Οι περισσότερες ιογενείς λοιμώξεις αναπτύσσουν ανοσοαποκρίσεις που χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση. Οι κυτταρικές αποκρίσεις αξιολογούνται συνήθως σε δοκιμές για την κυτταροτοξικότητα των λεμφοκυττάρων έναντι μολυσματικών παραγόντων ή κυττάρων-στόχων που έχουν μολυνθεί από αυτούς ή προσδιορίζεται η ικανότητα των λεμφοκυττάρων να ανταποκρίνονται σε διάφορα αντιγόνα και μιτογόνα.
Σε πρακτικά εργαστήρια, η σοβαρότητα των κυτταρικών αντιδράσεων σπάνια προσδιορίζεται. Οι μέθοδοι για τον προσδιορισμό των αντιιικών AT έχουν γίνει πιο διαδεδομένες.
RN βασίζεται στην καταστολή της κυτταροπαθογόνου δράσης μετά την ανάμειξη του ιού με ειδική ΑΤ. Ο άγνωστος ιός αναμιγνύεται με γνωστούς εμπορικούς αντιορούς και, μετά από κατάλληλη επώαση, προστίθεται στη μονοστιβάδα του κυττάρου. Η απουσία κυτταρικού θανάτου υποδηλώνει διαφορά μεταξύ του μολυσματικού παράγοντα και των γνωστών ΑΤ.
Αναστολή της αιμοσυγκόλλησης από RTHA χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό ιών που μπορούν να συγκολλήσουν διάφορα ερυθρά αιμοσφαίρια. Για να γίνει αυτό, αναμίξτε το μέσο καλλιέργειας που περιέχει το παθογόνο με έναν γνωστό εμπορικό αντιορό και προσθέστε τον στην κυτταρική καλλιέργεια. Μετά την επώαση, προσδιορίζεται η ικανότητα της καλλιέργειας σε αιμοσυγκόλληση και, ελλείψει αυτής, εξάγεται το συμπέρασμα ότι ο ιός δεν ταιριάζει με τον αντιορό. Αναστολή του κυτταροπαθητικού αποτελέσματος από παρεμβολή ιού Η αντίδραση αναστολής του κυτταροπαθητικού αποτελέσματος λόγω παρεμβολής ιού χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό ενός παθογόνου που παρεμβαίνει σε έναν γνωστό κυτταροπαθογόνο ιό σε μια καλλιέργεια ευαίσθητων κυττάρων. Για να γίνει αυτό, ορός του εμπορίου προστίθεται στο μέσο καλλιέργειας που περιέχει τον ιό που μελετάται (για παράδειγμα, στον ιό της ερυθράς εάν υπάρχει υποψία), επωάζεται και μολύνεται μια δεύτερη καλλιέργεια. μετά από 1-2 ημέρες, ένας γνωστός κυτταροπαθογόνος ιός (για παράδειγμα, οποιοσδήποτε ιός ECHO) εισάγεται σε αυτόν. Εάν υπάρχει κυτταροπαθογόνο αποτέλεσμα, συνάγεται το συμπέρασμα ότι η πρώτη καλλιέργεια είχε μολυνθεί με έναν ιό που αντιστοιχεί στο ΑΤ που χρησιμοποιήθηκε.
Άμεσος ανοσοφθορισμός.
Μεταξύ άλλων δοκιμών, η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη είναι η αντίδραση άμεσου ανοσοφθορισμού (η ταχύτερη, πιο ευαίσθητη και αναπαραγώγιμη). Για παράδειγμα, η αναγνώριση του CMV με κυτταροπαθογόνο δράση απαιτεί τουλάχιστον 2-3 εβδομάδες και όταν χρησιμοποιείται επισημασμένο μονοκλωνικό AT, η ταυτοποίηση είναι δυνατή εντός 24 ωρών. Έχοντας ένα σύνολο τέτοιων αντιδραστηρίων, μπορούν να προστεθούν σε καλλιέργειες μολυσμένες με τον ιό, επωασμένες , ξεπλύθηκε το μη δεσμευμένο αντιδραστήριο και εξετάστηκε με μικροσκοπία φθορισμού (σας επιτρέπει να ανιχνεύσετε την παρουσία φθορισμού μολυσμένων κυττάρων).
Ανοσοηλεκτρονική μικροσκοπία (ανάλογα με την προηγούμενη μέθοδο) σας επιτρέπει να προσδιορίσετε διαφορετικούς τύπους ιών που προσδιορίζονται με ηλεκτρονική μικροσκοπία (για παράδειγμα, διαφορετικοί τύποι ιών έρπητα), κάτι που δεν μπορεί να γίνει με βάση μορφολογικά χαρακτηριστικά. Αντί για αντιορούς, τα ΑΤ που έχουν επισημανθεί με διαφορετικούς τρόπους χρησιμοποιούνται για ταυτοποίηση, αλλά η πολυπλοκότητα και το υψηλό κόστος της μεθόδου περιορίζουν τη χρήση της.
Ανίχνευση αντιιικών αντισωμάτων (ΑΤ) στον ορό αίματος. RTGA. RSK. ΥΦΑΛΟΣ.
Μέθοδοι ανοσοπροσρόφησης για την ανίχνευση αντιιικών αντισωμάτων.
Μια απλούστερη και πιο προσιτή προσέγγιση είναι η ανίχνευση αντιιικών αντισωμάτων (ΑΤ) στον ορό. Τα δείγματα αίματος πρέπει να συλλέγονται δύο φορές: αμέσως μετά την έναρξη των κλινικών συμπτωμάτων και μετά από 2~3 εβδομάδες. Είναι εξαιρετικά σημαντικό να εξεταστούν ακριβώς δύο δείγματα ορού. Τα αποτελέσματα μιας μόνο μελέτης δεν μπορούν να θεωρηθούν οριστικά λόγω της αδυναμίας σύνδεσης της εμφάνισης ΑΤ με την παρούσα περίπτωση. Είναι πιθανό αυτά τα ΑΤ να κυκλοφορούν μετά από προηγούμενη μόλυνση. Σε μια τέτοια κατάσταση, ο ρόλος της μελέτης ορού που λαμβάνεται κατά την περίοδο της ανάρρωσης δύσκολα μπορεί να υπερεκτιμηθεί. Η παρουσία της νόσου κατά την περίοδο συλλογής του πρώτου δείγματος υποδεικνύεται από όχι λιγότερο από τετραπλάσια αύξηση του τίτλου ΑΤ που ανιχνεύθηκε κατά τη μελέτη του δεύτερου δείγματος.
Οι μέθοδοι που αναφέρονται παρακάτω δεν κάνουν διαφοροποίηση μεταξύ των αντισωμάτων (ΑΤ) που σχηματίζονται κατά τη διάρκεια της ασθένειας και εκείνων που κυκλοφορούν μετά την ανάρρωση (η διάρκεια αυτής της περιόδου ποικίλλει για διαφορετικές λοιμώξεις). Δεδομένου ότι για επαρκή διάγνωση είναι απαραίτητο να επιβεβαιωθεί μια σημαντική αύξηση στους τίτλους ΑΤ σε δύο δείγματα, το πρώτο δείγμα εξετάζεται στην οξεία φάση και το δεύτερο κατά την περίοδο ανάρρωσης (μετά από 2-3 εβδομάδες). Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται είναι αναδρομικού χαρακτήρα και είναι πιο κατάλληλα για τη διεξαγωγή επιδημιολογικών ερευνών. Το RTGA ανιχνεύει ΑΤ που συντίθεται έναντι αιμοσυγκολλητινών ιών (για παράδειγμα, του ιού της γρίπης).
Η μέθοδος καθιστά δυνατή την εύκολη ανίχνευση τέτοιων αντισωμάτων (AT) στον ορό του ασθενούς. Η RSK είναι η κύρια μέθοδος για την οροδιάγνωση των ιογενών λοιμώξεων (μεταξύ των διαθέσιμων). Η αντίδραση ανιχνεύει IgM και IgG στερέωσης συμπληρώματος, αλλά δεν τα διαφοροποιεί. Για τη βελτιστοποίηση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται, η σταδιοποίηση της αντίδρασης απαιτεί ορισμένες δεξιότητες προσωπικού.
ΥΦΑΛΟΣ. Εάν είναι δυνατή η λήψη βιοψίας μολυσμένου ιστού και η διαθεσιμότητα εμπορικών κιτ ΑΤ σημασμένων με φλουορεσκεΐνη, η διάγνωση μπορεί να επιβεβαιωθεί με άμεσο ανοσοφθορισμό.
