Απομόνωση καθαρού πολιτισμού
Η κύρια μέθοδος για την απομόνωση καθαρών καλλιεργειών βακτηρίων είναι η μέθοδος που προτείνει ο R. Koch, η αρχή της οποίας είναι η λήψη καλλιέργειας βακτηρίων από απομονωμένες αποικίες. Κατά την απομόνωση μιας καθαρής καλλιέργειας αερόβιων, η καλλιέργεια εμπλουτισμού ή το υλικό δοκιμής σπέρνεται σε πυκνό θρεπτικό μέσο. Η σειρά εργασιών είναι η εξής. Το τηγμένο θρεπτικό μέσο χύνεται σε αποστειρωμένα τρυβλία Petri. Αφού το μέσο σκληρύνει, μια σταγόνα του υλικού δοκιμής εφαρμόζεται στην επιφάνειά του και η σταγόνα διανέμεται με μια αποστειρωμένη σπάτουλα Drygalsky πρώτα στη μία πλευρά της επιφάνειας του θρεπτικού μέσου σε ένα τρυβλίο Petri και μετά στην άλλη. Η ίδια σπάτουλα χρησιμοποιείται για να σκουπίσει την επιφάνεια του πυκνού μέσου στο 2ο, 3ο και 4ο φλιτζάνι. Τα κύπελλα επωάζονται στη βέλτιστη θερμοκρασία για μικρόβια (τις περισσότερες φορές - 37°C) έως και 2 ημέρες. Συνήθως, στα δύο πρώτα πιάτα μετά την επώαση, παρατηρείται συνεχής ανάπτυξη μικροβίων, ενώ στις επόμενες - απομονωμένες αποικίες.
Είναι δυνατή η διασπορά της καλλιέργειας εμπλουτισμού χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της αραίωσης. Σε αυτή την περίπτωση, η καλλιέργεια εμπλουτισμού ή η αραίωσή της επιλέγεται με βρόχο και οι πινελιές πραγματοποιούνται σε ένα πυκνό θρεπτικό μέσο σε ένα τρυβλίο Petri με συγκεκριμένη σειρά. Πριν από κάθε νέο εγκεφαλικό επεισόδιο, ο βρόχος αποστειρώνεται. Τα κύπελλα θερμοστάζονται για 1-7 ημέρες, ανάλογα με τον ρυθμό ανάπτυξης του μικροοργανισμού. Οι αναπτυγμένες απομονωμένες αποικίες κοσκινίζονται με ένα βρόχο σε δοκιμαστικούς σωλήνες στην επιφάνεια του κεκλιμένου μέσου ή σε ένα υγρό μέσο.
Απομονωμένες αποικίες αναερόβιων και προαιρετικών αναερόβιων παρασκευάζονται με βαθιά σπορά. Για το σκοπό αυτό, 0,5-1,0 ml αραίωσης του υλικού δοκιμής σπέρνονται σε δοκιμαστικούς σωλήνες με τηγμένο θρεπτικό μέσο που έχει ψυχθεί στους 40-37°C με τέτοιο τρόπο ώστε να ληφθούν απομονωμένες αποικίες. Το μέσο ψύχεται γρήγορα και η επιφάνεια καλύπτεται με ένα στρώμα αποστειρωμένου μίγματος παραφίνης και ελαίου βαζελίνης. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν τριχοειδείς πιπέτες Pasteur, στις οποίες συλλέγεται η κατάλληλη αραίωση του μέσου άγαρ με ενοφθαλμισμό. Το άκρο του τριχοειδούς είναι σφραγισμένο. Με μια καλά επιλεγμένη αραίωση σε δοκιμαστικό σωλήνα ή πιπέτα, αναπτύσσονται απομονωμένες αποικίες. Για την αφαίρεσή τους, ο δοκιμαστικός σωλήνας (ή η πιπέτα) θερμαίνεται ελαφρώς περιστρέφοντας γρήγορα πάνω από τη φλόγα του καυστήρα ή χαμηλώνεται γρήγορα σε ζεστό νερό, ενώ το άγαρ δίπλα στον τοίχο λιώνει και το περιεχόμενο της στήλης γλιστρά εύκολα σε ένα αποστειρωμένο Petri. πιάτο. Η στήλη άγαρ κόβεται με ένα αποστειρωμένο νυστέρι και οι αποικίες αφαιρούνται συλλαμβάνοντάς τις με μια αποστειρωμένη τριχοειδή πιπέτα ή βρόχο. Οι εκχυλισμένες αποικίες μεταφέρονται σε ένα υγρό μέσο ευνοϊκό για την ανάπτυξη απομονωμένων μικροοργανισμών. Εάν ληφθούν απομονωμένες αποικίες σε τριχοειδές, τότε μετά από ενδελεχή απολύμανση σπάει με αποστειρωμένα τσιμπιδάκια και τα τμήματα του τριχοειδούς που περιέχουν απομονωμένες αποικίες μεταφέρονται σε αποστειρωμένο μέσο.
Προσδιορισμός της καθαρότητας της απομονωμένης καλλιέργειας
Η καθαρότητα των αποικιών που ελέγχονται σε κεκλιμένο άγαρ μπορεί να ελεγχθεί με διάφορους τρόπους: οπτικά, κάτω από μικροσκόπιο και με επίστρωση σε μια ποικιλία θρεπτικών μέσων. Με οπτικό έλεγχο, είναι ορατή η ανάπτυξη μικροοργανισμών κατά μήκος της διαδρομής στην επιφάνεια του κεκλιμένου θρεπτικού μέσου. Εάν η ανάπτυξη κατά μήκος του εγκεφαλικού επεισοδίου είναι ετερογενής, τότε η καλλιέργεια θεωρείται μολυσμένη. Ωστόσο, τέτοιος έλεγχος είναι δυνατός μόνο για καλλιέργειες ικανές να αναπτυχθούν στην επιφάνεια πυκνών θρεπτικών μέσων. Επομένως, η καθαρότητα της καλλιέργειας πρέπει να παρακολουθείται με μικροσκόπιο. Για να το κάνετε αυτό, ετοιμάστε ένα παρασκεύασμα χρωματισμένων κυττάρων και δείτε το με εμβάπτιση. Μια καθαρή καλλιέργεια θα πρέπει να είναι μορφολογικά ομοιόμορφη και μπορεί να έχει μόνο μικρή διακύμανση στο μέγεθος των κυττάρων.
Ο προσδιορισμός της συστηματικής θέσης των βακτηρίων περιλαμβάνει τη μελέτη ενός συνόλου χαρακτήρων: μορφολογικών, πολιτισμικών και φυσιολογικών-βιοχημικών.
πολιτιστικά σημάδια
Τα πολιτισμικά ή μακρομορφολογικά χαρακτηριστικά περιλαμβάνουν χαρακτηριστικά γνωρίσματα της ανάπτυξης μικροοργανισμών σε στερεά και υγρά θρεπτικά μέσα.
Ανάπτυξη σε πυκνά θρεπτικά μέσα.
Στην επιφάνεια των πυκνών θρεπτικών μέσων, τα μικρόβια μπορούν να αναπτυχθούν με τη μορφή αποικιών, εγκεφαλικού επεισοδίου ή συνεχούς χλοοτάπητα. Μια αποικία είναι μια απομονωμένη συσσώρευση κυττάρων του ίδιου είδους, η οποία στις περισσότερες περιπτώσεις έχει αναπτυχθεί από ένα κύτταρο. Ανάλογα με το πού αναπτύχθηκαν τα κύτταρα, υπάρχουν επιφανειακές, βαθιές και κάτω αποικίες. Οι αποικίες που αναπτύσσονται στην επιφάνεια του μέσου είναι πολύ διαφορετικές. Κατά την περιγραφή τους λαμβάνονται υπόψη τα ακόλουθα χαρακτηριστικά:
το σχήμα των αποικιών- στρογγυλεμένο, αμοιβοειδές, ακανόνιστο, ριζοειδές κ.λπ.
επιφάνεια αποικίας- λεία, τραχιά, αυλακωτά, διπλωμένα, ζαρωμένα, ακτινωτά ραβδωτά, με ομόκεντρους κύκλους.
προφίλ αποικίας- επίπεδο, κυρτό, σε σχήμα κρατήρα, σε σχήμα κώνου, κυρτό στο κέντρο με έναν κύλινδρο κατά μήκος της άκρης, πιεσμένο στο κέντρο, με έναν κύλινδρο κατά μήκος της άκρης, κ.λπ.
λάμψη και διαφάνεια- γυαλιστερό, ματ, θαμπό, αλευρωμένο, διαφανές.
