Поскольку FISH-тест позволяет выявить генетические отклонения, вызывающие рак, он является эффективным методом диагностики некоторых видов рака. Тест также используется для подтверждения поставленного диагноза и позволяет получить дополнительную информацию о возможном исходе болезни и целесообразности применения химиотерапии.
Например, у пациентов с раком молочной железы FISH-тест ткани, взятой при биопсии, помогает определить наличие в клетках копий HER2-гена.
Клетки с копиями HER2-гена имеют большее количество HER2-рецепторов, которые получают сигналы, стимулирующие рост раковых клеток в молочной железе. Поэтому для пациентов с копиями HER2-гена целесообразно применение герцептина (трастузумаба) - средства, угнетающего способность HER2-рецепторов принимать сигналы.
Из-за высокой стоимости и относительной недоступности FISH-теста чаще применяют другой тест на выявление рака молочной железы - иммуногистохомию (ИГХ).
Во врачебных кругах ведутся споры относительно высокой эффективности FISH-теста по сравнению со стандартными тестами. Однако благодаря техническому прогрессу FISH-тест становится все дешевле и доступнее в разнообразных клинических условиях.
Как работает FISH-тест
При проведении FISH-теста на образце ткани пациента используются флуоресцентные метки, которые связываются только с определенными участками хромосом. Затем с помощью флуоресцентного микроскопа определяют участки хромосом, с которыми связались флуоресцентные зонды, и наличие возможных отклонений, провоцирующих развитие рака.
В раковых клетках могут обнаруживаться следующие отклонения:
- транслокация - перенос участка хромосомы в новое положение на той же или другой хромосоме;
- инверсия - разворот участка хромосомы на 180 градусов при сохранении соединения с самой хромосомой;
- делеция - утрата части хромосомы;
- дупликация - удвоение участка хромосомы, приводящее к избыточному содержанию копий гена в клетке.
Транслокации помогают диагностировать некоторые виды лейкемии, лимфомы и саркомы. Наличие дупликации в раковых клетках молочной железы помогает врачу подобрать оптимальное лечение.
Преимущество FISH-теста перед стандартными цитогенетическими тестами (исследующими генетический состав клеток) состоит в том, что он позволяет определить даже самые небольшие генетические изменения, которые нельзя рассмотреть при помощи обычного микроскопа.
Другим важным отличием FISH-теста является возможность его проведения на клетках, которые еще не начали активно развиваться. Другие тесты выполняются на клетках только после их роста в лабораторных условиях в течение двух недель, поэтому весь процесс может занимать до трех недель, а результаты FISH-теста становятся известны уже через несколько дней.
Примеры FISH-теста для диагностики рака
Хотя FISH-тест чаще всего применяется для анализа генетических отклонений при раке молочной железы, он также помогает получить важную информацию о других видах рака.
Например, при диагностике рака мочевого пузыря FISH-тест клеток мочи дает более точные результаты, чем тесты на атипичные клетки. Кроме того, он позволяет определить рецидив рака мочевого пузыря на 3-6 месяцев раньше.
FISH-тест также помогает обнаружить отклонения в хромосомах при лейкозе, включая клетки, свидетельствующие об агрессивной форме хронического лимфолейкоза (ХЛЛ). Пациентам с агрессивной формой ХЛЛ может требоваться срочное лечение, в то время как при менее агрессивных формах может быть достаточно наблюдения.
Споры о FISH-тесте
Не все эксперты согласны с тем, что FISH-тест является наиболее точным анализом для диагностики видов рака, восприимчивых к герцептину.
В 2010 году ученые из института Mayo (Ирландия) заявили, что менее дорогостоящий ИГХ-тест почти настолько же эффективен для определения восприимчивости к герцептину, как и FISH-тест.
Другие эксперты критикуют FISH-тест за невозможность обнаружения малых мутаций, таких как небольшие делеции, вставки и точечные мутации, а также за игнорирование некоторых инверсий.
Совершенствование FISH-теста
Несмотря на то что технология FISH-теста позволяет анализировать пока не все участки хромосом, она постоянно развивается в этом направлении.
Например, в 2007 году канадские ученые объявили о разработке чипа размером с предметное стекло микроскопа, который позволит проводить FISH-тест при помощи устройства, помещающегося в ладони.