Η αντίδραση περιλαμβάνει την επώαση του υπό μελέτη ιστού με ΑΤ, την επακόλουθη αφαίρεσή τους και τη μικροσκοπία φθορισμού του δείγματος. Μέθοδοι ανοσοπροσρόφησης για την ανίχνευση αντιιικών αντισωμάτων Οι μέθοδοι ανοσοπροσρόφησης (για παράδειγμα, ELISA και RIA) είναι πιο ενημερωτικές επειδή ανιχνεύουν IgM και IgG ξεχωριστά, γεγονός που επιτρέπει σε κάποιον να συναγάγει ορισμένα συμπεράσματα σχετικά με τη δυναμική της μολυσματικής διαδικασίας ή την κατάσταση της ανάρρωσης. Για την ανίχνευση της ΑΤ, ένα γνωστό αντιγόνο προσροφάται σε ένα στερεό υπόστρωμα (για παράδειγμα, στα τοιχώματα των δοκιμαστικών σωλήνων, πλαστικές μικροπλάκες, τρυβλία Petri) και προστίθενται διάφορες αραιώσεις του ορού του ασθενούς. Μετά την κατάλληλη επώαση, αφαιρείται η μη δεσμευμένη ΑΤ, προστίθεται αντιορός στην ανθρώπινη Ig επισημασμένη με ένα ένζυμο, η διαδικασία επώασης και πλύσης της μη συνδεδεμένης ΑΤ επαναλαμβάνεται και προστίθεται κάποιο χρωμογόνο υπόστρωμα (ευαίσθητο στη δράση του ενζύμου). Δεδομένου ότι η αλλαγή χρώματος είναι ανάλογη με το περιεχόμενο συγκεκριμένου ΑΤ, είναι πολύ πιθανό να προσδιοριστεί ο τίτλος τους φασματοφωτομετρικά. Στη διάγνωση της HIV λοίμωξης, η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος είναι η ανοσοστύπωση.
Ανίχνευση ιικών αντιγόνων (AGs). ELISA. Επί του παρόντος, έχουν ήδη εμφανιστεί εμπορικά κιτ για τον εντοπισμό της υπέρτασης ορισμένων παθογόνων, επιτρέποντάς τους να αναγνωρίζονται μέσα σε 5-10 λεπτά. Για την ανίχνευση AG, τα γνωστά ΑΤ απορροφώνται στη στερεά φάση και προστίθεται ορός που περιέχει AG. Μετά την επώαση, το μη δεσμευμένο AG μεταγγίζεται, το σύστημα πλένεται και προστίθεται σήμανση ΑΤ, ειδικό για ροφημένο ΑΤ. Η διαδικασία επώασης και πλύσης επαναλαμβάνεται, προστίθεται χρωμογόνο υπόστρωμα, καταγράφεται θετικό αποτέλεσμα όταν αλλάξει το χρώμα του συστήματος. Ο υβριδισμός του DNA είναι μια εξαιρετικά ειδική μέθοδος που επιτρέπει την ταυτοποίηση του ιικού γονιδιώματος μετά τον υβριδισμό του με συμπληρωματικά μόρια DNA. Ως δείκτες χρησιμοποιούνται ένζυμα και ισότοπα.
Η μέθοδος προσδιορίζει την ικανότητα του ιικού DNA να υβριδοποιείται με επισημασμένο συμπληρωματικό DNA. η ειδικότητα της μεθόδου είναι ευθέως ανάλογη με το μήκος της συμπληρωματικής αλυσίδας. Η μέθοδος του in situ υβριδισμού νουκλεϊκών οξέων είναι πολλά υποσχόμενη. Για τη ρύθμιση της αντίδρασης, επισημασμένο DNA εφαρμόζεται σε βιοψίες ιστού (συμπεριλαμβανομένων εκείνων που είναι σταθεροποιημένες σε φορμαλίνη ή ενσωματωμένες σε μπλοκ παραφίνης) και καταγράφεται η αλληλεπίδραση με το συμπληρωματικό DNA. Η μέθοδος χρησιμοποιείται για την ανίχνευση ιών απλού έρπητα, ανθρώπινων θηλωμάτων, Epstein-Barr κ.λπ.
PCR. Η μέθοδος αυξάνει σημαντικά την ευαισθησία της μεθόδου υβριδισμού, αυξάνοντας την περιεκτικότητα σε ιικό DNA στο υλικό που λαμβάνεται από τον ασθενή και επίσης επιταχύνει το χρόνο λήψης αποτελεσμάτων.
119. Ορολογικές εξετάσεις που χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση ιογενών λοιμώξεων.
Ανίχνευση στον ορόΗ παρουσία αντισωμάτων έναντι των παθογόνων αντιγόνων επιτρέπει τη διάγνωση της νόσου. Χρησιμοποιούνται επίσης ορολογικές μελέτες για τον εντοπισμό μικροβιακών αντιγόνων, διαφόρων βιολογικά ενεργών ουσιών, ομάδων αίματος, αντιγόνων ιστών και όγκων, ανοσοσυμπλεγμάτων, κυτταρικών υποδοχέων κ.λπ.
Όταν ένα μικρόβιο απομονώνεταιΤο παθογόνο αναγνωρίζεται από τον ασθενή μελετώντας τις αντιγονικές του ιδιότητες χρησιμοποιώντας ανοσοδιαγνωστικούς ορούς, δηλαδή ορούς αίματος υπερανοσοποιημένων ζώων που περιέχουν ειδικά αντισώματα. Αυτό είναι το λεγόμενο ορολογική ταυτοποίησημικροοργανισμών.
Χρησιμοποιείται ευρέως στη μικροβιολογία και την ανοσολογίααντιδράσεις συγκόλλησης, κατακρήμνιση, εξουδετέρωση, αντιδράσεις που περιλαμβάνουν συμπλήρωμα, χρησιμοποιώντας επισημασμένα αντισώματα και αντιγόνα (ραδιοανοσολογική, ενζυμική ανοσοδοκιμασία, μέθοδοι ανοσοφθορισμού). Οι αντιδράσεις που αναφέρονται διαφέρουν ως προς το καταχωρημένο αποτέλεσμα και την τεχνική παραγωγής, ωστόσο, όλες βασίζονται στην αντίδραση αλληλεπίδρασης ενός αντιγόνου με ένα αντίσωμα και χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση τόσο αντισωμάτων όσο και αντιγόνων. Οι ανοσολογικές αντιδράσεις χαρακτηρίζονται από υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα.
Χαρακτηριστικά της αλληλεπίδρασης αντισωμάτων με αντιγόνααποτελούν τη βάση των διαγνωστικών αντιδράσεων στα εργαστήρια. Αντίδραση in vitroμεταξύ αντιγόνου και αντισώματος αποτελείται από μια ειδική και μη ειδική φάση. ΣΕ συγκεκριμένη φάσηλαμβάνει χώρα ταχεία ειδική δέσμευση του ενεργού κέντρου του αντισώματος στον καθοριστή αντιγόνου. Μετά έρχεται μη ειδική φάση -πιο αργή, η οποία εκδηλώνεται με ορατά φυσικά φαινόμενα, για παράδειγμα σχηματισμό κροκίδων (φαινόμενο συγκόλλησης) ή ίζημα με τη μορφή θολότητας. Αυτή η φάση απαιτεί την παρουσία ορισμένων συνθηκών (ηλεκτρολύτες, βέλτιστο pH του περιβάλλοντος).
Η δέσμευση του καθοριστή αντιγόνου (επίτοπος) στο ενεργό κέντρο του θραύσματος Fab των αντισωμάτων οφείλεται σε δυνάμεις van der Waals, δεσμούς υδρογόνου και υδρόφοβη αλληλεπίδραση. Η ισχύς και η ποσότητα του αντιγόνου που δεσμεύεται από τα αντισώματα εξαρτώνται από τη συγγένεια, την απληστία των αντισωμάτων και το σθένος τους.
Στην ερώτηση σχετικά με τα express διαγνωστικά:
1. Μπορεί να διαγνωστεί μια καλλιέργεια που απομονώνεται στην καθαρή της μορφή. 2. Σε ειδικά εξοπλισμένα εργαστήρια (πρέπει να υπάρχει άδεια) 3. Τήρηση αυστηρών κανόνων όπως: απομονωμένος χώρος, απαιτούμενες ειδικές προστατευτικές στολές, υποχρεωτική πλήρης απολύμανση του δωματίου μετά την εργασία με το παθογόνο, απολύμανση ερευνητών μετά την ολοκλήρωση της εργασίας. Μέθοδοι διάγνωσης ειδικών. 1. Βακτηριολογία - συνδυασμένα πολυτροπικά θρεπτικά μέσα για γρήγορη μελέτη μορφών, βαφής, βιοχημικών. ιδιότητες. Χρήση ενζυμικής ενδεικτικής ταινίας, ηλεκτροφυσική μέθοδος, μέθοδος χάρτινων δίσκων εμποτισμένων σε διάφορες ουσίες (γλυκόζη, λακτόζη κ.λπ.) 2. Διαγνωστικά φάγων. 3. Οροδιάγνωση - Μέθοδος Mancini, καθίζηση σε γέλη κατά Ascoli, RA, RPGA. 4. Βακτηριοσκόπηση - άμεση και έμμεση RIF. Εξπρές διαγνωστικές μέθοδοι για: Χολέρα - M.Z. Ermolyeva, σταθμός ακινητοποίησης με διαγνωστικό ορό χολέρας, RIF. Τουλαραιμία - RA σε γυαλί, RPGA Chume - τυποποίηση φάγου, μέθοδος χάρτινου δίσκου υδατανθράκων, RPGA. Έλκος κόλπων - Μέθοδος Ascoli, RIF, RPGA. Μοτίβο ανάπτυξης: υπάρχουν τρία από αυτά: διάχυτα (προαιρετικά αναερόβια), κάτω (υποχρεωτικά αναερόβια) και επιφάνεια (υποχρεωτικά αερόβια.)
