Diagnostikas metode (ELISA) ir informatīva un nav pārāk dārga, tāpēc daudzas laboratorijas saviem klientiem piedāvā šo metodi (asins enzīmu imūntestu). Pētījums tiek veikts tukšā dūšā, asinis analīzei tiek ņemtas no pacienta elkoņa kaula vēnas. Pirms ELISA vēlams nesmēķēt un nelietot alkoholu.
Kāda ir asins analīze, izmantojot ELISA metodi?
Starp asins analīzes metodēm, lai novērtētu ķermeņa spēju pretoties infekcijas slimības un parāda slimības fāzi, svarīga vietaņem saistītais imūnsorbcijas tests(ELISA). Šī pētījuma veikšana ļauj vispusīgi novērtēt asins aizsargfunkcijas aktivitāti un noteikt imūndeficīta stāvokli infekcijas patoloģijas, arī asins slimības, autoimūnie procesi, hormonālās problēmas.
Šis laboratorijas tests, kas ļauj noteikt specifisku antivielu klātbūtni ( aizsardzības faktori proteīna rakstura asinis) pret noteiktiem antigēniem (patogēniem aģentiem). Starp antivielām primārā nozīme ir imūnglobulīniem, kas var pastāvēt imūnkompleksu veidā.
Imūnglobulīni veidojas cilvēka imūnsistēmas sarežģītu neirohumorālu reakciju rezultātā, kas rodas atsaucība svešu antigēnu ievadīšanai. Katrs patogēna veids ražo savas specifiskas antivielas. Tie darbojas, "saistot" antigēnu vai patoloģisku mikroorganismu, veidojot kompleksu "antigēna-antivielu" savienojumu, kam seko neitralizācija, fermentatīvā līze, fagocitozes reakcijas un izvadīšana no organisma. ELISA metode nosaka noteiktu kompleksu klātbūtni pacientam esošā patogēna vai kaitīgās vielas veids.
Der atcerēties, ka pēc ārstēšanas kursa antivielas mūsu organismā var saglabāties ļoti ilgu laiku, pat pēc tam, kad infekcija ir atstājusi mūsu ķermeni, t.i. paliek tā sauktā “seroloģiskā rēta”. Ņemsim piemēru: naksnīgajās debesīs ir tūkstošiem zvaigžņu. Daudzas no šīm zvaigznēm ir mirušas jau sen, bet to gaisma joprojām sasniedz mūs gadsimtiem ilgi. Būtībā mēs redzam tikai zvaigznes pēdas. Gaisma ir, bet zvaigzne jau sen pazudusi.
Bet, ja nav gaismas, tas nenozīmē, ka zvaigznes tur nebija. Tas pats ir ar antivielām. To klātbūtne negarantē vēlamā infekcijas izraisītāja klātbūtni organismā. Antivielu trūkums nenozīmē, ka nav infekcijas. Ja ELISA testa rezultāts ir pozitīvs, tas nozīmē, ka jums ir jāmeklē infekcija, izmantojot specifiskākas un dārgākas metodes - PCR, bakterioloģiskās kultūras. Iespējams nepatiess pozitīvs rezultāts ja vairākiem mikrobiem ir līdzīgi antigēna struktūra, tad pret dažādiem mikrobiem tiks ražotas “līdzīgas” antivielas.
Kas ir imūnglobulīni?
Atklātas un pētītas 5 galvenās imūnglobulīnu klases - IgA, IgM, IgG, IgD, IgE. pārējo loma vēl nav pilnībā noskaidrota un tiek pētīta zinātniski.
Imūnglobulīna A (IgA) galvenais uzdevums ir gļotādu aizsargfunkcijas elpceļi, kuņģa-zarnu trakta un urīnceļu sistēma. Akūtā slimības sākumā tos nav iespējams identificēt. Šie aizsargājošie kompleksi parādās tikai no 2. slimības sākuma nedēļas, dažreiz vēlāk. Lielākā daļa imūnglobulīna A ir koncentrēta gļotādas audos. Apmēram aptuveni 80%. Atlikušās antivielas cirkulē asinīs.
Galvenā funkcija ir mikroorganismu neitralizācija un iznīcināšana. Pēc norimšanas akūtas izpausmes slimību, šo imūnglobulīnu daudzums sāk samazināties un pilnībā izzūd līdz 8 nedēļām pēc slimības sākuma. Ja IgA tiek konstatēts vairāk vēlie datumi, tad tas liecina par hronisku procesu.
Galvenais un pirmais marķieris akūtā fāze attīstās patoloģija ir M klases (IgM) imūnglobulīni. Tie tiek atklāti 5. dienā pēc slimības sākuma. To klātbūtni asinīs var noteikt aptuveni 6 nedēļu laikā. Tad viņi sāk ātri pazust.
Atlikušo imūnreakciju raksturo imūnglobulīnu G (IgG) klātbūtne asinīs. Šo faktoru parādīšanās asinīs tiek konstatēta aptuveni mēnesi pēc slimības sākuma. Nākotnē tos var noteikt daudziem mēnešiem, gadiem un pat mūža garumā, piepildot aizsardzības funkcija no slimības atgriešanās (recidīva) un dažos gadījumos padarot neiespējamu patoloģijas sekundāro attīstību.
Ja imūnglobulīna G daudzums atkal sāk palielināties, tad var būt aizdomas par atkārtotu inficēšanos. Līdzīgu secinājumu var izdarīt, veicot divus vai trīs paraugus, kas ņemti ar 2 nedēļu intervālu.
Kā tiek veikta asins ELISA?
Enzīmu imūnanalīzei vairumā gadījumu tiek izmantotas pacienta asinis, dažreiz tiek savākti audi stiklveida, šķidrumi mugurkaula kanāls, amnija šķidrums.
Asinis tiek ievilktas caur injekcijas adatu šļircē no kubitālās vēnas. Pētījums tiek veikts tukšā dūšā. Jāatceras, ka, ņemot dažus medicīnas preces var ietekmēt analīzes rezultātu. Pirms asins nodošanas jums ir jāatturas no smēķēšanas un alkohola lietošanas. Narkotiku lietošana var izkropļot rezultātus.
Imūnglobulīnu IgM, IgG, IgA negatīvu vērtību gadījumā mēs varam runāt par slimības vai tās neesamību. sākuma fāze, arī rezultāts ar mīnusiem iespējams, kad pilnīga atveseļošanās pēc ievērojama laika posma.
Ja IgA un IgM netiek atklāti un IgG ir pozitīvs, tad visticamāk mēs runājam par par izveidojušos imunitāti pēc infekcijas slimības, vai pēc vakcinācijas.
Ja IgA un IgM nav konstatēti un IgG ir pozitīvs, tad, visticamāk, mēs runājam par imunitātes veidošanos pēc infekcijas slimības vai pēc vakcinācijas
Augsta IgM titra gadījumā ar negatīvām IgG un IgA vērtībām var secināt, ka pastāv akūta infekcijas slimība.
