mnogi drugi.
3. Tumor supresorski gen DCC: funkcije gena: Dcc receptor, smanjeno preživljavanje stanica u nedostatku signala preživljavanja od njegovog neutrino liganda. Bolesti uzrokovane genskom patologijom: kolorektalni karcinom.
4. Tumor supresorski gen VHL: funkcije gena: sinteza Vhl, dio oblika kompleksa citoplazmatske destrukcije s APC, koji normalno, u prisutnosti kisika, inhibira indukciju rasta krvnih žila. Bolesti uzrokovane genskom patologijom: Hippel-Lindau sindrom, svijetlostanični karcinom bubrega.
5. Tumor supresorski geni BRCA1, BRCA2: funkcije gena: sinteza Brcal, Brca2, popravak kromosoma kao odgovor na dvostruke lomove DNA. Bolesti uzrokovane genskom patologijom: rak dojke, rak jajnika.
6. Tumor supresorski geni MLH1, MSH2: funkcije gena: sinteza Mlhl, Msh2, popravak nepodudarnosti nukleotida između lanaca DNA. Bolesti uzrokovane genskom patologijom: kolorektalni karcinom.