Этот усовершенствованный тест, получивший название «FISH-тест на чипе», позволит получить результаты в течение одного дня и будет стоить дешевле других тестов
Определение HER-2 статуса опухоли методом FISH - исследование предрасположенности к развитию опухоли и подбор своевременного адекватного лечения при раке молочной железы (РМЖ) или раке желудка (РЖ).
HER-2 (HER-2/neu) - human epidermal growth factor receptor-2 - это белок, который может влиять на рост раковых клеток. Он создается специальным геном, который называется ген HER-2/neu. HER-2 является рецептором для определённого фактора роста, который называется человеческим эпидермальным фактором роста, естественным образом существующим у человека. Когда человеческий эпидермальный фактор роста прикрепляется к рецепторам HER-2 на раковых клетках груди, он может стимулировать рост и деление этих клеток. В здоровой ткани HER-2 передаёт сигналы, регулирующие пролиферацию и выживаемость клеток, но гиперэкспрессия HER-2 может обусловить злокачественную трансформацию клеток.
Гиперэкспрессия HER-2 при некоторых подтипах РМЖ ведёт к усилению пролиферации и ангиогенеза, нарушению регуляции апоптоза (генетически запрограммированного самоуничтожения клеток). Показано, что при раке молочной железы гиперэкспрессия этого рецептора в ткани опухоли ассоциирована с более агрессивным течением болезни, повышенным метастатическим потенциалом опухоли и менее благоприятным прогнозом. Открытие связи гиперэкспрессии HER-2 с неблагоприятным прогнозом РМЖ привело к поиску таких подходов к лечению, которые направлены на специфическое блокирование онкогена HER-2/neu (таргетная анти-HER2-терапия).
Рак молочной железы (РМЖ) - злокачественная опухоль железистой ткани молочной железы. РЖМ занимает первое место среди всех злокачественных заболеваний у женщин.
В зависимости от наличия биологических маркёров опухоли - экспрессии гормональных рецепторов (эстрогена и/или прогестерона), экспрессии HER-2 - выделяют гормон-рецептор-положительный, HER-2-положительный и тройной негативный РМЖ.
HER-2/neu-положительные (HER-2+) типы рака молочной железы отличаются высокой экспрессией белка HER-2/neu.
HER=2/neu-негативные (HER-2-) типы рака молочной железы отличаются низкой экспрессией или отсутствием белка HER-2/neu.
Считается, что у одной из пяти женщин с раком груди опухоль является HER-2-положительной. Большинство раковых опухолей молочной железы являются гормонально-зависимыми: эстрогены и прогестерон оказывают на них стимулирующий эффект (пролиферативный и неопластический). При HER-2-положительном раке молочной железы на поверхности опухолевых клеток присутствует избыток HER-2-рецепторов. Данное явление носит название «положительный HER-2-статус» и диагностируется у 15–20% женщин, страдающих РМЖ.
HER-2 - рецептор эпидермального фактора роста человека 2-го типа, который присутствует в тканях и в норме, участвуя в регуляции деления и дифференцировки клеток. Его избыток на поверхности опухолевых клеток (гиперэкспрессия) предопределяет быстрый неконтролируемый рост новообразования, высокий риск метастазирования, низкую эффективность некоторых видов лечения. HER-2-положительный РМЖ является особенно агрессивной формой данного заболевания, поэтому точное определение HER-2-статуса имеет ключевое значение для выбора тактики лечения.
Рак желудка (РЖ) - злокачественная опухоль, происходящая из эпителия слизистой оболочки желудка.
РЖ занимает 4-е место в структуре онкологической заболеваемости и 2-е место в структуре онкологической смертности в мире. Заболеваемость РЖ у мужчин в 2 раза выше, чем у женщин. Россия относится к регионам с высоким уровнем заболеваемости РЖ и смертности от данного заболевания. Диагностика РЖ на ранних стадиях затруднена из-за длительного бессимптомного течения заболевания. Часто РЖ выявляют на поздних стадиях, когда 5-летняя выживаемость не превышает 5–10%, а единственным методом лечения остаётся химиотерапия.