Vienlaicīgi pozitīvas vērtības imūnglobulīna rezultāti - IgA, IgM, IgG ir raksturīgi esošas hroniskas slimības recidīva akūtā fāzē.
Ko nodrošina prezentētā tehnoloģija: helmintu klātbūtnes noteikšana asinīs; citu patogēnu meklēšana organismā; jūs varat uzzināt savas veselības pasliktināšanās iemeslus; ārstēšana balstās arī uz šādā veidā iegūtiem testiem; Jūs varat uzraudzīt savas imūnsistēmas stāvokli.
Vēl viens laba īpašība– iespēja izsekot vēža marķieriem neatkarīgi no to izcelsmes, bet, protams, atkarībā no to klātbūtnes organismā. Šis tests piemērots arī stāvokļa raksturošanai reproduktīvā sistēma persona. Atsevišķu proteīnu, hormonu un peptīdu klātbūtne ļauj spriest par partnera potenciālu bērna ieņemšanas ziņā, kā arī par gaidāmā augļa kvalitāti.
Giardia asins analīze ir diezgan populāra prakse mūsdienu ārstu vidū. Turklāt šī pētījuma metode ir lielisks instruments biomedicīnas analītikai un kvantitatīvās statistikas iegūšanai attiecībā uz specifiskiem antigēniem.
Kā tiek izmantots ar enzīmu saistīts imūnsorbcijas tests?
Tiesa, tas ir vairāk sarežģīti gadījumi, tāpēc šādas analīzes kvalitāte lielā mērā būs atkarīga no laboratorijas personāla, kas veiks testēšanu. Tehnoloģijas iezīmes un atšķirības no vecajiem laboratorijas pētījumiem:
- tagad, lai noteiktu helmintu klātbūtni, izkārnījumu parauga vietā izmanto asinis;
- Laboratorijā paraugs tiek pētīts ļoti ātri, un pilnu informāciju var iegūt jau nākamajā dienā;
- laboratorijas pētījumu izmaksas ir lētas, jo teoloģija ir ļoti vienkārša;
- asins analīze helmintiem dod augsta veiktspēja precizitāte.
Imunoloģiskās asins analīzes testi, izmantojot ELISA
Tikai daži cilvēki zina, kādas ir asins analīzes no cilvēka imunoloģiskās sistēmas viedokļa, jo šīs pārbaudes nav tik izplatītas. Parasti šāda asins analīze sniedz informāciju par imūndeficīta vīrusu cilvēka organismā un ir anonīma, jo tā tiek veikta pēc pacienta pieprasījuma.
Paraugu ņemšanai izmanto tukšā dūšā no vēnas ņemtas asinis, no kurām centrifugējot iegūst serumu testēšanai. Turklāt, pētot asins serumu, var atklāt vairākas veneriskām slimībām(sifiliss, herpes, hlamīdijas), kā arī visa veida hepatīts, masalas, masaliņas, cūciņas un toksoplazmoze.
Galvenokārt ELISA analīzes veikšanai mācību priekšmeti bioloģiskais materiāls ir asinis, tomēr to var izmeklēt cerebrospinālais šķidrums, stiklveida ķermeņa saturs, amnija šķidrums un utt.
Imūnglobulīni ir imūnmolekulas, kas var saistīties un neitralizēt lielāko daļu infekcijas patogēnu un toksīnu organismā. Šajā gadījumā vissvarīgākā imūnglobulīnu īpašība ir to specifika, tas ir, spēja saistīties ar noteiktu antigēnu. Tas ir šis īpašums, ko izmanto, lai veiktu imūnglobulīna asins analīzi.
Ir pieci imūnglobulīnu veidi, bet visvairāk pētītie ir imūnglobulīni A, M un G. Imūnglobulīni M un G parāda savu aktivitāti asinīs. Imūnglobulīni A ir sava veida barjera uz gļotādu virsmas, jo tie tur atrodas lielos daudzumos.
Imunoloģiskā asins analīze ļauj noteikt imūnglobulīnu veidu, pateicoties kuriem ELISA ļauj ne tikai diagnosticēt slimību, bet arī noteikt slimības stadiju un uzraudzīt slimības dinamiku:
- pirmajās 2 slimības nedēļās tiek konstatēti tikai imūnglobulīni A;
- no 2. līdz 3. slimības nedēļai asinīs tiek konstatēti imūnglobulīni A un M;
- CC3 līdz 4. nedēļai, imūnglobulīna asins analīze atklāj visus trīs veidus;
- pēc atveseļošanās imūnglobulīni M pazūd no asinīm, un A un G daudzums samazinās 2-4 reizes;
- hroniska procesa klātbūtnē imūnglobulīni G obligāti ir asinīs, imūnglobulīni M nav, imūnglobulīni A var būt vai nebūt.
Imunoloģiskās asins analīzes, izmantojot ELISA, piemērošanas joma
- Diagnostika vīrusu slimības: hepatīts, herpes, Epšteina-Barra vīruss, citomegalovīruss utt.;
- seksuāli transmisīvās infekcijas: hlamīdijas, gonoreja, trichomonas, mikoplazma, ureaplazma;
- sifiliss; endokrinoloģija (hormonu līmeņa noteikšana);
- audzēja marķieri (diagnoze onkoloģiskās slimības); imunoloģija (imūndeficīta diagnostika);
- alergoloģija (alerģiju diagnostika un ārstēšana).
Seroloģiskā asins analīze - laboratorijas metode asins analīzes, ko izmanto diagnostikas nolūkos infekcijas slimības un iestudējums infekcijas process. Seroloģiskā reakcija pamatojoties uz antivielu un antigēnu mijiedarbību.
Antigēnu noteikšanu izmanto, lai noteiktu mikroorganismu ģints un sugas. Šo pētījumu metodi izmanto uroloģijā un veneroloģijā. Asinis priekš seroloģiskā analīze asinis ņem no rīta tukšā dūšā no vēnas.
Lietošanas indikācijas un slimības, kas atklātas ar ELISA
Galvenais ELISA biomateriāls ir asins serums: laboratorijā pacientam no vēnas tiek ņemts asins paraugs, no kura tas tiek izņemts. formas elementi, kas sarežģī analīzi. Dažos citos gadījumos analīzei tiek izmantots cerebrospinālais šķidrums, amnija šķidrums, gļotādu uztriepes utt.
Lai izvairītos no rezultātu izkropļojumiem, asinis ieteicams nodot tukšā dūšā, savukārt divas nedēļas pirms pārbaudes (ja mērķis ir diagnosticēt hroniskas, latentas infekcijas slimības) jāpārtrauc antibiotiku un pretvīrusu zāļu lietošana. Nav iespējams segt pilns saraksts indikācijas ELISA veikšanai.
ELISA nenoliedzamās priekšrocības ir metodes augstā jutība un specifika. Jutīgums ir spēja atpazīt vēlamo vielu, pat ja tās koncentrācija paraugā ir zema. Specifiskums nozīmē diagnozi bez kļūdām: ja rezultāts ir pozitīvs, tas nozīmē, ka tika atrasta tieši tā antiviela vai antigēns, kas tika gaidīts, nevis daži citi.
ELISA lielā mērā ir aizstājusi mikrobioloģijas “zelta standartu” bakterioloģiskā metode diagnostika, kuras laikā patogēna identificēšanai bija nepieciešams to izolēt no organisma un pēc tam vairākas dienas audzēt kultūru uz barības vielu barotnes mēģenē.
Visu laiku, kad tika veikta analīze, ārsti bija spiesti ārstēt pacientu "akli", uzminot mikroorganisma izcelsmi no slimības simptomiem. IgM noteikšana ar ELISA palīdzību ļauj veikt precīzu diagnozi jau pirmajās slimības dienās.
Augsta pakāpe Enzīmu imūntesta izgatavojamība samazina cilvēka faktora ietekmi, kas samazina kļūdu iespējamību. Visbiežāk izmanto modernas laboratorijas tiek ražotas ELISA testu sistēmas un reaģenti rūpnieciskie apstākļi, kas garantē precīzu rezultātu.
ELISA metodes trūkumi
Diemžēl, lai veiktu ELISA, jums jāzina, ko tieši meklēt: analīzes tehnika nozīmē, ka ārstam jau iepriekš ir pieņēmums par slimības būtību. Tāpēc nav jēgas izrakstīt šādu testu, cerot nejauši “uzminēt” diagnozi.
Infekcijas slimību diagnosticēšanas gadījumā ar enzīmu imūntestu nevar atrast patogēnu un noteikt tā specifiskās īpašības: tas tikai norāda uz antivielu klātbūtni pacienta asinīs, kas netieši norāda uz sveša mikroorganisma klātbūtni cilvēka organismā. ELISA ir ārkārtīgi precīza, bet ne lēta metode, tāpēc jums tā jāizmanto saprātīgi, un kvalificētam ārstam ir jāinterpretē rezultāti.
Iespējamie ELISA rezultāti
Atkarībā no analīzes satura veidlapā var tikt parādīti dati tabulas veidā, kurā uzskaitītas visas antivielas vai antigēni ar piezīmēm par negatīvām vai pozitīva reakcija, vai tiks norādīta rezultāta kvantitatīvā vērtība (negatīva, vāji pozitīva, pozitīva vai izteikti pozitīva).
Pēdējais variants nosaka, cik antivielu ir analizētajā paraugā. Vēl viens kvantitatīvs rādītājs ir antivielu aviditātes indekss, kas izteikts procentos. Tas norāda, cik daudz laika ir pagājis kopš infekcijas procesa sākuma (jo augstāks indekss, jo vairāk).
Mūsdienās tiek ražoti tūkstošiem ELISA testu sistēmu veidu, kas maksimāli ļauj noteikt specifiskas antivielas un antigēnus. dažādas patoloģijas. Tāpēc šo analīzi izmanto gandrīz visās medicīnas nozarēs. Diagnoze, kas noteikta, izmantojot ELISA, ir garantija adekvātas terapijas izrakstīšanai un efektīva ārstēšana slimības.
Klātbūtnē nepieciešamie reaģenti un laba laboratorijas organizācija, testa rezultātu saņemsiet 1-2 dienu laikā pēc asins paraugu ņemšanas. Atsevišķos gadījumos, ja nepieciešams saņemt ārkārtas reaģēšanu, šo periodu var samazināt līdz 2–3 stundām.
Pārstāvot moderns izskats laboratoriskā pārbaude, ELISA vai enzīmu imūntests ļauj asinīs atrast specifiskas antivielas vai antigēnus pret noteiktām slimībām. Tas ļauj noteikt gan slimības etioloģiju, gan noteikt tās stadiju. Turklāt šāda veida pētījumu rezultātus var prezentēt gan kvantitatīvi, gan kvalitatīvi. Tātad, aplūkosim sīkāk fermentu imūnanalīzes metodes principu, tās metodiku un būtību.
Kas ir enzīmu imūnanalīze
Iecelts maksimālai pilnībai visaptverošs novērtējums veselības stāvokli, enzīmu imūnanalīze ļauj novērtēt vispārējais stāvoklis veselību un novērtēt tās aizsargfunkcijas. Šis laboratorijas tests ļauj diagnosticēt infekciozas, autoimūnas, hematoloģiskas patoloģijas, izmantojot asins analīzi.
Fermentu imūnanalīzes būtība ir aplūkota tālāk esošajā videoklipā:
Kam tas ir parakstīts?
Šo pētījumu var parakstīt pacientiem, kuriem ir diagnosticētas šādas slimības:
- slimības vīrusu izcelsme, kas ietver hepatītu,;
- seksuāli transmisīvās slimības - hlamīdijas, trichomonas, sifiliss, ureaplazma, mikoplazma;
- imūndeficīts;
- pirmsoperācijas visaptverošas izmeklēšanas veikšana.
ELISA asins analīze tiek noteikta arī, lai noteiktu hormonu līmeni un novērtētu terapijas veida kvalitāti.
Ārsts var izrakstīt šī analīze noteikt esošās slimības stadiju, kas ļauj savlaicīgi pielāgot izmantoto ārstēšanu. Un iegūto datu augstā precizitāte ļauj iegūt visplašāko priekšstatu par veselību. Tajā pašā laikā dati pēc pētījuma tiek iegūti ļoti īsā laika periodā, kas ļauj izsekot attīstības dinamikai patoloģisks process.
Kāpēc veikt šādus testus?
Tā kā, pateicoties ELISA asins analīzei, ir iespējams iegūt ievērojamu daudzumu informācijas par veselības stāvokli un patoloģiskajiem procesiem, kas notiek organismā, tas ļauj vispilnīgāk ņemt vērā sākotnējos datus (vispārējais veselības stāvoklis, slimības stadija). slimība, patoloģiskā procesa attīstības dinamika, izmantotās terapijas efektivitātes rādītājs), sastādot ārstēšanas shēmas.
Šī iemesla dēļ, lai iegūtu visizteiktāko ārstēšanas rezultātu un ātrāku patoloģiskā procesa apstāšanos organismā, tiek nozīmēta ELISA asins analīze. Nopietnas slimības imūnsistēmu, antigēnu klātbūtni asinīs un alerģiju cēloņus, pamatojoties uz iegūtajiem datiem, var ātrāk izārstēt, izmantojot visefektīvākās metodes.
ELISA analīze tiek nozīmēta dažādām patoloģijām, un tā jāveic tikai saskaņā ar ārsta norādījumiem. Analīzes biežumu nosaka arī ārsts, un, nododot asinis ELISA analīzei, slimības attēls ir vispilnīgākais. Tā kā iegūt slimības gaitas dinamiku iespējams, veicot šo testu vairākkārt, visbiežāk asins nodošanu var izrakstīt trīs līdz piecas reizes. Tas ļauj salīdzināt antivielu daudzumu asinīs dažādos laika periodos.
Šādas procedūras veidi
Ir vairāki enzīmu imūntestu veidi. Tie atšķiras no cilvēka ķermeņa ņemtā šķidruma veida, uz kura pamata tiek pētīts tā sastāvs un noteiktu antigēnu klātbūtne.
