Βακτηριολογική μέθοδοςπεριλαμβάνει βακτηριοσκόπηση του υλικού από τον ασθενή, απομόνωση καθαρής καλλιέργειας του παθογόνου και ταυτοποίησή του με τον προσδιορισμό της ευαισθησίας στα αντιβιοτικά και τα φάρμακα χημειοθεραπείας.
Επιλογή υλικούγια τη βακτηριοσκοπική εξέταση εξαρτάται από την υποτιθέμενη αιτιολογία της νόσου, το στάδιο της νόσου, λαμβάνοντας υπόψη την παθογένεσή της, τις βιολογικές ιδιότητες του παθογόνου και άλλους παράγοντες.
1. Για μολυσματικές ασθένειεςπου εμφανίζεται με βακτηριαιμία (τύφος, γενικευμένες και σηπτικές μορφές σαλμονέλωσης). με σήψη οποιασδήποτε αιτιολογίας, που προκαλείται όχι μόνο από την πυογόνο μικροχλωρίδα του κόκκου, την Pseudomonas aeruginosa, αλλά και από τα σπανιότερα παθογόνα του (Serratia Salinaria, βακτήρια που δεν ζυμώνουν, αναερόβια, στρεπτόκοκκος μορφής L (μέθοδος Suknev) και άλλους μικροοργανισμούς), που καταφεύγουν σε αυτούς περιπτώσεις σε καλλιέργειες σε ειδικά θρεπτικά μέσα. Πρέπει να τονιστεί ότι η επιτυχία της συχνότητας και του φάσματος των παθογόνων που απομονώνονται από το αίμα και άλλα βιολογικά μυστικά του ασθενούς εξαρτώνται από την πολυμάθεια, την περιέργεια, την επιμονή και την επιμονή των εργαζομένων του βακτηριολογικού εργαστηρίου.
2. Εγκεφαλονωτιαίο υγρό (πυώδης μηνιγγίτιδα, φυματιώδης μηνιγγίτιδα με παρατεταμένη καλλιέργεια (πάνω από ένα μήνα) σε θρεπτικά μέσα ειδικά για την απομόνωση φυματιωδών βακτηρίων.
3. Πτύελα (οξεία πνευμονία και τραχειοβρογχίτιδα, φυματίωση, κοκκύτης, πανώλη, σπάνιες μορφές τυφοειδή πυρετό (πνευμοτύφος), λεγεωνέλλωση, αναπνευστική μυκοπλάσμωση και χλαμύδια).
4. Βλέννη, πύον από τις αμυγδαλές (στρεπτόκοκκη και σταφυλοκοκκική αμυγδαλίτιδα).
5. Πλάκα και βλέννα από τις αμυγδαλές, από το λαιμό και τη μύτη, έκκριση από τον επιπεφυκότα, τα γεννητικά όργανα (διφθερίτιδα).
6. Απόξεση από τον ρινικό βλεννογόνο (λέπρα).
7. Εκκρίσεις από τη μύτη και τον στοματοφάρυγγα (ιγμορίτιδα, οζένα, ρινοσκλήρωση).
8. Οιδηματώδες υγρό, κομμάτια προσβεβλημένων μυών, νεκρωτικοί ιστοί (αναερόβιες λοιμώξεις). έκκριση τραύματος (αλαντίαση, εάν είναι απαραίτητο, τέτανος).
9. Στίξη από διευρυμένους λεμφαδένες (φυματίωση, τοξοπλάσμωση).
10 Περιεχόμενα Carbuncle και στίγματα από πυώδεις λεμφαδένες (πανώλης, τουλαραιμία, σηψαιμία, άνθρακας).
Βακτηριολογικές μελέτεςσε περίπτωση ιδιαίτερα επικίνδυνων λοιμώξεων (πανώλης, τουλαραιμία, βρουκέλλωση, χολέρα (στην οποία εξετάζονται μόνο κόπρανα (!)) πραγματοποιούνται σε εργαστήρια ειδικού καθεστώτος, τα οποία αποκλείουν την πιθανότητα αυτομόλυνσης των υπαλλήλων της όταν εργάζονται με βακτηριακές καλλιέργειες και η εξάπλωση των παθογόνων παραγόντων εκτός αυτών των εργαστηρίων.
Ορολογικές μελέτες. Εισήχθησαν στην κλινική λίγο αργότερα από τη βακτηριολογική μέθοδο που πρότεινε ο R. Koch. Το 1896, ο F. Vidal ανακάλυψε ότι μέχρι το τέλος της 1ης εβδομάδας της νόσου, ο ορός του αίματος των ασθενών με τυφοειδή πυρετό αποκτά την ικανότητα να συγκολλά τον τυφοειδή βάκιλο, τον αιτιολογικό παράγοντα του τυφοειδούς πυρετού (θετική αντίδραση Vidal). Στην περίπτωση της πολυμικροβιακής αιτιολογίας μολυσματικών ασθενειών, μετά την ανακάλυψη του Vidal, άρχισαν επίσης να καταφεύγουν στον προσδιορισμό των τίτλων των συγκολλητινών του ορού σε διάφορους τύπους βακτηρίων που απομονώθηκαν από παθολογικό υλικό (η αυτοβίαση αντίδραση) και να ελέγχουν τη δυναμική τους ανάλογα με την στάδιο της νόσου. Οι υψηλότεροι τίτλοι συγκολλητινών σε έναν από τους τύπους μεμονωμένων βακτηρίων μαρτυρούν υπέρ της μεγαλύτερης αιτιολογικής συμμετοχής του στην ανάπτυξη της νόσου.
Ήδη στην αρχή εφαρμογές της αντίδρασης Vidalστην κλινική, παρατηρήθηκε ότι οι πιο σοβαρές μορφές, για παράδειγμα, ο τυφοειδής πυρετός, μπορεί να εμφανιστούν απουσία συγκολλητινών στο αίμα (αρνητική αντίδραση Vidal), γεγονός που υποδεικνύει τη σχετική διαγνωστική αξία αυτής της μεθόδου τόσο στον τυφοειδή πυρετό όσο και στον άλλες μολυσματικές ασθένειες. Αργότερα αντικαταστάθηκε από πιο ευαίσθητες ορολογικές μεθόδους. Αλλά η αξία προτεραιότητας της ανακάλυψης του Βιδάλ θα παραμείνει για πάντα.
