Τι είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, η ουσία και οι εφαρμογές της. αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης


ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ (μοριακή βιολογική βάση)

Μεταξύ της μεγάλης ποικιλίας μεθόδων υβριδισμού για ανάλυση DNA, η PCR είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη στην κλινική εργαστηριακή διάγνωση.

Αρχή της μεθόδου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)(αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)) αναπτύχθηκε από τον Cary Mullis (Cetus, ΗΠΑ) το 1983. και χρησιμοποιείται σήμερα ευρέως τόσο για επιστημονική έρευνα όσο και για διαγνωστικά στην πρακτική υγειονομική περίθαλψη και την Κρατική Υγειονομική και Επιδημιολογική Εποπτεία (γονότυπος, διάγνωση μολυσματικών ασθενειών).

Η μέθοδος PCR βασίζεται σε μια φυσική διαδικασία - συμπληρωματική ολοκλήρωση του εκμαγείου DNA, που πραγματοποιείται με τη βοήθεια του ενζύμου DNA πολυμεράσης. Αυτή η αντίδραση ονομάζεται Αντιγραφή DNA.

Η φυσική αντιγραφή του DNA περιλαμβάνει διάφορα στάδια:

1) Μετουσίωσης DNA(ξετύλιξη της διπλής έλικας, απόκλιση κλώνων DNA).

2) Σχηματισμός βραχέων δίκλωνων τμημάτων DNA(οι σπόροι απαιτούνται για την έναρξη της σύνθεσης του DNA).

3) Σύνθεση νέου κλώνου DNA(συμπληρωματική ολοκλήρωση και των δύο κλώνων)

Αυτή η διαδικασία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη λήψη αντιγράφων μικρά τμήματα DNA ειδικά για συγκεκριμένους μικροοργανισμούς,εκείνοι. να πραγματοποιήσει μια στοχευμένη αναζήτηση για τέτοιες συγκεκριμένες περιοχές, που είναι ο στόχος της γονιδιακής διάγνωσης για τον εντοπισμό παθογόνων μολυσματικών ασθενειών.

Ανακάλυψη θερμοσταθερής πολυμεράσης DNA (Taq polymerase) από θερμόφιλα βακτήρια Thermis aquaticus, το βέλτιστο του οποίου είναι στην περιοχή των 70-72°C, κατέστησε δυνατή τη κυκλική διαδικασία αντιγραφής του DNA και τη χρήση του για εργασία in vitro. Η δημιουργία προγραμματιζόμενων θερμοστατών (ενισχυτών), οι οποίοι, σύμφωνα με ένα δεδομένο πρόγραμμα, πραγματοποιούν κυκλικές αλλαγές θερμοκρασίας, δημιούργησε τις προϋποθέσεις για την ευρεία εισαγωγή της μεθόδου PCR στην πρακτική της εργαστηριακής κλινικής διάγνωσης. Με την επαναλαμβανόμενη επανάληψη των κύκλων σύνθεσης, εμφανίζεται μια εκθετική αύξηση του αριθμού των αντιγράφων ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA, η οποία καθιστά δυνατή τη λήψη επαρκούς αριθμού αντιγράφων DNA από μια μικρή ποσότητα του αναλυόμενου υλικού, το οποίο μπορεί να περιέχει μεμονωμένα κύτταρα μικροοργανισμών , για την αναγνώρισή τους με ηλεκτροφόρηση.

Η συμπληρωματική ολοκλήρωση της αλυσίδας δεν ξεκινά σε κανένα σημείο της αλληλουχίας του DNA, αλλά μόνο σε ορισμένα αρχικά μπλοκ - κοντές δίκλωνες τομές. Με την προσάρτηση τέτοιων μπλοκ σε συγκεκριμένες περιοχές του DNA, είναι δυνατό να κατευθύνεται η διαδικασία σύνθεσης ενός νέου κλώνου μόνο σε αυτήν την περιοχή, και όχι σε όλο το μήκος του κλώνου DNA. Για τη δημιουργία αρχικών μπλοκ σε δεδομένες περιοχές DNA, χρησιμοποιούνται δύο ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές (20 ζεύγη νουκλεοτιδίων), που ονομάζονται αστάρια.Οι εκκινητές είναι συμπληρωματικοί με τις αλληλουχίες DNA στα αριστερά και δεξιά όρια ενός συγκεκριμένου θραύσματος και είναι προσανατολισμένοι με τέτοιο τρόπο ώστε η ολοκλήρωση ενός νέου κλώνου DNA να συμβαίνει μόνο μεταξύ τους.

Έτσι, η PCR είναι μια πολλαπλή αύξηση στον αριθμό των αντιγράφων (ενίσχυση) μιας συγκεκριμένης περιοχής DNA που καταλύεται από το ένζυμο πολυμεράσης DNA.

Τα ακόλουθα στοιχεία απαιτούνται για την ενίσχυση:

Ένα μείγμα τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων (dNTPs)(ένα μείγμα τεσσάρων dNTPs, που αποτελούν το υλικό για τη σύνθεση νέων συμπληρωματικών κλώνων DNA)

Ενζυμική πολυμεράση Taq(μια θερμοσταθερή πολυμεράση DNA που καταλύει την επιμήκυνση των αλυσίδων εκκινητών προσθέτοντας διαδοχικά νουκλεοτιδικές βάσεις σε μια αναπτυσσόμενη αλυσίδα συντιθέμενου DNA).

ρυθμιστικό διάλυμα(μέσο αντίδρασης που περιέχει ιόντα Mg2+ απαραίτητα για τη διατήρηση της ενζυμικής δραστηριότητας)
Για τον προσδιορισμό συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος των ιών που περιέχουν RNA, ένα αντίγραφο DNA λαμβάνεται πρώτα από ένα πρότυπο RNA χρησιμοποιώντας μια αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής (RT) που καταλύεται από το ένζυμο ανάστροφη μεταγραφάση (αντίστροφη μεταγραφάση).

Για να ληφθεί επαρκής αριθμός αντιγράφων του επιθυμητού χαρακτηριστικού θραύσματος DNA, η ενίσχυση περιλαμβάνει αρκετούς (20-40) κύκλους.



Κάθε κύκλος ενίσχυσης περιλαμβάνει 3 στάδια που προχωρούν σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας

Βήμα 1: Μετουσίωσης DNA(διπλό ξετύλιγμα έλικας). Ρέει στους 93-95°C για 30-40 δευτερόλεπτα.

Στάδιο 2: Προσάρτηση ασταριών (ανόπτηση).Η προσκόλληση εκκινητή λαμβάνει χώρα συμπληρωματικά προς τις αντίστοιχες αλληλουχίες σε αντίθετους κλώνους DNA στα όρια μιας συγκεκριμένης θέσης. Κάθε ζεύγος ασταριών έχει τη δική του θερμοκρασία ανόπτησης, οι τιμές της οποίας είναι στην περιοχή 50-65°C. Χρόνος ανόπτησης -20-60 sec.

Στάδιο 3: Δημιουργία αλυσίδων DNA.Η συμπληρωματική ολοκλήρωση των αλυσίδων DNA λαμβάνει χώρα από το 5'-άκρο έως το 3'-άκρο της αλυσίδας σε αντίθετες κατευθύνσεις, ξεκινώντας από τις θέσεις σύνδεσης του εκκινητή. Το υλικό για τη σύνθεση νέων αλυσίδων DNA είναι τα τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (dNTPs) που προστίθενται στο διάλυμα. Η διαδικασία σύνθεσης καταλύεται από το ένζυμο θερμοσταθερή DNA πολυμεράση (Taq polymerase) και λαμβάνει χώρα σε θερμοκρασία 70-72°C. Χρόνος σύνθεσης - 20-40 sec.






Οι νέοι κλώνοι DNA που σχηματίστηκαν στον πρώτο κύκλο ενίσχυσης χρησιμεύουν ως πρότυπα για τον δεύτερο κύκλο ενίσχυσης, στον οποίο σχηματίζεται το επιθυμητό ειδικό θραύσμα DNA (amplicon). (βλ. εικ. 2). Σε επόμενους κύκλους ενίσχυσης, τα αμπλικόνια χρησιμεύουν ως πρότυπο για τη σύνθεση νέων αλυσίδων. Έτσι, η συσσώρευση αμπλικονίων στο διάλυμα συμβαίνει σύμφωνα με τον τύπο 2n, όπου n είναι ο αριθμός των κύκλων ενίσχυσης. Επομένως, ακόμα κι αν αρχικά υπήρχε μόνο ένα δίκλωνο μόριο DNA στο αρχικό διάλυμα, περίπου 108 μόρια αμπλικονίου συσσωρεύονται στο διάλυμα μετά από 30-40 κύκλους. Αυτή η ποσότητα είναι επαρκής για αξιόπιστη οπτική ανίχνευση αυτού του θραύσματος με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Η διαδικασία ενίσχυσης πραγματοποιείται σε ειδικό προγραμματιζόμενο θερμοστάτη (ενισχυτή), ο οποίος, σύμφωνα με ένα δεδομένο πρόγραμμα, αλλάζει αυτόματα τις θερμοκρασίες ανάλογα με τον αριθμό των κύκλων ενίσχυσης.

ΣΤΑΔΙΑ PCR - ΑΝΑΛΥΣΗ


Η μέθοδος PCR, ως εργαστηριακό διαγνωστικό εργαλείο για μολυσματικές ασθένειες, βασίζεται στην ανίχνευση ενός μικρού θραύσματος DNA του παθογόνου (πολλές εκατοντάδες ζεύγη βάσεων), ειδικού μόνο για αυτόν τον μικροοργανισμό, χρησιμοποιώντας μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για τη συσσώρευση του επιθυμητού θραύσματος.
Η τεχνική ανάλυσης με τη μέθοδο PCR περιλαμβάνει τρία στάδια:

1. Απομόνωση DNA (RNA) από κλινικό δείγμα


2. Ενίσχυση συγκεκριμένων θραυσμάτων DNA
3. Ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης

Απομόνωση DNA (RNA)
Σε αυτό το στάδιο της ανάλυσης, το κλινικό δείγμα υποβάλλεται σε ειδική επεξεργασία, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη λύση του κυτταρικού υλικού, την απομάκρυνση των πρωτεϊνών και των κλασμάτων πολυσακχαρίτη και την παρασκευή ενός διαλύματος DNA ή RNA χωρίς
αναστολείς και έτοιμο για περαιτέρω ενίσχυση.
Η επιλογή της τεχνικής εξαγωγής DNA (RNA) καθορίζεται κυρίως από τη φύση του επεξεργασμένου κλινικού υλικού.

Ενίσχυση συγκεκριμένων θραυσμάτων DNA
Σε αυτό το στάδιο, μικρά ειδικά θραύσματα DNA συσσωρεύονται στην ποσότητα που απαιτείται για την περαιτέρω ανίχνευσή τους. Οι περισσότερες μέθοδοι για τον προσδιορισμό συγκεκριμένων θραυσμάτων του γονιδιώματος χρησιμοποιούν τα λεγόμενα. «μια κλασική έκδοση της καθοδηγούμενης PCR. Για να αυξηθεί η ειδικότητα και η ευαισθησία της ανάλυσης, ορισμένες μέθοδοι χρησιμοποιούν τη μέθοδο "φωλιασμένης" PCR, η οποία χρησιμοποιεί 2 ζεύγη εκκινητών ("εξωτερικό" - για το 1ο στάδιο και "εσωτερικό" - για το 2ο στάδιο).

Ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης
Στις περισσότερες τεχνικές, σε αυτό το στάδιο, το μείγμα των προϊόντων ενίσχυσης που λαμβάνεται στο 2ο στάδιο διαχωρίζεται με οριζόντια ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης. Πριν από τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό, ένα διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου προστίθεται στο μείγμα ενίσχυσης, το οποίο σχηματίζει ισχυρές ενδιάμεσες συνδέσεις με δίκλωνα θραύσματα DNA. Αυτές οι ενώσεις υπό τη δράση της υπεριώδους ακτινοβολίας είναι σε θέση να φθορίζουν, το οποίο καταγράφεται ως πορτοκαλοκόκκινες φωτεινές ζώνες μετά από ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό του μίγματος ενίσχυσης σε γέλη αγαρόζης.

Ως εναλλακτική στην ηλεκτροφορητική μέθοδο ανίχνευσης, η οποία έχει ορισμένα μειονεκτήματα: μπορεί να προταθεί υποκειμενικότητα στην ανάγνωση των αποτελεσμάτων, περιορισμοί στον προσδιορισμό του DNA διαφόρων μικροοργανισμών σε μία αντίδραση. σχήματα ανίχνευσης υβριδισμού.Σε αυτά τα σχήματα, το θραύσμα DNA που προκύπτει από την ενίσχυση υβριδοποιείται (σχηματίζει σύμπλοκα 2 κλώνων - "υβρίδια") με έναν ειδικό ολιγονουκλεοτιδικό ανιχνευτή. Η καταχώριση τέτοιων συμπλεγμάτων μπορεί να πραγματοποιηθεί χρωματομετρικά ή φθοριομετρικά. Η SPC "Litekh" δημιούργησε κιτ ανίχνευσης βασισμένα στον υβριδισμό με φθορισμομετρική καταχώρηση αποτελεσμάτων

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ PCR ως μέθοδος για τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών:

- Άμεση ανίχνευση της παρουσίας παθογόνων

Πολλές παραδοσιακές διαγνωστικές μέθοδοι, όπως η ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία, ανιχνεύουν πρωτεΐνες-δείκτες που είναι απόβλητα μολυσματικών παραγόντων, γεγονός που παρέχει μόνο έμμεσες ενδείξεις για την παρουσία μόλυνσης. Η αναγνώριση μιας συγκεκριμένης περιοχής DNA του παθογόνου με PCR δίνει μια άμεση ένδειξη της παρουσίας του μολυσματικού παράγοντα.



- Υψηλή ειδικότητα
Η υψηλή ειδικότητα της μεθόδου PCR οφείλεται στο γεγονός ότι ένα μοναδικό θραύσμα DNA που είναι χαρακτηριστικό μόνο για αυτό το παθογόνο ανιχνεύεται στο υλικό δοκιμής. Η ειδικότητα προσδιορίζεται από την νουκλεοτιδική αλληλουχία των εκκινητών, η οποία αποκλείει
τη δυνατότητα λήψης ψευδών αποτελεσμάτων, σε αντίθεση με τη μέθοδο της ενζυμικής ανοσοδοκιμασίας, όπου τα σφάλματα δεν είναι ασυνήθιστα λόγω των αντιγόνων που αντιδρούν διασταυρούμενα.

- Υψηλή ευαισθησία
Η μέθοδος PCR σάς επιτρέπει να ανιχνεύσετε ακόμη και μεμονωμένα κύτταρα βακτηρίων ή ιών. Η διάγνωση PCR ανιχνεύει την παρουσία παθογόνων μολυσματικών ασθενειών σε περιπτώσεις όπου άλλες μέθοδοι (ανοσολογικές, βακτηριολογικές,
μικροσκοπική) είναι αδύνατη. Η ευαισθησία της ανάλυσης PCR είναι 10-1000 κύτταρα ανά δείγμα (η ευαισθησία των ανοσολογικών και μικροσκοπικών εξετάσεων είναι 103-105 κύτταρα).

-Καθολικότητα της διαδικασίας εντοπισμού διαφόρων παθογόνων
Το υλικό για τη μελέτη με PCR είναι το DNA του παθογόνου. Η μέθοδος βασίζεται στην ανίχνευση ενός θραύσματος DNA ή RNA που είναι ειδικό για έναν συγκεκριμένο οργανισμό. Η ομοιότητα της χημικής σύνθεσης όλων των νουκλεϊκών οξέων επιτρέπει τη χρήση ενοποιημένων μεθόδων για εργαστηριακή έρευνα. Αυτό καθιστά δυνατή τη διάγνωση πολλών παθογόνων από μία βιοδοκιμασία. Ως υλικό δοκιμής μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορες βιολογικές εκκρίσεις (βλέννα, ούρα, πτύελα), ξύσεις επιθηλιακών κυττάρων, αίμα, ορός.

- Υψηλή ταχύτητα λήψης του αποτελέσματος της ανάλυσης
Η ανάλυση PCR δεν απαιτεί την απομόνωση και την καλλιέργεια της καλλιέργειας του παθογόνου, η οποία απαιτεί πολύ χρόνο. Μια ενοποιημένη μέθοδος για την επεξεργασία βιοϋλικών και την ανίχνευση των προϊόντων αντίδρασης και η αυτοματοποίηση της διαδικασίας ενίσχυσης καθιστούν δυνατή τη διεξαγωγή μιας πλήρους ανάλυσης σε 4-4,5 ώρες.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η μέθοδος PCR μπορεί να ανιχνεύσει παθογόνα όχι μόνο στο κλινικό υλικό που λαμβάνεται από τον ασθενή, αλλά και στο υλικό που λαμβάνεται από περιβαλλοντικά αντικείμενα (νερό, έδαφος κ.λπ.).

ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ PCR ΣΤΗΝ ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΦΡΟΝΤΙΔΑ ΥΓΕΙΑΣ

Η χρήση της μεθόδου PCR για τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών τόσο βακτηριακής όσο και ιογενούς φύσης έχει μεγάλη σημασία για την επίλυση πολλών προβλημάτων μικροβιολογίας και επιδημιολογίας. Η χρήση αυτής της μεθόδου συμβάλλει επίσης στην ανάπτυξη θεμελιώδους έρευνας στον τομέα των χρόνιων και ελάχιστα μελετημένων μολυσματικών ασθενειών.

Η πιο αποτελεσματική και οικονομικά δικαιολογημένη χρήση της μεθόδου σε:

ουρογυναικολογική πρακτική- για την ανίχνευση χλαμυδίων, ουρεαπλάσμωσης, γονόρροιας, έρπητα, γαρδνερέλλωσης, μόλυνσης από μυκόπλασμα.

στην πνευμονολογία- για διαφορική διάγνωση ιικής και βακτηριακής πνευμονίας, φυματίωσης.

στη γαστρεντερολογία- για την ανίχνευση ελικοβακτηρίωσης.

στην κλινική λοιμωδών νοσημάτων- ως εξπρές μέθοδος για τη διάγνωση της σαλμονέλωσης, της διφθερίτιδας, της ιογενούς ηπατίτιδας Β, C και G.

στην αιματολογία- για την ανίχνευση μόλυνσης από κυτταρομεγαλοϊό, ογκοϊούς.

Η PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) είναι ένα επίτευγμα της μοριακής βιολογίας, μια από τις κύριες μεθόδους κλινικής εργαστηριακής διάγνωσης του τέλους του 20ού και των αρχών του 21ου αιώνα, που φέρνει μεγάλα οφέλη σε διάφορους τομείς της ιατρικής επιστήμης.

Έτσι, ακόμα κι αν μεταξύ των εκατομμυρίων κυττάρων του ανθρώπινου σώματος δεν χάνεται ο ίδιος ο ζωντανός ιός, αλλά μόνο ένα σωματίδιο του DNA του, τότε η PCR, αν τίποτα δεν παρεμβαίνει σε αυτήν, πιθανότατα θα αντεπεξέλθει στην εργασία και θα αναφέρει το παραμονή του «άγνωστου» με θετικό αποτέλεσμα. Αυτή είναι η ουσία της PCR και το κύριο πλεονέκτημά της.

Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα

Το εργαστήριο που εκτελεί διαγνωστικά PCR υπόκειται στις υψηλότερες απαιτήσεις όσον αφορά τον εξοπλισμό, τα συστήματα δοκιμών και τα προσόντα του ιατρικού προσωπικού. Πρόκειται για ένα εργαστήριο υψηλής τεχνολογίας που διαθέτει ένα οπλοστάσιο αντιδραστηρίων υψηλής ευαισθησίας και εξαιρετικά ειδικών, επομένως δεν έχει ιδιαίτερα μειονεκτήματα. Εκτός και αν δίνει θετικό αποτέλεσμα ελλείψει κλινικών εκδηλώσεων και έτσι θέτει τον κλινικό ιατρό μπροστά σε ένα δίλημμα: αξίζει να ξεκινήσει η θεραπεία ή όχι;

Ο γιατρός που παρατηρεί τον ασθενή αρχίζει να αμφιβάλλει για την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων των εξετάσεων, αφού δεν βλέπει κανένα σημάδι της νόσου. Ωστόσο, δεδομένης της υψηλής ευαισθησίας του συστήματος PCR, θα πρέπει να θυμόμαστε ότι ανιχνεύει το παθογόνο ακόμη και στο προκλινικό στάδιο και ένα θετικό αποτέλεσμα σε αυτή την περίπτωση είναι περισσότερο πλεονέκτημα παρά μειονέκτημα. Με βάση αυτό, ο θεράπων ιατρός πρέπει ο ίδιος να αποφασίσει για την καταλληλότητα της θεραπείας, λαμβάνοντας υπόψη άλλα επιχειρήματα υπέρ και κατά.

Τα πλεονεκτήματα της διάγνωσης χρησιμοποιώντας την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι προφανή:

  • Υψηλή ειδικότητα, φτάνοντας το 100%, λόγω της παρουσίας στο επιλεγμένο δείγμα σωματιδίων νουκλεϊκού οξέος εγγενών σε έναν συγκεκριμένο οργανισμό, αλλά ξένων για τον άνθρωπο.
  • Υψηλή απόδοσηΕξάλλου, η PCR είναι μια αυτοματοποιημένη τεχνική υψηλής τεχνολογίας που παρέχει τη δυνατότητα διεξαγωγής δοκιμών την ημέρα της δειγματοληψίας υλικού και έτσι απαλλάσσει τον ασθενή από περιττές ανησυχίες.
  • Η PCR, που εργάζεται σε ένα μόνο δείγμα, είναι σε θέση να διεξάγει πολλές μελέτες και περίπου ανίχνευση πολλαπλών παθογόνωναν έχει τέτοιο καθήκον. Για παράδειγμα, κατά τη διάγνωση μιας λοίμωξης από χλαμύδια, όπου η PCR είναι μια από τις κύριες μεθόδους, μαζί με τα χλαμύδια, μπορεί επίσης να ανιχνευθεί η Neisseria (γονόκοκκος) - το παθογόνο. Επιπλέον, αυτό δεν επηρεάζει αρνητικά την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων.
  • Δοκιμή PCR αποκαλύπτει επικίνδυνους μικροοργανισμούς στην περίοδο επώασης, όταν δεν έχουν ακόμη χρόνο να προκαλέσουν απτή βλάβη στο σώμα, δηλαδή, η έγκαιρη διάγνωση προειδοποιεί για την επικείμενη ανάπτυξη της παθολογικής διαδικασίας, η οποία καθιστά δυνατή την προετοιμασία για αυτήν και την πλήρη όπλιση.

Επιπλέον, για να αποφευχθούν παρεξηγήσεις που προκύπτουν μερικές φορές κατά τη διάρκεια της διάγνωσης, η PCR προστατεύεται επίσης από το γεγονός ότι τα αποτελέσματά της μπορούν να καταγραφούν (φωτογραφία, υπολογιστής) προκειμένου να τα χρησιμοποιήσει για ειδικούς σκοπούς, εάν είναι απαραίτητο.

Ο κανόνας στις αποκρίσεις PCR θεωρείται αρνητικό αποτέλεσμα., υποδεικνύοντας την απουσία θραυσμάτων ξένων νουκλεϊκών οξέων, μια θετική απόκριση θα υποδεικνύει την παρουσία μόλυνσης στο σώμα, οι ψηφιακές τιμές υποδεικνύουν την κατάσταση του ιού και τη συγκέντρωσή του κατά τη στιγμή της δοκιμής. Ωστόσο, μια πλήρης μεταγραφή της ανάλυσης πραγματοποιείται από γιατρό που έχει παρακολουθήσει ειδική εκπαίδευση στο θέμα «PCR». Το να προσπαθείτε να ερμηνεύσετε μόνοι σας τα αποτελέσματα δεν έχει νόημα, καθώς είναι πιθανό, κάτι που είναι πιθανό να συμβεί, να παρεξηγήσετε και να αρχίσετε να ανησυχείτε εκ των προτέρων.

Τι είναι η PCR «φοβάται», τι μπορεί να κάνει και πώς να προετοιμαστεί για αυτό;

Όπως και με κάθε άλλη μελέτη, μερικές φορές τα αποτελέσματα των δοκιμών είναι ψευδώς θετικά ή ψευδώς αρνητικάόπου η PCR δεν αποτελεί εξαίρεση. Αυτό μπορεί να συμβεί στις ακόλουθες περιπτώσεις:

  1. Παραβιάσεις της τεχνολογικής διαδικασίας σε ένα από τα στάδια της αντίδρασης.
  2. Μη συμμόρφωση με τους κανόνες για τη συλλογή, την αποθήκευση ή τη μεταφορά του υλικού.
  3. Η παρουσία ξένων ακαθαρσιών στο υλικό.

Αυτό υποδηλώνει ότι η PCR - η διάγνωση των λοιμώξεων πρέπει να προσεγγίζεται προσεκτικά, προσεκτικά και με ακρίβεια, διαφορετικά τα δείγματα υλικού μπορεί να αλλάξουν τη δομική τους δομή ή ακόμα και να καταρρεύσουν.

Στάδια διάγνωσης PCR. Τα ψευδή αποτελέσματα μπορεί να δώσουν παραβιάσεις σε οποιοδήποτε στάδιο της μελέτης

Η διάγνωση λοιμώξεων με PCR ανήκει στην κατηγορία των "χρυσών προτύπων" μεταξύ άλλων εργαστηριακών μεθόδων, επομένως μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αναζήτηση παθογόνων πολλών ασθενειών που με την πρώτη ματιά δεν έχουν τίποτα κοινό μεταξύ τους:

  • Φυματίωση διαφόρων εντοπισμών, πνευμονία (συμπεριλαμβανομένης της άτυπης, που προκαλείται από χλαμύδια).
  • Παιδικές λοιμώξεις (ιλαρά, ερυθρά, παρωτίτιδα, ιλαρά).
  • Διφθερίτιδα;
  • σαλμονέλωση;
  • Ζωονοσογόνος λοιμώδης νόσος - λιστερίωση (η ασθένεια χαρακτηρίζεται από μια ποικιλία συμπτωμάτων με βλάβη στους λεμφαδένες, το κεντρικό νευρικό σύστημα, τα εσωτερικά όργανα).
  • Ασθένειες που προκαλούνται από τη διείσδυση του ιού Epstein-Barr (λοιμώδης μονοπυρήνωση κ.λπ.).
  • Ογκολογική παθολογία που προκαλείται από μόλυνση από ιό θηλώματος (HPV και οι τύποι του).
  • Βορρελίωση (νόσος του Lyme, εγκεφαλίτιδα που μεταδίδεται από κρότωνες).
  • Λοίμωξη από ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού, ο αιτιολογικός παράγοντας της οποίας είναι το βακτήριο Helicobacter pylori που ζει στο ανθρώπινο στομάχι. Έχει αποδειχθεί ότι το Helicobacter προκαλεί την ανάπτυξη καρκίνου του στομάχου ή του δωδεκαδακτύλου.
  • και πρακτικά τα πάντα.

Η διάγνωση PCR των σεξουαλικά μεταδιδόμενων λοιμώξεων έχει ιδιαίτερη σημασία, καθώς οι ασθένειες που προκαλούνται με αυτόν τον τρόπο συχνά προχωρούν για μεγάλο χρονικό διάστημα χωρίς κλινικές εκδηλώσεις, αλλά κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης αρχίζουν να γίνονται πιο δραστήριες και, ως εκ τούτου, απειλούν την υγεία, ακόμη και τη ζωή του παιδιού. . Και συμπεριφέρεστε παρόμοια. Μερικά από αυτά («φάδα») σχετίζονται ταυτόχρονα με ΣΜΝ, επομένως τα τελευταία απαιτούν λεπτομερέστερη εξέταση. Ο αναγνώστης θα μπορέσει να εξοικειωθεί με τις πιο δημοφιλείς μεθόδους στις ακόλουθες ενότητες του άρθρου.

Πώς να προετοιμαστείτε σωστά για να έχετε ένα αξιόπιστο αποτέλεσμα;

Σημειώνουμε αμέσως ότι η προετοιμασία για PCR είναι αρκετά απλή, δεν απαιτεί ιδιαίτερες προσπάθειες από την πλευρά του ασθενούς. Απλά πρέπει να ολοκληρώσετε τρεις απλές εργασίες:

  1. Μην έχετε σεξουαλική επαφή 24 ώρες πριν κάνετε το τεστ.
  2. Για να πάρετε και να αναλύσετε αίμα από μια φλέβα, πρέπει να έρθετε με άδειο στομάχι, παρεμπιπτόντως, δεν μπορείτε να πιείτε ούτε.
  3. Τα ούρα πρέπει να διοχετεύονται τη νύχτα (το πρωί - σε ένα αποστειρωμένο βάζο που αγοράστηκε την προηγούμενη μέρα σε φαρμακείο).

Η PCR μπορεί να λειτουργήσει σε οποιοδήποτε βιολογικό περιβάλλον

Η μέθοδος PCR δεν είναι «αιμοδιψή», επομένως δέχεται οποιοδήποτε βιολογικό περιβάλλον που περιέχει ύποπτο μολυσματικό παράγοντα.Συνήθως η επιλογή - τι πρέπει να πάρετε για έρευνα, παραμένει στον γιατρό.

Έτσι, σε αναζήτηση ενός παθογόνου, εκτός από μια εξέταση αίματος (αν και είναι επίσης κατάλληλη και στις περισσότερες περιπτώσεις λαμβάνεται παράλληλα με άλλο υλικό), μπορείτε να χρησιμοποιήσετε:

  • (έκκριση του ουρογεννητικού συστήματος).
  • Απόξεση των βλεννογόνων της στοματικής κοιλότητας, του επιπεφυκότα, του ρινοφάρυγγα, της γεννητικής οδού (στις γυναίκες λαμβάνονται από τον τράχηλο και τον κόλπο, στους άνδρες - από την ουρήθρα).
  • σάλιο;
  • σπέρμα;
  • χυμός προστάτη?
  • Πλακουντικοί ιστοί και αμνιακό υγρό (αμνιακό υγρό).
  • Ιζήματα ούρων (μετά από φυγοκέντρηση), για παράδειγμα, για την ανίχνευση ορισμένων ΣΜΝ και Mycobacterium tuberculosis.
  • Πτύελα και υπεζωκοτικό υγρό για τον ίδιο σκοπό.
  • εκκρίνει?
  • Εγκεφαλονωτιαίο υγρό σε περίπτωση υποψίας λοιμώδους βλάβης του κεντρικού νευρικού συστήματος.
  • Υλικό βιοψίας (βιοψία) που λαμβάνεται από το ήπαρ, το δωδεκαδάκτυλο, το στομάχι κ.λπ.

Θα ήθελα να προσθέσω στα παραπάνω ότι σε όλες τις περιπτώσεις, ακόμη και σε ξύσεις και εκκρίσεις, θα υπάρχει αρκετό υλικό για έλεγχο, καθώς η δοκιμή PCR δεν απαιτεί μεγάλους όγκους, μερικά μικρολίτρα αρκούν για ανάλυση, τα οποία συνήθως λαμβάνονται σε Μικροσωλήνας τύπου Eppendorf και αποστέλλεται για μελέτη.

Ασθένειες και χρήση PCR

HIV και η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Συνήθως, όταν περνάει μια ανώνυμη εξέταση σε περίπτωση θετικών αποτελεσμάτων ανοσοστύπωσης, η διάγνωση επαναλαμβάνεται ξανά. Εάν η διάγνωση επιβεβαιωθεί, ο ασθενής συνταγογραφείται πρόσθετες μελέτες:

  1. Προσδιορισμός, χρησιμοποιώντας ανοσολογικές αντιδράσεις, των απόλυτων τιμών του αριθμού των λεμφοκυττάρων CD 4 (ανοσοεπαρκή κύτταρα - Τ-βοηθοί ή βοηθοί), τα οποία η μόλυνση μολύνει αρχικά, μετά από την οποία χάνουν τις βασικές τους ιδιότητες και δεν μπορούν να διακρίνουν μεταξύ τους " δικός» και κάποιου άλλου. Παίρνουν το RNA του ιού που κυκλοφορεί στο πλάσμα του αίματος για τα φυσιολογικά κύτταρα του σώματος και δεν αντιδρούν σε αυτά.
  2. Ανίχνευση ιικού RNA με PCR και υπολογισμός της συγκέντρωσης των ιικών σωματιδίων προκειμένου να καθοριστεί το στάδιο, η σοβαρότητα της παθολογικής διαδικασίας και η πρόγνωση με βάση αυτά τα δεδομένα. Φυσικά, η λέξη «κανόνας» από αυτή την άποψη δεν υπάρχει, καθώς η αντίδραση είναι πάντα θετική και η αποκωδικοποίηση των ψηφιακών τιμών είναι στην αρμοδιότητα του γιατρού.

PCR και ηπατίτιδα

Η μέθοδος PCR μπορεί να ανιχνεύσει παθογόνα, πιο συχνά το τεστ χρησιμοποιείται για τη διάγνωση της ηπατίτιδας C, η οποία ανιχνεύεται ελάχιστα από άλλες μεθόδους.

Ο ιός της ηπατίτιδας C (που περιέχει RNA) στη συμπεριφορά του στο ανθρώπινο σώμα μοιάζει με τον ιό HIV. Σφηνώνοντας στο γονιδίωμα των ηπατικών κυττάρων (ηπατοκύτταρα), μένει εκεί περιμένοντας στα φτερά, κάτι που μπορεί να έρθει τουλάχιστον σε 2 χρόνια, τουλάχιστον σε 20 χρόνια, έτσι οι γιατροί τον αποκάλεσαν «ευγενικό δολοφόνο». Η ηπατίτιδα C οδηγεί στο σχηματισμό μιας κακοήθους διαδικασίας στο ηπατικό παρέγχυμα, η οποία εκδηλώνεται στα τελευταία στάδια. Το ανοσοποιητικό σύστημα δεν παρατηρεί όλα αυτά τα γεγονότα, παρερμηνεύοντας τον ιό με ηπατοκύτταρο. Είναι αλήθεια ότι τα αντισώματα κατά του ιού παράγονται σε ορισμένες ποσότητες, αλλά δεν παρέχουν μια αξιοπρεπή ανοσολογική απόκριση. Για τη διάγνωση της ηπατίτιδας C, η ELISA δεν είναι πολύ ενημερωτική, καθώς δείχνει ότι ο ιός έχει αφήσει ίχνη και δεν είναι γνωστό αν έφυγε από μόνος του. Με τον HCV είναι γνωστές περιπτώσεις αυτοθεραπείας, ενώ τα αντισώματα κατά του ιού παραμένουν και συνεχίζουν να κυκλοφορούν εφ' όρου ζωής (ανοσολογική μνήμη). Η PCR προηγείται αισθητά από το σχηματισμό αντισωμάτων και μπορεί να ανιχνεύσει ένα ιικό σωματίδιο ήδη από 1-1,5 εβδομάδες, ενώ τα αντισώματα μπορεί να εμφανιστούν στην περιοχή από 2 μήνες έως έξι μήνες

Η διάγνωση PCR σε περίπτωση υποψίας αχαλίνωτου ιού ηπατίτιδας C στο ανθρώπινο σώμα είναι η βέλτιστη μέθοδος έρευνας, επειδή μόνο αυτή μπορεί να αναγνωρίσει την παρουσία ενός «ευγενικού εχθρού» στο αίμα ή τη βιοψία ήπατος του ασθενούς.

Ωστόσο, μερικές φορές υπάρχουν περιπτώσεις που η ΑΤ είναι θετική και το αποτέλεσμα της PCR είναι αρνητικό. Αυτό συμβαίνει μερικές φορές όταν η ποσότητα του ιού είναι πολύ χαμηλή ή όταν είναι αδρανής στο ήπαρ χωρίς να εισέλθει στην κυκλοφορία του αίματος. Για να εξακολουθήσει να βρεθεί η αλήθεια, ο ασθενής αναλύεται εκ νέου, ή ακόμα και περισσότεροι από ένας.

Λοίμωξη από ιό θηλώματος

Εάν δεν συμβεί αυτοίαση, μπορεί επίσης, χωρίς να εκδηλωθεί, να επιμείνει για μεγάλο χρονικό διάστημα στο σώμα του ξενιστή, ο οποίος δεν το υποπτεύεται καν, αφού δεν έχει γίνει PCR και δεν υπήρχαν συμπτώματα της νόσου. Ωστόσο, η παρουσία λοίμωξης από τον ιό των θηλωμάτων, αν και λανθάνουσα, απέχει πολύ από το να είναι αδιάφορη για την ανθρώπινη υγεία, όπου ορισμένοι τύποι του ιού που προκαλούν ογκολογικά νοσήματα αποτελούν ιδιαίτερο κίνδυνο (τύποι 16, 18).

Συχνότερα, το γυναικείο μισό του πληθυσμού πάσχει από HPV, καθώς ο ιός αγαπά περισσότερο τη γυναικεία γεννητική περιοχή και ιδιαίτερα τον τράχηλο, όπου ορισμένοι τύποι ιών συμβάλλουν στην ανάπτυξη δυσπλαστικών διεργασιών και στη συνέχεια ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας, εάν δεν υπάρχει δυσπλασία. αντιμετωπίζεται και ο ιός απελευθερώνεται. Έτσι, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης θα ανιχνεύσει το DNA του ιού και στη συνέχεια θα υποδείξει τον «κακό» ή τον «καλό» (ογκογόνο ή μη ογκογόνο) τύπο που έχει εγκατασταθεί στο σώμα της γυναίκας.

Άλλα ΣΜΝ και λοιμώξεις TORCH

Προφανώς, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μπορεί να βρει οποιαδήποτε ξένη δομή που αποτελείται από νουκλεϊκά οξέα, επομένως αυτή η δοκιμή είναι κατάλληλη για την ανίχνευση όλων των ΣΜΝ και λοιμώξεων TORCH, ωστόσο, δεν χρησιμοποιείται πάντα. Γιατί, ας πούμε, να διεξάγουμε τόσο δαπανηρές έρευνες για τον εντοπισμό ή τον γονόκοκκο, αν υπάρχουν πιο προσιτές και φθηνότερες;

Οι λοιμώξεις TORCH και οι σεξουαλικώς μεταδιδόμενες λοιμώξεις είναι τόσο αλληλένδετες που μερικές φορές είναι δύσκολο να προσδιοριστεί σε ποια ομάδα πρέπει να αποδοθεί ένα συγκεκριμένο παθογόνο. Γενικά, μπορεί να είναι δύσκολο να τα καταλάβουμε, καθώς πρόκειται για αρκετά διαφορετικές ομάδες μικροοργανισμών που μπορούν πάντα να μεταδοθούν σεξουαλικά ή μόνο υπό ορισμένες συνθήκες (ανοσοανεπάρκεια) και μπορεί να ενδιαφέρουν μόνο κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης, λόγω των πιθανών αρνητικών επιπτώσεων στην την πορεία του και στο έμβρυο.

Η PCR είναι η κύρια μέθοδος για την ανίχνευση λανθάνουσας λοίμωξης

Η ανάπτυξη κλινικών εκδηλώσεων βασίζεται σε διάφορα παθογόνα, τα οποία μπορούν να εντοπιστούν μόνο με PCR, που είναι το κύριο καθήκον της, μερικές φορές μαζί με ELISA και μερικές φορές ως η μόνη επιβεβαιωτική εξέταση, ειδικά εάν δεν υπάρχουν συμπτώματα της νόσου.Μια τέτοια δύσκολη κατάσταση μπορεί να δημιουργήσει μια πολυμικροβιακή λοίμωξη, η οποία εκτός από εμφανή παθογόνα περιλαμβάνει και ευκαιριακά παθογόνα.

Το ουρεόπλασμα εμφανίζεται συχνά παράλληλα με το μυκόπλασμα.Και αυτό δεν είναι τυχαίο. Αυτά τα είδη, όπως τα χλαμύδια, δεν είναι ούτε ιοί ούτε βακτήρια, ζουν μέσα στα κύτταρα και ανήκουν σε ΣΜΝ, αν και η παρουσία τους σε ένα υγιές σώμα δεν είναι επίσης ασυνήθιστη. Έτσι, για να διακρίνουμε έναν υγιή φορέα από έναν άρρωστο, χρειάζονται ειδικές μέθοδοι, όπου η PCR θεωρείται η πιο αξιόπιστη, καθώς, λόγω των ιδιαιτεροτήτων της δομής και της συμπεριφοράς αυτών των μικροοργανισμών, άλλες μελέτες είναι αναποτελεσματικές.

Όσον αφορά τον (τύπος 1, 2) και, που ανήκει επίσης στους ιούς του έρπητα (τύπου 5), η κατάσταση είναι επίσης διφορούμενη. Το ποσοστό μόλυνσης του παγκόσμιου πληθυσμού πλησιάζει το 100%, επομένως, σε αυτή την περίπτωση, η αναγνώριση του ιού και η δόση του είναι πολύ σημαντική, κάτι που είναι ιδιαίτερα σημαντικό κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης, γιατί για έναν ενήλικα, ο ιός που έχει ριζώσει στην το σώμα συχνά δεν προκαλεί κανένα πρόβλημα και δεν δίνει σημάδια ασθένειας.

Επομένως, μια τέτοια εξέταση που συνταγογραφείται από γιατρό δεν πρέπει να αγνοηθεί, επειδή σε ορισμένες περιπτώσεις η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια υποχρεωτική και απαραίτητη μέθοδος εργαστηριακής διάγνωσης που μπορεί να προστατεύσει όχι μόνο μια γυναίκα, αλλά και έναν μικρό, αγέννητο άνδρα από σοβαρές επιπλοκές.

Εν κατακλείδι, θα ήθελα να σημειώσω ότι μια τόσο υπέροχη μέθοδος όπως η PCR υπηρετεί την ανθρωπότητα για περισσότερα από 30 χρόνια. Ταυτόχρονα, τα καθήκοντα του τεστ δεν περιορίζονται στην αναζήτηση παθογόνων μολυσματικών ασθενειών. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, που γεννήθηκε στο έδαφος της μοριακής βιολογίας, είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με τη γενετική. χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς στην εγκληματολογία για προσωπική ταυτοποίηση, στην ιατροδικαστική για τη διαπίστωση της πατρότητας, στην κτηνιατρική, εάν η κλινική ζώων έχει τη δυνατότητα αγοράς ακριβού εξοπλισμού, καθώς και σε άλλους τομείς (βιομηχανία, γεωργία κ.λπ.).

Βίντεο: PCR - ουσία και εφαρμογή

Βακτηριακή γενετική. Πληροφορίες για το δεύτερο μάθημα.

αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια μέθοδος που επιτρέπει την πολλαπλή αύξηση (ενίσχυση) του αριθμού ορισμένων μορίων DNA στο αναλυόμενο δείγμα (συμπεριλαμβανομένου βιολογικού υλικού ή καθαρής καλλιέργειας).

Τα κύρια πλεονεκτήματα της PCR ως διαγνωστικής μεθόδου στη μικροβιολογία είναι η πολύ υψηλή ευαισθησία της, η οποία επιτρέπει την ανίχνευση εξαιρετικά χαμηλών συγκεντρώσεων παθογόνων στα δείγματα, καθώς και ρυθμιζόμενη ειδικότητα, η οποία καθιστά δυνατή την ανίχνευση ή τον εντοπισμό παθογόνων στο γενικό είδος. , ή επίπεδο υποείδους. Το κύριο μειονέκτημα της PCR πηγάζει από την εξαιρετικά υψηλή ευαισθησία της - είναι πολύ εύκολο για τις εικόνες να μολύνουν το DNA από θετικό μάρτυρα, άλλο δείγμα ή προϊόν PCR, οδηγώντας σε ψευδώς θετική αντίδραση. Αυτό επιβάλλει αυστηρούς περιορισμούς στις συνθήκες υπό τις οποίες η PCR αναμειγνύεται και υποβάλλεται σε επεξεργασία με τελικά προϊόντα PCR.

Διεξαγωγή PCR.Παρασκευάζεται ένα μείγμα αντίδρασης που περιέχει τα ακόλουθα συστατικά:

    απομονωμένο DNA από το δείγμα δοκιμής,

    ρυθμιστικό διάλυμα,

    Ιόντα Mg2+ (απαιτούνται για να λειτουργήσει το ένζυμο),

    Δύο εκκινητές είναι μονόκλωνα βραχέα μόρια DNA (τις περισσότερες φορές μήκους 18 έως 24 νουκλεοτιδίων) συμπληρωματικά προς τα άκρα διαφορετικών κλώνων της προς ανίχνευση αλληλουχίας DNA.

    Ένα μείγμα τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων.

    Ανθεκτική στη θερμότητα πολυμεράση DNA (που χρησιμοποιείται πιο συχνά είναι η πολυμεράση Taq, μια πολυμεράση που απομονώνεται από Thermus aquaticus).

Στη συνέχεια, αυτό το μείγμα αντίδρασης τοποθετείται στον κυκλοποιητή, ο οποίος είναι στην πραγματικότητα ένας προγραμματιζόμενος θερμοστάτης. Στον κυκλοποιητή πραγματοποιούνται 30-40 κύκλοι μεταβολών θερμοκρασίας. Κάθε ένας από αυτούς τους κύκλους αποτελείται από τρία στάδια (βλ. Εικ. 1):

    Μετουσίωσης (θερμοκρασία 94 ° C) - οι αλυσίδες υδρογόνου σπάνε και οι αλυσίδες DNA αποκλίνουν.

    ανόπτηση ασταριού (η θερμοκρασία είναι συνήθως στην περιοχή των 50-60 ° C) - οι εκκινητές συνδέονται στα άκρα των αλυσίδων DNA. Γενικά, όταν η θερμοκρασία χαμηλώνει, είναι πιο ευνοϊκό ενεργειακά η επανένωση των αρχικών κλώνων DNA από το υπό μελέτη δείγμα (renaturation), ωστόσο, η συγκέντρωση των εκκινητών στο μείγμα αντίδρασης είναι πολλές τάξεις μεγέθους υψηλότερη από τη συγκέντρωση του DNA από το δείγμα (τουλάχιστον στους αρχικούς κύκλους PCR), οπότε η αντίδραση ανόπτησης του εκκινητή προχωρά ταχύτερα από την επαναδιάταξη. Η θερμοκρασία ανόπτησης επιλέγεται ανάλογα με τις θερμοκρασίες τήξης (μετουσίωσης) των ασταριών.

    Επιμήκυνση (η θερμοκρασία είναι συνήθως 72 ° C) - Η DNA πολυμεράση συμπληρώνει τους εκκινητές κατά μήκος του εκμαγείου των μακριών αλυσίδων DNA. Η θερμοκρασία αντιστοιχεί στη βέλτιστη θερμοκρασία λειτουργίας για τη χρησιμοποιούμενη πολυμεράση DNA.

Η ανίχνευση των αποτελεσμάτων διαφέρει σε διαφορετικά σκευάσματα PCR και περιγράφεται στην ενότητα "Ποικιλίες PCR".

Δυναμική της PCR

Στους πρώιμους κύκλους PCR, ο αριθμός των μορίων δίκλωνου DNA, των οποίων το μέγεθος καθορίζεται από την απόσταση μεταξύ των θέσεων εκκινητών, διπλασιάζεται με κάθε κύκλο. Σχηματίζεται επίσης ένας μικρός αριθμός μακρύτερων μορίων DNA, τα οποία μπορούν να αγνοηθούν (βλ. Εικόνα 2).

Έτσι, στους πρώιμους κύκλους, η ποσότητα του προϊόντος PCR περιγράφεται από τον τύπο m*2n, όπου m είναι η αρχική ποσότητα του επιθυμητού DNA στο δείγμα, n είναι ο αριθμός των κύκλων. Στη συνέχεια η αντίδραση φτάνει σε ένα οροπέδιο. Αυτό οφείλεται στη συσσώρευση του προϊόντος της αντίδρασης, σε μείωση της συγκέντρωσης εκκινητών και τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων και επίσης λόγω αύξησης της συγκέντρωσης πυροφωσφορικού (βλ. Εικ. 3).

Ποικιλίες PCR

Συμβατική PCR

Σε αυτήν την έκδοση της ρύθμισης PCR, η αντίδραση συνεχίζεται για έναν προεπιλεγμένο αριθμό κύκλων (30-40), μετά από τους οποίους αναλύεται εάν έχει συμβεί συσσώρευση μορίων δίκλωνου DNA στο μείγμα αντίδρασης.

Αυτή η παραλλαγή της PCR, όταν χρησιμοποιείται ως διαγνωστική μέθοδος, είναι μια ποιοτική μέθοδος. Μια θετική αντίδραση υποδηλώνει την παρουσία τουλάχιστον ιχνοποσοτήτων των επιθυμητών μορίων DNA στο δείγμα. Μια αρνητική αντίδραση υποδηλώνει την απουσία τους. Μια ποσοτική εκτίμηση της περιεκτικότητας των αρχικών μορίων DNA στο δείγμα είναι αδύνατη λόγω του ότι η αντίδραση φτάνει σε ένα οροπέδιο.

Η κύρια μέθοδος για την ανίχνευση της παρουσίας του προϊόντος είναι η ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης ή πολυακρυλαμιδίου. Τα προϊόντα PCR διαχωρίζονται στο πήκτωμα υπό τη δράση ηλεκτρικού πεδίου ανάλογα με το μοριακό τους βάρος. Μια παρεμβαλλόμενη χρωστική προστίθεται στο πήκτωμα (φθορισμού σε κατάσταση που σχετίζεται με δίκλωνο DNA - πιο συχνά βρωμιούχο αιθίδιο). Έτσι, όταν εκτίθεται στο υπεριώδες φως, θα είναι δυνατό να διαπιστωθεί η παρουσία ή η απουσία μιας λωρίδας που αντιστοιχεί σε DNA του απαιτούμενου μοριακού βάρους. Κατά τη διεξαγωγή PCR για διαγνωστικούς σκοπούς, τοποθετούνται πάντα μάρτυρες θετικής και αρνητικής αντίδρασης, με τα οποία συγκρίνονται τα δείγματα (βλ. Εικ. 4).

PCR σε πραγματικό χρόνο

Σε αυτήν την έκδοση της διάταξης PCR, η ποσότητα του προϊόντος PCR στο μίγμα της αντίδρασης καταγράφεται συνεχώς κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Αυτό σας επιτρέπει να δημιουργήσετε μια καμπύλη αντίδρασης (βλ. Εικ. 3) και, βάσει αυτής, να υπολογίσετε τον αριθμό των επιθυμητών μορίων DNA στα δείγματα.

Ένας τύπος PCR πραγματικού χρόνου είναι η χρήση μιας παρεμβαλλόμενης χρωστικής που προστίθεται απευθείας στο μείγμα αντίδρασης (το SYBRGreen χρησιμοποιείται πιο συχνά). Ένας άλλος τύπος είναι η χρήση ενός από τους τύπους ανιχνευτών φθορισμού που συνδέονται σε μια θέση μέσα στο προϊόν PCR, γεγονός που καθιστά δυνατή την αύξηση της ειδικότητας της ανίχνευσης (βλ. Εικ. 5).Η ανίχνευση φθορισμού λαμβάνει χώρα απευθείας στη συσκευή κατά τη διάρκεια της αντίδρασης.

Εκτός από τη δυνατότητα ποσοτικής ανίχνευσης, υπάρχουν και άλλα πλεονεκτήματα της PCR σε πραγματικό χρόνο σε σύγκριση με τη συμβατική PCR. Αυτή η παραλλαγή PCR είναι απλούστερη, ταχύτερη και δεν απαιτεί άνοιγμα σωλήνων με προϊόντα PCR, γεγονός που μειώνει την πιθανότητα μόλυνσης άλλων δειγμάτων. Το κύριο μειονέκτημα είναι το υψηλότερο κόστος ενός ενισχυτή με ενσωματωμένη ικανότητα ανίχνευσης φθορισμού σε σύγκριση με έναν συμβατικό.

Ψηφιακή ποσοτική PCR

Μια νέα, ακριβή και ακόμη μη ευρέως χρησιμοποιούμενη έκδοση της PCR, η οποία επιτρέπει τον ακριβέστερο προσδιορισμό της ποσότητας του DNA σε ένα δείγμα. Σε αυτήν την έκδοση, το μείγμα αντίδρασης που περιέχει μια φθορίζουσα χρωστική ουσία χωρίζεται σε έναν τεράστιο αριθμό μικροσκοπικών όγκων (για παράδειγμα , σταγονίδια σε ένα γαλάκτωμα). Μετά την PCR, αναλύεται σε ποια αναλογία των σταγονιδίων η αντίδραση αποδείχθηκε θετική και, κατά συνέπεια, παρατηρείται φθορισμός. Αυτή η αναλογία θα είναι ανάλογη με τον αριθμό των μορίων DNA που ενδιαφέρουν στο δείγμα.

PCR αντίστροφης μεταγραφής

Σε αυτή την περίπτωση, πριν από τη μία ή την άλλη παραλλαγή PCR, πραγματοποιείται αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής (RNA σε DNA) χρησιμοποιώντας το αντίστροφο ένζυμο. Έτσι, αυτή η μέθοδος επιτρέπει ποιοτική ή ποσοτική ανίχνευση μορίων RNA. Αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση ιών που περιέχουν RNA ή τον προσδιορισμό του επιπέδου μεταγραφής (η ποσότητα του mRNA) ενός συγκεκριμένου γονιδίου.

Εικόνα 1.Βήματα PCR. Τα αστάρια σημειώνονται με κόκκινο χρώμα.

Σχήμα 2.Συσσώρευση μορίων δίκλωνου DNA περιορισμένων σε εκκινητές κατά τη διάρκεια της PCR.

Εικόνα 3Η δυναμική της αντίδρασης PCR σε διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις των επιθυμητών μορίων DNA στο δείγμα. (α) - η υψηλότερη συγκέντρωση (β) - ενδιάμεση συγκέντρωση (γ) - η χαμηλότερη συγκέντρωση

Εικόνα 4Ηλεκτροφόρηση αγαρόζης προϊόντων PCR. K+ - θετικός έλεγχος (προφανώς υπάρχει το απαιτούμενο DNA). 1-7 - δείγματα δοκιμής (από τα οποία 1-2 είναι θετικά, 3-7 είναι αρνητικά). K--αρνητικός έλεγχος (λείπει σίγουρα το επιθυμητό DNA). Σε πολλές περιπτώσεις, εκτός από το προϊόν-στόχο, είναι ορατά ελαφρύτερα μη ειδικά προϊόντα αντίδρασης (διμερή εκκινητών).

Εικόνα 5Μέθοδοι ανίχνευσης με χρήση PCR σε πραγματικό χρόνο. (α) - παρεμβαλλόμενη χρωστική - φθορίζει όταν δεσμεύεται σε δίκλωνο DNA (β) - ανιχνευτής Taqman - ο φθορισμός εμφανίζεται όταν ο ανιχνευτής διασπάται από πολυμεράση DNA με δραστηριότητα ενδονουκλεάσης 5'-3' λόγω του διαχωρισμού του φθοροφόρου και του σβηστήρα. (γ) MolecularBeacon probe - φθορισμός εμφανίζεται όταν ο ανιχνευτής υβριδοποιείται με το θραύσμα στόχο λόγω του χωρικού διαχωρισμού του φθοροφόρου και του σβηστήρα (δ) - LightCycler probes - φθορισμός δέκτης εμφανίζεται όταν οι ανιχνευτές (που περιέχουν δέκτη και δότη) υβριδοποιούνται με τον στόχο θραύσμα λόγω της μεταφοράς ενέργειας συντονισμού φθορισμού (FRET).

Στο τέλος του άρθρου, βλ
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR, PCR)εφευρέθηκε το 1983 από τον Carey Mullis (αμερικανό επιστήμονα). Στη συνέχεια, έλαβε το βραβείο Νόμπελ για αυτήν την εφεύρεση. Επί του παρόντος, η διάγνωση PCR είναι μια από τις πιο ακριβείς και ευαίσθητες μεθόδους για τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών.
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)- μια πειραματική μέθοδος μοριακής βιολογίας, μια μέθοδος σημαντικής αύξησης μικρών συγκεντρώσεων ορισμένων θραυσμάτων νουκλεϊκού οξέος (DNA) σε βιολογικό υλικό (δείγμα).
Η μέθοδος PCR βασίζεται στον επαναλαμβανόμενο διπλασιασμό ενός συγκεκριμένου τμήματος του DNA με τη βοήθεια ενζύμων υπό τεχνητές συνθήκες (in vitro). Ως αποτέλεσμα, παράγονται επαρκείς ποσότητες DNA για οπτική ανίχνευση. Στην περίπτωση αυτή, αντιγράφεται μόνο η περιοχή που πληροί τις καθορισμένες προϋποθέσεις και μόνο εάν υπάρχει στο υπό μελέτη δείγμα.
Εκτός από την απλή αύξηση του αριθμού των αντιγράφων DNA (αυτή η διαδικασία ονομάζεται ενίσχυση), η PCR επιτρέπει πολλούς άλλους χειρισμούς με γενετικό υλικό (εισαγωγή μεταλλάξεων, μάτισμα θραυσμάτων DNA) και χρησιμοποιείται ευρέως στη βιολογική και ιατρική πρακτική, για παράδειγμα, για τη διάγνωση ασθενειών (κληρονομικές, μολυσματικές), για τη διαπίστωση της πατρότητας, για την κλωνοποίηση γονιδίων, την εισαγωγή μεταλλάξεων, την απομόνωση νέων γονιδίων.

Ιδιαιτερότητα και εφαρμογή

Διεξαγωγή PCR

Για την PCR, στην απλούστερη περίπτωση, απαιτούνται τα ακόλουθα στοιχεία:

  • Πρότυπο DNA που περιέχει το τμήμα του DNA που πρόκειται να ενισχυθεί.
  • δύο εκκινητές συμπληρωματικοί προς τα άκρα του επιθυμητού θραύσματος.
  • θερμοσταθερή πολυμεράση DNA;
  • τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (Α, G, C, Τ);
  • Ιόντα Mg2+ απαραίτητα για τη λειτουργία της πολυμεράσης.
  • ρυθμιστικό διάλυμα.

Η PCR πραγματοποιείται σε έναν ενισχυτή - μια συσκευή που παρέχει περιοδική ψύξη και θέρμανση δοκιμαστικών σωλήνων, συνήθως με ακρίβεια τουλάχιστον 0,1 ° C. Για να αποφευχθεί η εξάτμιση του μίγματος της αντίδρασης, ένα έλαιο υψηλής βρασμού, όπως η βαζελίνη, προστίθεται στον δοκιμαστικό σωλήνα. Η προσθήκη ειδικών ενζύμων μπορεί να αυξήσει την απόδοση της αντίδρασης PCR.
Πρόοδος αντίδρασης

Συνήθως, κατά τη διεξαγωγή PCR, εκτελούνται 20 - 35 κύκλοι, καθένας από τους οποίους αποτελείται από τρία στάδια. Το εκμαγείο δίκλωνου DNA θερμαίνεται στους 94 - 96°C (ή στους 98°C εάν χρησιμοποιείται μια ιδιαίτερα θερμοσταθερή πολυμεράση) για 0,5 - 2 λεπτά για να επιτραπεί ο διαχωρισμός των κλώνων DNA. Αυτό το στάδιο ονομάζεται μετουσίωση - οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των δύο αλυσίδων καταστρέφονται. Μερικές φορές, πριν από τον πρώτο κύκλο, το μείγμα αντίδρασης προθερμαίνεται για 2-5 λεπτά για να μετουσιωθεί πλήρως το εκμαγείο και τα αστάρια.
Όταν οι κλώνοι διαχωρίζονται, η θερμοκρασία μειώνεται για να επιτραπεί στους εκκινητές να συνδεθούν με το μονόκλωνο πρότυπο. Αυτό το στάδιο ονομάζεται ανόπτηση. Η θερμοκρασία ανόπτησης εξαρτάται από τα αστάρια και συνήθως επιλέγεται 4 - 5°C κάτω από το σημείο τήξης τους. Χρόνος σκηνής - 0,5 - 2 λεπτά.

Η DNA πολυμεράση αντιγράφει τον κλώνο του εκμαγείου χρησιμοποιώντας τον εκκινητή ως εκκινητή. Αυτό είναι το στάδιο επιμήκυνσης. Η θερμοκρασία επιμήκυνσης εξαρτάται από την πολυμεράση. Οι πολυμεράσες που χρησιμοποιούνται συχνά είναι πιο δραστικές στους 72°C. Ο χρόνος επιμήκυνσης εξαρτάται τόσο από τον τύπο της DNA πολυμεράσης όσο και από το μήκος του θραύσματος που θα ενισχυθεί. Τυπικά, ο χρόνος επιμήκυνσης θεωρείται ένα λεπτό για κάθε χίλια ζεύγη βάσεων. Μετά το τέλος όλων των κύκλων, συχνά πραγματοποιείται ένα πρόσθετο στάδιο τελικής επιμήκυνσης προκειμένου να ολοκληρωθούν όλα τα μονόκλωνα θραύσματα. Αυτό το στάδιο διαρκεί 10 - 15 λεπτά.
Προετοιμασία υλικού για έρευνα και μεταφορά του στο εργαστήριο

Για μια επιτυχημένη ανάλυση, είναι σημαντικό να συλλέξετε σωστά το υλικό από τον ασθενή και να το προετοιμάσετε σωστά. Είναι γνωστό ότι στην εργαστηριακή διάγνωση η πλειοψηφία των λαθών (έως και 70%) γίνονται στο στάδιο της προετοιμασίας του δείγματος. Για τη λήψη αίματος στο εργαστήριο INVITRO, χρησιμοποιούνται σήμερα συστήματα κενού, τα οποία αφενός τραυματίζουν ελάχιστα τον ασθενή και, αφετέρου, επιτρέπουν τη λήψη του υλικού με τέτοιο τρόπο ώστε να μην έρχεται σε επαφή. είτε με το προσωπικό είτε με το περιβάλλον. Έτσι αποφεύγεται η μόλυνση (μόλυνση) του υλικού και διασφαλίζεται η αντικειμενικότητα της ανάλυσης PCR.

DNA - δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ - ένα βιολογικό πολυμερές, ένας από τους δύο τύπους νουκλεϊκών οξέων που παρέχουν αποθήκευση, μετάδοση από γενιά σε γενιά και εφαρμογή του γενετικού προγράμματος για την ανάπτυξη και τη λειτουργία ζωντανών οργανισμών. Ο κύριος ρόλος του DNA στα κύτταρα είναι η μακροπρόθεσμη αποθήκευση πληροφοριών σχετικά με τη δομή του RNA και των πρωτεϊνών.


Το RNA - το ριβονουκλεϊκό οξύ είναι ένα βιολογικό πολυμερές, παρόμοιο στη χημική του δομή με το DNA. Το μόριο RNA είναι κατασκευασμένο από τις ίδιες μονομερείς μονάδες - νουκλεοτίδια με το DNA. Στη φύση, το RNA υπάρχει συνήθως ως μονή αλυσίδα. Σε ορισμένους ιούς, το RNA είναι ο φορέας της γενετικής πληροφορίας. Στο κύτταρο, παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταφορά πληροφοριών από το DNA στην πρωτεΐνη. Το RNA συντίθεται σε ένα πρότυπο DNA. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται μεταγραφή. Υπάρχουν τμήματα στο DNA που περιέχουν πληροφορίες που είναι υπεύθυνες για τη σύνθεση τριών τύπων RNA, που διαφέρουν ως προς τις λειτουργίες τους: αγγελιαφόρο ή αγγελιοφόρο RNA (mRNA), ριβοσωμικό (rRNA) και μεταφορά (tRNA). Και οι τρεις τύποι RNA εμπλέκονται στην πρωτεϊνοσύνθεση με τον ένα ή τον άλλο τρόπο. Ωστόσο, πληροφορίες για τη σύνθεση πρωτεϊνών περιέχονται μόνο στο mRNA.


Τα νουκλεοτίδια είναι η βασική επαναλαμβανόμενη μονάδα στα μόρια νουκλεϊκού οξέος, το προϊόν μιας χημικής ένωσης μιας αζωτούχου βάσης, ενός σακχάρου πέντε άνθρακα (πεντόζη) και μιας ή περισσότερων φωσφορικών ομάδων. Τα νουκλεοτίδια που υπάρχουν στα νουκλεϊκά οξέα περιέχουν μία φωσφορική ομάδα. Ονομάζονται ανάλογα με την αζωτούχα βάση που περιέχουν - αδενίνη (Α) που περιέχει αδενίνη, γουανίνη (G) - γουανίνη, κυτοσίνη (C) - κυτοσίνη, θυμίνη (Τ) - θυμίνη, ουρακίλη (U) - ουρακίλη. Το DNA αποτελείται από 4 τύπους νουκλεοτιδίων - A, T, G, C, το RNA έχει επίσης 4 τύπους - A, U, G, C. Το σάκχαρο στη σύνθεση όλων των νουκλεοτιδίων του DNA είναι δεοξυριβόζη, το RNA είναι ριβόζη. Κατά τον σχηματισμό των νουκλεϊκών οξέων, τα νουκλεοτίδια, δεσμεύοντας, σχηματίζουν μια σακχαροφωσφορική ραχοκοκαλιά του μορίου, στη μία πλευρά του οποίου υπάρχουν βάσεις.


Ένας εκκινητής είναι ένα σύντομο DNA που χρησιμοποιείται για την αντιγραφή του κλώνου προτύπου. Καθένας από τους εκκινητές είναι συμπληρωματικός με μία από τις αλυσίδες του δίκλωνου προτύπου, που πλαισιώνει την αρχή και το τέλος της ενισχυμένης περιοχής.


Βιβλιογραφία

  1. Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Αρχές και εφαρμογή. Ανά. από τα Αγγλικά. - Μ.: Μιρ, 2002. - 589 σ., εικονογράφηση. ISBN 5-03-003328-9
  2. Shchelkunov S.N. Γενετική μηχανική - Novosibirsk: Sib. πανεπιστημ. εκδοτικός οίκος, 2004. - 496 σ.; Εγώ θα. ISBN 5-94087-098-8
  3. Patrushev L.I. Τεχνητά γενετικά συστήματα - M .: Nauka, 2005 - Σε 2 τόμους - ISBN 5-02-033278-X

ΣΠΟΥΔΑΙΟΣ!

Οι πληροφορίες αυτής της ενότητας δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται για αυτοδιάγνωση ή αυτοθεραπεία. Σε περίπτωση πόνου ή άλλης έξαρσης της νόσου, μόνο ο θεράπων ιατρός πρέπει να συνταγογραφήσει διαγνωστικές εξετάσεις. Για διάγνωση και σωστή θεραπεία, θα πρέπει να επικοινωνήσετε με το γιατρό σας.