Απομόνωση καθαρής καλλιέργειας αναερόβιων βακτηρίων
Στην εργαστηριακή πρακτική, θα πρέπει συχνά να εργαστείτε με αναερόβιους μικροοργανισμούς. Είναι πιο απαιτητικά για θρεπτικά μέσα από τα αερόβια, απαιτούν συχνότερα ειδικά πρόσθετα ανάπτυξης, απαιτούν τη διακοπή της πρόσβασης σε οξυγόνο κατά την καλλιέργειά τους και η διάρκεια ανάπτυξής τους είναι μεγαλύτερη. Επομένως, η εργασία μαζί τους είναι πιο περίπλοκη και απαιτεί σημαντική προσοχή από βακτηριολόγους και τεχνικούς εργαστηρίου.
Είναι σημαντικό να προστατεύεται το υλικό που περιέχει αναερόβια παθογόνα από τις τοξικές επιδράσεις του ατμοσφαιρικού οξυγόνου. Επομένως, συνιστάται η λήψη υλικού από εστίες πυώδους μόλυνσης κατά τη διάρκεια της παρακέντησης με χρήση σύριγγας· ο χρόνος μεταξύ της λήψης του υλικού και του εμβολιασμού του σε θρεπτικό μέσο πρέπει να είναι όσο το δυνατόν μικρότερος.
Δεδομένου ότι χρησιμοποιούνται ειδικά θρεπτικά μέσα για την καλλιέργεια αναερόβιων βακτηρίων, τα οποία δεν πρέπει να περιέχουν οξυγόνο και έχουν χαμηλό δυναμικό οξειδοαναγωγής (-20 -150 mV), προστίθενται δείκτες στη σύνθεσή τους - ρεσαζουρίνη, μπλε του μεθυλενίου κ.λπ., που αντιδρούν σε μια αλλαγή σε αυτό το δυναμικό. Καθώς μεγαλώνει, οι άχρωμες μορφές των δεικτών αποκαθίστανται και αλλάζουν το χρώμα τους: η ρεσαζουρίνη μετατρέπει το μεσαίο ροζ και το μπλε του μεθυλενίου το μεσαίο μπλε. Τέτοιες αλλαγές υποδηλώνουν την αδυναμία χρήσης μέσων για την καλλιέργεια αναερόβιων μικροβίων.
Η εισαγωγή τουλάχιστον 0,05% άγαρ στο μέσο συμβάλλει στη μείωση του δυναμικού οξειδοαναγωγής, το οποίο, αυξάνοντας το ιξώδες του, βοηθά στη μείωση της παροχής οξυγόνου. Αυτό, με τη σειρά του, επιτυγχάνεται επίσης με τη χρήση φρέσκων (το αργότερο δύο ώρες μετά την παραγωγή) και μειωμένων θρεπτικών μέσων.
Θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι λόγω των ιδιαιτεροτήτων του ζυμωτικού τύπου μεταβολισμού των αναερόβιων βακτηρίων απαιτούν περιβάλλοντα πλουσιότερα σε θρεπτικά συστατικά και βιταμίνες. Τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα είναι εγχύματα καρδιάς-εγκεφάλου και συκωτιού, εκχυλίσματα σόγιας και ζύμης, υδρολυτική πέψη καζεΐνης, πεπτόνη, τρυπτόνη. Είναι υποχρεωτική η προσθήκη αυξητικών παραγόντων όπως Tween-80, αιμίνη, μεναδιόνη, πλήρες ή αιμολυμένο αίμα.
Η απομόνωση μιας καθαρής καλλιέργειας αερόβιων μικροοργανισμών αποτελείται από διάφορα στάδια. Την πρώτη ημέρα (στάδιο 1 της μελέτης), το παθολογικό υλικό εισάγεται σε αποστειρωμένο δοχείο (δοκιμαστικός σωλήνας, φιάλη, φιάλη). Μελετάται για την εμφάνιση, τη συνοχή, το χρώμα, την οσμή και άλλα χαρακτηριστικά του, παρασκευάζεται επίχρισμα, βάφεται και εξετάζεται σε μικροσκόπιο. Σε ορισμένες περιπτώσεις (οξεία γονόρροια, πανώλη), σε αυτό το στάδιο είναι δυνατό να γίνει προηγούμενη διάγνωση και επιπλέον να επιλέξετε τα μέσα στα οποία θα εμβολιαστεί το υλικό. Η κατάληψη πραγματοποιείται με βακτηριολογικό βρόχο (που χρησιμοποιείται πιο συχνά), χρησιμοποιώντας σπάτουλα με τη μέθοδο Drigalsky και μπατονέτα από βαμβάκι-γάζα. Τα κύπελλα κλείνονται, αναποδογυρίζονται, υπογράφονται με ειδικό μολύβι και τοποθετούνται σε θερμοστάτη στη βέλτιστη θερμοκρασία (37 ° C) για 18-48 χρόνια. Ο σκοπός αυτού του σταδίου είναι να ληφθούν απομονωμένες αποικίες μικροοργανισμών. Ωστόσο, μερικές φορές, για να συσσωρευτεί υλικό, σπέρνεται σε υγρά θρεπτικά μέσα.
Παρασκευάζονται επιχρίσματα από ύποπτες αποικίες, που χρωματίζονται με τη μέθοδο Gram για τη μελέτη των μορφολογικών και χρωματικών ιδιοτήτων των παθογόνων και εξετάζονται κινητά βακτήρια σε μια «κρεμασμένη» ή «θρυμματισμένη» σταγόνα. Αυτά τα σημάδια έχουν εξαιρετικά μεγάλη διαγνωστική αξία όταν χαρακτηρίζονται ορισμένοι τύποι μικροοργανισμών. Τα υπολείμματα των υπό μελέτη αποικιών αφαιρούνται προσεκτικά από την επιφάνεια του μέσου χωρίς να αγγίξουν άλλα και εμβολιάζονται σε κεκλιμένες πλευρές άγαρ ή σε τομείς ενός τρυβλίου Petri με θρεπτικό μέσο για να ληφθεί μια καθαρή καλλιέργεια. Οι δοκιμαστικοί σωλήνες ή τα πιάτα με καλλιέργειες τοποθετούνται σε θερμοστάτη στη βέλτιστη θερμοκρασία για 18-24 ώρες.
Τα βακτήρια μπορούν επίσης να αναπτυχθούν διαφορετικά σε υγρά θρεπτικά μέσα, αν και τα χαρακτηριστικά των εκδηλώσεων ανάπτυξης είναι φτωχότερα από ότι στα στερεά μέσα.
Τα βακτήρια είναι ικανά να προκαλέσουν διάχυτη θολότητα του μέσου, το χρώμα του μπορεί να μην αλλάξει ή να αποκτήσει το χρώμα μιας χρωστικής. Αυτό το μοτίβο ανάπτυξης παρατηρείται συχνότερα στους περισσότερους προαιρετικούς αναερόβιους μικροοργανισμούς.
Μερικές φορές σχηματίζεται ένα ίζημα στον πυθμένα του δοκιμαστικού σωλήνα. Μπορεί να είναι εύθρυπτο, ομοιογενές, παχύρρευστο, βλεννώδες κ.λπ. Το μέσο από πάνω του μπορεί να παραμείνει διαφανές ή να γίνει θολό. Εάν τα μικρόβια δεν σχηματίζουν χρωστική ουσία, το ίζημα έχει μπλε-μπλε ή κιτρινωπό χρώμα. Κατά κανόνα, τα αναερόβια βακτήρια αναπτύσσονται με παρόμοιο τρόπο.
Η βρεγματική ανάπτυξη εκδηλώνεται με το σχηματισμό νιφάδων και κόκκων που συνδέονται στα εσωτερικά τοιχώματα του δοκιμαστικού σωλήνα. Το περιβάλλον παραμένει διαφανές.
Τα αερόβια βακτήρια τείνουν να αναπτύσσονται επιφανειακά. Μια λεπτή, άχρωμη ή μπλε μεμβράνη σχηματίζεται συχνά με τη μορφή μιας ελάχιστα αισθητής επίστρωσης στην επιφάνεια, η οποία εξαφανίζεται όταν το μέσο ανακινείται ή ανακινείται. Η μεμβράνη μπορεί να είναι υγρή, παχιά, να έχει κολλώδη, γλοιώδη υφή και να κολλάει στη θηλιά, τραβώντας πίσω της. Ωστόσο, υπάρχει επίσης ένα πυκνό, ξηρό, εύθραυστο φιλμ, το χρώμα του οποίου εξαρτάται από τη χρωστική ουσία που παράγουν οι μικροοργανισμοί.
Εάν είναι απαραίτητο, γίνεται ένα επίχρισμα, χρωματίζεται, εξετάζεται στο μικροσκόπιο και οι μικροοργανισμοί εμβολιάζονται με βρόχο στην επιφάνεια ενός στερεού θρεπτικού μέσου για να ληφθούν απομονωμένες αποικίες.
Την τρίτη ημέρα (στάδιο 3 της μελέτης), μελετάται το πρότυπο ανάπτυξης μιας καθαρής καλλιέργειας μικροοργανισμών και πραγματοποιείται η ταυτοποίησή του.
Αρχικά, δίνουν προσοχή στα χαρακτηριστικά της ανάπτυξης μικροοργανισμών στο μέσο και κάνουν ένα επίχρισμα, βάφοντάς το με τη μέθοδο Gram, προκειμένου να ελέγξουν την καθαρότητα της καλλιέργειας. Εάν παρατηρηθούν βακτήρια ίδιου τύπου μορφολογίας, μεγέθους και ιδιοτήτων βαφής (ικανότητα βαφής) στο μικροσκόπιο, συμπεραίνεται ότι η καλλιέργεια είναι καθαρή. Σε ορισμένες περιπτώσεις, με βάση την εμφάνιση και τα χαρακτηριστικά της ανάπτυξής τους, μπορεί κανείς να βγάλει ένα συμπέρασμα σχετικά με τον τύπο των παθογόνων που απομονώνονται. Ο προσδιορισμός του είδους των βακτηρίων με βάση τα μορφολογικά χαρακτηριστικά τους ονομάζεται μορφολογική ταυτοποίηση. Ο προσδιορισμός του τύπου του παθογόνου με βάση τα πολιτισμικά του χαρακτηριστικά ονομάζεται πολιτισμική ταυτοποίηση.
Ωστόσο, αυτές οι μελέτες δεν επαρκούν για να βγάλουμε ένα τελικό συμπέρασμα σχετικά με τον τύπο των μικροβίων που απομονώνονται. Επομένως, μελετώνται οι βιοχημικές ιδιότητες των βακτηρίων. Είναι αρκετά διαφορετικοί.
Τις περισσότερες φορές, μελετώνται σακχαρολυτικές, πρωτεολυτικές, πεπτολυτικές, αιμολυτικές ιδιότητες, ο σχηματισμός ενζύμων αποκαρβοξυλάσης, οξειδάσης, καταλάσης, πλασμακοαγουλάσης, DNase, ινωδολυσίνης, η αναγωγή νιτρικών σε νιτρώδη και παρόμοια. Για το σκοπό αυτό, υπάρχουν ειδικά θρεπτικά μέσα που ενοφθαλμίζονται με μικροοργανισμούς (διαφοροποιημένη σειρά Hiss, MPB, πηγμένο ορό γάλακτος, γάλα κ.λπ.).
Ο προσδιορισμός του τύπου του παθογόνου με βάση τις βιοχημικές του ιδιότητες ονομάζεται βιοχημική ταυτοποίηση.
ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΑΓΝΗΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Για επιτυχημένη καλλιέργεια, εκτός από σωστά επιλεγμένα μέσα και σωστά σπαρμένα, απαιτούνται βέλτιστες συνθήκες: θερμοκρασία, υγρασία, αερισμός (παροχή αέρα). Η καλλιέργεια αναερόβιων είναι πιο δύσκολη από τα αερόβια· χρησιμοποιούνται διάφορες μέθοδοι για την απομάκρυνση του αέρα από το θρεπτικό μέσο. Η απομόνωση μεμονωμένων τύπων βακτηρίων (καθαρή καλλιέργεια) από το υλικό δοκιμής, το οποίο συνήθως περιέχει μείγμα διαφόρων μικροοργανισμών, είναι ένα από τα στάδια κάθε βακτηριολογικής μελέτης. Μια καθαρή καλλιέργεια μικροβίων λαμβάνεται από μια απομονωμένη μικροβιακή αποικία. Κατά την απομόνωση μιας καθαρής καλλιέργειας από το αίμα (αιμοκαλλιέργεια), αυτή πρώτα «αναπτύσσεται» σε υγρό μέσο: 10-15 ml στείρα ληφθέντος αίματος εμβολιάζονται σε 100-150 ml υγρού μέσου. Η αναλογία του εμβολιασμένου αίματος προς το θρεπτικό μέσο 1:10 δεν είναι τυχαία - έτσι επιτυγχάνεται η αραίωση του αίματος (το μη αραιωμένο αίμα έχει επιζήμια επίδραση στους μικροοργανισμούς). Στάδια απομόνωσης καθαρής καλλιέργειας βακτηρίων Στάδιο Ι (εγγενές υλικό) Μικροσκόπηση (κατά προσέγγιση ιδέα της μικροχλωρίδας). Σπορά σε στερεά θρεπτικά μέσα (λήψη αποικιών). Στάδιο ΙΙ (απομονωμένες αποικίες) Μελέτη αποικιών (πολιτιστικές ιδιότητες βακτηρίων). Μικροσκοπική μελέτη μικροβίων σε λεκιασμένο επίχρισμα (μορφολογικές ιδιότητες βακτηρίων). Σπορά σε κλίση θρεπτικού άγαρ για να απομονωθεί μια καθαρή καλλιέργεια. Στάδιο III (καθαρή καλλιέργεια) Προσδιορισμός πολιτιστικών, μορφολογικών, βιοχημικών και άλλων ιδιοτήτων για τον προσδιορισμό μιας βακτηριακής καλλιέργειας ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Η αναγνώριση απομονωμένων βακτηριακών καλλιεργειών πραγματοποιείται με τη μελέτη της μορφολογίας των βακτηρίων, των πολιτισμικών, βιοχημικών και άλλων χαρακτηριστικών τους που είναι εγγενή σε κάθε είδος .
Η ορολογική διάγνωση, με βάση την αντίδραση αντιγόνου-αντισώματος, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό και των δύο και παίζει ρόλο στον προσδιορισμό της αιτιολογίας μιας ιογενούς λοίμωξης ακόμα και όταν τα αποτελέσματα απομόνωσης του ιού είναι αρνητικά.
Η επιτυχία της ορολογικής διάγνωσης εξαρτάται από την ειδικότητα της αντίδρασης και τη συμμόρφωση με τις προσωρινές συνθήκες αιμοληψίας που είναι απαραίτητες για τη σύνθεση αντισωμάτων από τον οργανισμό.
Στις περισσότερες περιπτώσεις, χρησιμοποιούνται ζευγαρωμένοι οροί αίματος, που λαμβάνονται σε διαστήματα 2-3 εβδομάδων. Θετική αντίδραση θεωρείται ότι είναι τουλάχιστον 4 φορές αύξηση του τίτλου αντισωμάτων. Είναι γνωστό ότι τα περισσότερα ειδικά αντισώματα ανήκουν στις κατηγορίες IgG και IgM, τα οποία συντίθενται σε διαφορετικούς χρόνους κατά τη διάρκεια της μολυσματικής διαδικασίας. Ταυτόχρονα, τα αντισώματα IgM είναι πρώιμα αντισώματα και τα τεστ που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό τους χρησιμοποιούνται για έγκαιρη διάγνωση (αρκεί να εξετάσουμε έναν ορό). Τα αντισώματα IgG συντίθενται αργότερα και επιμένουν για μεγάλο χρονικό διάστημα.
Το RN χρησιμοποιείται για τυποποίηση ιών· για διαγνωστικά ειδικά για ομάδες, για παράδειγμα, αδενοϊική λοίμωξη, αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος(RSK). Τα πιο συνηθισμένα είναι αντίδραση αναστολής αιμοσυγκόλλησης(RTGA), RSK, RIF, παθητικές αντιδράσειςΚαι αντίστροφη παθητική αιμοσυγκόλληση(RPGA, ROPGA), διάφορες εκδόσεις του ELISA, το οποίο έχει αντικαταστήσει σχεδόν καθολικά το RIA, το οποίο είναι ίσης ευαισθησίας.