χρώμα αποικίας- άχρωμες (οι υπόλευκες αποικίες ταξινομούνται ως άχρωμες) ή με χρώμα - λευκό, κίτρινο, χρυσό, πορτοκαλί, λιλά, κόκκινο, μαύρο. Ιδιαίτερα σημαντική είναι η απελευθέρωση της χρωστικής στο υπόστρωμα.
άκρη της αποικίας- λείο, κυματιστό, οδοντωτό, με κρόσσια, σε σχήμα ρίζας κ.λπ.
δομή αποικίας- ομοιογενές, λεπτόκοκκο και χονδρόκοκκο, ραβδωτό (η άκρη και η δομή της αποικίας προσδιορίζονται με μεγεθυντικό φακό ή σε χαμηλή μεγέθυνση του μικροσκοπίου).
συνοχή της αποικίας- καθορίζεται αγγίζοντας την αποικία με βρόχο. Η αποικία μπορεί εύκολα να αφαιρεθεί από το άγαρ, να είναι πυκνή, μαλακή, να μεγαλώνει στο άγαρ, βλεννώδης (κολλάει στον βρόχο), παχύρρευστη, μεμβρανώδης (αφαιρείται πλήρως), εύθραυστη.
Οι βαθιές αποικίες είναι αρκετά μονότονες. Τις περισσότερες φορές μοιάζουν με πεπλατυσμένες φακές, σε προεξοχή που έχουν σχήμα οβάλ με μυτερά άκρα. Οι αποικίες μερικών βακτηρίων μοιάζουν με τούφες από βαμβάκι με νηματώδεις εκφύσεις στο μέσο. Ο σχηματισμός βαθιών αποικιών συχνά συνοδεύεται από ρήξη του πυκνού μέσου εάν τα μικρόβια σχηματίσουν αέρια. Οι κάτω αποικίες μιας μεγάλης ποικιλίας μικροοργανισμών μοιάζουν με λεπτές διαφανείς μεμβράνες που σέρνονται κατά μήκος του πυθμένα.
Το μέγεθος και ορισμένα άλλα χαρακτηριστικά των αποικιών αλλάζουν με την ηλικία και εξαρτώνται από τη σύνθεση του μέσου· επομένως, κατά την περιγραφή τους, υποδεικνύεται η ηλικία της καλλιέργειας, η σύνθεση του μέσου και η θερμοκρασία καλλιέργειας.
Όταν περιγράφεται η ανάπτυξη ενός μικροοργανισμού με εγκεφαλικό επεισόδιο, σημειώνονται τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: η ανάπτυξη είναι αραιή, μέτρια ή άφθονη, συνεχής με λεία ή κυματιστή άκρη, σαφώς ορατή, που μοιάζει με αλυσίδες απομονωμένων αποικιών, διάχυτη, πτερωτή, δενδροειδής ή ριζοειδής. Χαρακτηρίζουν τις οπτικές ιδιότητες της πλάκας, το χρώμα, την επιφάνεια και τη συνοχή της.
Ανάπτυξη σε υγρά θρεπτικά μέσα.
Υπάρχουν οι ακόλουθες μορφές βακτηριακής ανάπτυξης σε υγρά θρεπτικά μέσα:
Θολότητα του περιβάλλοντος. Αυτή η ανάπτυξη είναι χαρακτηριστική για πολλά παθογόνα μικρόβια που ανήκουν στην ομάδα των προαιρετικών αναερόβιων.
βενθική ανάπτυξη. Χαρακτηρίζεται από το σχηματισμό ιζήματος στον πυθμένα του σωλήνα. Μπορεί να είναι αραιό ή άφθονο, εύθρυπτο, ομοιογενές, ινώδες ή με τη μορφή μεγάλων χαλαρών νιφάδων. Η συνοχή του ιζήματος είναι παχύρρευστη, γλοιώδης, εύθραυστη ή παχύρρευστη. Εάν η καλλιέργεια δεν σχηματίζει χρωστική ουσία, τότε το χρώμα του μέσου δεν αλλάζει και το ίζημα αποκτά γκριζωπό λευκό ή κιτρινωπό χρώμα. Η ανάπτυξη κοντά στον πυθμένα είναι χαρακτηριστική των βακτηρίων με αναερόβια αναπνοή.
βρεγματική ανάπτυξηβακτήρια εκφράζεται στο γεγονός ότι το θρεπτικό μέσο στον δοκιμαστικό σωλήνα παραμένει διαφανές. Τα βακτήρια αναπτύσσονται με τη μορφή μεγάλων χαλαρών νιφάδων ή συμπαγών κόκκων που συνδέονται στην εσωτερική επιφάνεια των τοιχωμάτων του δοκιμαστικού σωλήνα.
επιφανειακή ανάπτυξηβακτήρια χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση μιας μεμβράνης στην επιφάνεια ενός υγρού θρεπτικού μέσου. Η μεμβράνη μπορεί να είναι λεπτή, άχρωμη, να εξαφανίζεται όταν ανακινείται ή αναταράσσεται, υγρή, παχύρρευστη, γλοιώδης, πυκνή, ξηρή· κατά τη λήψη υλικού από αυτήν, μπορεί να αφαιρεθεί εξ ολοκλήρου με τη μορφή στρογγυλού δίσκου. Συχνά, η ανάπτυξη μικροοργανισμών σε ένα υγρό θρεπτικό μέσο συνοδεύεται από την εμφάνιση αερίων και οσμής.
καθαρό πολιτισμόμικρόβια είναι ένας πληθυσμός μικροοργανισμών του ίδιου είδους, που λαμβάνεται από μια απομονωμένη μικροβιακή αποικία. Με τον όρο μικροβιακή αποικία εννοείται ο απόγονος βακτηρίων που προκύπτουν από τον πολλαπλασιασμό ενός μικροβιακού κυττάρου.
Η απομόνωση μιας καθαρής καλλιέργειας μικροβίων είναι ένα υποχρεωτικό βήμα σε κάθε βακτηριολογική μελέτη. Μια καθαρή καλλιέργεια είναι απαραίτητη για τη μελέτη μορφολογικών, πολιτιστικών, βιοχημικών και αντιγονικών ιδιοτήτων, ο συνδυασμός των οποίων καθορίζει το είδος του υπό μελέτη μικροοργανισμού.
Πολλές διαφορετικές μέθοδοι έχουν προταθεί για την απομόνωση καθαρών καλλιεργειών μικροβίων από υλικά που περιέχουν άφθονη μικτή μικροχλωρίδα. Η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος είναι ο μηχανικός διαχωρισμός των μικροοργανισμών που υπάρχουν στο υλικό δοκιμής προκειμένου να ληφθούν απομονωμένες αποικίες στην επιφάνεια ή στο βάθος του θρεπτικού μέσου.
Τα εκλεκτικά θρεπτικά μέσα χρησιμοποιούνται ευρέως, διεγείροντας την ανάπτυξη αυτών των μικροοργανισμών, η καθαρή καλλιέργεια των οποίων υποτίθεται ότι είναι απομονωμένη.
Όταν απομονώνουν μια καθαρή καλλιέργεια παθογόνων μικροβίων από παθολογικό υλικό μολυσμένο με ξένη μικροχλωρίδα, μερικές φορές καταφεύγουν στη μόλυνση εργαστηριακών ζώων.
Κατά τη σπορά σε υγρό θρεπτικό μέσο, ο βρόχος με το υλικό πάνω του βυθίζεται στο μέσο. Εάν το υλικό είναι παχύρρευστο και δεν αφαιρεθεί από τον βρόχο, τρίβεται στο τοίχωμα του αγγείου και στη συνέχεια ξεπλένεται με υγρό μέσο.
Κατά τη σπορά σε λοξότμητο άγαρ κρέατος-πεπτόνης, ο σωλήνας λαμβάνεται στο αριστερό χέρι μεταξύ του 1ου και του 2ου δακτύλου έτσι ώστε η βάση του σωλήνα να βρίσκεται στην επιφάνεια του χεριού και ο εμβολιασμός να γίνεται υπό τον έλεγχο του οφθαλμού. Ο φελλός αφαιρείται από τον δοκιμαστικό σωλήνα με το δεξί χέρι V και IV δάχτυλα, χωρίς να αγγίξει το τμήμα του φελλού που μπαίνει μέσα στον δοκιμαστικό σωλήνα. Τα υπόλοιπα 3 δάχτυλα του δεξιού χεριού παραμένουν ελεύθερα
λαμβάνοντας ένα βακτηριακό βρόχο μέσω του οποίου πραγματοποιείται η σπορά. Ο βρόχος κρατιέται σαν στυλό γραφής. Μετά την αφαίρεση του πώματος, ο δοκιμαστικός σωλήνας με το θρεπτικό μέσο διατηρείται σε κεκλιμένη θέση για να αποτραπεί η είσοδος ξένων μικροοργανισμών από τον αέρα.
Ο βρόχος με το ενοφθαλμισμένο υλικό εισάγεται στον δοκιμαστικό σωλήνα προς τα κάτω, χαμηλώνει επίπεδη στην επιφάνεια του θρεπτικού μέσου και εφαρμόζεται μια διαδρομή με κινήσεις ολίσθησης από κάτω προς τα πάνω, από το ένα τοίχωμα του δοκιμαστικού σωλήνα στο άλλο.
Κατά τη σπορά στην επιφάνεια ενός πυκνού θρεπτικού μέσου σε πιάτα Petri, το κύπελλο κρατιέται στο αριστερό χέρι. Από τη μία πλευρά, ο πυθμένας του συγκρατείται με τα δάχτυλα I και II και από την άλλη με τα δάχτυλα IV και V. Το καπάκι, ελαφρώς ανοιχτό ώστε μια θηλιά ή σπάτουλα να περνά ελεύθερα στο κενό, στερεώνεται με τα δάχτυλα I και III ή I και II. Μια μικρή ποσότητα του υλικού δοκιμής τρίβεται με βακτηριακό βρόχο στην επιφάνεια του θρεπτικού μέσου στην άκρη του πιάτου. Ο βρόχος στη συνέχεια καίγεται για να καταστραφεί το πλεονάζον υλικό πάνω του. Η γραμμή σποράς ξεκινά από το σημείο που βρίσκεται το υλικό. Ο βακτηριακός βρόχος τοποθετείται επίπεδος στο θρεπτικό μέσο για να μην γρατσουνιστεί η επιφάνειά του και πραγματοποιούνται εγκεφαλικά επεισόδια σε όλο το μέσο. Θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε οι πινελιές που εφαρμόζονται από τον βρόχο να διατηρούνται όσο το δυνατόν πιο κοντά μεταξύ τους, καθώς αυτό επιμηκύνει τη συνολική γραμμή σποράς και καθιστά δυνατή τη λήψη μεμονωμένων αποικιών μικροβίων. Για ομοιόμορφη κατανομή του εμβολιασμένου υλικού στην επιφάνεια ενός πυκνού θρεπτικού μέσου, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα στυλεό ή σπάτουλα αντί για βρόχο.
Η σπορά με έγχυση σε στήλη θρεπτικού μέσου πραγματοποιείται σε δοκιμαστικό σωλήνα με μέσο κατεψυγμένο σε μορφή στήλης. Ο σωλήνας λαμβάνεται στο αριστερό χέρι, ως συνήθως, και στο κέντρο της στήλης μέχρι το κάτω μέρος του σωλήνα, εγχέεται ένας βρόχος με το υλικό πάνω του.
Για τη μελέτη των ιδιοτήτων των αποικιών, τα μικρόβια καλλιεργούνται σε πυκνά θρεπτικά μέσα σε πιάτα Petri. Κατά τη σπορά του υλικού, προσπαθούν να αποκτήσουν μια απομονωμένη ανάπτυξη αποικιών. Οι πλάκες σποράς παρατηρούνται πρώτα με γυμνό μάτι ή μέσω ενός μεγεθυντικού φακού, στη συνέχεια τοποθετούνται ανάποδα στη σκηνή του μικροσκοπίου και οι αποικίες παρατηρούνται στο εκπεμπόμενο φως με έναν φακό χαμηλής μεγέθυνσης και ένα στενό άνοιγμα.
Οι αποικίες χαρακτηρίζονται από το μέγεθος, το σχήμα, το περίγραμμα των άκρων, το ανάγλυφο, την επιφάνεια, το χρώμα, τη δομή και τη συνοχή.
αξίαΗ αποικία καθορίζεται από τη διάμετρό της.Ανάλογα με τη διάμετρο, οι αποικίες είναι σημειακές (διάμετρος μικρότερη από 1 mm), μικρές (διάμετρος 1-2 mm), μεσαίες (διάμετρος 2-4 mm) και μεγάλες (διάμετρος 4-6 mm ή περισσότερο).
ΜορφήΟι αποικίες είναι κανονικές - στρογγυλές, ακανόνιστες - αμοιβοειδείς, ριζοειδείς - σε σχήμα ρίζας, που μοιάζουν με πλεγμένες ρίζες δέντρων.
Χαρακτήρας περιγράμματος άκρωνπροσδιορίζεται με εξέταση της αποικίας κάτω από μεγεθυντικό φακό ή μικροσκόπιο με χαμηλή μεγέθυνση. Υπάρχουν λείες άκρες με τη μορφή μιας σαφώς καθορισμένης γραμμής και ανομοιόμορφες (χτενισμένες, κυματιστές, με κρόσσια).
Ανάγλυφο της αποικίαςχαρακτηρίζεται από την ανύψωσή του πάνω από την επιφάνεια του θρεπτικού μέσου και το περίγραμμα της μορφής σε κατακόρυφη τομή. Το ανάγλυφο της αποικίας προσδιορίζεται με γυμνό μάτι ή με μεγεθυντικό φακό όταν το βλέπουμε από πάνω και από το πλάι. Διακρίνετε (σχήμα δακρύου, θολοειδές, κωνικό, αποικίες με καταθλιπτικό κέντρο, επίπεδες).
ΕπιφάνειαΟι αποικίες είναι ματ ή γυαλιστερές με γυαλάδα, ξηρές ή υγρές, λείες ή τραχιές. Οι λείες αποικίες υποδηλώνονται με το γράμμα S (λείο), τραχύ - με το γράμμα R (ακατέργαστο), που σημαίνει "λείο" και "τραχύ" αντίστοιχα. Η μετάβαση των μορφών S σε μορφές R παρατηρείται κατά τη διάσταση. Το φαινόμενο της διάσπασης σε παθογόνα μικρόβια παρατηρείται υπό την επίδραση αντιβιοτικών και χημειοθεραπείας, ειδικών παραγόντων ανοσίας που σχηματίζονται κατά τη διάρκεια της μολυσματικής διαδικασίας, καθώς και όταν ένα μικρόβιο εισέρχεται στο εξωτερικό περιβάλλον.
Χρώμα αποικίαςκαθορίζεται από τη χρωστική ουσία που παράγεται από την καλλιέργεια μικροβίων. Η συντριπτική πλειοψηφία των παθογόνων βακτηρίων δεν σχηματίζει χρωστική ουσία, με αποτέλεσμα οι αποικίες τους να είναι άχρωμες ή γαλακτώδες-θολό χρώμα, παρόμοιο με το οπάλιο. Στο μεταδιδόμενο φως, τέτοιες αποικίες είναι περισσότερο ή λιγότερο διαφανείς. Οι τύποι μικροβίων που σχηματίζουν χρωστικές δίνουν αποικίες διαφόρων χρωμάτων: κρεμ, κίτρινο, χρυσοπορτοκαλί, μπλε, κόκκινο, λιλά, μαύρο κ.λπ.
Δομή των αποικιώνπροσδιορίζεται στο εκπεμπόμενο φως σε χαμηλή μεγέθυνση του μικροσκοπίου.
Από τη φύση της δομής, διακρίνονται οι ακόλουθοι τύποι αποικιών:
1) υαλώδες - άχρωμο, διαφανές, χωρίς ορατή ορισμένη δομή.
2) κοκκώδης?
3) νηματώδη ή ινώδη, που χαρακτηρίζεται από την παρουσία μακριών, πυκνά πλεγμένων νημάτων στο πάχος της αποικίας.
συνοχή της αποικίαςεξετάστε αγγίζοντας ή παίρνοντας μέρος του υλικού από αυτό με βακτηριακό βρόχο.
Από τη φύση της συνέπειας της αποικίας είναι:
1) παχύρρευστο, εύκολα αφαιρούμενο και διαβρωμένο πάνω από την επιφάνεια του θρεπτικού μέσου όπως το βούτυρο.
2) παχύρρευστο ή βλεννογόνο, που κολλάει και φτάνει στον βρόχο.
3) ινώδες ή δερματώδες, πυκνό, αφαιρούμενο από την επιφάνεια του θρεπτικού μέσου με τη μορφή ελαστικής μεμβράνης που αντιστοιχεί στο μέγεθος και το σχήμα της αποικίας.
4) εύθραυστοι, ξηροί βρόχοι που θρυμματίζονται όταν αγγίζονται.
Σε υγρά θρεπτικά μέσαη φύση της μικροβιακής ανάπτυξης είναι λιγότερο ποικιλόμορφη από ό,τι σε πυκνά θρεπτικά μέσα. Ωστόσο, οι ακόλουθες μορφές βακτηριακής ανάπτυξης έχουν επίσης εντοπιστεί εδώ.
