Наиболее часто на практике используются три варианта твердофазного иммуноанализа - непрямой иммуноанализ, прямой иммуноанализ и иммуноанализ сэндвич-типа. Различия между этими типами иммуноанализа заключаются в следующем. В непрямом варианте иммуноанализа на первой стадии на поверхность лунок полистирольного планшета сорбируется антиген. После удаления несвязавшихся молекул антигена добавляется образец, содержащий специфичные к данному антигену антитела. Образовавшиеся комплексы антиген-антитело детектируются с помощью анти-видовых антител, конъюгированных с какой-либо меткой (Рис. 1А). В прямом варианте иммунанализа детекция сорбированного антигена осуществляется непосредственно с помощью специфичных антител, конъюгированных с меткой (Рис. 1Б). В иммуноанализе сэндвич-типа на первой стадии на поверхность планшета сорбируется не антиген, а антитела, специфичные к исследуемому антигену (антитела подложки). После удаления не связавшихся молекул антител добавляется образец, содержащий антиген. Для детекции образовавшегося комплекса антитела подложки-антиген добавляются вторые антитела, специфичные к другому, пространственно удаленному, эпитопу антигена, конъюгированные с какой-либо меткой (Рис. 1В). Использование в иммуноанализе сэндвич-типа антител, специфичных к двум различным эпитопам антигена, позволяет добиться высокой чувствительности и специфичности при определении антигена даже в таких гетерогенных образцах, как плазма крови.
Рис. 1. Принцип непрямого (А), прямого (Б) и иммуноанализа сэндвич-типа (В)
Непрямой иммуноферментный анализ (indirect ELISA)
Метод непрямого иммуноанализа характеризуется осуществлением 3-х стадийного процесса, на первой стадии которого антиген адсорбируется на специально подготовленном пластике, на второй с антигеном взаимодействуют специфичные к нему антитела, а на третьей в систему вводят антивидовые антитела, конъюгированные с ферментом, обуславливающим проведение индикаторной ферментативной реакции. В данной методике в качестве фермента используют пероксидазу хрена. Реакция проводится в специальных 96-луночных планшетах.
I. Сорбция антигена
В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антиген 0,1-0,5 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0.1% Tween-20 (PBSТ).
II. Блокировка
Для блокирования мест неспецифического связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре.
III. Раститровка специфичных антител
Раститровку можно проводить как по горизонтальным, так и по вертикальным рядам планшета. Необходимо отметить, что раститровка антител проводится в том случае, если необходимо подобрать оптимальную концентрацию антител или определить титр. В том случае, если оптимальная концентрация и/или титр антител определены, то используют рекомендованное для данных конкретных антител разведение.
При раститровке в первую лунку ряда вносят готовое разведение антител - в среднем 1-10 мкг в лунку, далее проводят последовательное разведение антител в лунках. Инкубацию со специфичными антителами проводят в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 3 раза.
IV. Добавление антивидовых антител, конъюгированных с ферментной меткой
В качестве детекторных (вторичных) антител используются антивидовые поликлональные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. Чаще всего используются козьи или кроличьи антитела, специфичные к целой молекуле или к Fc-фрагментам специфичных антител. Концентрация детекторных антител как правило указывается производителем в виде разведения исходного раствора (например, 1:1000). Инкубация со вторичными антителами проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз.
Пероксидаза хрена катализирует реакцию окисления субстрата перекисью водорода. В качестве субстрата пероксидазы хрена используется о-фенилендиамин (ОФД). В результате прохождения реакции образуется окрашенный продукт окисления ОФД.
Раствор субстрата: К 10 мл субстратного буфера (0,1 М Na-цитратный буфер, рН 4,5) добавить 0,01 мл 30% перекиси водорода и 0,2 мл 50х раствора ОФД (340 мг ОФД в 10 мл этилового спирта; хранить при –20°С).
Инкубация проводится в течение 10 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.
V. Остановка ферментативной реакции
VI. Измерение оптической плотности
Прямой иммуноферментный анализ (direct ELISA)
Методика прямого иммуноанализа имеет лишь небольшие отличия по сравнению с методикой непрямого иммуноанализа. Так, стадии I и II одинаковы в обоих типах анализа. Отличие заключается в том, что в прямом варианте иммуноанализа на стадии III используют специфичные антитела, конъюгированные с ферментной меткой. При необходимости также можно проводить раститровку специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой, аналогично описанному ранее для неконъюгированных антител. Стадия IV опускается, а дальнейшие стадии (V-VII) проводятся аналогично описанному выше для непрямого варианта иммуноанализа.
Иммуноанализ сэндвич-типа (Sandwich-type immunoassay)
Рис. 2. Схематическое изображение иммуноанализа «сэндвич»-типа. АТп - антитело подложки, АТд - детекторное антитело, АГ - антиген, М - метка, ковалентно связанная с детекторным антителом, П - подложка, на которую сорбируется антитело подложки.
В данном варианте иммуноанализа (Рис.2) используется пара антител, специфичных к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена.
I. Сорбция антител подложки
В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антитела подложки 1-2 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0,1% Tween-20 (PBSТ).
II. Блокировка
Для блокирования мест неспецифичного связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре.
III. Инкубация с антигеном
В лунки планшета с преадсорбироваными антителами вносят по 50 мкл исследуемого раствора либо стандартных разведений антигена. Разведения антигена должны быть приготовлены на основе PBST, поскольку Tween-20 снижает неспецифичное связывание белковых молекул друг с другом и с поверхностью планшета. И исследуемый раствор, и стандартные разведения антигена вносят попарно (либо по 3 повторности), используя по две (три) лунки на каждое разведение белка. Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Отмывка осуществляется раствором PBST 3 раза.
IV. Инкубация с антителами, конъюгированными с ферментной меткой
В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой. Оптимальная концентрация конъюгированных антител как правило указывается производителем (обычно используют концентрацию 2-4 мкг/мл). Инкубация с антителами, содержащими ферментную метку, проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз.
V. Проведение ферментативной реакции, сопровождающейся появлением окрашенного продукта
В лунки вносят по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании.
VI. Остановка ферментативной реакции
Перед измерением оптической плотности проводят остановку цветной реакции с помощью 0,5 М H 2 SO 4 . В лунки с рабочим раствором ОФД после инкубации вносят по 50 мкл раствора 0,5 М серной кислоты. После этого можно сразу приступать к измерению оптической плотности.
VII. Измерение оптической плотности
Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при λ=490 нм с использованием планшетного спектрофотометра.
С прогрессом современной медицины удается проводить более углубленную диагностику при подозрении на те или иные патологии у пациента. Одним из информативных методов лабораторного исследования стал ИФА анализ, который проводят методом забора венозной крови. То есть для пациента ничего в целом не меняется. А вот лаборант-анализатор ИФА проводит сложную технику исследования забранного биоматериала. В том, что такое анализы ИФА и, каковы тонкости применения ИФА метода в качестве диагностического, разбираемся в материале ниже.
Что такое иммуноферментный анализ?
Выработку антител провоцируют сами же антигены, проникшие в организм человека. При вступлении в «битву» за здоровье организма антитела как бы помечают собой антигены, что при исследовании крови и видит лаборант. То есть в забранном биоматериале можно отследить не только наличие инфекции, но и ее следы уже после того, как организм полностью выздоровел.