Šajā gadījumā analīzei var ņemt ne tikai cilvēka asinis, bet arī citus viņa šķidrumus:
- amnija šķidrums,
- cerebrospinālais šķidrums,
- stiklveida saturs,
- insulti,
- gļotas no urīnizvadkanāla un dzemdes kakla kanāla.
Pati operācija noteikta veida šķidruma uzņemšanai ir standarta un tiek veikta dienas stacionārā.
Indikācijas testēšanai
Parasti ELISA testu nosaka ārsts, ja ir nepieciešams iegūt detalizētu priekšstatu par pašreizējo slimību, kas notiek jebkurā formā: hroniska, gausa vai akūta. Un šādus nosacījumus un ārstēšanas mērķus var uzskatīt par indikācijām šāda veida analīzei:
- noteiktu slimību antigēnu meklēšana;
- hormonālā stāvokļa noteikšana;
- hepatīta vīrusa noteikšana organismā;
- pētījumi par ;
- meklēt antivielas pret jebkāda veida infekcijas slimībām;
- ķermeņa autoimūno bojājumu klātbūtnes pārbaude.
Lai iegūtu informāciju par enzīmu imūntestu, skatiet tālāk redzamo videoklipu:
Kontrindikācijas par
Līdz šim nav konstatētas kontrindikācijas enzīmu imūnanalīzei.
Grūtniecības laikā, kad pastāvīgi mainās hormonu līmenis asinīs, šī analīze ir jāveic atkārtoti, lai apstiprinātu iegūto rezultātu. Jaundzimušie un bērni zīdaiņa vecumā var būt arī nepareizi analīzes dati: intrauterīnās attīstības laikā noteikta veida antivielas var iekļūt augļa asinīs caur mātes placentu. Tāpēc to klātbūtne analīzē nav jāuzskata par esošas infekcijas pazīmi.
Pārbaudi drošību
Jebkura veida šķidruma izņemšanas no cilvēka ķermeņa procedūra nerada negatīvu ietekmi uz ķermeni. Pilnīga sterilitāte manipulāciju laikā novērš inficēšanās risku ar jebkāda veida slimībām.
Gatavošanās pasākumam
Lai iegūtu maksimumu ticamus rezultātus pētījumiem vajadzētu atturēties no patēriņa alkoholiskie dzērieni un narkotiskās vielas pirms asiņu (vai cita šķidruma) ņemšanas analīzei.
Kā notiek procedūra un ko jūs jūtaties tās laikā
Lai veiktu ELISA testu, pacienta asinis tiek ņemtas stingri tukšā dūšā: vismaz stundas pirms procedūras nevajadzētu ēst nekādu pārtiku. Analīze tiek ņemta no elkoņa kaula vēnas.
Par jebkādām slimībām un lietotajiem medikamentiem ārstam tiek ziņots iepriekš, asins nodošanas brīdī medikamentu lietošana tiks pārtraukta. Sajūtas procedūras laikā ir līdzīgas asiņu ņemšanai bioķīmiskai analīzei.
Rezultātu atšifrēšana
ELISA diagnostika ļauj noteikt infekcijas klātbūtni organismā, patoloģiskā procesa aktivitāti un esošās infekcijas etioloģiju. Ātra analīzes rezultātu saņemšana (24 stundu laikā) ir viena no šāda veida pētījuma priekšrocībām.
Saņemtās informācijas atšifrēšanas procesu veic ārsts. Jāņem vērā, ka iegūto rezultātu pareizība par jebkuru procesu dinamiku tiek garantēta, veicot pārbaudes vienā laboratorijā.
Vidējās procedūras izmaksas
ELISA testa vidējā cena ir atkarīga no analīzes fokusa un konkrētu vērtību noteikšanas. Tādējādi infekcijas slimību seroloģisko marķieru noteikšana dažādi veidi(anti-HAV IgG, anti-HAV IgM, HBsAg) maksās no 200 līdz 320 rubļiem un tiek veikta 2 darba dienu laikā. Šīs procedūras izmaksas tiek uzskatītas arī par tās priekšrocībām: jebkura veida pētījumu cenu pieejamība ļauj veikt pētījumus jebkurā budžeta apjomā.
ELISA testu izmaksas ir atkarīgas no politikas medicīnas iestāde tomēr tā jāuzskata par vispārpieejamu procedūru, kas ļauj iegūt detalizētu priekšstatu par esošo slimību un nodrošināt vispilnīgāko ārstēšanu.
Par ELISA pētījuma normām un iezīmēm skatiet tālāk esošo video:
(saite uz 3. rakstu šajā failā), kas ļauj novērtēt organisma spēju pretoties infekcijas slimībām un parāda slimības fāzi, svarīga loma ir enzīmu imūnsorbcijas testam (ELISA). Šī pētījuma veikšana ļauj vispusīgi novērtēt asins aizsargfunkcijas aktivitāti un identificēt imūndeficīta stāvokli infekcijas patoloģiju, kā arī asins slimību, autoimūnu procesu un hormonālo problēmu gadījumā.
Kā vienā analīzē ir iespējams aptvert tik daudz mērķu, un kādas ir norādes uz tās īstenošanu? Mēģināsim to izdomāt.
Kāda ir asins analīze, izmantojot ELISA metodi?
Tas ir laboratorijas tests, kas ļauj noteikt specifisku antivielu (proteīna rakstura asinsaizsardzības faktoru) klātbūtni noteiktiem antigēniem (patogēniem aģentiem). Starp antivielām primārā nozīme ir imūnglobulīniem, kas var pastāvēt imūnkompleksu veidā.
Imūnglobulīni tiek ražoti sarežģītu cilvēka neirohumorālu reakciju rezultātā, kas rodas kā reakcija uz svešu antigēnu ievadīšanu. Katrs patogēna veids ražo savas specifiskas antivielas. Tie darbojas, “saistot” antigēnu vai patoloģisku mikroorganismu, veidojot kompleksu “antigēna-antivielu” savienojumu, kam seko neitralizācija, fermentatīvā līze, fagocitozes reakcijas un izvadīšana no organisma.
Piezīme:Ar noteiktu kompleksu klātbūtni ELISA metode nosaka pacienta patogēna vai kaitīgās vielas veidu.
Zināt pamatprincipi Jūs varat redzēt, kā darbojas cilvēka imūnsistēma, aplūkojot šis video pārskats:
Kas ir imūnglobulīni?
Atklātas un pētītas 5 galvenās imūnglobulīnu klases - IgA, IgM, IgG, IgD, IgE. pārējo loma vēl nav pilnībā noskaidrota un tiek pētīta zinātniski.
Piezīme:A, M un G klases imūnglobulīniem ir vislielākā nozīme praktiskajā medicīnā. Definīcijas informatīvums balstās uz dažādiem to parādīšanās, maksimuma un izzušanas laika intervāliem.
Apskatīsim šo jautājumu sīkāk.