Θρεπτικά μέσα για την καλλιέργεια βακτηρίων
Για την απομόνωση καθαρών καλλιεργειών παθογόνων βακτηρίων, χρησιμοποιούνται θρεπτικά μέσα με σταθερό pH που είναι βέλτιστα για την ανάπτυξή τους. Τα περισσότερα βακτήρια μπορούν να αναπτυχθούν σε διάφορα θρεπτικά μέσα. η εξαίρεση είναι τα χλαμύδια και η ρικέτσια, που δεν αναπτύσσονται σεvitroεκτός κυτταροκαλλιεργειών. Το περιβάλλον που χρησιμοποιείται πρέπει να περιέχει
Ουσίες που χρησιμοποιούνται από βακτήρια για διάφορες βιοσυνθετικές διεργασίες.
Καθολικές πηγές υδρολύματα αζώτου και άνθρακα - πρωτεϊνών (περιέχουν πλήρες σύνολο αμινοξέων), πεπτίδια και πεπτόνες. Καθολικές πηγές βιταμινών και μικροστοιχείων είναι τα εκχυλίσματα ζωικών ή φυτικών πρωτεϊνών και τα υδρολύματα πρωτεϊνών.
pH περιβάλλον. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η ζωτική δραστηριότητα των βακτηρίων συνοδεύεται από μια μετατόπιση του pH στην όξινη ή αλκαλική πλευρά, η οποία απαιτεί την εισαγωγή διαφόρων ρυθμιστικών συστημάτων στα μέσα (συνήθως χρησιμοποιείται ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών). Τα ισορροπημένα μέσα διακρίνονται από υψηλή ρυθμιστική ικανότητα και σταθερό βέλτιστο pH. Είναι επίσης σημαντικό να δημιουργηθεί μια βέλτιστη συγκέντρωση O 2 και CO 2 .
Σπορά και καλλιέργεια
Με επαρκή περιεκτικότητα σε παθογόνα βακτήρια στο δείγμα, ο εμβολιασμός πραγματοποιείται σε πυκνά θρεπτικά μέσα (για τη λήψη απομονωμένων αποικιών). Εάν υπάρχουν λίγα βακτήρια στο υλικό δοκιμής, τότε ο εμβολιασμός πραγματοποιείται σε υγρά μέσα εμπλουτισμού. Στην πράξη, η απομόνωση σχετικά ανεπιτήδευτων βακτηρίων πραγματοποιείται συνήθως σε απλά μέσα (για παράδειγμα, σε KA, άγαρ Ploskirev, ζωμό θειογλυκόλης, άγαρ Sabouraud κ.λπ.). Για να απομονώσετε ιδιότροπα είδη, προσθέστε στο περιβάλλον ΘΡΕΠΤΙΚΕΣ ουσιες(αίμα, ορός, εκχύλισμα μαγιάς κ.λπ.), καθώς και απορροφητές τοξικών μεταβολιτών που σχηματίζονται κατά την ανάπτυξη βακτηρίων(για παράδειγμα, κάρβουνο). Για καλλιέργειες, χρησιμοποιούνται μικροβιολογικοί βρόχοι, λιγότερο συχνά βελόνες και σπάτουλες.
Απόκτηση απομονωμένων αποικιών
Στην πράξη, για τη λήψη απομονωμένων αποικιών, χρησιμοποιείται συχνότερα η τροποποίηση κοσκίνισης Drygalski. Για να γίνει αυτό, το υλικό εφαρμόζεται στην επιφάνεια ενός πυκνού θρεπτικού μέσου πιο κοντά στην άκρη και δημιουργείται μια "πλάκα". Στη συνέχεια, από αυτό, το υλικό κατανέμεται σε τέσσερα τετράγωνα, σχεδιάζοντας πινελιές σε βρόχο, όπως φαίνεται στο Σχ. 1-12, ψήσιμο του βρόχου μετά τη σπορά κάθε τετραγώνου. Αυτή η μέθοδος σας επιτρέπει να αποκτήσετε απομονωμένες αποικίες και να τις μελετήσετε. Εξαίρεση αποτελεί η τεχνική σποράς για βακτηριολογική εξέταση των ούρων (η τεχνική σποράς ραβδώσεων φαίνεται στο Σχ. 1-13). Αυτές οι μέθοδοι είναι κατάλληλες για τη σπορά αερόβιων και προαιρετικών αναερόβιων βακτηρίων, καθώς και για μη αυστηρά αναερόβια.
Θερμοκρασία καλλιέργειας
Τα παθογόνα βακτήρια ποικίλλουν ως προς τις βέλτιστες θερμοκρασίες για την ανάπτυξή τους, αλλά τα περισσότερα από αυτά αναπτύσσονται καλά στους 35-37°C. Εξαιρούνται ορισμένα άτυπα μυκοβακτήρια, ο αιτιολογικός παράγοντας της πανώλης, της λιστέριας και της λεπτοσπείρας (βέλτιστη θερμοκρασία 20-30 ° C), καθώς και CampylobacterΤζετζούνι(βέλτιστη θερμοκρασία 42 °C).
Τα βακτήρια διαχωρίζονται σαφώς σε σχέση με την περιεκτικότητα σε οξυγόνο στην ατμόσφαιρα καλλιέργειας.
Αερόμπες.Οι καλλιέργειες αερόβιων βακτηρίων καλλιεργούνται σε απλούς θερμοστάτες. Μερικά προαιρετικά αναερόβια είδη μπορούν επίσης να καλλιεργηθούν στον ατμοσφαιρικό αέρα, αλλά είναι καλύτερο να τοποθετούνται οι καλλιέργειες σε θερμοστάτες με μετρημένη παροχή οξυγόνου. Στην πράξη, τοποθετούνται συχνότερα σε ξηραντήρες, όπου εισάγεται ένα αναμμένο κερί. μετά την εξάντλησή του στην ατμόσφαιρα, η περιεκτικότητα σε οξυγόνο μειώνεται και η περιεκτικότητα σε CO 2 αυξάνεται.
Αναερόβια.Καλλιέργειες αναερόβιων βακτηρίων σε υγρά μέσα χύνονται με βαζελίνη ή άλλο λάδι. Όταν χρησιμοποιούνται πυκνά μέσα, οι καλλιέργειες καλλιεργούνται σε ειδικές συσκευές - αναεροστατικά (από όπου αντλείται ο αέρας) ή οι καλλιέργειες χύνονται με ένα λεπτό στρώμα άγαρ. Αναερόβιες συνθήκες μπορούν να δημιουργηθούν χημικά τοποθετώντας τις καλλιέργειες σε ξηραντήρες, στον πυθμένα των οποίων χύνεται ένα αλκαλικό διάλυμα πυρογαλλόλης που απορροφά οξυγόνο. Μπορείτε επίσης να χρησιμοποιήσετε τις μεθόδους Fortner, Zeissler και Weinberg.
Μέθοδος Fortner.Οι εμβολιασμοί πραγματοποιούνται σε ένα τρυβλίο Petri με ένα παχύ στρώμα μέσου, χωρισμένο στη μέση με μια στενή αυλάκωση κομμένη σε άγαρ. Στο ένα μισό, σπέρνεται μια καλλιέργεια αερόβιων βακτηρίων, από την άλλη - αναερόβια. Οι άκρες του κυπέλλου γεμίζονται με παραφίνη και επωάζονται σε θερμοστάτη. Αρχικά, παρατηρείται η ανάπτυξη των αερόβιων, και στη συνέχεια (μετά την απορρόφηση του οξυγόνου) - η ανάπτυξη των αναερόβιων.
Μέθοδος Zeisslerχρησιμοποιείται για την απομόνωση καθαρών καλλιεργειών αναερόβιων που σχηματίζουν σπόρους. Για να γίνει αυτό, ενοφθαλμίστε το θρεπτικό υλικό Kitta-Tarozzi, θερμαίνετε για 15 λεπτά στους 80 ° C (για να καταστραφούν οι βλαστικές μορφές), περιχύστε το με λάδι βαζελίνης και επωάστε για 24 ώρες. Στη συνέχεια εμβολιάστε σε άγαρ σακχάρου αίματος για να λάβετε καθαρές καλλιέργειες . Μετά από 24 ώρες καλλιέργειας, οι ύποπτες αποικίες μελετώνται και κοσκινίζονται στο μέσο Kitta-Tarozzi (με επακόλουθο έλεγχο της καθαρότητας της απομονωμένης καλλιέργειας).
Μέθοδος Weinbergχρησιμοποιείται για τη λήψη καθαρών καλλιεργειών αυστηρών αναερόβιων. Καλλιέργειες που αναπτύσσονται σε μέσο Kitta-Tarozzi προστίθενται σε ζωμό ζάχαρης. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας μια πιπέτα Pasteur με σφραγισμένο άκρο, το υλικό μεταφέρεται σε στενούς δοκιμαστικούς σωλήνες (Vignal tubes) με ζάχαρη MPA, βυθίζοντας την παστέρκα στον πάτο του δοκιμαστικού σωλήνα. Οι σπαρμένοι δοκιμαστικοί σωλήνες ψύχονται γρήγορα με κρύο νερό, το οποίο επιτρέπει τη στερέωση μεμονωμένων βακτηριακών κυττάρων στο πάχος του σκληρυμένου άγαρ. Οι σωλήνες επωάζονται και οι αναπτυσσόμενες αποικίες εξετάζονται. Εάν βρεθεί μια ύποπτη αποικία, γίνεται μια τομή στη θέση της, η αποικία επιλέγεται γρήγορα και σπέρνεται στο μέσο Kitta-Tarozzi (με επακόλουθο έλεγχο της καθαρότητας της απομονωμένης καλλιέργειας).
Μέθοδοι καλλιέργειας
Κατά την ανάπτυξη βακτηρίων, χρησιμοποιείται η στατική μέθοδος, η μέθοδος βαθιάς καλλιέργειας με αερισμό και η μέθοδος ροής θρεπτικών μέσων. Σύμφωνα με τις μεθόδους καλλιέργειας, οι βακτηριακές καλλιέργειες χωρίζονται σε περιοδικός(με στάσιμη και βαθιά καλλιέργεια) και συνεχής(σε καλλιέργεια ροής).
Σταθερή μέθοδοςείναι το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο στην πράξη. Η σύνθεση των μέσων παραμένει σταθερή· δεν γίνονται πρόσθετοι χειρισμοί με αυτά.
Μέθοδος βαθιάς καλλιέργειαςχρησιμοποιούνται στη βιομηχανική καλλιέργεια βακτηριακής βιομάζας, για την οποία χρησιμοποιούνται ειδικοί λέβητες-αντιδραστήρες. Είναι εξοπλισμένα με συστήματα διατήρησης της θερμοκρασίας, παροχής διαφόρων θρεπτικών συστατικών στο ζωμό, ανάμειξης βιομάζας και συνεχούς παροχής οξυγόνου. Η δημιουργία αερόβιων συνθηκών σε όλο το πάχος του μέσου συμβάλλει στη ροή των ενεργειακών διεργασιών κατά μήκος της αερόβιας οδού, γεγονός που συμβάλλει στη μέγιστη αξιοποίηση του ενεργειακού δυναμικού της γλυκόζης και, κατά συνέπεια, στη μέγιστη απόδοση βιομάζας.
Μέθοδος μέσων ροής(μέθοδος βιομηχανικής καλλιέργειας) σας επιτρέπει να διατηρείτε συνεχώς τη βακτηριακή καλλιέργεια στη φάση εκθετικής ανάπτυξης, η οποία επιτυγχάνεται με τη συνεχή εισαγωγή θρεπτικών ουσιών και την απομάκρυνση ορισμένου αριθμού βακτηριακών κυττάρων. Η παραμονή των βακτηρίων στο στάδιο της εκθετικής ανάπτυξης εξασφαλίζει τη μέγιστη απόδοση διαφόρων βιολογικά δραστικών ουσιών (βιταμίνες, αντιβιοτικά κ.λπ.).
Πρωτογενής αναγνώριση βακτηρίων
Στις περισσότερες περιπτώσεις, η μελέτη των χαρακτηριστικών ανάπτυξης για την πρωτογενή ταυτοποίηση των παθογόνων πραγματοποιείται σε αποικίες που έχουν αναπτυχθεί εντός 18-24 ωρών.Η φύση της βακτηριακής ανάπτυξης σε διάφορα μέσα μπορεί να προσφέρει πολλές χρήσιμες πληροφορίες. Στην πράξη, χρησιμοποιείται ένα σχετικά μικρό σύνολο κριτηρίων. Στα υγρά μέσα, συνήθως λαμβάνεται υπόψη η φύση της επιφάνειας (σχηματισμός φιλμ) ή η ανάπτυξη κοντά στον πυθμένα (τύπος ιζήματος) και η γενική θολότητα του μέσου. Σε στερεά μέσα, σχηματίζονται βακτήρια αποικίες--απομονωμένες δομές που προκύπτουν από την ανάπτυξη και τη συσσώρευση βακτηρίων.Οι αποικίες προκύπτουν ως αποτέλεσμα της ανάπτυξης και της αναπαραγωγής ενός ή περισσότερων κυττάρων. Ετσι, η επανασπορά από την αποικία καθιστά περαιτέρω δυνατή τη λειτουργία με μια καθαρή καλλιέργεια του παθογόνου.Η ανάπτυξη βακτηρίων σε πυκνά μέσα έχει πιο χαρακτηριστικά χαρακτηριστικά.
Το μέγεθος και το σχήμα των αποικιών
Σημαντικά χαρακτηριστικά των αποικιών είναι το μέγεθος και το σχήμα τους. Οι αποικίες μπορεί να είναι μεγάλες ή μικρές. Το μέγεθος των αποικιών είναι ένα χαρακτηριστικό που καθιστά δυνατή τη διάκριση μεταξύ διαφορετικών ειδών, γενών, ακόμη και τύπων βακτηρίων.
Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι αποικίες θετικών κατά Gram βακτηρίων είναι μικρότερες από τις αποικίες αρνητικών κατά Gram βακτηρίων.Οι αποικίες βακτηρίων μπορεί να είναι επίπεδες, ανυψωμένες, κυρτές, να έχουν καταθλιπτικό ή ανυψωμένο κέντρο. Ένα άλλο σημαντικό σημάδι είναι το σχήμα των άκρων των αποικιών.Κατά τη μελέτη της μορφής των αποικιών, λαμβάνεται υπόψη η φύση της επιφάνειάς του: ματ, γυαλιστερή, λεία ή τραχιά. Οι άκρες των αποικιών μπορεί να είναι λείες, κυματιστές, λοβώδεις (βαθιά οδοντωτές), οδοντωτές, διαβρωμένες, με κρόσσια κ.λπ. Τα μεγέθη και τα σχήματα των αποικιών μπορούν συχνά να αλλάξουν. Τέτοιες αλλαγές είναι γνωστές ως διάσταση.Συσχετισμοί S- και R-duc εντοπίζονται συχνότερα.Οι αποικίες S είναι στρογγυλές, λείες και κυρτές, με λείες άκρες και γυαλιστερή επιφάνεια. Οι αποικίες R έχουν ακανόνιστο σχήμα, τραχιές, με οδοντωτές άκρες.
Χρώμα αποικίας
Κατά την προβολή των καλλιεργειών, προσέξτε επίσης το χρώμα των αποικιών. Τις περισσότερες φορές είναι άχρωμα, λευκά, μπλε, κίτρινα ή μπεζ. λιγότερο συχνά - κόκκινο, μοβ, πράσινο ή μαύρο. Μερικές φορές οι αποικίες είναι ιριδίζουσες, λαμπυρίζουν δηλαδή με όλα τα χρώματα του ουράνιου τόξου [από τα ελληνικά. Ίρις,ΟΥΡΑΝΙΟ ΤΟΞΟ]. Η χρώση εμφανίζεται ως αποτέλεσμα της ικανότητας των βακτηρίων να σχηματίζουν χρωστική ουσία. Σε ειδικά μέσα διαφοροποίησης που περιέχουν ειδικά συστατικά ή βαφές, οι αποικίες μπορούν να αποκτήσουν ποικιλία χρωμάτων (μαύρο, μπλε, κ.λπ.) λόγω της συμπερίληψης βαφών ή της ανάκτησής τους από μια άχρωμη μορφή. Σε αυτή την περίπτωση, το χρώμα τους δεν σχετίζεται με το σχηματισμό χρωστικών.
Μυρωδιά
Η όσφρηση είναι λιγότερο σημαντικό σημάδι των αποικιών, καθώς οι συνειρμοί που προκαλεί είναι υποκειμενικοί. Συγκεκριμένα, οι καλλιέργειες Pseudomonas aeruginosa έχουν τη μυρωδιά της καραμέλας, οι καλλιέργειες Listeria - ορού γάλακτος, Proteus - μια σάπια μυρωδιά, Nocardia - φρεσκοσκαμμένη γη.