Таким образом, назначая иммуноферментный анализ крови пациенту, лечащий врач может отследить давность инфекции, степень ее прогрессирования или выявить наличие иммунитета к той или иной инфекции.
Процесс ИФА диагностики выглядит таким образом:
- Забранная венозная кровь приводится в лаборатории в состояние сыворотки крови;
- Затем лаборант использует специальный лоток с ячейками, в каждой из которых уже имеются все необходимые антигены. Достаточно просто капнуть в каждую ячейку сыворотку крови и отследить реакцию иммуноглобулинов (антител) на антигены. О наличии «нужной» реакции свидетельствует изменение цвета исследуемого материала. В дальнейшем лаборант изучает оптическую плотность исследуемой среды.
- Аскаридоз и энтеробиоз (аскариды и острицы);
- Трихинеллез;
- Описторхоз в острой и хронической формах;
- Лямблиоз;
- Амебиоз;
- Токсоплазмоз;
- Лейшманиоз в любой форме.
Важно: иммуноферментный анализ бывает как качественным, так и количественным. В первом случае лаборант лишь подтверждает или опровергает наличие искомого вещества в крови. Во втором случае в результате анализа указывают его концентрацию в организме пациента.
Недостатки метода
При всех достоинствах такого способа диагностики стоит понимать, что иммуноферментный анализ крови - не способ нахождения причины болезни пациента, а лишь метод подтверждения предполагаемого лечащим врачом диагноза. А ввиду того, что исследование является достаточно недешевым, использовать его нужно с умом. При этом результаты исследования должен трактовать только квалифицированный специалист.
Расшифровка результатов
После того как мы разобрали аббревиатуру ИФА и что это такое ─ выяснили, стоит перейти к трактовке результатов. Здесь важно понимать, что если анализ проводили качественный, то результат будет лишь положительным или отрицательным. То есть диагностика либо подтверждает подозрения доктора относительно определенного диагноза, либо опровергает их. В этом случае в бланке будут стоять символы «+» или «-» соответственно.
Важно: отрицательный результат анализа не всегда свидетельствует об отсутствии инфекции. Дело в том, что антитела к антигенам могут формироваться в течение 14 дней после инфицирования и вполне вероятно, что они еще не сформированы.
В случае же если проводится количественный анализ, то здесь определяется вид антител, их количество и стадия активности. В частности при такой диагностике определяют антитела (иммуноглобулины) IgG и IgM, которые формируются в разные периоды прогрессирования инфекции. Самыми распространенными вариантами результатов в этом случае являются:
- Повышенный IgМ и полное отсутствие IgG. Такая картина свидетельствует о недавнем инфицировании и острой фазе течения патологии.
- Повышенная активность иммуноглобулинов обоих видов (IgМ и IgG). Говорит о давнем и хроническом протекании инфекционного процесса.
- Активность IgG и полное отсутствие IgМ. Инфицирование было не менее полугода назад и сейчас вирус пребывает в затяжной хронической стадии.
- Отсутствие антител IgG и IgA. Результат не определен.
- Отсутствие антител IgM, IgA и IgG. Свидетельствует об отсутствии иммунитета к определенной инфекции.
- Активность антител IgG, IgM и IgA говорит об обострении хронического процесса.
Помимо выявления типов антител лаборант в специальной графе бланка указывает и их количество на объем крови. Помните, разобравшись в том, что такое метод ИФА, не трактуйте результаты самостоятельно. Полученные результаты с точностью может интерпретировать только лечащий врач в зависимости от предполагаемого диагноза, выстраиваемого на основании клинической картины у пациента.
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Вводится впервые
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод иммуноферментного анализа (ИФА). Метод ИФА является высокочувствительным и высокоспецифичным иммунодиагностическим методом, с помощью которого проводят качественное и количественное определение различных веществ, обладающих свойствами антигена, гаптена (неполноценного антигена) или антитела. Метод ИФА широко используется для диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний человека и животных и может также применяться для подтверждения качества иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП).
Принцип метода заключается в реакции специфического взаимодействия антигена с антителом с образованием иммунного комплекса и последующей детекции полученного комплекса с помощью спектрофотометрии, хемилюминесценции и других адекватных методик. Детекция может быть как прямой (когда исследуемое вещество само обладает ферментативной активностью, либо оно помечено ферментной меткой), так и косвенной или непрямой (когда исследуемое вещество, связавшееся с иммобилизованными на твердой фазе антителами, инкубируется с антителами, меченными ферментом). Качественный анализ позволяет получить информацию о содержании антигена или антитела в исследуемом материале по принципу «есть/»нет». При проведении количественного анализа определяют концентрацию антигена или антитела в исследуемом материале с использованием калибровочного графика.
ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
Метод ИФА включает 3 основных этапа: 1) образование иммунного комплекса «антиген (исследуемое вещество) – специфическое к нему антитело» или наоборот; 2) формирование связи конъюгата с образовавшимся на предыдущем этапе иммунным комплексом или со свободными местами связывания (детерминантами); 3) преобразование субстрата под действием ферментной метки в регистрируемый сигнал в результате биохимической реакции.
Все методики выполнения иммуноферментного анализа классифицируются как гомогенные или гетерогенные.
Методики, в которых все 3 стадии ИФА проходят в растворе, и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, относятся к группе гомогенных методов ИФА. В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит процесс ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. В результате реакции антиген–антитело активность фермента восстанавливается. При образовании иммунного комплекса антиген–антитело, содержащего ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95 % по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена происходит связывание все больше антител, и сохраняется все больше свободных конъюгатов «антиген–фермент», способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Гомогенный метод ИФА проводится очень быстро. На анализ одного определения требуется 1 мин. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.
Для гетерогенных методов характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя и обязательна стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.
Методы относятся к гомогенно-гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов – происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.
Метод гетерогенного ИФА состоит из 3 основных этапов:
- иммобилизация антигена или антитела на твердой фазе, полученный комплекс называется иммуносорбентом;
- удаление несвязавшегося реагента и блокирование сайтов связывания на твердой подложке с помощью блокирующих белков, таких, например, как альбумин, казеин; инкубация анализируемого препарата с иммуносорбентом для того, чтобы произошло их связывание;
3) детекция благодаря ферментативной активности самого исследуемого вещества или благодаря связанной с анализируемым препаратом ферментативной метке (прямой вариант). В некоторых случаях производится дополнительная инкубация комплекса «иммуносорбент–исследуемое вещество» с вторичными антителами, конъюгированными с ферментативной меткой (непрямой вариант).
Количественное определение исследуемого вещества осуществляется путем добавления подходящего для используемого детектора субстрата и сравнения сигнала исследуемого вещества со стандартным образцом.
Метод гетерогенного ИФА подразделяют на неконкурентный ИФА и конкурентный ИФА. Схемы анализа могут быть модифицированы в процессе разработки лекарственного препарата в соответствии с необходимыми требованиями. Изменения должны быть указаны в фармакопейной статье или нормативной документации. Выбор способа постановки ИФА зависит от природы исследуемого вещества и его количества, так как разные виды ИФА обладают различной чувствительностью. Для оценки качества веществ, содержащих антитела, возможно использование специфичных антиидиотипических антител.