RTGAχρησιμοποιείται για τη διάγνωση ασθενειών που προκαλούνται από αιμοσυγκολλητικούς ιούς. Βασίζεται στη δέσμευση του προστιθέμενου τυπικού ιού στον ορό του ασθενούς από αντισώματα. Δείκτης της αντίδρασης είναι τα ερυθρά αιμοσφαίρια που συγκολλούνται από τον ιό (σχηματισμός χαρακτηριστικής «ομπρέλας») απουσία ειδικών αντισωμάτων και καθιζάνουν στον πυθμένα, μη συγκολλημένα, εάν υπάρχουν.
RSKείναι μια από τις παραδοσιακές ορολογικές αντιδράσεις και χρησιμοποιείται για τη διάγνωση πολλών ιογενών λοιμώξεων. Στην αντίδραση συμμετέχουν δύο συστήματα: αντισώματα από τον ορό του ασθενούς + τυπικός ιός και ερυθρά αιμοσφαίρια προβάτου + αντισώματα σε αυτά, καθώς και τιτλοδοτημένο συμπλήρωμα. Εάν τα αντισώματα και ο ιός ταιριάζουν, αυτό το σύμπλεγμα δεσμεύει το συμπλήρωμα και δεν συμβαίνει λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων προβάτου (θετική αντίδραση). Με αρνητικό RSC, το συμπλήρωμα προάγει τη λύση των ερυθροκυττάρων. Το μειονέκτημα της μεθόδου είναι η ανεπαρκώς υψηλή ευαισθησία της και η δυσκολία τυποποίησης των αντιδραστηρίων.
Για να ληφθεί υπόψη η σημασία του RSC, καθώς και του RTGA, είναι απαραίτητο να τιτλοδοτηθούν οι ζευγαρωμένοι οροί, δηλαδή που λαμβάνονται κατά την έναρξη της νόσου και κατά την περίοδο της ανάρρωσης.
RPGA– συγκόλληση ερυθροκυττάρων (ή σφαιριδίων πολυστυρενίου) που ευαισθητοποιούνται από ιικά αντιγόνα παρουσία αντισωμάτων. Οποιοσδήποτε ιός μπορεί να προσροφηθεί στα ερυθροκύτταρα, ανεξάρτητα από την παρουσία ή την απουσία αιμοσυγκολλητικής δραστηριότητας. Λόγω της παρουσίας μη ειδικών αντιδράσεων, οι οροί ελέγχονται σε αραίωση 1:10 ή περισσότερο.
RNGA– συγκόλληση ερυθροκυττάρων που ευαισθητοποιούνται από ειδικά αντισώματα παρουσία ιικών αντιγόνων. Το ROPHA έχει γίνει πιο διαδεδομένο στην ανίχνευση του αντιγόνου HBs τόσο σε ασθενείς όσο και σε αιμοδότες.
ΑΝμέθοδο καθώς και ELISA, χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων στον ορό. Η ELISA γίνεται ολοένα και πιο σημαντική και διαδεδομένη για διαγνωστικούς σκοπούς. Το ιικό αντιγόνο προσροφάται στη στερεά φάση (στο κάτω μέρος των φρεατίων δισκίων πολυστυρενίου ή σφαιριδίων πολυστυρενίου). Όταν προστεθούν τα αντίστοιχα αντισώματα που υπάρχουν στον ορό, δεσμεύονται στα ροφημένα αντιγόνα. Η παρουσία των επιθυμητών αντισωμάτων ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας αντι-αντισώματα (για παράδειγμα, ανθρώπινα) συζευγμένα με ένα ένζυμο (υπεροξειδάση). Η προσθήκη ενός υποστρώματος και η αντίδραση υποστρώματος-ενζύμου δίνουν χρώμα. Η ELISA μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό των αντιγόνων. Σε αυτή την περίπτωση, τα αντισώματα απορροφώνται στη στερεά φάση.
Μονοκλωνικά αντισώματα. Μεγάλη πρόοδος στη διάγνωση των ιογενών λοιμώξεων έχει επιτευχθεί την τελευταία δεκαετία, όταν, με την ανάπτυξη της έρευνας γενετικής μηχανικής, αναπτύχθηκε ένα σύστημα παραγωγής μονοκλωνικών αντισωμάτων. Έτσι, η ειδικότητα και η ευαισθησία των διαγνωστικών μεθόδων για τον προσδιορισμό των ιικών αντιγόνων αυξήθηκαν απότομα. Η στενή ειδικότητα των μονοκλώνων, που αντιπροσωπεύουν ένα μικρό κλάσμα ιικών πρωτεϊνών που μπορεί να μην υπάρχουν στο κλινικό υλικό, έχει ξεπεραστεί επιτυχώς με τη χρήση αρκετών μονοκλωνικών αντισωμάτων σε διαφορετικούς ιικούς καθοριστικούς παράγοντες.
Εργαστηριακή διάγνωση
UDC -078
Εργαστηριακή διάγνωση ιογενών λοιμώξεων
Ν.Ν. Nosik, V.M. Σταχάνοφ
Ινστιτούτο Ιολογίας που πήρε το όνομά του. DI. Ivanovsky RAMS, Μόσχα
Εργαστηριακή Διάγνωση Ιογενών Λοιμώξεων
Ν.Ν. Nosik, V.M. Σταχάνοβα
Εισαγωγή
Η επέκταση των ευκαιριών για τη θεραπεία και την πρόληψη ιογενών ασθενειών με τη χρήση αντιιικών φαρμάκων, ανοσοτροποποιητών και εμβολίων με διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης απαιτεί ταχεία και ακριβή εργαστηριακή διάγνωση. Η στενή εξειδίκευση ορισμένων αντιιικών φαρμάκων απαιτεί επίσης ταχεία και εξαιρετικά ειδική διάγνωση του μολυσματικού παράγοντα. Υπάρχει ανάγκη για ποσοτικές μεθόδους για την ανίχνευση ιών για την παρακολούθηση της αντιιικής θεραπείας. Εκτός από τον καθορισμό της αιτιολογίας της νόσου, η εργαστηριακή διάγνωση είναι σημαντική για την οργάνωση αντιεπιδημικών μέτρων.
Η έγκαιρη διάγνωση των πρώτων περιπτώσεων επιδημικών λοιμώξεων επιτρέπει την έγκαιρη εφαρμογή αντιεπιδημικών μέτρων - καραντίνα, νοσηλεία, εμβολιασμός κ.λπ. της εργαστηριακής διάγνωσης αυξάνεται. Τα εργαστηριακά διαγνωστικά διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στις υπηρεσίες αίματος και στη μαιευτική πρακτική, για παράδειγμα, στον εντοπισμό δοτών που έχουν μολυνθεί τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας(HIV), ιός ηπατίτιδας Β (HBV), διάγνωση λοίμωξης από ερυθρά και κυτταρομεγαλοϊό σε έγκυες γυναίκες.
Διαγνωστικές μέθοδοι
Στην εργαστηριακή διάγνωση των ιογενών λοιμώξεων υπάρχουν τρεις κύριες προσεγγίσεις (Πίνακας 1, Πίνακας 2):
1) άμεση εξέταση του υλικού για την παρουσία ιικού αντιγόνου ή νουκλεϊκών οξέων.
2) απομόνωση και ταυτοποίηση του ιού από κλινικό υλικό.
3) ορολογική διάγνωση, με βάση τη διαπίστωση σημαντικής αύξησης των ιικών αντισωμάτων κατά την πορεία της νόσου.
Με οποιαδήποτε επιλεγμένη προσέγγιση για τη διάγνωση ιών, ένας από τους πιο σημαντικούς παράγοντες είναι η ποιότητα του υλικού που μελετάται. Έτσι, για παράδειγμα, για άμεση ανάλυση ενός δείγματος ή για απομόνωση ιού, το υλικό δοκιμής πρέπει να λαμβάνεται στην αρχή της νόσου, όταν το παθογόνο εξακολουθεί να εκκρίνεται σε σχετικά μεγάλες ποσότητες και δεν έχει ακόμη δεσμευτεί από αντισώματα, και Ο όγκος του δείγματος πρέπει να είναι επαρκής για άμεση δοκιμή. Είναι επίσης σημαντικό να επιλέξετε το υλικό σύμφωνα με την αναμενόμενη ασθένεια, δηλαδή το υλικό στο οποίο, με βάση την παθογένεια της μόλυνσης, η πιθανότητα παρουσίας του ιού είναι μεγαλύτερη.
Σημαντικό ρόλο στην επιτυχή διάγνωση παίζει το περιβάλλον στο οποίο λαμβάνεται το υλικό, πώς μεταφέρεται και πώς αποθηκεύεται. Έτσι, ρινοφαρυγγικά ή ορθικά επιχρίσματα και τα περιεχόμενα των κυστιδίων τοποθετούνται σε μέσο που περιέχει πρωτεΐνη που αποτρέπει την ταχεία απώλεια μολυσματικότητας του ιού (εάν σχεδιάζεται να απομονωθεί) ή σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα (εάν προγραμματίζεται για εργασία με νουκλεϊκά οξέα).
Άμεσες μέθοδοι διάγνωσης κλινικού υλικού
Οι άμεσες μέθοδοι είναι μέθοδοι που ανιχνεύουν έναν ιό, ένα ιικό αντιγόνο ή έναν ιό νουκλεϊκό οξύ(NC) απευθείας σε κλινικό υλικό, δηλαδή είναι οι πιο γρήγοροι (2–24 ώρες). Ωστόσο, λόγω ορισμένων χαρακτηριστικών των παθογόνων, οι άμεσες μέθοδοι έχουν τους περιορισμούς τους (δυνατότητα λήψης ψευδώς θετικών και ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων). Ως εκ τούτου, συχνά απαιτούν επιβεβαίωση με έμμεσες μεθόδους.
Ηλεκτρονική μικροσκοπία (EM). Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, μπορείτε να εντοπίσετε τον ίδιο τον ιό. Για τον επιτυχή προσδιορισμό του ιού, η συγκέντρωσή του στο δείγμα θα πρέπει να είναι περίπου 1·106 σωματίδια ανά 1 ml. Αλλά δεδομένου ότι η συγκέντρωση του παθογόνου σε υλικό από ασθενείς είναι, κατά κανόνα, ασήμαντη, η αναζήτηση του ιού είναι δύσκολη και απαιτεί την προκαταρκτική καθίζηση του χρησιμοποιώντας φυγοκέντρηση υψηλής ταχύτητας που ακολουθείται από αρνητική αντίθεση. Επιπλέον, το EM δεν επιτρέπει την τυποποίηση ιών, αφού πολλοί από αυτούς δεν έχουν μορφολογικές διαφορές εντός της οικογένειας. Για παράδειγμα, οι ιοί του απλού έρπητα, της κυτταρομεγαλίας ή του έρπητα ζωστήρα είναι μορφολογικά πρακτικά δυσδιάκριτοι.
Μία από τις επιλογές EM που χρησιμοποιούνται για διαγνωστικούς σκοπούς είναι ανοσοποιητική ηλεκτρονική μικροσκοπία(IEM), στο οποίο χρησιμοποιούνται ειδικά αντισώματα κατά των ιών. Ως αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης των αντισωμάτων με τους ιούς, σχηματίζονται σύμπλοκα, τα οποία είναι ευκολότερο να ανιχνευθούν μετά από αρνητική αντίθεση.
Το IEM είναι ελαφρώς πιο ευαίσθητο από το EM και χρησιμοποιείται σε περιπτώσεις όπου ο ιός δεν μπορεί να καλλιεργηθεί in vitro, για παράδειγμα, κατά την αναζήτηση για παθογόνα της ιογενούς ηπατίτιδας.
Αντίδραση ανοσοφθορισμού (RIF). Η μέθοδος βασίζεται στη χρήση αντισωμάτων συζευγμένων με μια βαφή, όπως η ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη. Το RIF χρησιμοποιείται ευρέως για την ανίχνευση ιικών αντιγόνων στο υλικό του ασθενούς και για ταχεία διάγνωση.
Στην πράξη, χρησιμοποιούνται δύο παραλλαγές RIF: ευθείαΚαι έμμεσος. Στην πρώτη περίπτωση χρησιμοποιούνται επισημασμένα με βαφή αντισώματα έναντι ιών, τα οποία εφαρμόζονται σε μολυσμένα κύτταρα (επιχρίσματα, κυτταροκαλλιέργεια). Έτσι, η αντίδραση προχωρά σε ένα βήμα. Το μειονέκτημα της μεθόδου είναι η ανάγκη ύπαρξης ενός μεγάλου συνόλου συζευγμένων ειδικών ορών για πολλούς ιούς.
Στην έμμεση εκδοχή του RIF, ένας ειδικός ορός εφαρμόζεται στο υλικό δοκιμής, τα αντισώματα του οποίου συνδέονται με το ιικό αντιγόνο που βρίσκεται στο υλικό και στη συνέχεια ο ορός κατά του είδους τοποθετείται στις γ-σφαιρίνες του ζώου στο οποίο Παρασκευάστηκε ειδικός ανοσοποιητικός ορός, για παράδειγμα, κατά του κουνελιού, κατά του αλόγου, κ.λπ. Πλεονέκτημα Η έμμεση έκδοση του RIF συνίσταται στην ανάγκη για έναν μόνο τύπο επισημασμένου αντισώματος.
Η μέθοδος RIF χρησιμοποιείται ευρέως για την γρήγορη αποκρυπτογράφηση της αιτιολογίας των οξειών αναπνευστικών ιογενών λοιμώξεων κατά την ανάλυση των επιχρισμάτων δακτυλικών αποτυπωμάτων από τη βλεννογόνο μεμβράνη της ανώτερης αναπνευστικής οδού. Η επιτυχής χρήση του RIF για την άμεση ανίχνευση του ιού σε κλινικό υλικό είναι δυνατή μόνο εάν περιέχει αρκετά μεγάλο αριθμό μολυσμένων κυττάρων και μικρή μόλυνση με μικροοργανισμούς που μπορεί να δώσει μια μη ειδική λάμψη.
Ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA). Οι μέθοδοι ενζυμικής ανοσοδοκιμασίας για τον προσδιορισμό των ιικών αντιγόνων είναι κατ' αρχήν παρόμοιες με το RIF, αλλά βασίζονται στην επισήμανση αντισωμάτων με ένζυμα και όχι με βαφές. Οι πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες είναι η υπεροξειδάση του χρένου και η αλκαλική φωσφατάση· χρησιμοποιούνται επίσης η β-γαλακτοσιδάση και οι β-λακταμάσες. Τα επισημασμένα αντισώματα συνδέονται με το αντιγόνο και αυτό το σύμπλεγμα ανιχνεύεται όταν προστίθεται ένα υπόστρωμα για το ένζυμο στο οποίο συζευγνύονται τα αντισώματα. Το τελικό προϊόν της αντίδρασης μπορεί να είναι με τη μορφή αδιάλυτου ιζήματος και στη συνέχεια η καταγραφή πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας ένα συμβατικό μικροσκόπιο φωτός ή με τη μορφή ενός διαλυτού προϊόντος, το οποίο είναι συνήθως έγχρωμο (ή μπορεί να φθορίζει ή να φωτίζει) και ηχογραφείται οργανικά.
Επειδή η ELISA μπορεί να μετρήσει διαλυτά αντιγόνα, δεν υπάρχει απαίτηση για άθικτα κύτταρα στο δείγμα και έτσι μπορεί να χρησιμοποιηθεί ποικιλία κλινικού υλικού.
Ένα άλλο σημαντικό πλεονέκτημα της μεθόδου ELISA είναι η ικανότητα ποσοτικοποίησης των αντιγόνων, η οποία επιτρέπει τη χρήση της για την αξιολόγηση της κλινικής πορείας της νόσου και της αποτελεσματικότητας της χημειοθεραπείας. Το ELISA, όπως και το RIF, μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο άμεσα όσο και έμμεσα.
Η ELISA στερεάς φάσης, η οποία παράγει ένα διαλυτό έγχρωμο προϊόν αντίδρασης, είναι πιο διαδεδομένη. Το ELISA μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο για τον προσδιορισμό του αντιγόνου (μετά τα αντισώματα εφαρμόζονται στη στερεά φάση - το κάτω μέρος του φρεατίου μιας πλάκας πολυστυρενίου) όσο και για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων (στη συνέχεια τα αντιγόνα εφαρμόζονται στη στερεά φάση).
Ραδιοανοσοδοκιμασία (RIA) . Η μέθοδος βασίζεται στη σήμανση αντισωμάτων με ραδιοϊσότοπα, γεγονός που εξασφαλίζει υψηλή ευαισθησία στον προσδιορισμό του ιικού αντιγόνου. Η μέθοδος έγινε ευρέως διαδεδομένη στη δεκαετία του '80, ειδικά για τον προσδιορισμό δεικτών του HBV και άλλων μη καλλιεργήσιμων ιών. Τα μειονεκτήματα της μεθόδου περιλαμβάνουν την ανάγκη εργασίας με ραδιενεργές ουσίες και τη χρήση ακριβού εξοπλισμού (μετρητές γάμμα).
Μοριακές μέθοδοι. Αρχικά, η κλασική μέθοδος αναγνώρισης του ιικού γονιδιώματος θεωρήθηκε η ιδιαίτερα ειδική μέθοδος υβριδισμού ΝΑ, αλλά σήμερα η απομόνωση γονιδιωμάτων του ιού με τη χρήση αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης(PCR).
Μοριακός υβριδισμός νουκλεϊκών οξέων.Η μέθοδος βασίζεται στον υβριδισμό συμπληρωματικών κλώνων DNA ή RNA για το σχηματισμό δικλωνικών δομών και την ταυτοποίησή τους με χρήση ετικέτας. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιούνται ειδικοί ανιχνευτές DNA ή RNA, σημασμένοι με ισότοπο (32 P) ή βιοτίνη, οι οποίοι ανιχνεύουν συμπληρωματικές έλικες DNA ή RNA. Υπάρχουν διάφορες παραλλαγές της μεθόδου: – υβριδισμός σημείου – απομονωμένο και μετουσιωμένο ΝΑ εφαρμόζεται στα φίλτρα και στη συνέχεια προστίθεται ένας επισημασμένος ανιχνευτής. Ένδειξη αποτελεσμάτων - αυτοραδιογραφία κατά τη χρήση 32 P ή χρώση - με αβιδίνη-βιοτίνη. – Ο υβριδισμός στυπώματος είναι μια μέθοδος για την απομόνωση θραυσμάτων ΝΑ που κόβονται με περιοριστικές ενδονουκλεάσες από το συνολικό DNA και μεταφέρονται σε φίλτρα νιτροκυτταρίνης και ελέγχονται με επισημασμένους ανιχνευτές. χρησιμοποιείται ως επιβεβαιωτική εξέταση για τη μόλυνση από τον ιό HIV. – υβριδισμός επί τόπου– σας επιτρέπει να προσδιορίσετε το NK σε μολυσμένα κύτταρα.
PCRβασίζεται στην αρχή της φυσικής αντιγραφής του DNA. Η ουσία της μεθόδου είναι η επανάληψη πολλαπλών κύκλων σύνθεσης (ενίσχυσης) μιας ειδικής για τον ιό αλληλουχίας DNA χρησιμοποιώντας θερμοσταθερή Taq DNA πολυμεράση και δύο ειδικούς εκκινητές - τους λεγόμενους εκκινητές.
Κάθε κύκλος αποτελείται από τρία στάδια με διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας. Σε κάθε κύκλο, ο αριθμός των αντιγράφων της συνθετικής περιοχής διπλασιάζεται. Τα πρόσφατα συντιθέμενα θραύσματα DNA χρησιμεύουν ως πρότυπο για τη σύνθεση νέων κλώνων στον επόμενο κύκλο ενίσχυσης, που επιτρέπει, σε 25-35 κύκλους, να παραχθεί επαρκής αριθμός αντιγράφων του επιλεγμένου τμήματος DNA για τον προσδιορισμό του, συνήθως χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης.
Η μέθοδος είναι ιδιαίτερα συγκεκριμένη και πολύ ευαίσθητη. Σας επιτρέπει να ανιχνεύσετε πολλά αντίγραφα ιικού DNA στο υπό μελέτη υλικό. Τα τελευταία χρόνια, η PCR χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο για τη διάγνωση και παρακολούθηση ιογενών λοιμώξεων (ιοί ηπατίτιδας, έρπης, κυτταρομεγαλία, θηλώματα κ.λπ.).
Έχει αναπτυχθεί μια ποσοτική παραλλαγή PCR που επιτρέπει σε κάποιον να προσδιορίσει τον αριθμό αντιγράφων μιας ενισχυμένης θέσης DNA. Η τεχνική είναι πολύπλοκη, δαπανηρή και δεν είναι ακόμη επαρκώς ενοποιημένη για χρήση ρουτίνας.
Κυτταρολογικές μέθοδοι επί του παρόντος έχουν περιορισμένη διαγνωστική αξία, αλλά θα πρέπει να εξακολουθούν να χρησιμοποιούνται για ορισμένες λοιμώξεις. Εξετάζονται υλικά αυτοψίας, βιοψίες και επιχρίσματα, τα οποία μετά από κατάλληλη επεξεργασία χρωματίζονται και αναλύονται στο μικροσκόπιο. Σε περίπτωση μόλυνσης από κυτταρομεγαλοϊό, για παράδειγμα, χαρακτηριστικά γιγαντιαία κύτταρα – «μάτια κουκουβάγιας» – βρίσκονται σε τμήματα ιστού ή στα ούρα· σε περίπτωση λύσσας, εντοπίζονται εγκλείσματα στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων (σώματα Babes-Negri). Σε ορισμένες περιπτώσεις, για παράδειγμα, στη διαφορική διάγνωση της χρόνιας ηπατίτιδας, η αξιολόγηση της κατάστασης του ηπατικού ιστού είναι σημαντική.
Αντιγόνα– Γενετικά ξένες ουσίες που, όταν εισάγονται στο σώμα του ζώου ή του ανθρώπου, προκαλούν ειδική ανοσολογική απόκριση - σύνθεση αντισωμάτων, σχηματισμός ευαισθητοποιημένων Τ-λεμφοκυττάρων, ανοσολογική μνήμη ή ανοχή. Οι ξένες ουσίες αναφέρονται σε χημικές δομές που δεν υπάρχουν στο σώμα. Ξένοι για το ανθρώπινο σώμα είναι ιοί, μικροοργανισμοί, καθώς και κύτταρα, ιστοί, όργανα ζώων και άλλων ανθρώπων. Τα αντιγόνα έχουν αρκετούς υποδοχείς για την επικοινωνία με τα αντισώματα και είναι σε θέση να αντιδρούν μαζί τους τόσο στο σώμα του ζώου ή του ανθρώπου (in vivo) όσο και έξω από το σώμα - in vitro (in vitro).
Αντισώματα- πρωτεΐνες υψηλού μοριακού βάρους του κλάσματος σφαιρίνης του ορού αίματος. Τα αντισώματα συντίθενται υπό την επίδραση ενός αντιγόνου και είναι σε θέση να αντιδράσουν (συνδυάζονται) ειδικά με το αντίστοιχο αντιγόνο. Όλα τα αντισώματα έχουν τη χαρακτηριστική δομή των ανοσοσφαιρινών. διαφέρουν ως προς τις ανοσολογικές, βιολογικές και φυσικές ιδιότητες. και χωρίζονται σε 5 κατηγορίες - IgG, IgA, IgM, IgD και IgE.
Ορολογικές αντιδράσεις
Στην εργαστηριακή πρακτική χρησιμοποιούν ορολογικές αντιδράσεις- εργαστηριακές αντιδράσεις μεταξύ αντιγόνων και αντισωμάτων που οδηγούν σε ανιχνεύσιμες αλλαγές στο υπό μελέτη σύστημα. Αυτές οι αντιδράσεις ονομάζονται ορολογικές, αφού πραγματοποιούνται με χρήση ορού (ορού) που περιέχει αντισώματα.
Οι ορολογικές εξετάσεις που πραγματοποιούνται για την ανίχνευση συγκεκριμένων αντισωμάτων και αντιγόνων παθογόνων σε μολυσματικές ασθένειες είναι πιο προσιτές εργαστηριακές διαγνωστικές μέθοδοι από τη βακτηριολογική ανίχνευση του παθογόνου. Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι ορολογικές εξετάσεις παραμένουν η μόνη μέθοδος για τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών.
Ορισμένες μέθοδοι για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται στην εργαστηριακή πρακτική
Όλες οι ορολογικές αντιδράσεις βασίζονται στην αλληλεπίδραση αντιγόνου και αντισώματος με το σχηματισμό ανοσοσυμπλεγμάτων, τα οποία μπορούν να ανιχνευθούν σε δοκιμές in vitro (δηλαδή «in vitro» - έξω από ζωντανό οργανισμό). Οι αντιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος σε ένα σύστημα in vitro μπορεί να συνοδεύονται από την εμφάνιση πολλών φαινομένων - συγκόλληση, καθίζηση, λύση και άλλα. Οι εξωτερικές εκδηλώσεις της αντίδρασης εξαρτώνται από τις φυσικοχημικές ιδιότητες του αντιγόνου (μέγεθος σωματιδίων, φυσική κατάσταση), την κατηγορία και τον τύπο των αντισωμάτων, καθώς και από τις πειραματικές συνθήκες (μέση σύσταση, συγκέντρωση άλατος, pH, θερμοκρασία).
1. Αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος
Συμπλήρωμαείναι ένα σύστημα πρωτεϊνών του πλάσματος του αίματος, το οποίο περιλαμβάνει 9 συστατικά που υποδεικνύονται με το γράμμα C (C1, C2, C3,... C9), παράγοντα Β, παράγοντα D και έναν αριθμό ρυθμιστικών πρωτεϊνών. Μερικά από αυτά τα συστατικά αποτελούνται από 2 - 3 πρωτεΐνες, για παράδειγμα το C1 είναι ένα σύμπλεγμα τριών πρωτεϊνών. Αυτές οι πρωτεΐνες κυκλοφορούν στην κυκλοφορία του αίματος και υπάρχουν στις κυτταρικές μεμβράνες. Το συμπλήρωμα είναι το πιο σημαντικό σύστημα τόσο της έμφυτης όσο και της επίκτητης ανοσίας. Αυτό το σύστημα έχει σχεδιαστεί για να προστατεύει τον οργανισμό από τη δράση ξένων παραγόντων και συμμετέχει στην υλοποίηση της ανοσολογικής απόκρισης του οργανισμού. Το συμπλήρωμα ανακαλύφθηκε στα τέλη του 19ου αιώνα από τον Βέλγο επιστήμονα J. Bordet.
Αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος (CFR)– ορολογική αντίδραση που χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό αντισωμάτων και αντιγόνων που δεσμεύουν το συμπλήρωμα. Περιγράφηκε για πρώτη φορά από τους Bordet και Gengou το 1901. Το RSC βασίζεται στο γεγονός ότι το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος είναι ικανό να απορροφά συμπλήρωμα, το οποίο προστίθεται στο μίγμα της αντίδρασης. Όταν τα αντιγόνα και τα αντισώματα αντιστοιχούν μεταξύ τους, σχηματίζουν ένα ανοσοποιητικό σύμπλεγμα στο οποίο προσκολλάται το συμπλήρωμα. Ένα συγκεκριμένο ανοσοσύμπλεγμα προσροφά συμπλήρωμα που προστίθεται στο σύστημα, δηλ. Το συμπλήρωμα δεσμεύεται από το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος. Όσο περισσότερα αντισώματα, τόσο περισσότερο συμπλήρωμα στερεώνεται. Εάν το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος δεν σχηματιστεί, τότε το συμπλήρωμα παραμένει ελεύθερο.
Η πολυπλοκότητα του RSC είναι ότι η αντίδραση σχηματισμού του συμπλόκου αντιγόνου-αντισώματος-συμπληρώματος είναι αόρατη. Για την αναγνώριση των συστατικών της αντίδρασης, χρησιμοποιείται ένα πρόσθετο σύστημα αιμολυτικού δείκτη. Χρησιμοποιώντας την αντίδραση αιμόλυσης, πραγματοποιείται ποσοτικός προσδιορισμός του υπολείμματος του συμπληρώματος μετά το τέλος της αντίδρασης του αντιγόνου με τον αντιορό.
Η αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος (CFR) χρησιμοποιείται για την ανίχνευση αντισωμάτων σε ένα συγκεκριμένο αντιγόνο ή για τον προσδιορισμό του τύπου του αντιγόνου χρησιμοποιώντας ένα γνωστό αντίσωμα. Αυτή η πολύπλοκη ορολογική αντίδραση περιλαμβάνει δύο συστήματα και συμπλήρωμα. Το πρώτο σύστημα είναι βακτηριολογικό (βασικό), αποτελείται από ένα αντιγόνο και ένα αντίσωμα. Το δεύτερο σύστημα είναι αιμολυτικό (δείκτης). Περιλαμβάνει ερυθρά αιμοσφαίρια προβάτου (αντιγόνο) και τον αντίστοιχο αιμολυτικό ορό (αντίσωμα).
Το RSC χορηγείται σε δύο στάδια: πρώτα, το αντιγόνο συνδυάζεται με τον δοκιμαστικό ορό αίματος, στον οποίο αναζητούνται τα αντισώματα και στη συνέχεια προστίθεται συμπλήρωμα. Εάν το αντιγόνο και το αντίσωμα ταιριάζουν μεταξύ τους, σχηματίζεται ένα ανοσοσύμπλεγμα που δεσμεύει το συμπλήρωμα. Σε περίπτωση απουσίας αντισωμάτων στον ορό, το ανοσοποιητικό σύμπλεγμα δεν σχηματίζεται και το συμπλήρωμα παραμένει ελεύθερο. Δεδομένου ότι η διαδικασία της προσρόφησης του συμπληρώματος από το σύμπλεγμα είναι οπτικά αόρατη, προστίθεται ένα σύστημα αίμης για την αναγνώριση αυτής της διαδικασίας.
Λόγω της υψηλής ευαισθησίας του, η αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος (FFR) χρησιμοποιείται τόσο για την ορολογική διάγνωση βακτηριακών και ιογενών λοιμώξεων, αλλεργικών καταστάσεων, όσο και για την ταυτοποίηση αντιγόνων (απομονωμένη βακτηριακή καλλιέργεια).
Αντίδραση καθίζησης (RP)(από το λατινικό praecipitatio - κατακρήμνιση, πτώση) βασίζεται στην κατακρήμνιση ενός συγκεκριμένου ανοσοσυμπλέγματος που αποτελείται από ένα διαλυτό αντιγόνο και ένα συγκεκριμένο αντίσωμα παρουσία ηλεκτρολύτη. Ως αποτέλεσμα της αντίδρασης, σχηματίζεται ένας θολός δακτύλιος ή χαλαρό ίζημα - ένα ίζημα. Μια αντίδραση καθίζησης συμβαίνει μεταξύ ενός υδατοδιαλυτού αντιγόνου και ενός αντισώματος, με αποτέλεσμα μεγάλα σύμπλοκα που καθιζάνουν
3. Αντίδραση κροκίδωσης
Αντίδραση κροκίδωσης (σύμφωνα με τον Ramon)(από το λατινικό floccus - νιφάδες μαλλί, κροκίδες - τεμάχια, νιφάδες· κροκίδωση - ο σχηματισμός χαλαρών κροκιδωδών συσσωματωμάτων (κροκίδων) από μικρά σωματίδια της διασκορπισμένης φάσης) - η εμφάνιση ωχρότητας ή κροκιδωτής μάζας (ανοσοκαθίζηση) σε δοκιμαστικό σωλήνα κατά τη διάρκεια η αντίδραση τοξίνη - αντιτοξίνη ή τοξοειδές - αντιτοξίνη. Χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας αντιτοξικού ορού ή τοξοειδούς.
Η αντίδραση κροκίδωσης βασίζεται στην ανίχνευση «αρχικής» κροκίδωσης - θολότητας κατά τον σχηματισμό συμπλόκου εξωτοξίνης (ανατοξίνης) + αντιτοξίνης σε βέλτιστες ποσοτικές αναλογίες συστατικών.
4. Αντίδραση συγκόλλησης
Συγκόλληση(από το λατινικό agglutinatio - κόλληση) είναι μια αντίδραση αλληλεπίδρασης μεταξύ ενός αντιγόνου και ενός συγκεκριμένου αντισώματος, η οποία εκδηλώνεται με τη μορφή κόλλησης. Σε αυτή την περίπτωση, τα αντιγόνα με τη μορφή σωματιδίων-σωμάτιων (μικροβιακά κύτταρα, ερυθρά αιμοσφαίρια κ.λπ.) κολλώνται μεταξύ τους με αντισώματα και κατακρημνίζονται (συγκολλούνται) με τη μορφή νιφάδων. Τα συσσωματώματα είναι συνήθως ορατά με γυμνό μάτι. Για να συμβεί η αντίδραση, είναι απαραίτητη η παρουσία ηλεκτρολυτών (για παράδειγμα, ισοτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου), οι οποίοι επιταχύνουν τη διαδικασία συγκόλλησης.
Χρησιμοποιώντας την αντίδραση συγκόλλησης (RA), ανιχνεύονται reactio agglutinationis (αγγλική δοκιμή συγκόλλησης), αντισώματα ή σωματιδιακά αντιγόνα. Ανάλογα με τον τύπο του ανοσοδιαγνωστικού που χρησιμοποιείται, διακρίνονται οι αντιδράσεις μικροβιακής συγκόλλησης, αιμοσυγκόλλησης, λατεξοσυγκόλλησης, πήξης κ.λπ.
5. Ονομασία αντισωμάτων που εμπλέκονται στις αντιδράσεις καθίζησης
Τα αντισώματα που εμπλέκονται στις αντιδράσεις καθίζησης ονομάζονται παραδοσιακά από την αλληλεπίδρασή τους με το αντιγόνο:
συγκολλητίνες - προκαλούν κόλληση του σωματικού αντιγόνου - συγκολλητογόνο και καθίζηση του συμπλέγματος αντιγόνου - αντισώματος (συγκολλητίνη).
ιζήματα - σχηματίζουν ένα ίζημα με ένα διαλυτό αντιγόνο - ιζηματογόνο.
Οι βακτηριολυσίνες (προκαλούν τη λύση των βακτηρίων) και οι αιμολυσίνες (προκαλούν τη λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων) συμμετέχουν στις αντιδράσεις λύσης.