Основным методом лечения РЖ является хирургический. Однако у большинства пациентов на момент постановки диагноза определяется распространённый опухолевый процесс, что делает невозможным выполнение радикальной операции и требует проведения системной лекарственной терапии. Проведение химиотерапии статистически достоверно увеличивает общую выживаемость больных метастатическим РЖ, улучшая качество их жизни.
Онкоген HER-2 (erbB-2) был первоначально идентифицирован в опухолях молочной железы. Амплификация и гиперэкспрессия данного гена является относительно специфическим событием для карцином молочной железы и практически не встречается в опухолях других локализаций. Рак желудка представляется одним из немногих исключений: активация HER-2 отмечается примерно в 10–15% злокачественных новообразований этого органа и коррелирует с агрессивным течением заболевания.
Гиперэкспрессия HER-2 является фактором неблагоприятного прогноза. По данным разных исследований, амплификация гена HER-2 у больных РЖ коррелирует с низкими показателями общей выживаемости.
Для оценки HER-2-статуса при РЖ и РМЖ используют FISH метод.
FISH - исследования позволяет определять качественные и количественные изменения хромосом для диагностики злокачественных заболеваний крови и солидных опухолей.
Сегодня во всём мире широко применяются исследования методом FISH.
Метод FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) - изучение числа HER-2/neu-генов внутри раковых клеток.
Показания:
- рак молочной железы - в целях прогноза и подбора терапии;
- рак желудка - в целях прогноза и подбора терапии.
Определяется лечащим врачом.
Необходимы гистологический протокол и иммуногистохимический протокол, стекло ИГХ.
Интерпретация результатов
Результаты FISH-теста выражаются следующим образом:
1. Положительный (повышенное содержание, есть амплификация гена HER-2):
- HER-2-положительный рак молочной железы;
- HER-2-отрицательный рак молочной железы.
Во всех без исключения случаях образование и рост связано с деятельностью гена типа HER2. Именно он отвечает за то, какое количество белков будет выделено женскому организму для развития тканей молочной железы. Когда перерождаются первые здоровые клетки в злокачественные, в рецепторы гена поступает информация о том, что требуется дополнительное деление клеточного материала.
Ген запускает программу наращивания дополнительных тканей внутри груди, хотя на самом деле этот клеточный материал будет использован опухолью для своего роста и развития. Так, карцинома, по сути, обманывает организм, и заставляет его питать рак за счет своих же ресурсов.
Задача фиш анализа при раке молочной железы, как раз и заключается в том, чтобы выявить неправильную работу гена HER2, и предпринять соответствующие меры реагирования в части назначения адекватного медицинского лечения.
Если своевременно не провести фиш тест при раке молочной железы, то даже в случае применения в процессе лечения тех или иных препаратов - это может привести к тому, что опухоль и дальше будет агрессивно развиваться, охватывать все новые ткани груди. Это так званые, последствия не правильно назначенной терапии из-за отсутствия объективных данных о функционировании HER2 гена.
В процессе прохождения фиш анализа врачом вводится в кровь пациентки специальные вещества, содержащие окрашивающие элементы, которые способны визуаллизировать картину хромосомных нарушений. Таким образом, доктор способен наглядно увидеть, а в дальнейшем изучить генетические аномалии в геноме женщины, которые привели к развитию онкологии груди.
Если отклонения в работе гена HER2 подтверждаются, то назначается соответствующее лечение. Если же нет, то врач с помощью других анализов устанавливает иную причину развития РМЖ.
Еще одним важным достоинством фиш анализа является то, что уже через пару дней пациент получает комплексный отчет о генетической предрасположенности к развитию того или иного онкологического заболевания. С помощью данного медицинского тестирования можно одновременно диагностировать патологию не только молочной железы, но и всех органов брюшной полости.
Информативное видео
Краткий ответ : Метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH - fluorescence in situ hybridization) включает применение уникальных нуклеотидных последовательностей ДНК в качестве зонда для поиска нужных последовательностей ДНК в материале, полученном от пациента. Метод основан на комплементарном связывании ДНК-зонда с ДНК метафазных хромосом или интерфазных клеток. ДНК-зонд и исследуемую ДНК денатурируют, образуется одноцепочная ДНК. ДНК-зонд добавляют к препарату хромосом, инкубируют определенное время. Присутствие или отсутствие меченного флюорохромом зонда в составе ДНК после гибридизации определяется при исследовании хромосом с помощью флюоресцентной микроскопии.