Неконкуретный метод ИФА
Неконкурентный метод ИФА подразделяется на несколько видов по типу детекции (прямой конкурентный, косвенный (непрямой) конкурентный) и по типу иммобилизованного на твердой фазе вещества (антиген или антитело).
Прямой вариант ИФА
Может выполняться 2 способами. В первом случае исследуемое вещество (антиген) непосредственно иммобилизовано на твердой фазе; тогда связавшееся с антигеном меченое антитело является детектором. При выполнении теста иным способом используют иммобилизованные на твердой фазе антитела. В этом случае детектором является исследуемое вещество, меченное ферментом.
Косвенный (непрямой) вариант ИФА
При выполнении непрямого варианта ИФА антиген иммобилизован на твердой фазе. После блокировки к антигену прибавляют раствор специфических к нему антител. После инкубации образовавшийся комплекс антиген–антитело отмывают от несвязавшихся антител и добавляют меченный ферментом анти-иммуноглобулин (анти-Ig), выступающий в роли детектора. Анти-Ig детекторы коммерчески доступны для конкретных классов и подклассов Ig, что делает этот формат анализа удобным для изотипирования антител. Кроме того, использование меченого анти-Ig усиливает сигнал по сравнению с прямым методом иммуноферментного анализа, тем самым увеличивая чувствительность анализа.
Метод «сэндвича» как вариант постановки ИФА
Наиболее распространенным неконкурентным методом является «сэндвич» метод. При его выполнении на твердой фазе иммобилизуют первичные антитела с их последующей блокировкой. Затем к ним прибавляют исследуемое вещество, содержащее антиген, и инкубируют. После инкубации комплекс антиген–антитело отмывают от несвязавшегося антигена и добавляют вторичные антитела, меченные ферментом, и проводят детекцию.
Конкурентный метод ИФА
Конкурентный метод ИФА подразделяется на несколько видов: по типу детекции (прямой конкурентный, косвенный (непрямой) конкурентный) и по типу иммобилизованного на твердой фазе вещества (антиген или антитело).
Прямой конкурентный вариант ИФА
Для обнаружения или количественного определения растворимых антигенов применяют прямой конкурентный вариант ИФА с иммобилизованным на твердой фазе антигеном. Для этого используют антиген-специфические антитела, конъюгированные с соответствующим детектором (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, рутений или флуоресцеин). На твердую фазу иммобилизуют стандартный антиген с последующей блокировкой. Конъюгированное с ферментативной меткой антитело инкубируют с исследуемым веществом (растворимым антигеном). Затем эту смесь добавляют к иммобилизованному антигену, инкубируют, а потом отмывают от несвязавшегося комплекса антиген–антитело. Следующий шаг заключается в добавлении подходящего субстрата для используемого в качестве метки фермента. Ингибирование реакции, обусловленное наличием 2 антигенов в системе, по сравнению с контрольным образцом без конкурентного растворимого антигена, является обратно пропорциональным значению количества исследуемого вещества.
Выполнение прямого конкурентного варианта ИФА с иммобилизованным на твердой фазе антителом аналогично прямому конкурентному ИФА с иммобилизованным на твердой фазе антигеном, однако используется для обнаружения или количественного определения антител.
Косвенный (непрямой) конкурентный вариант ИФА
Этот способ постановки ИФА аналогичен прямому конкурентному варианту, однако вместо меченого антитела или антигена при детекции используется меченый анти-Ig реагент или меченые вторичные антитела, соответственно.
Общие условия проведения метода ИФА
В качестве твердой фазы для проведения иммуноферментного анализа применяют различные материалы: силикон, нитроцеллюлоза, полиамиды, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, акрил и другие. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и другие планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки. От выбора твердой фазы зависит принцип иммобилизации (гидрофобное, гидрофильное, ковалентное взаимодействие). Чаще других в качестве твердой фазы используют 96-луночные пластиковые планшеты для микротитрования. Количество лунок в планшете может варьироваться. Планшет может быть прозрачным (колориметрическая детекция) и матовым (хемилюминесцентная детекция, флуориметрия).
Иммобилизацию необходимо проводить без пузырьков воздуха в лунке, так как их присутствие изменяет показание оптической плотности. Возможно использование биотинилированных иммобилизованных реагентов. В этом случае в реакции используют стрептавидин и биотинилированную ферментативную метку. Данный метод используется для усиления сигнала. Время и температура иммобилизации, зависящие от кинетической природы, стабильности и концентрации реагента, должны быть указаны в фармакопейной статье и нормативной документации.
Все стадии иммуноферментного анализа, промывочные и блокирующие растворы, временные промежутки и температурные условия для каждой стадии, количество оборотов в минуту для инкубации на шейкере, условия детекции также должны быть указаны в фармакопейной статье и нормативной документации.
Примеры методик для некоторых видов ИФА
Косвенный неконкурентный метод ИФА
- Сорбция антигена. В каждую лунку 96-луночного планшета вносят 0,1-0,5 мкг антигена и 100 мкл 0,05 М карбонат-бикарбонатного буферного раствора (рН 9,6), если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации, и далее проводят сорбцию при температуре 4 О С в течение 16 ч. Возможно использование других буферных растворов с высокими значениями pH. Инкубация проводится при встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.
Отмывка (двукратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буферным раствором (pH 9,0), содержащим 0,1 % твин-20 (по 300 мкл на лунку), если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации.
- Блокировка. Для блокирования мест неспецифического связывания антигенов или антител лунки планшета заполняют фосфатно-солевым буферным раствором (pH 9,0) или другим буферным раствором, указанным в фармакопейной статье или в нормативной документации, содержащим 1% раствор бычьего сывороточного альбумина или других белков (казеина, желатина, сухого молока и др.), и инкубируют в течение 10–15 мин при комнатной температуре (если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации).
III. Титрование специфических антител. При необходимости количественной оценки исследуемое вещество (антиген или антитело) титруют в серийных разведениях параллельно со стандартным образцом (СО).
Титрование можно проводить как в горизонтальных, так и в вертикальных рядах планшета. Необходимо отметить, что титрование антител проводится в том случае, если необходимо подобрать оптимальную концентрацию антител или определить их титр. В том случае, если оптимальная концентрация и/или титр антител определены, то используют рекомендованное для данных антител (сыворотки) разведение.
При титровании в первую лунку ряда вносят готовое разведение антител – в среднем 1–10 мкг на лунку, далее производят последовательное разведение антител в лунках. Инкубацию со специфическими антителами проводят в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.
Отмывка осуществляется не менее 3–4 раз с помощью фосфатно-солевого буферного раствора pH 9,0, содержащего 0,1% твин-20.
- Добавление антивидовых (антиглобулиновых) антител, конъюгированных с ферментной меткой. В качестве детекторных (вторичных) антител используются антивидовые поликлональные антитела, конъюгированные с ферментативной меткой. Чаще всего используются козьи или кроличьи антитела, специфичные к целой молекуле или к Fc- фрагментам специфических антител. Концентрация детекторных антител, как правило, указывается производителем в виде разведения исходного раствора (например, 1:1000).
Инкубация с вторичными мечеными антителами проводится в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.