Επί του παρόντος για ορολογική διάγνωσηβακτηριακές λοιμώξεις, χρησιμοποιούνται πιο ευαίσθητες μέθοδοι όταν το βακτηριακό αντιγόνο προσροφάται στην επιφάνεια των ερυθροκυττάρων (erythrocyte diagnosticums1). Έτσι, αναπτύχθηκαν θεμελιωδώς νέες ορολογικές εξετάσεις: άμεση (TPHA) και έμμεση αιμοσυγκόλληση (RIHA). Χρησιμοποιούνται ευρέως για ορολογική διάγνωση πολλών βακτηριακών, ιογενών και άλλων λοιμώξεων (τύφος, σαλμονέλωση, σιγκέλλωση, βρουκέλλωση, τουλαραιμία κ.λπ.). Η αντίδραση της κατακρήμνισης διατηρεί τη διαγνωστική της αξία σε ορισμένες ασθένειες (αλαντίαση και άνθρακας - η αντίδραση Ascoli για τη διάγνωσή της σε ζώα). Στην οροδιάγνωση χρησιμοποιείται ευρέως η αντίδραση στερέωσης του συμπληρώματος (RCC) που προτάθηκε το 1901 από τους Γάλλους ερευνητές Bordet και Zhangu (σύφιλη, γονόρροια, βρουκέλλωση, τοξοπλάσμωση, φυματίωση, λέπρα, αδένες). Το RSK είναι υψίστης σημασίας για την οροδιάγνωση ιογενών λοιμώξεων (γρίπη, άλλες οξείες ιογενείς λοιμώξεις του αναπνευστικού, έρπης, εγκεφαλίτιδα, παρωτίτιδα, ψιττάκωση κ.λπ.), καθώς και πολυάριθμες ρικετσιώσεις.
10385 0
Η χρήση της βακτηριολογικής μεθόδου καθιστά δυνατή την απομόνωση του παθογόνου σε μια καθαρή καλλιέργεια από το υλικό που λαμβάνεται από τον ασθενή και την ταυτοποίησή του με βάση τη μελέτη ενός συμπλέγματος ιδιοτήτων. Τα περισσότερα βακτήρια είναι ικανά να καλλιεργηθούν σε διάφορα τεχνητά θρεπτικά μέσα (εκτός από τα χλαμύδια και τη ρικέτσια), επομένως η βακτηριολογική μέθοδος είναι σημαντική για τη διάγνωση πολλών μολυσματικών ασθενειών.
Εάν επιτευχθεί θετικό αποτέλεσμα, η βακτηριολογική μέθοδος καθιστά δυνατό τον προσδιορισμό της ευαισθησίας του απομονωμένου παθογόνου σε αντιμικροβιακά φάρμακα. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα αυτής της μελέτης εξαρτάται από πολλές παραμέτρους, ιδίως από συνθήκες συλλογήςκαι το δικό του Μεταφοράστο εργαστήριο.
ΠΡΟΣ ΤΗΝ βασικές απαιτήσειςΟι απαιτήσεις για την επιλογή και τη μεταφορά υλικού για βακτηριολογική εξέταση περιλαμβάνουν:
- λήψη υλικού πριν από την έναρξη της ετιοτροπικής θεραπείας.
- τήρηση των συνθηκών στειρότητας κατά τη συλλογή υλικού.
- τεχνική ορθότητα συλλογής υλικού·
- επαρκή ποσότητα υλικού.
- εξασφάλιση του καθεστώτος θερμοκρασίας αποθήκευσης και μεταφοράς του υλικού.
- μείωση στο ελάχιστο χρονικό διάστημα μεταξύ της συλλογής του υλικού και της σποράς σε πυκνά θρεπτικά μέσα.
Η μεταφορά του υλικού στο εργαστήριο θα πρέπει να πραγματοποιείται το συντομότερο δυνατό, αλλά όχι περισσότερο από 1-2 ώρες μετά τη λήψη του. Τα δείγματα του υλικού πρέπει να βρίσκονται σε συγκεκριμένη θερμοκρασία. Ειδικότερα, κανονικά αποστειρωμένα υλικά (αίμα, εγκεφαλονωτιαίο υγρό) αποθηκεύονται και παραδίδονται στο εργαστήριο στους 37 °C. Τα μη αποστειρωμένα υλικά (ούρα, αναπνευστικές εκκρίσεις κ.λπ.) αποθηκεύονται σε θερμοκρασία δωματίου για όχι περισσότερο από 1-2 ώρες ή όχι περισσότερο από μία ημέρα στους 4 ° C (συνθήκες οικιακού ψυγείου). Εάν είναι αδύνατη η παράδοση δειγμάτων στο εργαστήριο εντός του προκαθορισμένου χρονικού πλαισίου, συνιστάται η χρήση μέσων μεταφοράς που έχουν σχεδιαστεί για τη διατήρηση της βιωσιμότητας των παθογόνων σε συνθήκες διατήρησης.
Αίμα για έρευναπρέπει να λαμβάνεται από τον ασθενή κατά την αύξηση της θερμοκρασίας του σώματος, στην αρχή της έναρξης του πυρετού. Συνιστάται η εξέταση 3-4 δειγμάτων αίματος που λαμβάνονται με μεσοδιάστημα 4-6 ωρών, γεγονός που είναι εύλογο από την άποψη της μείωσης του κινδύνου «έλλειψης» παροδικής βακτηριαιμίας και της αύξησης της ικανότητας επιβεβαίωσης του αιτιολογικού ρόλου της ευκαιριακής μικροχλωρίδας που απομονώνεται από το αίμα εάν αυτή η μικροχλωρίδα βρεθεί σε πολλά δείγματα του φλεβικού αίματος. Δείγμα αίματος σε ποσότητα 10 ml σε ενήλικα και 5 ml σε παιδιά εμβολιάζεται σε τουλάχιστον δύο φιαλίδια με μέσο για αερόβιους και αναερόβιους μικροοργανισμούς σε αναλογία 1:10. Μια ενιαία μελέτη του αρτηριακού αίματος είναι επίσης επιθυμητή.