Galvenais uzdevums imūnglobulīns A (IgA) sastāv no elpceļu, kuņģa-zarnu trakta un urīnceļu gļotādu aizsargfunkcijām. Akūtā slimības sākumā tos nav iespējams identificēt. Šie aizsargājošie kompleksi parādās tikai no 2. slimības sākuma nedēļas, dažreiz vēlāk. Lielākā daļa imūnglobulīna A ir koncentrēta gļotādas audos. Apmēram aptuveni 80%. Atlikušās antivielas cirkulē asinīs. Galvenā funkcija ir mikroorganismu neitralizācija un iznīcināšana. Pēc akūtu slimības izpausmju mazināšanās šo imūnglobulīnu daudzums sāk samazināties un pilnībā izzūd līdz 8 nedēļām pēc slimības sākuma. Ja IgA tiek atklāts vēlāk, tas norāda uz hronisku procesu.
Patoloģijas attīstības akūtās fāzes galvenie un pirmie marķieri ir M klases imūnglobulīni (IgM). Tie tiek atklāti 5. dienā pēc slimības sākuma. To klātbūtni asinīs var noteikt aptuveni 6 nedēļu laikā. Tad viņi sāk ātri pazust.
Atlikušo imūnreakciju raksturo klātbūtne asinīs G klases imūnglobulīni (IgG). Šo faktoru parādīšanās asinīs tiek konstatēta aptuveni mēnesi pēc slimības sākuma. Nākotnē tos var noteikt daudziem mēnešiem, gadiem un pat mūža garumā, veicot aizsargfunkciju pret slimības atgriešanos (recidīvu) un atsevišķos gadījumos padarot neiespējamu patoloģijas sekundāro attīstību. Ja imūnglobulīna G daudzums atkal sāk palielināties, tad var būt aizdomas par atkārtotu inficēšanos. Līdzīgu secinājumu var izdarīt, veicot divus vai trīs paraugus, kas ņemti ar 2 nedēļu intervālu.
Imūnglobulīns D (IgD) atrodas uz B-limfocītiem, atrodami zemā koncentrācijā in veseliem cilvēkiem. Pēc 10 dzīves gadiem tas sasniedz maksimālās vērtības. Imūnglobulīna D daudzums palielinās grūtniecības laikā, pacientiem sistēmiskas slimības saistaudi, imūndeficīta izraisītas slimības.
Indikācijas enzīmu imūnanalīzes asins analīzes izrakstīšanai
Antivielu noteikšana pret patogēno mikrobu klātbūtni organismā, kas izraisa:
- trichomoniāze;
- ureaplazmoze un
Ir imūnglobulīnu daudzuma palielināšanās un ar.
Diagnostika tiek veikta, lai noteiktu:
- herpetiskas slimības;
- vīrusu hepatīta grupas;
- Epšteina-Barra vīruss;
- citomegoalovīruss.
Izmantojot ELISA, jūs varat noteikt antivielu klātbūtni pret 600 alergēnu veidiem, noteikt imūndeficīta stāvokli, veikt visaptveroša pārbaude pirms transplantācijas operācijām veikt visaptveroša analīze par ārstēšanas efektivitāti.
ELISA ir papildu metode vēža šūnu noteikšana.
Kā tiek veikta asins ELISA?
Enzīmu imūnanalīzei vairumā gadījumu tiek izmantotas pacienta asinis, dažreiz tiek savākti stiklveida audi, mugurkaula kanāla šķidrums un amnija šķidrums.
Asinis tiek ievilktas caur injekcijas adatu šļircē no kubitālās vēnas. Pētījums tiek veikts tukšā dūšā. Jāatceras, ka noteiktu medikamentu lietošana var ietekmēt testa rezultātu. Pirms asins nodošanas jums ir jāatturas no smēķēšanas un alkohola lietošanas. Narkotiku lietošana var izkropļot rezultātus.
IgM, IgG, IgA imūnglobulīnu negatīvu vērtību gadījumā mēs varam runāt par slimības neesamību vai tās sākuma fāzi, ja pēc ievērojama laika ir iespējams pilnībā atveseļoties.
Ja IgA un IgM nav konstatēti un IgG ir pozitīvs, tad, visticamāk, mēs runājam par imunitātes veidošanos pēc infekcijas slimības vai pēc vakcinācijas.
Augsta IgM titra gadījumā ar negatīvām IgG un IgA vērtībām var secināt, ka pastāv akūta infekcijas slimība.
Vienlaicīgas pozitīvas imūnglobulīna rezultātu vērtības - IgA, IgM, IgG ir raksturīgas esošas hroniskas slimības recidīva akūtā fāzē.
Priekš hroniska infekcija, kas atrodas procesa norimšanas fāzē (remisija), ELISA uzrāda negatīvas imūnglobulīna M (IgM) vērtības, savukārt imūnglobulīnu G (IgG) un A (IgA) rezultāts būs pozitīvs.
Fermentu imūnanalīzes asins analīzes metodes priekšrocības
Galvenās ELISA metodes priekšrocības ir:
- zemas analīzes izmaksas;
- diagnostikas specifika, precizitāte;
- dinamiskā kontrole (analīzes atkārtošana, lai noteiktu ārstēšanas efektivitāti un slimības stadijas);
- iespēja veikt masveida izmeklējumus infekcijas zonās;
- rezultātu iegūšanas ātrums;
- relatīvā analīzes vienkāršība;
- izmantošanas iespēja informācijas tehnoloģijas apstrādē;
- drošību un nesāpīgumu pacientam.
Vai ir kādi asins ELISA trūkumi?
Galvenā negatīvais punkts pētījumi ir iespēja iegūt viltus negatīvus un viltus pozitīvus datus. Pārpratumu cēlonis var būt tehniskas nepilnības vai medikamentu lietošana, kas var deformēt priekšstatu.
ELISA izmanto, lai noteiktu:
- (ascaris, pinworms);
- akūts un hroniska forma opisthorchiasis;
- trihineloze;
- Giardia klātbūtne (kā papildu analīze);
- leišmaniozes formas;
- amēbiāze;
- Toksoplazmas saturs;
Noslēgumā jāatzīmē, ka mūsdienu imunoloģija pastāvīgi atrodas attīstības stadijā, meklējot jaunas metodes slimību diagnosticēšanai un ārstēšanai.
Stepaņenko Vladimirs, ķirurgs
5.1. ELISA būtība un klasifikācija.
ELISA parādījās 60. gadu vidū un sākotnēji tika izstrādāta kā metode antigēna noteikšanai histoloģiskā paraugā, kā arī nokrišņu līniju vizualizācijai imūndifūzijas un imūnelektroforēzes testos, un pēc tam to sāka izmantot antigēnu un antivielu kvantitatīvā noteikšanai. bioloģiskie šķidrumi. Metodes izstrādē piedalījās E. Engvalls un R. Pēlmans, kā arī neatkarīgi V. Van Vīmens un R. Šurs.
Rīsi. 6 ELISA pamatprincips:
identificēt antigēnus; 2) noteikt antivielas
Metode balstās uz antivielas specifisku saistīšanos ar antigēnu, reakcijas rezultātā ar atbilstošo hromogēno substrātu konjugējot kādu no sastāvdaļām, veidojas krāsains produkts, kura daudzumu var noteikt; spektrofotometriski (6. att.).
Atklājot iespēju imobilizēt antigēnu un antivielas uz dažādiem nesējiem, vienlaikus saglabājot to saistīšanās aktivitāti, ir iespējams paplašināt ELISA izmantošanu dažādās bioloģijas un medicīnas jomās.
Monoklonālo antivielu rašanās veicināja ELISA turpmāku attīstību, kas ļāva palielināt tā jutīgumu, specifiskumu un rezultātu reproducējamību.
Teorētiski ELISA balstās uz mūsdienu imūnķīmijas un ķīmiskās enzimoloģijas datiem, zināšanām par antigēna-antivielu reakcijas fizikāli ķīmiskajiem likumiem, kā arī uz galvenajiem analītiskās ķīmijas principiem. ELISA jutīgumu un tai nepieciešamo laiku nosaka vairāki galvenie faktori: antigēna-antivielu reakcijas kinētiskās un termodinamiskās īpašības, reaģentu attiecība, fermenta aktivitāte un tā noteikšanas metožu izšķirtspēja. IN vispārējs skats Antigēna-antivielu reakciju var aprakstīt ar vienkāršu shēmu:
+[AG]↔[ATAG]
Pētījumu objektu daudzveidība no mazmolekulāriem savienojumiem līdz vīrusiem un baktērijām, kā arī neparasti plašs uzdevumu klāsts, kas saistīts ar ELISA izmantošanas nosacījumu dažādību, nosaka ārkārtīgi liela skaita šīs metodes variantu attīstību.
Jebkurā ELISA versijā ir 3 obligāti posmi:
1. testējamā savienojuma atpazīšanas stadija ar tam specifisku antivielu, kas noved pie imūnkompleksa veidošanās;
2. konjugāta savienojuma veidošanas stadija ar imūnkompleksu vai ar brīvām saistīšanās vietām;
3. fermenta marķējuma pārvēršanas posms ierakstītā signālā. ELISA metožu klasifikācija balstās uz vairākām pieejām:
1. Pamatojoties uz ELISA pirmajā posmā esošo reaģentu veidu, izšķir konkurējošās un nekonkurējošās metodes.
A) Konkurētspējīgā ELISA pirmajā posmā sistēma satur gan analizēto savienojumu, gan tā analogu, kas marķēts ar fermentu un konkurē ar to par specifiskām saistīšanās vietām.
B) Nekonkurējošām metodēm ir raksturīga tikai analizētā savienojuma un tam raksturīgo saistīšanās centru klātbūtne sistēmā pirmajā posmā.
2. Visas ELISA metodes iedala homogēnajās un neviendabīgajās.
Ja visi trīs ELISA posmi notiek šķīdumā un starp galvenajiem posmiem nav papildu soļu izveidoto imūnkompleksu atdalīšanai no neizreaģējušām sastāvdaļām, metode pieder viendabīgo grupai.
Homogēnās ELISA pamatā, ko parasti izmanto mazmolekulāru vielu noteikšanai, ir fermenta aktivitātes inhibīcija, kad tas apvienojas ar antigēnu vai antivielu. Antigēna-antivielu reakcijas rezultātā tiek atjaunota fermentu aktivitāte.
Kad antiviela saistās ar antigēnu, kas satur enzīma marķējumu, fermenta aktivitāte tiek inhibēta par 95% attiecībā pret substrātu ar augstu molekulmasu, kas ir saistīts ar substrāta sterisku izslēgšanu no fermenta aktīvā centra. Palielinoties antigēna koncentrācijai, saistās vairāk antivielu un paliek vairāk brīvu antigēna-enzīmu konjugātu, kas spēj hidrolizēt augstas molekulmasas substrātu. Analīze tiek veikta ļoti ātri, vienai noteikšanai nepieciešama 1 minūte. Metodes jutīgums ir diezgan augsts. To var izmantot, lai noteiktu vielu pikomola līmenī.
Heterogēnās metodes raksturo analīze divfāžu sistēmā ar cietās nesējfāzes piedalīšanos un obligāta imūnkompleksu atdalīšanas stadija no nereaģējušām sastāvdaļām (mazgāšana), kas atrodas dažādas fāzes(veidotie imūnkompleki atrodas cietā fāzē, un nereaģējušie kompleksi atrodas šķīdumā). Heterogēnās metodes, kurās imūnkompleksu veidošanās pirmajā posmā notiek uz cietās fāzes, sauc par cietās fāzes metodēm.
Metodes tiek klasificētas kā viendabīgas-heterogēnas, ja 1. posms - šķīdumā veidojas specifiski kompleksi, un tad komponentu atdalīšanai izmanto cieto fāzi ar imobilizētu reaģentu.
3. Saskaņā ar testējamās vielas noteikšanas principu:
A) Vielas (antigēna vai antivielas) koncentrācijas tieša noteikšana pēc saistīšanās vietu skaita, kas mijiedarbojas ar to. Šajā gadījumā fermentu marķējums atradīsies izveidotajā specifiskajā AG-AT kompleksā. Analīta koncentrācija būs tieši proporcionāla ierakstītajam signālam.
B) Vielas koncentrācijas noteikšana pēc starpības kopējais skaits saistīšanās vietas un atlikušās brīvās saistīšanās vietas. Šajā gadījumā analizējamās vielas koncentrācija palielināsies, un ierakstītais signāls samazināsies, tāpēc šajā gadījumā ir apgriezta atkarība no ierakstītā signāla lieluma.
5.2. ELISA izmantoto komponentu raksturojums.
Fermenti.
Fermentu tagiem ir ārkārtīgi spēcīgs katalītiskais efekts, viena fermenta molekula var reaģēt ar lielu skaitu substrāta molekulu. Tādējādi fermentu, kas atrodas nelielā daudzumā, var identificēt un kvantitatīvi noteikt pēc produktu veidošanās un reakcijas, ko tas katalizē. Vēl viena priekšrocība, izmantojot fermentus kā etiķetes, ir daudzu funkcionālo grupu klātbūtne molekulā (sulfhidrilgrupa, karboksilgrupa, tirazīna atlikumi utt.), Caur kurām ligandu molekulas var pievienot kovalenti.
Enzīmu marķieriem, ko izmanto ELISA, ir jābūt šādām īpašībām:
– augsta fermenta aktivitāte un stabilitāte analītiskajos apstākļos, ja tas ir modificēts un konjugēts ar antivielām vai citiem proteīniem;
– jutīgu substrātu klātbūtne un fermentatīvās reakcijas produktu vai substrātu noteikšanas metodes vienkāršība;
– iespēja pielāgot substrātu sistēmas tālākai stiprināšanai;
– enzīma un tā inhibitoru trūkums pētāmajā bioloģiskais šķidrums.
ELISA var izmantot vismaz 15 dažādus enzīmus. Visplašāk lietotās saskaņā ar augstāk minētajām prasībām ir mārrutku peroksidāze (HRP), sārmainās fosfatāzes (ALP) un β-D-galaktozidāze. Visi trīs ir stabili un katalizē ļoti jutīgas reakcijas. Turklāt produktus, kas rodas šo enzīmu katalizēto reakciju rezultātā, atkarībā no izmantotā substrāta var noteikt ne tikai ar kolorimetriskām, bet arī ar fluorescējošām metodēm. Citi fermenti tiek izmantoti daudz retāk. Tas izskaidrojams ar to zemāku specifisko aktivitāti salīdzinājumā ar PC un AP.
Substrāti.
Substrāta izvēli galvenokārt nosaka ferments, ko izmanto kā marķējumu, jo fermenta-substrāta reakcija ir ļoti specifiska.
Pamatprasības pamatnei:
– metodes augstas jutības nodrošināšana fermenta noteikšanai konjugātā;
– labi atpazīstamu (piemēram, krāsainu) enzīmu-substrātu reakcijas produktu veidošanās;
– pamatnei jābūt drošai, lētai, pieejamai un ērtai lietošanā.
Biežāk tiek izmantoti hromogēnie substrāti, kas, iznīcinot, veido krāsainu vielu. Daudzsološa ir augstas enerģijas substrātu – fluorescējošu, hemiluminiscējošu – izmantošana. Šādu substrātu izmantošana ļauj teorētiski palielināt ELISA jutīgumu par divām kārtām.
Konjugāta veidošanās.
Konjugāts ir antigēns vai antiviela, kas marķēta ar enzīma marķējumu. Konjugāta veidošanās ir viena no svarīgi posmi veicot ELISA.
Veidojot konjugātu, tiek izvēlēta optimālā metode fermenta marķējuma ievadīšanai, lai abas konjugāta sastāvdaļas saglabātu savu bioloģisko aktivitāti: enzīms - spēju mijiedarboties ar substrātu un antigēns vai antiviela - antigenitāte un antigēnu saistīšanās aktivitāte. , attiecīgi. Marķēta, ļoti attīrīta antigēna klātbūtne ļauj izmantot konkurētspējīgas metodes. Šajā gadījumā pēdējā posmā ir iespējams izmērīt konjugāta aktivitāti, kas nav saistīta ar imobilizētām antivielām, kas ļauj izvairīties no mazgāšanas procedūras un padara analīzi ērtāku. Tomēr antigēni atšķiras pēc to fizikāli ķīmiskajām īpašībām un struktūras, kas nozīmē, ka nav iespējams izstrādāt universālas metodes konjugāta iegūšanai ar antigēnu. Šajā gadījumā antigēna-enzīma konjugāta iegūšana ir atsevišķs sarežģīts uzdevums. Marķēto antivielu sagatavošana ELISA testam ir metodiski pieejamāka.
Fermenta konjugāciju ar imūnķīmiski aktīvām olbaltumvielām veic ar dažādām metodēm: ķīmisko šķērssavienojumu, enzīma molekulas kovalento saistīšanos ar Ag vai AT un savienojumu veidošanu ar nekovalentu saišu palīdzību, piemēram, savienojoties starp fermentu. un Ag vai AT tiek veikta imunoloģiski, izmantojot antigēna-antivielu mijiedarbību.
Visplašāk izmantotās ir kovalentās metodes konjugātu pagatavošanai. Saistīšanās reakcijas izvēli nosaka konkrētajās olbaltumvielu molekulās pieejamo funkcionālo grupu veids. Glutaraldehīdu, nātrija perjodātu utt. izmanto kā reaģentus, ko izmanto, lai ievadītu fermentu antigēnu un antivielu molekulās.
Ir vienpakāpju un divpakāpju metodes konjugātu iegūšanai, izmantojot glutaraldehīdu. Var veidoties dažāda lieluma konjugāti ar samazinātu fermentatīvo aktivitāti (15 - 60% brīvā enzīma). Iegūtais konjugāts lieli izmēri var steriski kavēt testējamās vielas noteikšanu. Konjugāti ar salīdzinoši zemu molekulmasu sastāv no Fab fragmenta un vienas fermenta molekulas.
Divpakāpju sintēzes rezultātā, kas sastāv no fermenta, kas vispirms modificēts ar šķērssaistīšanas aģentu, pakāpeniskas ražošanas, tā izolēšanas un pēc tam tā turpmākās mijiedarbības ar antigēnu (antivielu), enzīma molekulas. veidojas viendabīgs sastāvs, kas satur 1-2 enzīmu molekulas vienā imūnglobulīna molekulā un saglabā augstu fermentatīvo un imunoloģisko aktivitāti. Tomēr šādu konjugātu skaits ir neliels (mārrutku peroksidāzei tas ir 5–10%).
Vislielākais praktiskais pielietojums konstatēts imūnoperoksidāzes konjugātu iegūšanas metodē, kuras pamatā ir fermenta ogļhidrātu komponenta oksidēšana ar nātrija perjodātu (peroksidāzes saistīšanās konjugātā sasniedz 70-90% no sākotnējā fermenta daudzuma).
Uzticamam konjugātam jābūt šādām īpašībām:
Augsta antivielu stiprība un augsta afinitāte pret antigēnu, lai to varētu izmantot lielā atšķaidījumā un tādējādi samazinātu nespecifisko saistīšanos;
Pietiekama specifika darba atšķaidīšanā;
Monomēru formu pārsvars pār polimēru, jo polimēru formas mēdz nespecifiski pieķerties plastmasai, kā rezultātā rodas augsts reakcijas fona līmenis;
Optimālā molārā attiecība starp fermentu un antivielām (optimālā attiecība ir aptuveni 1:1);
Pietiekama konjugāta fermentatīvā aktivitāte. Šo īpašību galvenokārt nosaka konjugācijas apstākļi un enzīmu molekulu un antivielu attiecība konjugātā.
5.3. Heterogēnās ELISA metodes.
Heterogēni ELISA (vai cietās fāzes ELISA) ietver metodes, kurās analizējamā viela ir divās fāzēs. Imūnķīmiskās reakcijas komponentu atdalīšanai izmanto cieto fāzi (nešķīstošu nesēju, parasti plastmasu) ar imobilizētām antivielām vai antigēnu, kuru katrā posmā mazgā, lai atdalītu starpposma un nereaģējušos komponentus.
Imobilizāciju var veikt, kovalenti saistot antivielas (antigēnus) ar aktivētu nesēju, izmantojot ķīmiskas metodes, kā arī fizikāli adsorbējot antivielas (antigēnus) uz cieto polimēru virsmas (piemēram, polistirola plāksnēm). Ārzemju literatūrā šo virzienu sauc par ELISA testu vai ar enzīmu saistīto imūnsorbcijas testu.
Nekonkurējoša ELISA antigēnu noteikšanai, izmantojot ar fermentu iezīmētu specifisku antivielu un imobilizētu antivielu izmantošanas piemēru.
Šķīdumu, kas satur analizējamo antigēnu, pievieno nesējam ar imobilizētām antivielām. Inkubācijas procesā veidojas specifisks antigēna-antivielu komplekss. Pēc tam nesēju nomazgā no nesaistītajiem antigēniem un pievieno iezīmētās antivielas – konjugātu. Šajā gadījumā saistītā konjugāta daudzums ir tieši proporcionāls antigēna daudzumam testa paraugā. Pēc sekundārās inkubācijas un liekā konjugāta noņemšanas tiek pievienots izmantotā enzīma hromogēnais substrāts, kas fermenta iedarbībā maina krāsu, t.i., iedobēs iekrāsojoties šķīdumam, notiek fermentatīvā reakcija. Krāsošanas pakāpe ir tieši proporcionāla specifisko antivielu daudzumam, kas iezīmētas ar fermentu, fermentu un attiecīgi pētāmo antigēnu. Šķīduma optiskā blīvuma mērījumus iedobēs pie noteikta viļņa garuma (atkarībā no izmantotā substrāta) veic, izmantojot īpašus spektrofotometrus, kas pielāgoti mikroplašu lasītājiem. Antigēna koncentrācijas paraugā kvantitatīvo novērtējumu nosaka, rezultātus salīdzinot ar šķīduma optiskā blīvuma atkarības no standarta antigēna šķīduma koncentrācijas kalibrēšanas līkni.
7. attēls.
Tā kā specifiska imūnkompleksa identificēšanas stadijā antigēns tiek saistīts ar imobilizētu un marķētu antivielu molekulām, literatūrā šo metodi bieži sauc par “sviestmaižu” metodi (no angļu valodas sandvich) vai divu vietu ELISA metodi (no plkst. angļu valodas divu vietu tests).
Šo metodi var izmantot, lai analizētu tikai tos antigēnus, kuru virsmā ir vismaz divi antigēnu determinanti. Tas ir nepieņemami, lai analizētu lielu skaitu monovalentu antigēnu (ārstniecisko savienojumu, pesticīdu utt.).
Galvenā priekšrocība šī metode- augsta jutība. Savienojumu noteikšanas robeža ar šo metodi pašlaik sasniedz aptuveni 10-21 molu, kas atbilst tikai 600 analizējamās vielas molekulu noteikšanai paraugā. Maksimālā jutība tiek sasniegta, ja katra imunoloģiskā reakcija tiek veikta līdzsvarā, kas ietekmē analīzes ilgumu, kas vidēji ir 4–6 stundas. Nekonkurējoša ELISA metode antivielu noteikšanai, izmantojot piemēru, izmantojot ar enzīmu iezīmētas sekundārās antivielas un imobilizētus antigēnus.
Testa serumu pievieno imobilizētajam antigēnam. Pēc nesaistīto antivielu inkubācijas un mazgāšanas pievieno iezīmētās sekundārās antivielas, kas ir specifiskas analizējamajām antivielām. Pēc sekundārās inkubācijas un lieko iezīmēto sekundāro antivielu noņemšanas fermenta marķējuma saturs uz nesēja ir proporcionāls specifisko antivielu koncentrācijai serumā.
Šī shēma ir viena no visizplatītākajām ELISA metodēm antivielu noteikšanai, jo tā ļauj noteikt antivielas pret dažādiem antigēniem.
Heterogēna konkurējoša ELISA antigēnu noteikšanai, izmantojot marķēta antigēna un imobilizētu antivielu izmantošanas piemēru.
Uz nesēja imobilizētajām antivielām pievieno šķīdumu, kas satur analizējamo antigēnu un fiksētu antigēna-enzīma konjugāta koncentrāciju. Pēc inkubācijas nesējs tiek nomazgāts no nesaistītā brīvā un iezīmētā antigēna un uz nesēja tiek reģistrēta fermentatīvā aktivitāte, kas ir apgriezti proporcionāla nosakāmā antigēna koncentrācijai.
5.4. Homogēna ELISA metode.
Homogēnu enzīmu imūntests (HELISA) ir metodoloģiski vienkāršākais ELISA veids. To veicot, viens no imūnreakcijas dalībniekiem (parasti mazmolekulārs antigēns) tiek marķēts ar enzīmu un tiek sekots līdzi antigēna-antivielu kompleksa veidošanās gaitai, fiksējot enzīmu aktivitātes izmaiņas.
Šāds fermentatīvās aktivitātes pārkāpums var rasties vai nu fermenta un substrāta telpiskās atdalīšanas dēļ, vai fermenta molekulas konformācijas izmaiņu dēļ, kas pavada imūnkompleksa veidošanos. HIFA ir vairākas būtiskas priekšrocības salīdzinājumā ar citām imūnķīmiskajām metodēm. Pirmkārt, augsta izteiksme (visa analīze, izmantojot HIFA, aizņem minūtes un pat minūšu daļas).
Rīsi.8 Homogēnu enzīmu imūnanalīzes iespējas(A - fermenta (F) un substrāta (C) atdalīšanas efekts, ko izraisa steriski šķēršļi antigēna (Ag) un antivielas (Ab) mijiedarbības laikā; B - konformācijas izmaiņu ietekme enzīms antigēna-antivielu kompleksa veidošanās laikā).
Otrkārt, metode ir vienpakāpju un tai nav nepieciešami darbietilpīgi un laikietilpīgi mazgāšanas soļi. Un visbeidzot, treškārt, metodei ir nepieciešami minimāli bioloģiskā vai klīniskā parauga tilpumi (8-50 μl) un daudzumi. Tomēr HIFA metodei ir viens ārkārtīgi būtisks trūkums - uz tās pamata ir iespējams izveidot diagnostikas testu sistēmas tikai mazmolekulārajiem antigēniem. Tikai šajā gadījumā antiviela, mijiedarbojoties ar antigēnu, var efektīvi aizsargāt vai modificēt ar šo antigēnu saistīto enzīma molekulu. Tieši šajā sakarā (neskatoties uz šķietamo vienkāršību un acīmredzamajām priekšrocībām salīdzinājumā ar citām metodēm, uz HIFA bāzes tika izveidoti diagnostikas instrumenti, lai noteiktu tikai hormonus, peptīdus, ārstnieciskās un narkotiskās vielas un dažus zemas molekulmasas proteīnus.
5.5 “Sendvičs” - ELISA variants antigēnu noteikšanai.
Antigēniem, kas atklāti, izmantojot šo ELISA variantu, ir jābūt vairākiem epitopiem, kas spēj saistīt antivielas, vai tiem jābūt atkārtotiem, telpiski atdalītiem epitopiem ar tādu pašu specifiku.
Veicot šo ELISA versiju, ļoti specifiskas poli- vai monoklonālās antivielas, kas adsorbētas uz cietās fāzes, tiek inkubētas ar testa paraugu. Pēc mazgāšanas procedūras iedobēm pievieno enzīmu iezīmētas antivielas (konjugātu) pret to pašu antigēnu un pēc tam veic visus pārējos reakcijas posmus. Konkrēta kompleksa veidošanās efektivitāte katrā analīzes posmā ir atkarīga no antigēna-antivielu reakcijas saistīšanās konstantes.