Отмывка осуществляется не менее 3–4 раз с помощью фосфатно-солевого буферного раствора (pH 9,0), содержащего 0,1 % твин-20.
Инкубация проводится в течение 10 мин при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.
- В лунки вносят по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Для остановки ферментативной реакции применяют «стоп реагент», который добавляют во все исследуемые и контрольные пробы в равных количествах. Наиболее часто в качестве «стоп реагента» применяют серную кислоту.
Прямой неконкурентный метод ИФА
Методика прямого ИФА имеет лишь небольшие отличия от методики непрямого неконкурентного ИФА. Так, I и II стадии одинаковы в обоих типах анализа. Отличие заключается в том, что в прямом варианте ИФА на стадии III используют специфические исследуемому антигену антитела, конъюгированные с ферментной меткой, и они прямо взаимодействуют с исследуемым веществом. При необходимости также можно проводить титрование конъюгатов аналогично принципу, описанному ранее для неконъюгированных антител. Стадия IV в рамках прямого неконкурентного ИФА не проводится.
«Сэндвич» метод ИФА
В данном варианте ИФА используется пара антител (первичные и вторичные), специфичных к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена.
- Сорбция антител на твердой фазе. Методика сорбции антигена аналогична методике сорбции антител в разделе «Косвенный неконкурентный метод ИФА».
- Блокировка. Методика блокировки мест неспецифического связывания на подложке (твердой фазе) аналогична методике блокировки, описанной в разделе «Косвенный неконкурентный метод ИФА».
III. Инкубация с антигеном. В лунки планшета с преадсорбированными антителами вносят по 50 мкл исследуемого вещества и стандартных разведений антигена, если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации. Разведения антигена должны быть приготовлены на основе фосфатно-солевого буферного раствора (pH 9,0), содержащего 0,1 % твин-20, поскольку твин-20 снижает неспецифическое связывание белковых молекул друг с другом и с поверхностью планшета. И исследуемое вещество, и стандартные разведения антигена вносят попарно в соседние в горизонтальном ряду лунки (либо по 3 повторности), используя по 2 (3) лунки на каждое разведение белка.
Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Отмывка осуществляется не менее 3–4 раз фосфатно-солевым буферным раствором (pH 9,0), содержащим 0,1 % твин-20, или другим буферным раствором, указанным в фармакопейной статье или нормативной документации.
- Инкубация с антителами, конъюгированными с ферментной меткой. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора специфических антител, конъюгированных с ферментной меткой. Оптимальная концентрация конъюгированных антител, как правило, указывается в фармакопейной статье или нормативной документации (обычно используют концентрацию 2–4 мкг/мл).
Инкубация с антителами, содержащими ферментную метку, проводится в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.
Отмывка осуществляется не менее 3–4 раз с помощью фосфатно-солевого буферного раствора (pH 9,0), содержащего 0,1 % твин-20, или другим буферным раствором, указанным в фармакопейной статье или нормативной документации.
- Проведение ферментативной реакции, сопровождающейся появлением окрашенного продукта. Методика проведения ферментативной реакции аналогична методике, описанной в разделе: «Косвенный неконкурентный метод ИФА».
Детекция
Как было указано выше, для детекции используются меченные ферментной меткой или другим реагентом антитела. В качестве ферментной метки могут выступать, например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза или галактозидаза. В качестве детектора могут быть использованы антитела или антигены с другими метками. Выбор реагента-детектора зависит от типа метки, конъюгированной с антителом или антигеном и способа детекции.
В качестве методов детекции могут быть использованы спектрофотометрия, хемилюминесценция, флуориметрия и другие методы, исходя из выбора метки.
Результаты количественного метода ИФА
Результаты количественного метода ИФА рассчитывают по линейной калибровочной кривой с обратной регрессией или с помощью комплексного метода, использующего нелинейную калибровочную кривую с обратной регрессией. Методика интерпретации результатов зависит от используемого способа постановки ИФА. Например, по результатам испытания с помощью калибровочной кривой можно оценивать концентрацию неизвестного образца, проводить оценку полумаксимальной концентрации ингибирования или эффективной концентрации. Это позволяет определять количество исследуемого вещества или его активность в сравнении с эталонным/калибровочным стандартным образцом (СО). Обычно вид калибровочной кривой при выполнении количественного метода ИФА, характеризующий концентрацию анализируемого препарата, зависит от рассчитанного среднего значения нелинейно. В связи с этим, рекомендуется использовать различные математические модели для анализа полученной кривой. В остальных случаях метод ИФА используют как качественный метод, позволяющий оценить наличие того или иного исследуемого вещества в пробе в пределах чувствительности методики.
Примечание.
Приготовление карбонат-бикарбонатного буферного раствора (pH 9,6). В мерный цилиндр вместимостью 1000 мл вносят 1,59 г натрия карбоната (безводного) или 4,29 г натрия карбоната 10-водного и 2,93 г натрия гидрокарбоната, растворяют в 800 мл воды очищенной, доводят pH до 9,6, перемешивают, далее доводят объем раствора до метки водой очищенной и вновь перемешивают.
Трепонемные тесты на сифилис. Общее описание.
При проведении диагностических тестов на сифилис, применяются различные серологические реакции : агглютинации, преципитации, иммунофлюоресценции, связывания комплемента, иммуноферментный анализ и др. В основе всех этих серологических реакций лежит взаимодействие антигенов и антител .
Специфические серологические тесты называются трепонемными потому, что в этих тестах используются бледные трепонемы или их антигены, то есть антигены трепонемного происхождения.
Цель трепонемных тестов - выявление специфических антител к антигенным структурам возбудителя сифилиса, то есть антител, направленные конкретно против самих бактерий T.
Pallidum, а не против тканей организма, поврежденных трепонемой. Специфические противотрепонемные антитела класса IgM могут быть обнаружены уже в конце второй недели заболевания.
Как и в нетрепонемных тестах , при проведении трепонемных тестов используется реакция «антиген-антитело». Для проведения и обнаружения результатов реакции «антиген-антитело» используют более сложные и дорогие методы, чем в случае нетрепонемных тестов.
Своевременное и качественное распознавание сифилитической инфекции связывается в настоящее время с широким внедрением трепонемных тестов.
Трепонемные тесты используют, чтобы подтвердить наличие сифилиса - с их помощью проверяют результаты нетрепонемных тестов, что особенно необходимо при диагностике скрытых форм сифилиса . Трепонемные тесты также применяются для выявления сифилиса на ранних стадиях, когда нетрепонемные кардиолипиновые тесты (реакция Вассермана, реакция микропреципитации и др.) отрицательные.
Трепонемные тесты применяются только для диагностики сифилиса и не используются для проведения контроля излеченности, т/к трепонемные реакции у некоторых больных могут оставаться положительными в течение многих лет после полноценного лечения сифилиса.
Однако, при проведении трепонемных тестов, в небольшом числе исследований могут встречаться ложноположительные результаты , особенно при наличии у пациента таких заболеваний, как инфекционный мононуклеоз, болезни соедининтельной ткани, лепра или инъекционная наркомания.
По клинической специфичности трепонемные тесты сопоставимы с нетрепонемными, по клинической чувствительности – превосходят их.