Παίρνω εγκεφαλονωτιαίο υγρό(CSJ) παράγεται από γιατρό με οσφυονωτιαία παρακέντηση σε ποσότητα 1-2 ml σε στεγνό αποστειρωμένο σωληνάριο. Το δείγμα παραδίδεται αμέσως στο εργαστήριο, όπου ξεκινά άμεσα και η μελέτη του. Εάν αυτό δεν είναι δυνατό, το υλικό αποθηκεύεται στους 37 °C για αρκετές ώρες. Αυξάνει σημαντικά τον αριθμό των θετικών αποτελεσμάτων της βακτηριολογικής εξέτασης με σπορά 1-2 σταγόνων ΕΝΥ σε δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει ημι-υγρό μέσο με γλυκόζη και σε τρυβλίο Petri με άγαρ «αίματος». Για την αποστολή του υλικού, χρησιμοποιούνται ισοθερμικά κουτιά, θερμαντικά μαξιλάρια, θερμοσυσκευές ή οποιαδήποτε άλλη συσκευασία όπου η θερμοκρασία διατηρείται στους 37 °C περίπου.
Περιττώματαγια βακτηριολογική εξέταση λαμβάνονται με αποστειρωμένες ξύλινες σπάτουλες σε ποσότητα 3-5 g σε αποστειρωμένο δοχείο με ερμητικά κλειστό καπάκι. Η μελέτη του ληφθέντος υλικού θα πρέπει να ξεκινήσει το αργότερο 2 ώρες αργότερα.Εάν είναι αδύνατο να ξεκινήσει η μελέτη σε αυτό το διάστημα, θα πρέπει να επιλεγεί μια μικρή ποσότητα υλικού και να τοποθετηθεί σε κατάλληλο μέσο μεταφοράς. Κατά την επιλογή των περιττωμάτων, θα πρέπει να προσπαθήσουμε να στείλουμε παθολογικές ακαθαρσίες (βλέννα, πύον, επιθηλιακά σωματίδια κ.λπ.) για έρευνα, εάν υπάρχουν, αποφεύγοντας ακαθαρσίες αίματος με βακτηριοκτόνες ιδιότητες να εισέλθουν στο υλικό.
Για τη λήψη του υλικού, μπορούν να χρησιμοποιηθούν επιχρίσματα ορθού (με βαμβακερή άκρη). Το στυλεό θα πρέπει να υγραίνεται με αποστειρωμένο ισοτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου ή μέσο μεταφοράς (όχι γέλη λαδιού). Εισάγεται ανά ορθό σε βάθος 5-6 cm και, περιστρέφοντας το ταμπόν, αφαιρείται προσεκτικά, ελέγχοντας την εμφάνιση του χρώματος των κοπράνων στο ταμπόν. Το στυλεό τοποθετείται σε στεγνό δοκιμαστικό σωλήνα εάν η μελέτη του υλικού ξεκινήσει εντός 2 ωρών, διαφορετικά - στο μέσο μεταφοράς.
Ούρο(μέση μερίδα ελεύθερα απελευθερωμένων ούρων) σε ποσότητα 3-5 ml συλλέγεται σε αποστειρωμένο πιάτο μετά από σχολαστική τουαλέτα των εξωτερικών γεννητικών οργάνων. Είναι προτιμότερο να παίρνετε πρωινές μερίδες ούρων.
Χολήσυλλέγονται κατά τον ηχογράφημα του δωδεκαδακτύλου στην αίθουσα θεραπείας χωριστά στις μερίδες Α, Β και Γ σε τρεις στείρους δοκιμαστικούς σωλήνες, τηρώντας τους κανόνες της ασηψίας.
Πλύνετε το νερό του στομάχουσυλλέγονται σε αποστειρωμένα βάζα σε ποσότητα 20-50 ml. Θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι η πλύση στομάχου σε αυτές τις περιπτώσεις πραγματοποιείται μόνο με αδιάφορα (χωρίς βακτηριοστατική ή βακτηριοκτόνο δράση στους μικροοργανισμούς) διαλύματα - κατά προτίμηση βρασμένο νερό (χωρίς προσθήκη σόδας, υπερμαγγανικού καλίου κ.λπ.).
Πτύελο. Τα πρωινά πτύελα που απελευθερώνονται κατά τη διάρκεια μιας κρίσης βήχα συλλέγονται σε ένα αποστειρωμένο βάζο. Πριν από το βήχα, ο ασθενής βουρτσίζει τα δόντια του και ξεπλένει το στόμα του με βρασμένο νερό για να αφαιρέσει μηχανικά τα υπολείμματα τροφής, το απολεπισμένο επιθήλιο και τη μικροχλωρίδα της στοματικής κοιλότητας.
Νερό έκπλυσης των βρόγχων. Κατά τη βρογχοσκόπηση, εγχέεται όχι περισσότερο από 5 ml ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου, ακολουθούμενο από αναρρόφηση σε αποστειρωμένο σωλήνα.
Έκκριση του φάρυγγα, της στοματικής κοιλότητας και της μύτης. Το υλικό από τη στοματική κοιλότητα λαμβάνεται με άδειο στομάχι ή 2 ώρες μετά το φαγητό με ένα αποστειρωμένο βαμβάκι ή ένα κουτάλι από τον βλεννογόνο και τις πληγείσες περιοχές του στις εισόδους των αγωγών των σιελογόνων αδένων, στην επιφάνεια της γλώσσας, από πληγές. Εάν υπάρχει φιλμ, το τελευταίο αφαιρείται με αποστειρωμένο τσιμπιδάκι. Το υλικό από τη ρινική κοιλότητα λαμβάνεται με στεγνό αποστειρωμένο βαμβάκι, το οποίο εισάγεται βαθιά στη ρινική κοιλότητα. Το υλικό από το ρινοφάρυγγα λαμβάνεται με ένα αποστειρωμένο βαμβάκι οπίσθιου φάρυγγα, το οποίο εισάγεται προσεκτικά μέσω του ρινικού ανοίγματος στο ρινοφάρυγγα. Εάν ένας βήχας ξεκινήσει την ίδια στιγμή, το στυλεό δεν αφαιρείται μέχρι να τελειώσει ο βήχας. Για τη διεξαγωγή ανάλυσης για διφθερίτιδα, εξετάζονται ταυτόχρονα μεμβράνες και βλέννα από τη μύτη και τον φάρυγγα, λαμβάνοντας το υλικό με διαφορετικά επιχρίσματα.
Το υλικό δοκιμής εμβολιάζεται σε στερεά θρεπτικά μέσα χρησιμοποιώντας ειδικές τεχνικές για να επιτευχθεί η ανάπτυξη μεμονωμένων αποικιών μικροοργανισμών, οι οποίες στη συνέχεια κοσκινίζονται για να απομονωθεί μια καθαρή καλλιέργεια του παθογόνου.
Ορισμένοι τύποι βακτηρίων απομονώνονται χρησιμοποιώντας εκλεκτικά (επιλεκτικά) μέσα που επιβραδύνουν την ανάπτυξη ξένων μικροοργανισμών ή περιέχουν ουσίες που διεγείρουν την ανάπτυξη ορισμένων παθογόνων μικροβίων.
Μικροοργανισμοί που απομονώνονται σε θρεπτικά μέσα αναγνωρίζω, δηλ. να προσδιορίσουν το είδος ή τον τύπο τους. Πρόσφατα, για την ταυτοποίηση στην πρακτική της υγειονομικής περίθαλψης, χρησιμοποιούνται συστήματα μικροδοκιμών, τα οποία είναι πάνελ με ένα σύνολο διαφορικών διαγνωστικών περιβαλλόντων, γεγονός που επιταχύνει τη μελέτη. Τα συστήματα μικροδοκιμών χρησιμοποιούνται επίσης για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας των μικροοργανισμών στα αντιμικροβιακά φάρμακα με την αραίωση ενός αντιβιοτικού σε ένα υγρό θρεπτικό μέσο.
Κατά την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων μιας βακτηριολογικής μελέτης, ο γιατρός θα πρέπει να λάβει υπόψη ότι ένα αρνητικό αποτέλεσμα δεν σημαίνει πάντα την απουσία παθογόνου και μπορεί να σχετίζεται με τη χρήση αντιμικροβιακών, υψηλή μικροκτόνο δράση στο αίμα και τεχνικά σφάλματα. Η ανίχνευση ενός παθογόνου μικροβίου στο υλικό από έναν ασθενή, ανεξάρτητα από την κλινική εικόνα, είναι δυνατή σε περίπτωση αναρρώσεως, υγιούς ή παροδικού βακτηριοφορέα.
Η απομόνωση από το αίμα, με την επιφύλαξη όλων των κανόνων ασηψίας, παθογόνων μικροοργανισμών υπό όρους (Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli) και ακόμη και σαπρόφυτων θα πρέπει να θεωρείται εκδήλωση βακτηριαιμίας, ειδικά εάν αυτά τα μικρόβια βρίσκονται σε περισσότερα από ένα δείγματα υλικού ή σε διαφορετικά υποστρώματα ( αίμα, ούρα), αφού όταν μειώνεται η ανοσοαντιδραστικότητα του σώματος, αυτοί και άλλοι «μη παθογόνοι» μικροοργανισμοί μπορεί να είναι οι αιτιολογικοί παράγοντες μολυσματικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της σήψης.
Μια ορισμένη δυσκολία είναι ερμηνεία των αποτελεσμάτων της βακτηριολογικής εξέτασης μη αποστειρωμένων μέσων, δηλαδή την απόδειξη του αιτιολογικού ρόλου των ευκαιριακών μικροοργανισμών. Σε αυτήν την περίπτωση, λαμβάνονται υπόψη δείκτες όπως ο τύπος των απομονωμένων καλλιεργειών, ο αριθμός των μικροβιακών κυττάρων ενός δεδομένου τύπου στο υλικό, η επαναλαμβανόμενη απομόνωσή τους κατά τη διάρκεια της νόσου, η παρουσία μονοκαλλιέργειας ή σύνδεσης ενός μικροοργανισμού. σε ένα συγκρότημα.
Yushchuk N.D., Vengerov Yu.Ya.
26. Βακτηριολογική μέθοδος διάγνωσης λοιμωδών νοσημάτων.
Η βακτηριολογική μέθοδος συνίσταται στην απομόνωση μιας καθαρής καλλιέργειας του παθογόνου (πληθυσμός που περιέχει βακτήρια του ίδιου είδους) και η ταυτοποίηση αυτού του παθογόνου είναι η κύρια μέθοδος βακτηριολογικής έρευνας
Η μελέτη των ιδιοτήτων των μικροοργανισμών σε ένα βακτηριολογικό εργαστήριο προκειμένου να διαπιστωθεί ότι ανήκουν σε μια συγκεκριμένη συστηματική ομάδα (είδος, γένος) ονομάζεται ταυτοποίησή τους.
Γενικά, η μέθοδος βακτηριολογικής έρευνας είναι μια βακτηριολογική εξέταση πολλαπλών σταδίων, η οποία διαρκεί 18-24 ώρες.
Στη βακτηριολογική μέθοδο τοποθετούνται αναερόβιες καλλιέργειες στον αναερόστατο. Ο αέρας αφαιρείται από το μπαλόνι και αντικαθίσταται με ένα μείγμα αερίων που δεν περιέχει οξυγόνο.
Η βάση της βακτηριολογικής μεθόδου είναι η απομόνωση μιας καθαρής καλλιέργειας του παθογόνου, η οποία εμφανίζεται στο πρώτο στάδιο της μελέτης. Για να απομονωθεί μια καθαρή καλλιέργεια του παθογόνου, το υλικό που λαμβάνεται εμβολιάζεται. Η σπορά γίνεται, κατά κανόνα, σε πυκνά θρεπτικά μέσα, τα οποία επιλέγονται με βάση τις ιδιότητες του υποτιθέμενου παθογόνου.