Μέθοδος Παστέρ (μέθοδος περιορισμού των αραιώσεων).Συνίσταται στο γεγονός ότι ένας αριθμός διαδοχικών αραιώσεων γίνεται από το υπό μελέτη υλικό σε ένα υγρό θρεπτικό μέσο. Για να γίνει αυτό, μια σταγόνα ενοφθαλμίσματος εισάγεται σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα με ένα αποστειρωμένο υγρό μέσο, από το οποίο μια σταγόνα μεταφέρεται στον επόμενο δοκιμαστικό σωλήνα και έτσι ενοφθαλμίζεται έως και 8-10 δοκιμαστικούς σωλήνες. Με κάθε αραίωση, ο αριθμός των μικροβιακών κυττάρων που εισέρχονται στο μέσο θα μειώνεται και είναι δυνατόν να ληφθεί μια τέτοια αραίωση στην οποία θα υπάρχει μόνο ένα μικροβιακό κύτταρο σε ολόκληρο τον δοκιμαστικό σωλήνα με το μέσο, από το οποίο μια καθαρή καλλιέργεια του μικροοργανισμού θα αναπτυχθεί. Δεδομένου ότι τα μικρόβια αναπτύσσονται διάχυτα σε υγρά μέσα, δηλ. κατανέμονται εύκολα σε όλο το περιβάλλον, είναι δύσκολο να απομονωθεί ένα μικροβιακό κύτταρο από ένα άλλο. Έτσι, η μέθοδος Pasteur δεν παρέχει πάντα μια καθαρή καλλιέργεια. Ως εκ τούτου, επί του παρόντος, αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται κυρίως για την προκαταρκτική μείωση της συγκέντρωσης μικροοργανισμών στο υλικό πριν από τον εμβολιασμό του σε ένα πυκνό μέσο για τη λήψη απομονωμένων αποικιών.
Μέθοδοι μηχανικού διαχωρισμού μικροοργανισμών με χρήση πυκνών θρεπτικών μέσων.Αυτές οι μέθοδοι περιλαμβάνουν τη μέθοδο Koch και τη μέθοδο Drygalsky.
Μέθοδος Koch (μέθοδος βαθιάς σποράς).Το υλικό δοκιμής εισάγεται με ένα βακτηριολογικό βρόχο ή μια πιπέτα Pasteur σε δοκιμαστικό σωλήνα με λιωμένο πυκνό θρεπτικό μέσο. Ανακατέψτε το περιεχόμενο του δοκιμαστικού σωλήνα ομοιόμορφα περιστρέφοντάς τον ανάμεσα στις παλάμες. Μια σταγόνα του αραιωμένου υλικού μεταφέρεται στον δεύτερο δοκιμαστικό σωλήνα, από τον δεύτερο στον τρίτο κ.ο.κ. Το περιεχόμενο κάθε σωλήνα, ξεκινώντας από το πρώτο, χύνεται σε αποστειρωμένα τρυβλία Petri. Μετά τη στερεοποίηση του μέσου στα κύπελλα, τοποθετούνται σε θερμοστάτη για καλλιέργεια.
Για την απομόνωση αναερόβιων μικροοργανισμών με τη μέθοδο Koch, είναι απαραίτητο να περιοριστεί η πρόσβαση του οξυγόνου στην καλλιέργεια. Για το σκοπό αυτό, η επιφάνεια της βαθιάς σποράς σε ένα τρυβλίο Petri γεμίζεται με ένα αποστειρωμένο μείγμα παραφίνης και βαζελίνης (1:1). Μπορείτε επίσης να αφήσετε το εμβόλιο, αναμεμειγμένο καλά με το μέσο άγαρ, απευθείας στον δοκιμαστικό σωλήνα. Ταυτόχρονα, το βαμβακερό βύσμα αντικαθίσταται με ένα ελαστικό ή η επιφάνεια του άγαρ χύνεται με ένα μείγμα παραφίνης και λαδιού βαζελίνης. Για να εξαχθούν οι αναπτυγμένες αποικίες αναερόβιων μικροοργανισμών, οι δοκιμαστικοί σωλήνες θερμαίνονται ελαφρά περιστρέφοντας γρήγορα πάνω από μια φλόγα καυστήρα. Το άγαρ δίπλα στα τοιχώματα λιώνει και η στήλη γλιστράει εύκολα στο προετοιμασμένο πιάτο Petri. Στη συνέχεια, η στήλη άγαρ κόβεται με ένα αποστειρωμένο νυστέρι, οι αποικίες αφαιρούνται με στείρο βρόχο ή αποστειρωμένη τριχοειδική κοπή και μεταφέρονται σε υγρό μέσο.
Μέθοδος Drygalskiβασίζεται στον μηχανικό διαχωρισμό μικροβιακών κυττάρων στην επιφάνεια ενός πυκνού θρεπτικού μέσου σε τρυβλία Petri. Κάθε μικροβιακό κύτταρο, στερεωμένο σε ένα συγκεκριμένο μέρος, αρχίζει να πολλαπλασιάζεται, σχηματίζοντας μια αποικία.
Για τη σπορά σύμφωνα με τη μέθοδο Drygalsky, χρησιμοποιούνται πολλά πιάτα Petri, γεμάτα με ένα πυκνό θρεπτικό μέσο. Μια σταγόνα του υλικού δοκιμής τοποθετείται στην επιφάνεια του μέσου. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη σπάτουλα, η σταγόνα αυτή κατανέμεται σε ολόκληρο το θρεπτικό μέσο (σπορά με γκαζόν).
Η σπορά μπορεί επίσης να γίνει με ραβδώσεις χρησιμοποιώντας βακτηριολογική θηλιά. Με την ίδια σπάτουλα ή θηλιά, η σπορά πραγματοποιείται στο δεύτερο, τρίτο κ.λπ. φλιτζάνια. Κατά κανόνα, η μικροβιακή ανάπτυξη με τη μορφή συνεχούς πλάκας εμφανίζεται στο πρώτο πιάτο μετά την καλλιέργεια του εμβολιασμού, στα επόμενα πιάτα μειώνεται το μικροβιακό περιεχόμενο και σχηματίζονται απομονωμένες αποικίες, από τις οποίες μπορεί εύκολα να απομονωθεί μια καθαρή καλλιέργεια με διαλογή.
Έτσι, επιτυγχάνεται συνεχής ανάπτυξη στους πρώτους τομείς και μεμονωμένες αποικίες θα αναπτυχθούν κατά μήκος των επόμενων εγκεφαλικών επεισοδίων, που είναι απόγονοι ενός κυττάρου.
Για να εξοικονομήσετε μέσα και σκεύη, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε ένα πιάτο, χωρίζοντάς το σε τομείς και να τα ενοφθαλμίσετε διαδοχικά με ένα κτύπημα (μέθοδος εξάντλησης). Για να γίνει αυτό, το υλικό λαμβάνεται με έναν βρόχο και σχεδιάζεται μια σειρά από παράλληλες πινελιές, πρώτα πάνω από την επιφάνεια του πρώτου τομέα και στη συνέχεια σπάρονται όλοι οι άλλοι τομείς με τα κελιά που παραμένουν στον βρόχο. Με κάθε επόμενο εγκεφαλικό επεισόδιο, ο αριθμός των σπαρμένων κυττάρων μειώνεται.
Μέθοδος απομόνωσης καθαρών καλλιεργειών με χρήση χημικώνχρησιμοποιείται για την απομόνωση καλλιεργειών μικροοργανισμών ανθεκτικών σε ορισμένες χημικές ουσίες. Για παράδειγμα, αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση μιας καθαρής καλλιέργειας μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης που είναι ανθεκτική σε οξέα, αλκάλια και αλκοόλ. Στην περίπτωση αυτή, το υλικό δοκιμής πριν από τη σπορά χύνεται με διάλυμα οξέος 15% ή αντιφορμίνη και διατηρείται σε θερμοστάτη για 3-4 ώρες. Μετά την έκθεση σε οξύ ή αλκάλιο, τα κύτταρα του βάκιλλου της φυματίωσης παραμένουν ζωντανά και όλοι οι άλλοι μικροοργανισμοί που περιέχονται στο εξεταζόμενο υλικό πεθαίνουν. Μετά την εξουδετέρωση με οξύ ή αλκάλιο, το κατεργασμένο υλικό σπέρνεται σε στερεό μέσο και λαμβάνονται απομονωμένες αποικίες του αιτιολογικού παράγοντα της φυματίωσης.
Η μελέτη των βακτηρίων έχει μεγάλη πρακτική σημασία για τον άνθρωπο. Μέχρι σήμερα έχει ανακαλυφθεί μεγάλος αριθμός προκαρυωτών, οι οποίοι διαφέρουν μεταξύ τους ως προς την παθογένεια, την περιοχή κατανομής, το σχήμα, το μέγεθος, τον αριθμό των μαστιγίων και άλλες παραμέτρους. Για τη λεπτομερή μελέτη αυτού του στελέχους, χρησιμοποιείται μια βακτηριολογική μέθοδος έρευνας.
Ποιες κυτταρικές μέθοδοι υπάρχουν;
Για να προσδιοριστεί εάν τα βακτήρια είναι παθογόνα, η καλλιέργεια εξετάζεται με διάφορους τρόπους. Ανάμεσα τους:
1. Βακτηριοσκοπική μέθοδος.
2. Βακτηριολογική μέθοδος.
3. Βιολογική μέθοδος.
Τα βακτηριοσκοπικά και τα βακτηριολογικά βασίζονται απευθείας στην εργασία με προκαρυωτικά κύτταρα, όταν απαιτείται βιολογική ανάλυση για τη μελέτη της επίδρασης τέτοιων κυττάρων στον ζωντανό οργανισμό των πειραματόζωων. Σύμφωνα με τον βαθμό εκδήλωσης ορισμένων σημείων της νόσου, ο επιστήμονας μπορεί να βγάλει ένα συμπέρασμα σχετικά με την παρουσία ή απουσία παθογόνων βακτηρίων στο δείγμα, καθώς και να τα πολλαπλασιάσει φυσικά στο σώμα του ζώου για να αποκτήσει την καλλιέργεια και τη χρήση τους σε άλλες εργασίες .
Η βακτηριολογική μέθοδος έρευνας διαφέρει από τη βακτηριοσκοπική. Στην πρώτη χρησιμοποιείται για ανάλυση μια ειδικά παρασκευασμένη καλλιέργεια ζωντανών προκαρυωτών, ενώ στη δεύτερη γίνεται εργασία με νεκρά ή ζωντανά κύτταρα σε γυάλινη πλάκα.
Στάδια της μεθόδου βακτηριολογικής έρευνας. Μικροβιολογία
Η αρχή της μελέτης των ιδιοτήτων μιας βακτηριακής καλλιέργειας μπορεί να είναι χρήσιμη τόσο για μικροβιολόγους που θέτουν ως στόχο τη μελέτη προκαρυωτικών κυττάρων όσο και για εργαστηριακούς βοηθούς των οποίων το καθήκον είναι να καθορίσουν την παθογένεια ή τη μη παθογένεια των βακτηρίων και στη συνέχεια να διαγνώσουν τον ασθενή.
Η μεθοδολογία για τη μελέτη των βακτηρίων χωρίζεται σε τρία στάδια:
1. Απομόνωση βακτηρίων από το αρχικό δείγμα.
2. Σπορά βακτηρίων και καλλιέργεια μελέτη των ιδιοτήτων του.
Πρώτο στάδιο
Το δείγμα, ή το επίχρισμα, λαμβάνεται από την ελεύθερη επιφάνεια του μέσου ή από τον ασθενή. Έτσι, παίρνουμε ένα «κοκτέιλ» πολλών ειδών βακτηρίων που πρέπει να σπαρθούν σε ένα θρεπτικό μέσο. Μερικές φορές καθίσταται δυνατή η άμεση απομόνωση των απαραίτητων βακτηρίων, γνωρίζοντας τις εστίες κατανομής τους στο σώμα.
Μετά από δύο ή τρεις ημέρες, επιλέγονται οι επιθυμητές αποικίες και σπέρνονται σε στερεά μέσα τριβλίων Petri με τη βοήθεια ενός αποστειρωμένου βρόχου. Πολλά εργαστήρια λειτουργούν με δοκιμαστικούς σωλήνες, οι οποίοι μπορεί να περιέχουν στερεά ή υγρά θρεπτικά μέσα. Έτσι διεξάγεται η βακτηριολογική μέθοδος έρευνας στη μικροβιολογία.
Δεύτερη φάση
Μετά τη λήψη μεμονωμένων αποικιών βακτηρίων, πραγματοποιείται μια άμεση μακρο- και μικροανάλυση. Όλες οι παράμετροι των αποικιών μετρώνται, προσδιορίζεται το χρώμα και το σχήμα καθεμιάς από αυτές. Δεν είναι ασυνήθιστο να μετράμε αποικίες σε ένα πιάτο Petri και μετά στην πρώτη ύλη. Αυτό είναι σημαντικό στην ανάλυση παθογόνων βακτηρίων, ο αριθμός των οποίων εξαρτάται από τον βαθμό της νόσου.
Η μέθοδος βακτηριολογικής έρευνας, το 2ο στάδιο της οποίας συνίσταται στη μελέτη μεμονωμένων αποικιών μικροοργανισμών, μπορεί να συσχετιστεί με μια βιολογική μέθοδο για την ανάλυση βακτηρίων. Ένας άλλος στόχος της εργασίας σε αυτό το στάδιο είναι να αυξηθεί η ποσότητα του αρχικού υλικού. Αυτό μπορεί να γίνει σε ένα θρεπτικό μέσο ή μπορείτε να πραγματοποιήσετε ένα πείραμα in vivo σε ζωντανούς πειραματικούς οργανισμούς. Τα παθογόνα βακτήρια θα πολλαπλασιαστούν, και ως αποτέλεσμα, το αίμα θα περιέχει εκατομμύρια προκαρυωτικά κύτταρα. Είναι εύκολο να παρασκευαστεί το απαραίτητο υλικό εργασίας των βακτηρίων από το ληφθέν αίμα.
Τρίτο στάδιο
Το πιο σημαντικό μέρος της μελέτης είναι ο προσδιορισμός των μορφολογικών, βιοχημικών, τοξικογόνων και αντιγονικών ιδιοτήτων της βακτηριακής καλλιέργειας. Οι εργασίες εκτελούνται με προκαθαρισμένες καλλιέργειες σε θρεπτικό μέσο, καθώς και με παρασκευάσματα (συχνά χρωματισμένα) στο μικροσκόπιο.
Η βακτηριολογική μέθοδος έρευνας επιτρέπει τη διαπίστωση της αναγωγής παθογόνων ή ευκαιριακών βακτηρίων σε μια ή την άλλη συστηματική ομάδα, καθώς και για τον προσδιορισμό της αντοχής τους στα φάρμακα. Στάδιο 3 - αντιβιοτικά, δηλαδή ανάλυση της συμπεριφοράς των βακτηριακών κυττάρων στις συνθήκες της περιεκτικότητας φαρμάκων στο περιβάλλον.
Η μελέτη της αντοχής στα αντιβιοτικά μιας καλλιέργειας έχει μεγάλη πρακτική σημασία όταν είναι απαραίτητο να συνταγογραφηθούν τα απαραίτητα, και κυρίως, αποτελεσματικά φάρμακα για έναν συγκεκριμένο ασθενή. Εδώ μπορεί να βοηθήσει η βακτηριολογική μέθοδος έρευνας.
Τι είναι ένα θρεπτικό μέσο;
Για ανάπτυξη και αναπαραγωγή, τα βακτήρια πρέπει να βρίσκονται σε προπαρασκευασμένα θρεπτικά μέσα. Σύμφωνα με τη συνοχή, μπορούν να είναι υγρά ή στερεά και κατά προέλευση - φυτικά ή ζωικά.
Βασικές απαιτήσεις για θρεπτικά μέσα:
1. Στειρότητα.
2. Μέγιστη διαφάνεια.
3. Βέλτιστοι δείκτες οξύτητας, υδάτινης δραστηριότητας και άλλες βιολογικές τιμές.
Απόκτηση απομονωμένων αποικιών
1. Μέθοδος Drygalsky. Συνίσταται στο γεγονός ότι εφαρμόζεται επίχρισμα με διάφορους τύπους μικροοργανισμών στον βακτηριακό βρόχο. Αυτή η θηλιά περνάει κατά μήκος του πρώτου πιάτου Petri με ένα θρεπτικό μέσο. Περαιτέρω, χωρίς αλλαγή του βρόχου, η μέθοδος του υπολειμματικού υλικού πραγματοποιείται στο δεύτερο και τρίτο πιάτο Petri. Έτσι, στα τελευταία δείγματα της αποικίας, τα βακτήρια δεν θα σπαρθούν πολύ πυκνά, απλοποιώντας έτσι την ικανότητα εύρεσης των βακτηρίων που είναι απαραίτητα για την εργασία.
2. Η μέθοδος του Koch. Χρησιμοποιεί δοκιμαστικούς σωλήνες με λιωμένο θρεπτικό μέσο. Ένας βρόχος ή μια πιπέτα με ένα επίχρισμα βακτηρίων τοποθετείται εκεί, μετά την οποία το περιεχόμενο του δοκιμαστικού σωλήνα χύνεται σε μια ειδική πλάκα. Το άγαρ (ή η ζελατίνη) στερεοποιείται μετά από κάποιο χρονικό διάστημα και είναι εύκολο να ανιχνευθούν οι επιθυμητές κυτταρικές αποικίες στο πάχος του. Είναι σημαντικό να αραιώνεται το μείγμα βακτηρίων σε δοκιμαστικούς σωλήνες πριν από την έναρξη της εργασίας, έτσι ώστε η συγκέντρωση των μικροοργανισμών να μην είναι πολύ υψηλή.
Τα στάδια των οποίων βασίζονται στην απομόνωση της επιθυμητής καλλιέργειας βακτηρίων, δεν μπορούν να κάνουν χωρίς αυτές τις δύο μεθόδους για την εύρεση απομονωμένων αποικιών.
Αντιβιοτογράφημα
Οπτικά, η αντίδραση των βακτηρίων στα φάρμακα μπορεί να φανεί με δύο πρακτικούς τρόπους:
1. Μέθοδος χάρτινων δίσκων.
2. Αραίωση βακτηρίων και αντιβιοτικού σε υγρό μέσο.
Η μέθοδος χάρτινου δίσκου απαιτεί καλλιέργεια μικροοργανισμών που έχουν αναπτυχθεί σε στερεό θρεπτικό μέσο. Σε ένα τέτοιο μέσο βάλτε μερικά κομμάτια στρογγυλεμένο χαρτί εμποτισμένο με αντιβιοτικά. Εάν το φάρμακο αντιμετωπίσει επιτυχώς την εξουδετέρωση των βακτηριακών κυττάρων, μετά από μια τέτοια θεραπεία θα υπάρχει μια περιοχή χωρίς αποικίες. Εάν η αντίδραση στο αντιβιοτικό είναι αρνητική, τα βακτήρια θα επιβιώσουν.
Σε περίπτωση χρήσης υγρού θρεπτικού μέσου, προετοιμάστε πρώτα αρκετούς δοκιμαστικούς σωλήνες με καλλιέργεια βακτηρίων διαφορετικών αραιώσεων. Σε αυτούς τους δοκιμαστικούς σωλήνες προστίθενται αντιβιοτικά και η διαδικασία αλληλεπίδρασης μεταξύ της ουσίας και των μικροοργανισμών παρατηρείται κατά τη διάρκεια της ημέρας. Στο τέλος, λαμβάνεται ένα αντιβιόγραμμα υψηλής ποιότητας, σύμφωνα με το οποίο μπορεί κανείς να κρίνει την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου για μια δεδομένη καλλιέργεια.
Κύρια καθήκοντα ανάλυσης
Εδώ παρατίθενται οι στόχοι και τα στάδια της βακτηριολογικής μεθόδου έρευνας.
1. Λάβετε το αρχικό υλικό που θα χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση βακτηριακών αποικιών. Μπορεί να είναι ένα επίχρισμα από την επιφάνεια οποιουδήποτε αντικειμένου, βλεννογόνου ή κοιλότητας ανθρώπινου οργάνου, εξέταση αίματος.
2. σε στερεό θρεπτικό μέσο. Μετά από 24-48 ώρες, αποικίες διαφορετικών τύπων βακτηρίων μπορούν να βρεθούν στο πιάτο Petri. Επιλέγουμε το επιθυμητό σύμφωνα με μορφολογικά ή/και βιοχημικά κριτήρια και πραγματοποιούμε περαιτέρω εργασίες με αυτό.
3. Αναπαραγωγή της καλλιέργειας που προκύπτει. Η μέθοδος βακτηριολογικής έρευνας μπορεί να βασίζεται σε μια μηχανική ή βιολογική μέθοδο αύξησης του αριθμού των βακτηριακών καλλιεργειών. Στην πρώτη περίπτωση, η εργασία πραγματοποιείται με στερεά ή υγρά θρεπτικά μέσα, στα οποία πολλαπλασιάζονται βακτήρια σε θερμοστάτη και σχηματίζουν νέες αποικίες. Η βιολογική μέθοδος απαιτεί φυσικές συνθήκες για την αύξηση του αριθμού των βακτηρίων, οπότε εδώ το πειραματόζωο μολύνεται από μικροοργανισμούς. Μετά από λίγες ημέρες, πολλά προκαρυωτικά μπορούν να βρεθούν σε δείγμα αίματος ή επίχρισμα.
4. Εργαστείτε με καθαρισμένη καλλιέργεια. Για τον προσδιορισμό της συστηματικής θέσης των βακτηρίων, καθώς και της ιδιότητάς τους σε παθογόνα, είναι απαραίτητο να διεξαχθεί διεξοδική ανάλυση των κυττάρων σύμφωνα με μορφολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά. Κατά τη μελέτη παθογόνων ομάδων μικροοργανισμών, είναι σημαντικό να γνωρίζουμε πόσο αποτελεσματική είναι η δράση των αντιβιοτικών.
Αυτό ήταν ένα γενικό χαρακτηριστικό της μεθόδου βακτηριολογικής έρευνας.
Χαρακτηριστικά της ανάλυσης
Ο κύριος κανόνας της βακτηριολογικής έρευνας είναι η μέγιστη στειρότητα. Εάν εργάζεστε με δοκιμαστικούς σωλήνες, οι καλλιέργειες και οι υποκαλλιέργειες βακτηρίων θα πρέπει να πραγματοποιούνται μόνο σε θερμαινόμενο αλκοολούχο λαμπτήρα.
Όλα τα στάδια της μεθόδου βακτηριολογικής έρευνας απαιτούν τη χρήση ειδικού βρόχου ή πιπέτας Παστέρ. Και τα δύο εργαλεία πρέπει να υποβληθούν σε προεπεξεργασία στη φλόγα μιας λάμπας αλκοόλης. Όσο για την πιπέτα Pasteur, τότε πριν από τη θερμική αποστείρωση είναι απαραίτητο να σπάσετε το άκρο της πιπέτας με τσιμπιδάκια.
Η τεχνική της σποράς βακτηρίων έχει επίσης τα δικά της χαρακτηριστικά. Πρώτον, κατά τον εμβολιασμό σε στερεά μέσα, ένας βακτηριακός βρόχος περνά πάνω από την επιφάνεια του άγαρ. Ο βρόχος, φυσικά, θα πρέπει να έχει ήδη ένα δείγμα μικροοργανισμών στην επιφάνεια. Ασκείται επίσης ο εμβολιασμός, οπότε ο βρόχος ή η πιπέτα θα πρέπει να φτάσει στον πυθμένα του τρυβλίου Petri.
Όταν εργάζεστε με υγρά μέσα, χρησιμοποιούνται δοκιμαστικοί σωλήνες. Εδώ είναι σημαντικό να βεβαιωθείτε ότι τα υγρά δεν αγγίζουν τις άκρες των γυάλινων σκευών ή των φελλών του εργαστηρίου και τα εργαλεία που χρησιμοποιούνται (σιφώνια, βρόχος) δεν αγγίζουν ξένα αντικείμενα και επιφάνειες.
Η αξία της μεθόδου βιολογικής έρευνας
Η ανάλυση δειγμάτων βακτηρίων έχει τις δικές της πρακτικές εφαρμογές. Πρώτα απ 'όλα, η βακτηριολογική μέθοδος έρευνας μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην ιατρική. Για παράδειγμα, είναι απαραίτητο να μελετηθεί η μικροχλωρίδα του ασθενούς προκειμένου να τεθεί η σωστή διάγνωση, καθώς και να αναπτυχθεί η σωστή πορεία θεραπείας. Εδώ βοηθάει ένα αντιβιόγραμμα, το οποίο θα δείξει τη δράση των φαρμάκων κατά του παθογόνου.
Η βακτηριακή ανάλυση χρησιμοποιείται στο εργαστήριο για την ανίχνευση επικίνδυνων ασθενειών όπως η φυματίωση, ο υποτροπιάζων πυρετός ή η γονόρροια. Χρησιμοποιείται επίσης για τη μελέτη της βακτηριακής σύνθεσης των αμυγδαλών, των κοιλοτήτων των οργάνων.
Η βακτηριολογική μέθοδος έρευνας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της μόλυνσης του περιβάλλοντος. Σύμφωνα με τα δεδομένα για την ποσοτική και ποιοτική σύνθεση ενός επιχρίσματος από την επιφάνεια ενός αντικειμένου, προσδιορίζεται ο βαθμός πληθυσμού αυτού του περιβάλλοντος από μικροοργανισμούς.