Причины ложноположительных результатов
Реакция Вассермана может определять «острый» и «хронический» ложноположительный результат. Его выраженность зависит от характера изменений состояния человека. Показывать стадию обострения RW может в таких случаях:
- инфекционные заболевания в стадии обострения;
- травматические повреждения;
- инфаркт миокарда;
- введение любой вакцины за несколько дней до пробы;
- пищевое отравление.
Типы анализов на сифилис
Диагностика сифилиса имеет некоторые особенности и отличается от диагностики других бактериальных инфекций. Сложное строение и антигенные свойства бледной трепонемы обусловливают ошибки в интерпретации результатов серологических реакций.
Сдать анализ крови на сифилис предлагают 3 основным группам пациентов:
- 1 Скрининг и диспансеризация групп населения (в том числе и беременность, постановка на учет в женской консультации, поступление на работу и оформление медкнижки и так далее).
- 2 Скрининг в группах риска (незащищенные половые контакты с человеком, инфицированным сифилисом, лица после принудительных сексуальных контактов, ВИЧ-инфицированные и так далее).
- 3 Лица, имеющие симптомы заболевания, или лица с подозрением на сифилитическую инфекцию.
Все лабораторные методы условно подразделяют на прямые и непрямые.
Прямые методы
- 1 Идентификация Treponema pallidum в тёмном поле (темнопольная микроскопия).
- 2 Заражение подопытных животных (культивирование в лабораторных животных).
- 3 ПЦР (полимеразно-цепная реакция).
- 4 ДНК-зонд или гибридизация нуклеиновых кислот.
Непрямые методы
Серологические реакции — это методы лабораторной диагностики, базирующиеся на обнаружении антител (сокращенно АТ) к антигенам бледной трепонемы (сокращенно АГ). Они имеют основное значение для подтверждения диагноза.
- 1
Нетрепонемные тесты:
- Реакция Вассермана (РСК);
- Реакция микропреципитации (МР, РМП) и ее аналоги, которые приведены ниже;
- Тест быстрых плазменных реагинов (RPR, РПР);
- Тест с красным толуидином и сывороткой (TRUST);
- Нетрепонемный тест Лаборатории исследования венерических болезней — VDRL.
- 2
Трепонемные тесты:
- Р-ция иммобилизации Treponema pallidum – РИБТ/РИТ;
- Р-ция иммунофлюоресценции – РИФ, FTA (разведения сывороток РИФ-10, РИФ-200, РИФ-абс);
- Р-ция пассивной гемагглютинации (РПГА, ТРПГА, TPHA);
- Иммуноферментный анализ (ИФА, EIA);
- Иммуноблоттинг.
Рисунок 1 — Алгоритм серодиагностики сифилиса
Гистоморфологические методы
Эти методы сводятся к выявлению особенностей гистоморфологии сифилитических проявлений. Внимание уделяется тонкостям строения твёрдого шанкра.
Однако, дифференциальная диагностика инфекции с помощью гистологии весьма затруднительна. Гистоморфология используется с другими лабораторными и клиническими тестами.
Методы клинических исследований стремительно совершенствуются с каждым годом. С разработкой новых способов диагностики, ложноположительная реакция на сифилис встречается всё реже.
При необходимости диагностика может включать в себя несколько разных методик – это позволяет получить наиболее достоверный результат.
Нетрепонемные методы исследования
Эти методики направлены на выявление белков, которые образуются в результате активности бледной спирохеты. Они направлены на определение «следов» возбудителя.
Такие методы имеют относительно высокий процент погрешности (до 10%). Подобные методики являются неспецифичными, но позволяют по титру антител определять степень заражения.
Реакция Вассермана RW
Наиболее распространённым анализом, который проводится для выявления бледной трепонемы, является серологическое исследование крови. Реакция Вассермана позволяет всего за несколько минут определить наличие болезни.
Поэтому данная методика применяется в лабораториях чаще всего – она не требует много времени и имеет относительно низкую стоимость.
Для выполнения анализа используется спинномозговая жидкость или кровь. Забор исследуемого материала может осуществляться из пальца (если анализ всего один) или из вены (если требуется проведение нескольких исследований).
В результате проведения анализа может быть не только ложноположительный, но и ложноотрицательный. Он возможен при следующих обстоятельствах:.
- ранняя стадия заражения, когда количество трепонем в организме ещё низкое;
- хроническое заболевание в стадии затихания, когда число антител снижается.
Для выявления болезни используют различные методики и биоматериалы. На ранних этапах сифилис определяют с помощью бактериоскопического теста.
Образцы исследуют под микроскопом. Прибор позволяет обнаружить штаммы возбудителя.
Позднее проводят серологические анализы. Благодаря им, в пробах выявляют антигены и антитела к болезни.
Способы определения половой инфекции поделены на 2 категории:
- Прямые, выявляющие патогенный микроорганизм. К ним относят: темнопольная микроскопия, RIT-анализ (инфицирование кроликов биоматериалом для исследования), метод ПЦР – полимеразной цепной реакции (с его помощью находят генетические элементы возбудителя).
- Непрямые (серологические) позволяют обнаружить антитела к патогену. Они продуцируются иммунной системой, как ответная реакция на заражение.
Серологические методики поделены на 2 категории: трепонемные и нетрепонемные.
Нетрепонемные, включающие: тест с толуидиновым красным, анализ РСК, RPR- тест, исследование крови экспресс-методом РМП.
Трепонемные, объединяющие: иммуноблоттинг, РСК-тест, РИТ-анализ, исследование РИФ, РПГА-тест, ИФА-анализ.
Информативность тестов на инфекцию различна. Чаще делают основные виды анализов на сифилис, к которым отнесены серологические методики. Пациентам, нуждающимся в обследовании, врач назначает тесты индивидуально.
Биоматериал для исследования
Чтобы выявить бледную трепонему – патогена, который выглядит, как спираль и вызывает сифилис, берут пробы:
- венозной крови;
- ликвора (секрета из спинномозгового канала);
- содержимое лимфатических узлов;
- ткани изъязвлений.
Если необходимо провести тесты на обнаружение сифилиса, кровь сдают не только из локтевой вены, но и из пальца. На выбор биоматериала и способ исследования влияет тяжесть течения инфекции и оснащенность диагностического центра.
Лабораторные анализы на выявления трепонемы называются серодиагностикой. Серодиагностика сифилиса условно подразделяется на две группы:
- Специфические анализы, дающие положительную пробу даже после излечения заболевания;
- Неспецифические анализы, показывающие результат, при наличии в конкретное время заболевания.
Как называется анализ на сифилис? Исследования в зависимости разделают на 2 группы:
Специфические анализы:
- Сифилис рпга, что расшифровывается как реакция пассивной агглютинации или сифилис трна, что переводится - Treponema pallidum haemagglutination;
- РИФ или реакция иммунофлюоресценции;
- РИТ или реакция иммобилизации трепонем;
- Иммуноферментный анализ;
- Иммуноблот на сифилис или иммуноблоттинг;
Наиболее известны следующие трепонемные тесты:
- Реакция связывания комплемента (реакция Вассермана) с трепонемным антигеном (РСКт).