Развёрнутый ответ
:
Метод флуоресцентной гибридизации in situ
позволяет выявлять индивидуальные хромосомы или их отдельные участки на препаратах метафазных хромосом или интерфазных ядрах на основе комплементарного взаимодействия ДНК-зонда, конъюгированного с флуоресцентной меткой и искомого участка на хромосоме. Для визуализации на хромосоме пептидно-нуклеиновых соединений применяют PNA-зонды на основе белкового продукта.
Метод основан на комплементарном связывании ДНК-зонда с ДНК метафазных хромосом или интерфазных клеток и включает следующие этапы:
1. Денатурация
двухцепочечной ДНК зонда и ДНК мишени до одноцепочечных под воздействием высокой температуры или химических агентов.
2. Гибридизация
ДНК-зонда с ДНК-мишенью по принципу комплементарности с образованием двухцепочечной гибридной молекулы
3. Постгибридизационная отмывка
для удаления негибридизовавшегося ДНК-зонда
4. Анализ
гибридизационных сигналов с люминисцентном микроскопе
Преимущества
метода молекулярно-генетической диагностики FISH включают быстрый анализ большого числа клеток, высокую чувствительность и специфичность, возможность исследовать некультивируемые и неделящиеся клетки.
Недостатки
метода заключаются в невозможности получить информацию о физическом состоянии исследуемой ДНК или участка хромосомы.
FISH применяют в пренатальной молекулярно-генетической диагностике и для характеристики опухолей; в педиатрической практике его используют, как правило, для идентификации субмикроскопических делеций, ассоциированных со специфическими пороками развития. Синдромы, в основе которых лежат микроделеции, раньше считались заболеваниями неизвестной этиологии, так как хромосомные делеции и перестройки, вызывающие развитие этих заболеваний, обычно не визуализируются при традиционных методах хромосомного анализа. Такие мелкие делеции в специфических участках хромосом можно с большой точностью выявить методом FISH. К заболеваниям, обусловленным субмикроскопическими делециями, относятся синдромы Прадера-Вилли, Ангельмана, Вильямса, Миллера-Дикера, Смит-Мадженис и велокардиофациальный синдром
. FISH облегчает диагностику этих синдромов в нетипичных случаях, особенно в младенческом возрасте, когда еще отсутствуют многие диагностически значимые признаки заболевания. Применение этого метода молекулярно-генетической диагностики целесообразно также в подростковом и во взрослом возрасте, когда типичные клинические признаки заболевания, характерные для детского возраста, претерпевают изменения.
121. ДНК-зонды. Их применение в определении наследственных заболеваний.
Краткий обзор
ДНК – зонд - это короткий фрагмент ДНК, конъюгированный с флуоресцеином, ферментно, или радиоактивным изотопом, который используется для гибридизации с комплементарным участком молекулы ДНК – мишени.
Основная часть
Системы ДНК-диагностики
Информация о всем многообразии свойств организма заключена в его генетическом материале. Так, патогенность бактерий определяется наличием у них специфического гена или набора генов, а наследственное генетическое заболевание возникает в результате повреждения определенного гена. Сегмент ДНК, детерминирующий данный биологический признак, имеет строго определенную нуклеотидную последовательность и может служить диагностическим маркером.
В основе многих быстрых и надежных диагностических методов лежит гибридизация нуклеиновых кислот - спаривание двух комплементарных сегментов разных молекул ДНК. Процедура в общих чертах состоит в следующем.
1. Фиксация одноцепочечной ДНК-мишени на мембранном фильтре.
2. Нанесение меченой одноцепочечной ДНК-зонда, которая при определенных условиях (температуре и ионной силе) спаривается с ДНК-мишенью.
3. Промывание фильтра для удаления избытка несвязавшейся меченой ДНК-зонда.
4. Детекция гибридных молекул зонд/мишень.
В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевыми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции гибридизационного сигнала. Система детекции должна быть в высшей степени специфичной и высокочувствительной.
*Флуоресцеин (диоксифлуоран, уранин А) - органическое соединение, флуоресцентный краситель. В аналитической химии флуоресцеин используется в качестве люминесцентного кислотно-основного индикатора. В биохимии и молекулярной биологии изотиоцианатные производные флуоресцеина в качестве биологических красок для определения антигенов и антител.
* Детекция – это обнаружение, выявление, нахождение чего либо.
*конъюгирование=сопряжение
*Если в одной "пробирке" провести плавление и отжиг смеси ДНК, например, человека и мыши, то некоторые участки цепей ДНК мыши будут воссоединяться с комплементарными участками цепей ДНК человека с образованием гибридов. Число таких участков зависит от степени родства видов. Чем ближе виды между собой, тем больше участков комплементарности нитей ДНК. Это явление называется гибридизация ДНК-ДНК.
122. Методы и условия применения прямой ДНК-диагностики.
Краткий обзор:
С помощью прямых методов выявляются нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК (мутации и их типы). Прямые методы отличаются точностью, достигающей почти 100 %.
Целью прямой диагностики является идентификация мутантных аллелей (нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, мутации и их типы).
Недостатком метода прямой ДНК-диагностики является необходимость знания точной локализации гена и спектра его мутаций. Методы прямой ДНК-диагностики показаны для таких заболеваний, как фенилкетонурия (мутация R408W), муковисцидоз - (наиболее частая мутация delF508), хорея Гентингтона (экспансия тринуклеотидных повторов-CTG-повторы) и др.
Полный ответ:
С помощью прямых методов выявляются нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК (мутации и их типы). Прямые методы отличаются точностью, достигающей почти 100 %. Однако на практике указанные методы могут применяться при определенных условиях:
1) известной цитогенетической локализации гена, ответственного за развитие наследственного заболевания,
2) должен быть клонированным ген заболевания и известна его нуклеотидная последовательность.
Целью прямой диагностики является идентификация мутантных аллелей (нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, мутации и их типы). Высокая точность метода прямой ДНК-диагностики в большинстве случаев не требует ДНК-анализа всех членов семьи, так как выявление мутации в соответствующем гене позволяет почти со 100-процентной точностью подтвердить диагноз и определить генотип всех членов семьи больного ребенка, включая гетерозиготных носителей.
Недостатком метода прямой ДНК-диагностики является необходимость знания точной локализации гена и спектра его мутаций.
Методы прямой ДНК-диагностики показаны для таких заболеваний, как фенилкетонурия (мутация R408W), муковисцидоз - (наиболее частая мутация delF508), хорея Гентингтона (экспансия тринуклеотидных повторов-CTG-повторы) и др.
Однако к настоящему времени гены многих заболеваний не картированы, неизвестна их экзонно-интронная организация, и многие наследственные болезни отличаются выраженной генетической гетерогенностью, что не позволяет в полной мере использовать прямые методы ДНК-диагностики. Поэтому информативность метода прямой ДНК-диагностики широко варьирует. Так, при диагностике хореи Гентингтона, ахондроплазии она составляет 100 %, при фенилкетонурии, муковосицидозе, адреногенитальном синдроме - от 70 до 80 %, а при болезни Вильсона-Коновалова и миопатии Дюшенна/Бекера - 45-60 %. В связи с этим используются косвенные методы молекулярно-генетической диагностики наследственных болезней.
Техника FISH — Fluorescent in situ hybridization, разработана в середине 1980-х годов и используется для детекции присутствия или отсутствия специфических ДНК-последовательностей на хромосомах, а также альфа-сателлита ДНК, локализованного на центромере хромосомы 6, CEP6(6р11.1-q11.1).
Это дало существенный сдвиг в диагностике онкологических заболеваний меланоцитарного генеза произошел в связи с обнаружением опухолевых антигенов. На фоне злокачественной определяется мутация в трех антигенах: CDK2NA (9p21), CDK4 (12q14) и CMM1(1p). В связи с этим возможность объективной дифференциальной диагностики, основанной на определении генетических характеристик меланоцитарных опухолей кожи, имеет большое значение в ранней диагностике меланомы и ее предшественников.В ядре с нормальным набором исследуемых генов и хромосомы 6 наблюдается два гена RREB1, окрашенных красным, два гена MYB, окрашенных желтым, два гена CCND1, выделенных зеленым цветом, и две центромеры хромосомы 6, обозначенные голубым цветом. С диагностической целью используются флуоресцентные пробы.
Оценка результатов реакции: проводится подсчет количества красного, желтого, зеленого и голубого сигналов в 30 ядрах каждого образца, выявляются четыре параметра различных вариантов генетических нарушений, при которых образец генетически соответствует меланоме. Например, образец соответствует меланоме, если среднее количество гена CCND1 на ядро ≥2,5. По этому же принципу производится оценка копийности других генов. Препарат считается FISH-положительным, если выполняется хотя бы одно из четырех условий. Образцы, в которых все четыре параметра ниже пограничных значений, расцениваются как FISH-отрицательные.
Определение специфических ДНК-последовательностей на хромосомах проводят на срезах биоптатов или операционного материала. В практическом исполнении FISH-реакция выглядит следующим образом: исследуемый материал, содержащий ДНК в ядрах меланоцитов, подвергается обработке для частичного разрушения ее молекулы с целью разрыва двухцепочной структуры и тем самым облегчения доступа к искомому участку гена. Пробы классифицируются по месту присоединения к молекуле ДНК. Материалом для FISH-реакции в клинической практике служат парафиновые срезы тканей, мазки и отпечатки.
FISH-реакция позволяет находить изменения, произошедшие в молекуле ДНК в результате увеличения числа копий гена, потери гена, изменения числа хромосом и качественных изменений — перемещения локусов генов как в одной и той же хромосоме, так и между двумя хромосомами.
Для обработки полученных данных при применении FISH-реакции и изучения зависимости между копийностью генов трех исследумых групп используется коэффициент корреляции Спирмена.
Для меланомы характерно увеличение копийности по сравнению с невусом и диспластическим невусом.
Простой невус по сравнению с диспластическим невусом имеет меньше нарушений в копийности (т.е. больше нормальных копийностей).
Для построения решающих правил, позволяющих предсказать, относится ли образец к тому или иному классу (дифференциальная диагностика простых и диспластических невусов), используется математический аппарат «деревьев решений» (decision trees). Данный подход хорошо зарекомендовал себя на практике, а результаты применения указанного метода (в отличие от многих других методов, например нейронных сетей) могут быть наглядно интерпретированы для построения решающих правил для дифференциации простого, диспластического невусов и меланомы. Исходными данными во всех случаях являлись копийности четырех генов.
Задачу по построению решающего правила для дифференциальной диагностики разбивают на несколько этапов. На первом этапе дифференцируют меланому и невус, не учитывая тип невуса. На следующем этапе строят решающее правило для разделения простого и диспластического невусов. Наконец на последнем этапе возможно построение «дерева решений» для определения степени дисплазии диспластического невуса.
Подобное разделение задачи классификации невусов на подзадачи позволяет достичь высокой точности предсказаний на каждом из этапов. Входными данными для построения «дерева решений» служат данные о копийности четырех генов для пациентов с диагнозом «меланома» и пациентов с диагнозом «не меланома» (пациенты с различными типами невуса — простым и диспластическим). Для каждого пациента имеются данные о копийности генов для 30 клеток.
Таким образом, разделение задачи предсказания диагноза на несколько этапов позволяет строить высокоточные решающие правила не только для дифференцирования между меланомой и невусами, но и для определения типа невусов и предсказания степени дисплазии для диспластического невуса. Построенные «деревья решений» являются наглядным способом предсказания диагноза по сведениям о копийностях генов и легко могут быть использованы в клинической практике при дифференциации доброкачественных, предзлокачественных и злокачественных меланоцитарных новообразований кожи. Предлагаемый дополнительный метод дифференциальной диагностики особенно важен при иссечении гигантских врожденных пигментных невусов и диспластических невусов у пациентов детского возраста, поскольку при обращении таких пациентов в медицинские учреждения отмечается высокий процент диагностических ошибок. Результаты использования описанного метода высокоэффективны, целесообразно его использовать при диагностике пигментных опухолей кожи, особенно у пациентов с FAMM-cиндромом.