Στη βακτηριολογική μέθοδο, εάν είναι δυνατόν, χρησιμοποιούνται μέσα στα οποία αναπτύσσεται μόνο ένας συγκεκριμένος τύπος βακτηρίων - εκλεκτικά μέσα ή μέσα που καθιστούν δυνατή τη διάκριση του υποτιθέμενου παθογόνου από άλλους μικροοργανισμούς ή διαφορετικά διαφορικά διαγνωστικά μέσα.
Με τη βακτηριολογική μέθοδο, ο εμβολιασμός του υλικού σε θρεπτικά μέσα πραγματοποιείται είτε με γυάλινη ή μεταλλική σπάτουλα, είτε με βακτηριακό βρόχο με τέτοιο τρόπο ώστε τα βακτήρια που υπάρχουν στο υλικό δοκιμής να διασπείρονται στην επιφάνεια του θρεπτικού μέσου. Ως αποτέλεσμα μιας τέτοιας διασποράς, κάθε βακτηριακό κύτταρο εισέρχεται στο δικό του μέρος του περιβάλλοντος.
Σε περίπτωση που, ως αποτέλεσμα της βακτηριολογικής μεθόδου έρευνας, αναμένεται η περιεκτικότητα σε μικρή ποσότητα παθογόνου στο υλικό δοκιμής, ο εμβολιασμός πραγματοποιείται σε υγρό θρεπτικό μέσο για τη συσσώρευσή του, τον λεγόμενο εμπλουτισμό μέσο, το οποίο είναι βέλτιστο για αυτόν τον μικροοργανισμό. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται επανασπορά από το υγρό θρεπτικό μέσο σε στερεό μέσο που χύνεται σε τρυβλία Petri. Το μέσο που έχει ενοφθαλμιστεί με το παθογόνο τοποθετείται σε θερμοστάτη, συνήθως σε συγκεκριμένη θερμοκρασία, η οποία είναι σημαντική για τη βακτηριολογική μέθοδο.
Στο δεύτερο στάδιο της μεθόδου βακτηριολογικής έρευνας, πραγματοποιείται η μελέτη βακτηριακών αποικιών που αναπτύσσονται σε πυκνό θρεπτικό μέσο και προέρχονται από ένα βακτηριακό κύτταρο. (αποικία και είναι καθαρή καλλιέργεια του παθογόνου). Η μικροσκοπική και μακροσκοπική εξέταση των αποικιών πραγματοποιείται σε ανακλώμενο και μεταδιδόμενο φως: με γυμνό μάτι, κάτω από μικροσκόπιο χαμηλής μεγέθυνσης, με μεγεθυντικό φακό.
Σημειώνονται οι πολιτιστικές ιδιότητες των αποικιών: το σχήμα, το μέγεθος, το χρώμα, η φύση των άκρων και η επιφάνεια, η δομή, η συνοχή τους. Περαιτέρω, ένα μέρος κάθε μιας από τις στοχευόμενες αποικίες χρησιμοποιείται για την παρασκευή επιχρισμάτων. Τα επιχρίσματα χρωματίζονται κατά Gram, μικροσκοπικά, προσδιορίζοντας τις χρωστικές (σχέση με το χρώμα) και τις μορφολογικές ιδιότητες της απομονωμένης καλλιέργειας και ελέγχοντας ταυτόχρονα την καθαρότητά της.
Η υπόλοιπη αποικία εμβολιάζεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες με το βέλτιστο μέσο για αυτό το είδος, για παράδειγμα, λοξό άγαρ, προκειμένου να συσσωρευτεί μια καθαρή καλλιέργεια για μια πληρέστερη μελέτη. Οι σωλήνες μετακινούνται για 18–24 ώρες σε θερμοστάτη. Στο δεύτερο στάδιο, εκτός από τις παραπάνω μελέτες, συχνά μετράται και ο αριθμός των αναπτυσσόμενων αποικιών.
Για τη διεξαγωγή μιας τέτοιας μελέτης, παρασκευάζονται διαδοχικές αραιώσεις του ληφθέντος υλικού δοκιμής, από τις οποίες πραγματοποιείται σπορά σε κύπελλα με θρεπτικό μέσο, μετράται ο αριθμός των αναπτυσσόμενων αποικιών, πολλαπλασιασμένος με την αραίωση, από την οποία η περιεκτικότητα σε μικροοργανισμούς στο υλικό καθορίζεται.
Η αναγνώριση της απομονωμένης καθαρής καλλιέργειας του παθογόνου και ο προσδιορισμός της ευαισθησίας σε αντιβιοτικά και άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα για αυτήν την καλλιέργεια είναι το τρίτο στάδιο της βακτηριολογικής μεθόδου. Η απομονωμένη βακτηριακή καλλιέργεια αναγνωρίζεται από χρωστικές, μορφολογικές, βιοχημικές, πολιτιστικές, τοξικογονικές, αντιγονικές ιδιότητες.
Το πρώτο βήμα είναι να πάρετε ένα επίχρισμα από την καλλιέργεια που αναπτύχθηκε στο λοξό άγαρ, να εξετάσετε τη μορφολογία των βακτηρίων και να ελέγξετε την καθαρότητα της καλλιέργειας των αναπτυσσόμενων βακτηρίων. Στη συνέχεια, η απομονωμένη καθαρή καλλιέργεια βακτηρίων εμβολιάζεται σε μέσο Hiss. Είναι επιθυμητό ο εμβολιασμός σε άλλα μέσα για τον προσδιορισμό των βιοχημικών ιδιοτήτων.
Ο σχηματισμός τοξινών των μικροβίων προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας την αντίδραση εξουδετέρωσης τοξίνης με αντιτοξίνη in vivo ή in vitro. Σε ορισμένες περιπτώσεις, μελετώνται και άλλοι παράγοντες λοιμογόνου δράσης. Οι παραπάνω μελέτες, οι οποίες πραγματοποιούνται σε βακτηριολογικό εργαστήριο, μας επιτρέπουν να προσδιορίσουμε το γένος ή τον τύπο του παθογόνου.
Η μέθοδος του χάρτινου δίσκου βασίζεται στον εντοπισμό μιας ζώνης αναστολής της ανάπτυξης βακτηρίων γύρω από δίσκους που είναι εμποτισμένοι με αντιβιοτικά. Σε περίπτωση χρήσης της μεθόδου των σειριακών αραιώσεων, ένα χημικό παρασκεύασμα - ένα αντιβιοτικό με υγρό θρεπτικό μέσο αραιώνεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες, μετά τον οποίο ο ίδιος αριθμός βακτηρίων εμβολιάζεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες. Με την απουσία ή την παρουσία βακτηριακής ανάπτυξης, τα αποτελέσματα καταγράφονται. Ως αποτέλεσμα της μεθόδου βακτηριολογικής έρευνας για τον προσδιορισμό της ταυτότητας των στελεχών, το αντιβιόγραμμα που προκύπτει μπορεί να εξυπηρετήσει και επιδημιολογικούς σκοπούς.
Μπορούν να πραγματοποιηθούν επαναλαμβανόμενες μελέτες κατά την ανίχνευση βακτηριοφορέα, καθώς είναι δυνατό να μην ανιχνευθεί το παθογόνο σε ένα τμήμα του υλικού.
9. Βακτηριολογική μέθοδος διάγνωσης λοιμωδών νοσημάτων
Η κύρια μέθοδος μικροβιολογικής διάγνωσης και το «χρυσό πρότυπο» της μικροβιολογίας είναι η βακτηριολογική μέθοδος.
Ο σκοπός της βακτηριολογικής μεθόδουσυνίσταται στην απομόνωση μιας καθαρής καλλιέργειας του παθογόνου από το υλικό δοκιμής, στη συσσώρευση μιας καθαρής καλλιέργειας και στην ταυτοποίηση αυτής της καλλιέργειας με ένα σύνολο ιδιοτήτων: μορφολογικές, χρωστικές, πολιτιστικές, βιοχημικές, αντιγονικές, με την παρουσία παθογένειας, παράγοντες τοξικότητας και προσδιορισμό της ευαισθησίας της σε αντιμικροβιακά φάρμακα και βακτηριοφάγους.
Η μέθοδος βακτηριολογικής έρευνας περιλαμβάνει:
1. εμβολιασμός του υλικού δοκιμής σε θρεπτικά μέσα
2. καθαρή απομόνωση καλλιέργειας
3. ταυτοποίηση μικροοργανισμών (προσδιορισμός ανήκει σε είδος).
Η απομόνωση και η ταυτοποίηση καθαρών καλλιεργειών αερόβιων και αναερόβιων βακτηρίων περιλαμβάνει τις ακόλουθες μελέτες:
Στάδιο Ι (εργασία με εγγενές υλικό)
Σκοπός: απόκτηση απομονωμένων αποικιών
1. Η προκαταρκτική μικροσκοπία δίνει μια κατά προσέγγιση ιδέα της μικροχλωρίδας
2. Προετοιμασία υλικού για έρευνα
3. Σπορά σε πυκνά θρεπτικά μέσα για να ληφθούν απομονωμένες αποικίες
4. Επώαση στη βέλτιστη θερμοκρασία, τις περισσότερες φορές 37°C, για 18-24 ώρες
ΙΙ στάδιο
Σκοπός: απόκτηση καθαρής καλλιέργειας
1. Μακροσκοπική μελέτη αποικιών στο εκπεμπόμενο και ανακλώμενο φως (χαρακτηριστικά μεγέθους, σχήματος, χρώματος, διαφάνειας, συνοχής, δομής, περιγράμματος, επιφάνειας των αποικιών).
2. Μικροσκοπική εξέταση απομονωμένων αποικιών
3. Δοκιμή αεροανοχής (για επιβεβαίωση της παρουσίας αυστηρών αναερόβιων στο υλικό δοκιμής).
4. Σπορά αποικιών χαρακτηριστικών ενός συγκεκριμένου είδους σε καθαρά μέσα συσσώρευσης καλλιέργειας ή εκλεκτικά μέσα και επώαση υπό βέλτιστες συνθήκες.
Στάδιο III
Σκοπός: Αναγνώριση απομονωμένης καθαρής καλλιέργειας
1. Για την αναγνώριση της απομονωμένης καλλιέργειας από ένα σύμπλεγμα βιολογικών ιδιοτήτων, μελετώνται τα ακόλουθα:
μορφολογία και χρωματικές ιδιότητες
πολιτιστικές ιδιότητες (φύση ανάπτυξης σε θρεπτικά μέσα)
βιοχημικές ιδιότητες (ενζυματική δραστηριότητα μικροοργανισμών)
ορολογικές ιδιότητες (αντιγονικές)
μολυσματικές ιδιότητες (ικανότητα παραγωγής παραγόντων παθογένειας: τοξίνες, ένζυμα, αμυντικοί και επιθετικοί παράγοντες)
παθογένεια για τα ζώα
ευαισθησία σε φάγους (ευαισθησία σε διαγνωστικούς βακτηριοφάγους)
ευαισθησία στα αντιβιοτικά
άλλα μεμονωμένα ακίνητα
Στάδιο IV (συμπέρασμα)
Σύμφωνα με τις ιδιότητες που μελετήθηκαν, συνάγεται συμπέρασμα για την απομονωμένη καλλιέργεια
Το πρώτο στάδιο της έρευνας.Η μελέτη του παθολογικού υλικού ξεκινά με τη μικροσκοπία. Η μικροσκοπία χρωματισμένου εγγενούς υλικού καθιστά δυνατό τον προσδιορισμό κατά προσέγγιση της σύνθεσης του μικροβιακού τοπίου του υπό μελέτη αντικειμένου, ορισμένων μορφολογικών χαρακτηριστικών των μικροοργανισμών. Τα αποτελέσματα της μικροσκοπίας του φυσικού υλικού καθορίζουν σε μεγάλο βαθμό την πορεία περαιτέρω έρευνας και στη συνέχεια συγκρίνονται με τα δεδομένα που λαμβάνονται κατά τον εμβολιασμό σε θρεπτικά μέσα.
Με επαρκή περιεκτικότητα παθογόνων μικροοργανισμών στο δείγμα, η σπορά πραγματοποιείται σε πυκνά θρεπτικά μέσα (για να ληφθούν απομονωμένες αποικίες). Εάν υπάρχουν λίγα βακτήρια στο υλικό δοκιμής, τότε ο εμβολιασμός πραγματοποιείται σε υγρά μέσα εμπλουτισμού θρεπτικών συστατικών. Τα θρεπτικά μέσα επιλέγονται σύμφωνα με τις απαιτήσεις των μικροοργανισμών.
Η καλλιέργεια μικροοργανισμών είναι δυνατή μόνο όταν δημιουργούνται βέλτιστες συνθήκες για τη ζωτική τους δραστηριότητα και τηρούνται οι κανόνες που αποκλείουν τη μόλυνση (τυχαία μόλυνση από ξένα μικρόβια) του υλικού δοκιμής. Τεχνητές συνθήκες που θα αποκλείουν τη μόλυνση της καλλιέργειας από άλλα είδη μπορούν να δημιουργηθούν σε δοκιμαστικό σωλήνα, φιάλη ή τρυβλίο Petri. Όλα τα σκεύη και τα θρεπτικά μέσα πρέπει να είναι αποστειρωμένα και, μετά τον ενοφθαλμισμό μικροβιακού υλικού, προστατευμένα από εξωτερική μόλυνση, η οποία επιτυγχάνεται με πώματα ή μεταλλικά καπάκια και καπάκια. Οι χειρισμοί με το υλικό δοκιμής θα πρέπει να γίνονται στη ζώνη φλόγας μιας λάμπας αλκοόλης για να αποκλείεται η μόλυνση του υλικού από το εξωτερικό περιβάλλον, καθώς και για τη συμμόρφωση με τους κανονισμούς ασφαλείας.
Ο εμβολιασμός του υλικού σε θρεπτικά μέσα πρέπει να γίνεται το αργότερο 2 ώρες από τη στιγμή της συλλογής τους.
Το δεύτερο στάδιο της έρευνας.Μελέτη αποικιών και απομόνωση καθαρών πολιτισμών. Μετά από μια ημέρα επώασης, οι αποικίες αναπτύσσονται στις πλάκες και στο πρώτο εγκεφαλικό επεισόδιο η ανάπτυξη είναι συνεχής και στην επόμενη - απομονωμένες αποικίες. Μια αποικία είναι μια συλλογή μικροβίων του ίδιου είδους που έχουν αναπτυχθεί από ένα μόνο κύτταρο. Δεδομένου ότι το υλικό είναι συνήθως ένα μείγμα μικροβίων, αναπτύσσονται διάφοροι τύποι αποικιών. Διαφορετικές αποικίες σημειώνονται με μολύβι, σκιαγραφώντας τες με κύκλο από την πλευρά του πυθμένα και μελετώντας τις (Πίνακας 11). Πρώτα απ 'όλα, μελετήστε τις αποικίες με γυμνό μάτι: μακροσκοπικά σημάδια. Το πιάτο παρατηρείται (χωρίς να το ανοίγει) από την κάτω πλευρά στο εκπεμπόμενο φως, σημειώνεται η διαφάνεια των αποικιών (διαφανές, εάν δεν παγιδεύει φως, ημιδιαφανές, εάν παγιδεύει μερικώς φως, αδιαφανές, εάν δεν περνάει φως η αποικία), μετρήστε (σε mm) το μέγεθος των αποικιών. Στη συνέχεια μελετούν τις αποικίες από την πλευρά του καπακιού, σημειώνουν το σχήμα (κανονικό στρογγυλό, ακανόνιστο, επίπεδο, κυρτό), τη φύση της επιφάνειας (λεία, γυαλιστερή, θαμπή, τραχιά, ζαρωμένη, υγρή, ξηρή, βλεννώδης), το χρώμα (άχρωμο, έγχρωμο).
Πίνακας 11. Σχήμα μελέτης αποικιών
|
Πιθανά χαρακτηριστικά αποικίας |
||
|
Επίπεδη, κυρτή, σε σχήμα θόλου, κατάθλιψη, στρογγυλή, σε σχήμα ροζέτας, σε σχήμα αστεριού |
||
|
Μέγεθος, mm |
Μεγάλο (4-5 mm), μεσαίο (2-4 mm), μικρό (1-2 mm), νάνος (< 1 мм) |
|
|
Επιφανειακή φύση |
Λείο (σχήμα S), τραχύ (σχήμα R), γλοιώδες (σχήμα Μ), ραβδωτό, ανώμαλο, ματ, γυαλιστερό |
|
|
Άχρωμο, βαμμένο |
||
|
Διαφάνεια |
Διαφανές, αδιαφανές, ημιδιαφανές |
|
|
Η φύση των άκρων |
Ομαλή, οδοντωτή, με κρόσσια, ινώδη, χτενισμένη |
|
|
Εσωτερική δομή |
Ομογενής, κοκκώδης, ετερογενής |
|
|
Συνοχή |
Παχύρρευστο, γλοιώδες, εύθρυπτο |
|
|
Γαλακτωματοποίηση σε μια σταγόνα νερού |
Καλό κακό |
Σημείωση: 5-7 σημεία μελετώνται σε χαμηλή μεγέθυνση του μικροσκοπίου.
Μπορείτε να δείτε τη διαφορά μεταξύ των αποικιών ακόμα καλύτερα όταν κάνετε μεγέθυνση σε αυτές. Για να γίνει αυτό, ένα κλειστό πιάτο τοποθετείται ανάποδα σε ένα τραπέζι αντικειμένων, ο συμπυκνωτής είναι ελαφρώς χαμηλωμένος, χρησιμοποιείται μια μικρή μεγέθυνση του αντικειμενικού φακού (x8), μετακινώντας το πιάτο, μελετώνται μικροσκοπικά σημάδια στις αποικίες: η φύση του άκρη (λεία, κυματιστή, οδοντωτή, χτενισμένη), δομή (ομοιογενής, κοκκώδης, ινώδης, ομοιογενής ή διαφορετική στο κέντρο και κατά μήκος της περιφέρειας).
Στη συνέχεια, μελετάται η μορφολογία των μικροβιακών κυττάρων από τις αποικίες. Για να γίνει αυτό, φτιάχνονται επιχρίσματα από ένα μέρος καθεμιάς από τις σημειωμένες αποικίες, χρωματισμένες σύμφωνα με το Gram. Όταν λαμβάνετε αποικίες, προσέξτε τη συνοχή (στεγνή, εάν η αποικία θρυμματίζεται και είναι δύσκολο να ληφθεί· μαλακή, εάν λαμβάνεται εύκολα στον βρόχο· γλοιώδης, εάν η αποικία φτάνει για τον βρόχο· σκληρή, εάν είναι μέρος της αποικίας δεν λαμβάνεται από τον βρόχο, μόνο ολόκληρη η αποικία μπορεί να αφαιρεθεί) .
Κατά την προβολή επιχρισμάτων, διαπιστώνεται ότι η αποικία αντιπροσωπεύεται από έναν τύπο μικροβίου, επομένως, μπορούν να απομονωθούν καθαρές καλλιέργειες βακτηρίων. Για να γίνει αυτό, από τις αποικίες που μελετήθηκαν, η επανασπορά γίνεται σε κεκλιμένο άγαρ. Κατά την επανασπορά από αποικίες, πρέπει να ληφθεί μέριμνα ώστε να ληφθούν ακριβώς οι προβλεπόμενες αποικίες, χωρίς να αγγίξετε τον βρόχο των κοντινών αποικιών. Οι σωλήνες σφραγίζονται και επωάζονται σε θερμοστάτη στους 37°C για 24 ώρες.
Το τρίτο στάδιο της έρευνας.Ταυτοποίηση του απομονωμένου πολιτισμού. Ταυτοποίηση μικροβίων - προσδιορισμός της συστηματικής θέσης της καλλιέργειας που απομονώνεται από το υλικό στο είδος και την παραλλαγή. Η πρώτη προϋπόθεση για την αξιοπιστία της ταυτοποίησης είναι η άνευ όρων καθαρότητα του πολιτισμού. Για τον εντοπισμό μικροβίων, χρησιμοποιείται ένα σύνολο σημείων: μορφολογικά (σχήμα, μέγεθος, παρουσία μαστιγίων, κάψουλες, σπόροι, αμοιβαία διάταξη σε ένα επίχρισμα), χρωστικές (σχέση με χρώση Gram ή άλλες μεθόδους), χημικά (αναλογία γουανίνης + κυτοσίνης σε μόριο DNA), πολιτιστικά (απαιτήσεις σε θρεπτικά συστατικά, συνθήκες καλλιέργειας, ρυθμός και φύση ανάπτυξης σε διάφορα θρεπτικά μέσα), ενζυματική (διάσπαση διαφόρων ουσιών με σχηματισμό ενδιάμεσων και τελικών προϊόντων), ορολογική (αντιγονική δομή, ειδικότητα), βιολογική (μολυσματικότητα για τα ζώα, τοξικότητα , αλλεργιογένεση, την επίδραση των αντιβιοτικών κ.λπ.).
Για βιοχημική διαφοροποίηση, η ικανότητα των βακτηρίων να ζυμώνουν υδατάνθρακες με το σχηματισμό ενδιάμεσων και τελικά προϊόντα, την ικανότητα αποικοδόμησης πρωτεϊνών και πεπτονών και μελέτης οξειδοαναγωγικών ενζύμων.
Για τη μελέτη σακχαρολυτικών ενζύμων, απομονωμένες καλλιέργειες εμβολιάζονται σε δοκιμαστικούς σωλήνες με ημι-υγρό μέσο που περιέχει λακτόζη, γλυκόζη και άλλους υδατάνθρακες και πολυόλες. Σε ημι-υγρά μέσα, ο εμβολιασμός γίνεται με έγχυση στο βάθος του μέσου. Κατά τη σπορά με έγχυση, ο δοκιμαστικός σωλήνας με το μέσο συγκρατείται υπό γωνία, το πώμα αφαιρείται και η άκρη του δοκιμαστικού σωλήνα καίγεται. Το υλικό λαμβάνεται με έναν αποστειρωμένο βρόχο και μια στήλη θρεπτικού μέσου τρυπιέται σχεδόν μέχρι κάτω με αυτό.
Για τον προσδιορισμό των πρωτεολυτικών ενζύμων, η απομονωμένη καλλιέργεια εμβολιάζεται σε νερό πεπτόνης ή MPB. Για να γίνει αυτό, παίρνουν έναν δοκιμαστικό σωλήνα με ενοφθαλμισμό πιο κοντά στον εαυτό τους και έναν δοκιμαστικό σωλήνα με το μέσο - πιο μακριά από τον εαυτό τους. Και οι δύο δοκιμαστικοί σωλήνες ανοίγουν ταυτόχρονα, πιάνοντας τα πώματα τους με το μικρό δάχτυλο και την άκρη της παλάμης, οι άκρες των δοκιμαστικών σωλήνων καίγονται, λίγη καλλιέργεια συλλαμβάνεται με φρυγμένο ψυχρό βρόχο και μεταφέρεται στον δεύτερο δοκιμαστικό σωλήνα, λειοτριβείται σε ένα υγρό μέσο στο τοίχωμα του δοκιμαστικού σωλήνα και ξεπλύθηκε με το μέσο.
Κατά τη σπορά και τη επανασπορά, πρέπει να δίνεται προσοχή στη συμμόρφωση με τους κανόνες στειρότητας, προκειμένου να μην μολύνουν τις καλλιέργειές τους με ξένη μικροχλωρίδα και επίσης να μην μολύνουν το περιβάλλον. Οι σωλήνες επισημαίνονται και τοποθετούνται σε θερμοστάτη για επώαση στους 37°C για μια ημέρα.
συμπέρασμα
Λογιστική για τα αποτελέσματα. Συμπεράσματα έρευνας. Τα αποτελέσματα της ταυτοποίησης λαμβάνονται υπόψη και, με βάση το σύνολο των δεδομένων που λαμβάνονται, με βάση την ταξινόμηση και τα χαρακτηριστικά των στελεχών τύπου που περιγράφονται στο εγχειρίδιο (οδηγός Bergy, 1994-1996), προσδιορίζεται ο τύπος των απομονωμένων καλλιεργειών.
| " |