- Реакция иммунофлюоресценции (РИФ; Fluorescent treponemal antibody, FTA). Она применяется в нескольких модификациях: РИФ-200 (FTA-200); РИФ-абс (FTA-abs; FTA-abs double staining; FTA-abs IgM; РИФ-абс-IgM; 19S-IgM-FTA-abs); РИФц - реакция иммунофлюоресценции с цельной кровью.
- Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА; Treponema pallidum haemagglutination assay, TPHA).
- Реакция пассивной агглютинации желатиновых частиц, сенсибилизированных антигенами возбудителя сифилиса (TPPA, Treponema pallidum particle agglutination assay)
- Иммуноферментный анализ (ИФА; Enzyme Lynced Immunosorbent Assay, ELISA).
- ИХЛ - иммунохемилюминесцентное исследование (ИХЛ; Chemiluminescence immunoassays, CLIA)
- Реакция иммобилизации бледных трепонем РИБТ (РИТ), в зарубежной литературе TPI (Treponema pallidum immobilization test). В последние годы используется все реже и только в научных целях и в исследовательских лабораториях.
- Иммуноблотинг (ИБ; Western Blot, Line Blot). Как правило, используется метод линейного иммуноблотинга, являющийся вариантом иммуноферментного анализа. Применяется в двух вариантах: для выявления IgG и IgM-антител к возбудителю сифилиса
Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) и иммуноферментный анализ (ИФА) на антитела классов IgM, IgG и суммарные имеют универсальное значение и применяются как для скрининга, так и для подтверждения диагноза.
Эти методики просты и доступны в проведении, имеют высокую воспроизводимость, автоматизированы. При применении ИФА или РПГА обязательным условием является использование в повторном анализе той же тест-системы, что и при первичном обследовании.
РИФ (fluorescent treponemal antibody, FTA) основана на визуализации при люминесцентной микроскопии комплексов антигенов с антителами с помощью сыворотки против Ig человека, меченной флюорохромом.
Методы РИФ, ИФА, иммуноблоттинг (ИБ) позволяют выявить специфические антитела к антигенам T. pallidum (при сифилисе результаты тестов становятся положительными) с 3-й недели от момента заражения и ранее, РПГА и РИБТ – с 7–8-й недели.
Из наиболее распространенных специфических трепонемных тестов в мировой практике, в которых используется реакция агглютинации, можно перечислить следующие. В РПГА (Treponema pallidum hemagglutination assay, ТРНА), реакции микрогемагглютинации (microhemagglutination assay for Treponema pallidum, MHA-TP) при положительном результате происходит агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных (обработанных) трепонемным антигеном, в присутствии антитрепонемных антител. Использование в качестве носителя латекса или желатиновых частиц в тесте ТРРА (Treponema pallidum particle agglutination) позволяет применять нагрузочный тест в случае лизиса эритроцитов (распада эритроцитов из-за разрушения их мембраны) сыворотками некоторых больных, а также придает стабильность реагентам.
Трепонемные тесты
| Антиген | Улавливающая система | Тест |
|
Живые патогенные трепонемы |
Взвесь живых трепонем |
РИТ, РИБТ (реакция иммобилизации бледных трепонем) |
| Интактные трепонемы | Трепонемы, фиксированные на стеклах |
РИФ (реакция иммунофлуоресценции), РИФ-абс (РИФ с абсорбцией), РИФ-ц, РИФ с капиллярной кровью из пальца и т.п. |
| Очищенные и разрушенные ультразвуком трепонемы | Связаны с эритроцитами | РПГА (реакция пассивной гемагглютинации) |
| Связаны с желатиновыми частицами | Реакция агглютинации частиц (TPPA) | |
| ИФА | ||
| Иммуноблоттинг | ||
| Рекомбинантные | Связаны с поверхностью лунок микропланшета | Рекомбинантный ИФА |
|
Белки, разделенные методом электрофореза в полиакриламидном геле и перенесенные на мембраны методом вестерн-блоттинга |
Иммуноблотинг с рекомбинантными АГ | |
| Связаны с частицами латекса | Латекс-агглютинация |
Диагностировать болезни возможно посредством прямых и непрямых способов. Сама бледная трепонема выявляется только прямым методом.
Непрямой же метод обнаруживает антитела к спирохете. Если найдены антитела, то это подтверждает наличие спирохеты в организме.
К непрямым способам диагностики относятся серологические реакции, объектом исследования которых является сыворотка крови.
Антитела можно обнаружить в процессе их контактирования с антигенами. Поэтому для проведения серологической реакции употребляются вещества с содержанием заданного антигена. По типу данного антигена реакции подразделяются на трепонемные и нетрепонемные:
- Трепонемная реакция проходит с выявлением антител к антигенам трепонемы.
- К нетрепонемным относятся реакции, обнаруживающин антитела к липопротеидам разрушенных трепонем или клеток человеческого организма.
Важно! Так как последние мало чем отличаются от липопротеидов тканей животных, то итог анализа на сифилис может оказаться ложноположительным. Кардинально подтвердить диагноз заболевания может только положительная трепонемная реакция.
Подтверждаем или исключаем сифилис: анамнез, симптомы, анализы
Подтвердить или исключить диагноз может только дерматовенеролог. Уролог или гинеколог могут лишь заподозрить болезнь по внешним признакам. И тогда они должны направить пациента к дерматовенерологу для дальнейшего обследования, лечения и наблюдения.
Диагноз «сифилис» основывается на совокупности следующих признаков:
- На наличии или отсутствии внешних проявлений и симптомов.
- На результатах минимум двух лабораторных исследований: нетрепонемного (РМП , или RW , или RPR ) и трепонемного (РПГА или ИФА ) тестов.
- На данных о том, был ли сифилис ранее, и проводили ли уже его лечение.
Если симптомы присутствуют
Основные тесты на сифилис - RPR и РПГА- Наиболее очевидным и обоснованным диагноз считается тогда, когда имеются клинические симптомы и подтверждающие результаты двух анализов: RPR (или RW , РМП ) и РПГА (или ИФА ).
- Если же при наличии симптомов результаты анализов расходятся, и RPR
отрицательный, а РПГА
(или ИФА
) положительный, проводят дополнительный трепонемный тест - ИФА
(или РПГА
, если вначале проводился ИФА
). В случае положительного дополнительного анализа диагноз считается доказанным и проводится лечение, в случае отрицательного - кровь отправляют в экспертную лабораторию.
Отрицательный RPR при положительном ИФА/РПГА встречается обычно в позднем периоде. Тогда на наличие инфекции обязательно исследуют спинномозговую жидкость (РИФ-ц, РИТ ). - Обратная ситуация, когда RPR положительный, а РПГА отрицательный (или сомнительный) встречаются крайне редко. Это возможно в первые 3–4 недели после появления твердого шанкра, а также во вторичном периоде во время иммунной «прозоны» (чрезмерно большого количества антител). В этом случае анализ рекомендуется повторить.
Если внешних признаков нет
Тогда диагностика усложняется. Здесь врачи опираются только на анализы и сведения о проводимом или непроводимом ранее лечении.
Варианты в этом случае:
- Если нетрепонемный (один из РМП/RW/RPR ) и трепонемный тест (РПГА/ИФА ) - положительны, проводится дополнительный альтернативный трепонемный тест (ИФА , если первый тест был РПГА , и наоборот - РПГА , если был ИФА ). Если тест становится отрицательным, то кровь пациента направляют в экспертную лабораторию и проводят дополнительные анализы. В случае если второй трепонемный тест становится положительным, ставят диагноз: «скрытый сифилис».Такое состояние может наблюдаться некоторое время после проведенного лечения. Если пациенту было проведено до этого лечение, то для того чтобы подтвердить диагноз, проводят дополнительное исследование на I gM . При положительных результатах - диагноз подтверждается, но исследование все равно рекомендуется повторить через 2 недели. При отрицательных результатах сифилис опровергается.
- Если нетрепонемный тест (РМП/RW/RPR ) отрицательный, а трепонемный (РПГА/ИФА ) положительный, то состояние может оцениваться как «поздний сифилис» или «отсутствие сифилиса», если пациенту было проведено ранее полноценное лечение. Для разграничения этих двух состояний проводят дополнительный тест на I gM (ИФА I gM , РИФ -абс-I gM , Иммуноблоттинг-I gM ). Если I gM в крови имеются, ставят «поздний сифилис» и лечат. Если нет - пациент считается здоровым.
- Если RPR (или RW/РМП ) положительный, РПГА положительный, а ИФА отрицательный (или наоборот: РПГА «-» и ИФА «+»), то результаты анализов вызывают сомнение и рекомендуется отправить кровь в экспертную лабораторию или провести альтернативные анализы (РИФ , Иммуноблоттинг).
- Если нетрепонемный тест (PMП/RW/RPR ) положительный, а трепонемный (РПГА/ИФА ) отрицательный, то проводится дополнительный трепонемный тест (ИФА/РПГА ). Если он дает положительный результат, то кровь направляют в экспертную лабораторию. Если отрицательный, то диагноз опровергается, а результат нетрепонемного теста признается ложноположительным.
Классификация методов лабораторной диагностики
Серологическая диагностика помогает врачу изучать динамику образования антител в организме больного сифилисом в начальных стадиях заболевания, в период лечения и после его окончания, решить вопрос рецидив заболевания у больного или повторное заражение (реинфекция), поставить диагноз сифилиса при массовых медицинских условиях.
Антитела к бледной трепонеме IgM
Первыми после заражения начинают вырабатываться антитела IgM. Они начинают выявляться при помощи серологических реакций уже со второй недели после заражения.
На 6 - 9 неделях заболевания их количество становится максимальным. Если больной не лечился, то антитела исчезают через полгода.
Антитела IgM исчезают через 1 - 2 мес. после лечения раннего сифилиса, через 3 - 6 мес.
После лечения позднего сифилиса. Если регистрируется их рост, то это служит признаком рецидива сифилиса или говорит о повторном заражении.
Молекулы IgM крупные и через плаценту к плоду не переходят.
Антитела к бледной трепонеме IgG
Антитела иммуноглобулины IgG появляются в конце первого месяца (на 4-й неделе) от момента заражения. Их титр выше, чем титр IgM. IgG сохраняются после излечения достаточно длительное время.
Неспецифические антитела
Существует множество серологических реакций. Это объясняется антигенной множественностью бледных трепонем.
В сыворотке крови больного человека на разных стадиях сифилиса кроме специфических образуются те или иные неспецифические антитела - агглютинины, комплементсвязывающие, иммобилизины, антитела, вызывающие иммунную флюоресценцию, преципитины и др.
Серологические реакции по выявлению неспецифических антител обладают относительной специфичностью поэтому, чтобы избежать диагностических ошибок, следует пользоваться не одним, а комплексом серологических реакций (КСР).
Ложноположительные анализы на сифилис
Антитела-реагины, которые вырабатываются в крови человека против кардиолипинового антигена, регистрируются не только при сифилисе, но и при других заболеваниях: коллагенозах, гепатитах, заболеваниях почек, тиреотоксикозе, онкозаболеваниях, при инфекционных заболеваниях (лепра, туберкулез, бруцеллез, малярия, сыпной тиф, скарлатина), при беременности и месячных циклах, при приеме жирной пищи и алкоголя.
Благодаря развитию современной медицины, врачу при постановке диагноза больше не нужно ориентироваться на косвенные проявления заболеваний или проводить многоступенчатые лабораторные исследования. Достаточно провести один анализ, который подтвердит или опровергнет предполагаемый первоначальный диагноз.
Таким методом является иммуноферментный анализ (ИФА) — это исследование позволяет обнаружить специфические антитела и антигенны свойственные при разнообразных патологиях, что во многом ускоряет установку диагноза.
ИФА анализ — это такоелабораторное исследование (метод), которое помогает определить присутствие или отсутствие определённых антител в организме для борьбы с вирусом и их количество.
Основой исследования является естественная реакция антиген (вредоносный организму объект) – антитело (белок уничтожающий вредоносные объекты), позволяющая выявить присутствие разнообразных вирусов, бактерий.
ИФА представляет собой естественный иммунный ответ организма – взаимодействие антитела с соответствующим антигеном. Так во время ИФА в пробирку с материалом добавляются поочередно антигены или антитела, после чего происходит выявление концентрации получившихся комплексов антиген-антитело.
Если совпадения образовались, то возникают иммунные комплексы, далее происходит ферментная реакция красящего вещества с объединённой молекулой. Именно благодаря изменению цвета в ходе ферментативной индикации происходит идентификация заболевания после исследования уровня определяемого соединения.
Виды иммуноглобулинов
Иммуноглобулины человека дифференцируются на несколько классов, отличающихся друг от друга свойствами, структурой и антигенными особенностями тяжелых цепей (Н-цепи). У всех млекопитающих, в том числе и человека, выделяют пять Н-цепей, которые и определяют принадлежность иммуноглобулинов к соответствующему классу: G, М, A, D, Е.
Каждый класс отличается друг от друга биологическими свойствами, и способностями связывать антигены, и скоростью и прочностью связи с молекулой.
Функции каждых иммуноглобулинов (lg) различны:
| Кол-во в организме | Функции | Период полураспада (дней) | Значение | |||||||||||||||||||||||||||
| G | 70% | Формируют пассивный иммунитет у новорожденного; необходимы для иммунного ответа улучшают фагоцитоз, | 21-24 | обеспечивают длительный гуморальный иммунитет при инфекционных заболеваниях | ||||||||||||||||||||||||||
| М | 5-10% | нужны для активации фагоцитоза, способны связать 5 молекул антигена, | 5 | Обеспечивает первичную иммунную реакцию | ||||||||||||||||||||||||||
| А | 10-15 | Нейтрализуют токсины и вирусы нужны для формирования раннего иммунитета Возникновение иммуноглобулинов происходит по своеобразной «цепочке» — lgM lgG, именно так реагирует организм на появление в организме антигена. Во время лабораторной диагностики проводится оценка концентрации трех основных иммуноглобулинов – G, M, A. Показания к сдаче анализа на иммуноглобулиныИФА-анализ с каждым годом становится все более популярным. Такое исследование ускоряет постановку диагноза, а это очень важно для терапии таких патологий как:
ИФА является своеобразным маркером аутоиммунных патологий и злокачественных новообразований. Подготовка к сдаче анализаПри подготовке к исследованию следует придерживаться таких правил: Так же врачи рекомендуют придерживаться специальной диеты – исключить жирную и жареную пищу, а если исследование проводится на гепатиты, то необходимо не употреблять любые оранжевые овощи и особенно цитрусовые. Сдавать кровь следует с утра на голодный желудок. Ложноположительным анализ бывает из-за невыполненных рекомендаций, особенно употребления жирной пищи, что приводит к слишком большой концентрации триглицеридов в плазме, из-за чего проводимость ИФА снижается. Порядок взятия пробыВ качестве исследуемого материала может использоваться цельная кровь, сыворотка или плазма венозной крови. Забор материала, обычно проводится из локтевой вены, для этого применяется одноразовая игла и вакуумная пробирка, необходимо 5-10 мл крови. Для точности результата важно придерживаться правильной техники взятия пробы – прокол самого сосуда и окружающих тканей должен быть произведен одной манипуляцией, поэтому используется короткая игла с большим диаметром, благодаря чему не травмируется противоположная стенка вены и не повреждаются эритроциты.
Во время хранения материала следует избегать возможной его ионизации, кроме того материал не должен контактировать с остатками дезинфицирующих средств, поэтому используется только одноразовая пластиковая пробирка, с маркировкой ФИО пациента, датой и временем сдачи материала. Если необходимо непродолжительное хранение исследуемого материала, то используется холодильная камера с температурой 2-4 о С, если необходимо более продолжительное хранение, то материал замораживается при температуре -20 о С. Как делают анализПосле подготовки исследуемого материала врач-лаборант приступает к необходимым манипуляциям. Для этого используются ряд специальных наборов антигенов, обдающих свойством спровоцировать ответные реакции организма на раздражитель, это разнообразные инфекции, гормоны, аллергены. Схема ожидаемой реакции «антиген-антитело» выглядит приблизительно так:
В настоящий момент разработано множество разнообразных вариантов ИФА, четкая классификация их отсутствует. Обычно, методы рассматриваются исходя из разделения её на гетеро- и гомогенные — все фазы анализа происходят с применением твердой фазы или с использованием только раствора. Современные клинико-диагностические лаборатории обычно используют гетерогенный (твердофазный) ИФА, в нем под твердой фазой подразумевается абсорбция антигенов или антител на твердой поверхности специальных лунок, расположенных на полистироловом микропланшете, метод подразделяется на прямой и непрямой ИФА. При прямом ИФА, вносимый антиген закрепляет в период инкубационного процесса на поверхности пустых лунок, для этого исследуемые пробы материал помещают в чистые лунки на 20-25 минут, это нужно для прикрепления антигена к их поверхности. После этого происходит добавление необходимого антитела. Далее материал остается на определенное время для образования связей. Антитела всегда добавляют в избытке, поэтому даже при их наличии в пробе остаются не связанные антигены, а если антигенов нет совсем, то связей не будет. Чтобы удалить«лишние» антитела проводится декантация, после чего остаются только те антитела, которые создали связь с антигеном.
При непрямом методе ИФА используемые антитела, заранее соединенные с субстратом ферментативной реакции; в этом случае связь антител с антигеном происходит в период инкубационного процесса, после чего происходит мобилизация связей на поверхности лунок, а вносимый после конъюгат и субстратно-хромогенный реагент окрашивают реакцию. Таким образом, главным отличием непрямого от прямого метода является не приклеивание материала к поверхности чистых лунок, а связывание с антигеном, иммобилизованным на планшете. Останавливается протекание реакции с применением специализированных устройств, далее каждая лунка подвергается процессу фотометрирования, за которым следует сравнительная характеристика полученного результата с проведенными ранее контрольными пробами. Если обнаруживается повышение оптической плотности в пробе, то завышена и концентрация специфических антител в исследуемом результате. Когда будет готов анализПроведение исследования не занимает много времени, от забора крови до получения результата проходит от 1 до 10 дней, в зависимости от диагностических мероприятий. Результаты теста и их расшифровкаНа полученном пациентом бланке-результате диагностики указывается отрицательный либо положительный результат на определенные классы иммуноглобулинов, так же указывается количественный показатель различных классов антител. Возможны различные интерпретации результатов:
Так, например, если были обнаружены IgG и IgM, то возможно у пациента одно из таких заболеваний:
Иммуноферментный анализ часто назначается при гормональных исследованиях, нормы показаны в таблице:
ИФА анализ — это такое диагностическое исследование, которое позволяет оценить вероятность образования онкологических патологий. Однако интерпретация результатов проводится только лечащим врачом. Значение результатов тестаИФА подходит для выявления разнообразных форм половых инфекций, в том числе сифилиса, часто используется и для скрининга беременных. Благодаря этому исследованию можно узнать, как давно произошло заражение и стадия заболевания на момент исследования:
В процессе исследования лунки на планшете с отрицательным показателем остаются бесцветные, а положительные окрашиваются в ярко-желтый цвет. Если цвет положительных лунок не совпадает с цветом контроля, то результат считается сомнительным и необходимо повторное исследование. Иммуноферментный анализ — это первая ступень в диагностике ВИЧ. Проводить анализ нельзя сразу же после предполагаемого заражения необходимо дождаться окончания инкубационного периода (от 14 дней до 6 месяцев). В ходе анализа определяются антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, происходит поиск АТ класса G, который обычно появляется на более поздних сроках и АТ класса А и М, они могут быть определены на ранних стадиях (во время инкубационного периода).
ИФА также применяется в качестве диагностического исследования туберкулеза, но если у пациента даже и были выявлены антитела к данной патологии, то это не всегда подтверждает наличие у него туберкулеза, поэтому ИФА часто применяется качестве уточняющей методики, либо же для диагностики скрытой внелегочной формы. IgG- хроническая стадия инвазии |
||||||||||||||||||||||||||||
| IgA – заражение произошло более 30 дней назад | ||||||||||||||||||||||||||||||
| IgG – инвазия находится в острой фазе | ||||||||||||||||||||||||||||||
| IgG – подтверждает диагноз и показывает эффективность терапии |
Плюсы и минусы анализа
ИФА имеет множество достоинств, что и объясняет его популярность среди врачей и пациентов, это:
- высокая точность результата,
- доступная цена,
- быстрый результат,
- выявление стадии заболевания,
- контроль заболевания в динамике.
Однако наравне с достоинствами существует и недостаток – в редких случаях анализ бывает ложноположительным или ложноотрицательным.
Почему результат может быть недостоверным
Ошибки в результате могут возникать из-за технических нарушений, так же недостоверным анализ бывает у людей с некоторыми хроническими заболеваниями (ревматоидный фактор) для которых характерной является выработка специфических антител.
Так же на конечный результат оказывает влияние употребление пациентов медикаментов и нарушение метаболизма. По данным причинам положительный результат на ВИЧ и онкопатологии требует повторную сдачу проб.
Стоимость исследования
Цена ИФА варьируется в зависимости от направления диагностики (руб.):
- гепатит 250 -900;
- вирусы – 250 -1000;
- ВИЧ – 250-350;
- глистные инвазии – 280 — 900;
- сифилис -150-250;
- грибковые инфекции 400-500.
Оформление статьи: Лозинский Олег
Видео о ИФА анализе
Как выполняется анализ ИФА: