61. Реакция иммунофлюоресценции. Механизм, компоненты, применение. Прямой и непрямой методы постановки.
Различают три основные разновидности метода: прямой, непрямой (рис. 13.10), с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.
Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.тБактерии в мазке, обработанные такой люми- несцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген-антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьеи диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.
В качестве метки используются светящиеся флюорохром-ные красители (изотиоционат флюорисцеина и др.).
Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний - для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.
Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.
Компоненты прямой РИФ:
1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглоткой и др.);
2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ-ла к искомому
антигену;
3) изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.
Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в
том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию -
свечение.
Компоненты непрямой РИФ:
1) исследуемый материал;
2) специфическая антисыворотка;
3) антиглобулиновая сыворотка (АТ-ла против иммуноглобулина), меченая
флюорихромом;
4) Изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем - меченой антиглобулиновой сывороткой.
Светящиеся комплексы АГ-АТ -
меченые АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа.
Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости
приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а
применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.
Также выделяют 4-компонентную разновидность непрямой РИФ, когда дополнительно вводится комплемент (сыворотка морской свинки). При положительной реакции образуется комплекс АГ-АТ - меченые - АТ-комплемент.
В настоящее время широко применяются серологические реакции (СР), в которых участвуют меченые АГ или АТ. К ним относятся реакция иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы, реакция иммуноблотинга, проточная цитометрия и электронная микроскопия.
Они применяются:
1) для серодиагностики инфекционных заболеваний, т. е. для выявления АТ с помощью набора известных конъюгированных (химически соединённых) с различными метками (ферментами, флюорохромными красителями), антигенов;
2) для определения микроорганизма или его серовара с помощью стандартных меченных диагностических антител (экспресс-диагностика).
Готовят диагностические сыворотки иммунизацией животных соответствующим АГ, затем выделяют иммуноглобулины и конъюгируют их со светящимися красителями (флюорохромами), ферментами, радиоизотопами.
Диагностических моноклональных антител получают с помощью гибридных клеток, образованных путем слияния иммунного В-лимфоцита с миеломной клеткой. Гибридомы способны быстро размножаться in vitro в культуре клеток и продуцировать при этом иммуноглобулин, характерный для взятого В-лимфоцита.
Меченые СР по специфичности не уступают другим СР, а по своей чувствительности они превосходят все СР.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
В качестве метки используются светящиеся флюорохромные красители (изотиоционат флюоресцеина и др.).
Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс – диагностики инфекционных заболеваний - для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.
Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.
Компоненты прямой РИФ:
1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглотки и др.);
2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ к искомому антигену;
3) изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.
Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию метки (рис.34).
Компоненты непрямой РИФ, предназначенной для экспреесс-диагностики гриппа А:
1) исследуемый материал смыв с носоглотки больного с подозрением на грипп;
2) специфическая антисыворотка с антителами против вируса гриппа А;
3) антиглобулиновая сыворотка (АТ против иммуноглобулина), меченная флюорохромом;
4) изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем – меченной антиглобулиновой сывороткой.
Иммунные комплексы АГ-АТ – меченные АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа.
Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.
Для серологической диагностики гриппа А, то есть для определения антител против вируса гриппа А в сыворотке крови с помощью непрямой РИФ используют гриппозный диагностикум (антиген вируса гриппа А). Серодиагностика вирусных инфекций в основном носит ретроспективный характер и применяется для подтверждения диагноза и эпидемиологического анализа.
Иммуноферментный анализ (ИФА): конкуретный способ (определение HBs-АГ вируса гепатита В) и непрямой способ (серологическая диагностика ВИЧ - инфекции)
Иммуноферментный анализ (ИФА)
В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.
Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидазы является раствор ортофенилдиамина (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ).
Наиболее широко применяется твердофазный ИФА (рис.35), непрямой и конкурентные способы (рис.36).
Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре (ИФА – анализаторе).
К преимуществам ИФА следует отнести:
Простота методов оценки реакции;
Стабильность конъюгатов;
Легко поддаётся автоматизации.
В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:
А) конкурентный тип
Предназначен для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs Ag) в сыворотках и плазме крови при диагностики вирусного гепатита В и определения носительства HBs Ag.
Компоненты:
1) исследуемый материал – сыворотка или плазма крови;
2) антитела к HBs Ag, адсорбированные на поверхности лунки полистиролого микропланшета;
3) конъюгат – мышиные моноклональные антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой;
4) ортофенилендиамин (ОФД) – субстрат;
5) фосфатно – солевой буфер;
6) контрольные сыворотки:
Положительная (сыворотка с HBs Ag);
Отрицательная (сыворотка без HBs Ag).
Ход работы:
2. Инкубация 1 час при 37°С.
3. Отмывание лунок.
4. Внесение конъюгата.
5. Инкубация 1 час при 37°С.
6. Отмывание лунок.
7. Внесение ОФД. При наличии HBs Ag раствор в лунках желтеет.
8. Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых HBs Ag.
Реакция протекает в три фазы:
1. HBs Ag исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ-АТ. (HBs Ag – anti HBs АТ).
2. Антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой связываются с оставшимися свободными детерминантоми HBs Ag комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ (anti HBs АТ - HBs Ag - anti HBs АТ, меченые пероксидазой).
3. ОФД взаимодействуют с пероксидазой комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.
В) непрямой тип
Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ – инфекции.
Цель: Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции – обнаружение антител к антигенам ВИЧ.
Компоненты:
1) исследуемый материал – сыворотка крови (АТ к АГ-м ВИЧ);
2) синтетические пептиды имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: gp 120 и gр 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки;
3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТ к АТ);
5) фосфатно-солевой буфер;
6) контрольные сыворотки:
Положительная;
Отрицательная.
Ход работы:
1. Внесение контрольных и исследуемых сывороток.
2. Инкубация 30 минут при 37°С.
3. Отмывание.
4. Внесение антиглобулиновой сыворотки меченой ферментом.
5. Инкубация 30 минут при 37°С.
6. Отмывание.
7. Внесение ОФД.
Реакция протекает в 3 фазы:
1. Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (gр 120 и gр 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ (АГ ВИЧ - АТ к ВИЧ).
2. Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т.к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки.
3. ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.
Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических Аг с помощью Ат, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.
Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.
Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.
Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.
Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген - антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими анти телами образуются светящиеся комплексы антиген - антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.
4. В воздухе детской спальни яслей обнаружено 75 мт/м3 стрептококка, 12 мт/м3 стафилококка и 1 мт/м3 туберкулезных бактерий. Дать санитарно-бактериологическую оценку воздуха и наметить план его санации.
ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ № _54
Ретровирусы. ВИЧ-инфекция (СПИД), и ее возбудители.
Вирус иммунодефицита человека вызывает ВИЧ-инфекцию, заканчивающуюся развитием синдрома приобретенного иммунного дефицита.
Возбудитель ВИЧ-инфекции - лимфотропный вирус, относящийся к семейству Retroviridae роду Lentivirus.
Морфологические свойства: РНК-содержащий вирус. Вирусная частица сферической формы Оболочка состоит из двойного слоя липидов, пронизанного гликопротеинами. Липидная оболочка происходит из плазматической мембраны клетки хозяина, в которой репродуцируется вирус. Гликопротеиновая молекула состоит из 2 субъединиц, находящихся на поверхности вириона и пронизывающих его липидную оболочку.
Сердцевина вируса конусовидной формы, состоит из капсидных белков, ряда матриксных белков и белков протеазы. Геном образует две нити РНК, для осуществления процесса репродукции ВИЧ имеет обратную транскриптазу, или ревертазу.
Геном вируса состоит из 3 основных структурных генов и 7 регуляторных и функциональных генов. Функциональные гены выполняют регуляторные функции и обеспечивают осуществление процессов репродукции и участие вируса в инфекционном процессе.
Вирус поражает в основном Т- и В-лимфоциты, некоторые клетки моноцитарного ряда (макрофаги, лейкоциты), клетки нервной системы.
Культуральные свойства: на культуре клеток Т-лимфоцитов и моноцитов человека (в присутствии ИЛ-2).
Антигенная структура: 2 типа вируса - ВИЧ-1 и ВИЧ-2 ВИЧ-1, имеет более 10 генотипов (субтипов): А, В, С, D, E, F…, отличающихся между собой по аминокислотному составу белков.
ВИЧ-1 делят на 3 группы: М, N, О. Большинство изолятов относится к группе М, в которой выделяют 10 подтипов: А, В, С, D, F-l, F-2, G, Н, I, К. Устойчивость: Чувствителен к физическим и химическим факторам, гибнет в при нагревании. Вирус может длительно сохраняться в высушенном состоянии, в высохшей крови.
Факторы патогенности, патогенез: Вирус прикрепляется к лимфоциту, проникает в клетку и репродуцирует в лимфоците. В результате размножения ВИЧ в лимфоците последние разрушаются или теряют свои функциональные свойства. В результате размножения вируса в различных клетках происходит накопление его в органах и тканях, и он обнаруживается в крови, лимфе, слюне, моче, поте, каловых массах.
При ВИЧ-инфекции снижается число Т-4-лимфоцитов, нарушается функция В-лимфоцитов, подавляется функция естественных киллеров и ответ на антигены снижается и нарушается продукция комплемента, лимфокинов и других факторов, регулирующих иммунные функции (ИЛ), в результате чего наступает дисфункция иммунной системы.
Клиника: поражается дыхательная система (пневмония, бронхиты); ЦНС (абсцессы, менингиты); ЖКТ (диареи), возникают злокачественные новообразования (опухоли внутренних органов).
ВИЧ-инфекция протекает в несколько стадий: 1) инкубационный период, составляющий в среднем 2-4 недели; 2) стадия первичных проявлений, характеризующаяся вначале острой лихорадкой, диареей; завершается стадия бессимптомной фазой и персистенцией вируса, восстановлением самочувствия, однако в крови определяются ВИЧ-антитела, 3) стадия вторичных заболеваний, проявляющихся поражением дыхательной, нервной системы. Завешается ВИЧ-инфекция последней, 4-й терминальной стадией- СПИДом.
Микробиологическая диагностика.
Вирусологические и серологические исследования включают методы определения антигенов и антител ВИЧ. Для этого используют ИФА, ИБ и ПЦР. Сыворотки больных ВИЧ-1 и ВИЧ-2 содержат антитела ко всем вирусным белкам. Однако для подтверждения диагноза определяют антитела к белкам gp41, gpl20, gpl60, p24 у ВИЧ-1 и антитела к белкам gp36, gpl05, gpl40 у ВИЧ-2. ВИЧ-антитела появляются через 2-4 недели после инфицирования и определяются на всех стадиях ВИЧ.
Метод выявления вируса в крови, лимфоцитах. Однако при любой положительной пробе для подтверждения результатов ставится реакция ИБ. Применяют также ПЦР, способную выявлять ВИЧ-инфекцию в инкубационном и раннем клиническом периоде, однако ее чувствительность несколько ниже, чем у ИФА.
Клинический и серологический диагнозы подтверждаются иммунологическими исследованиями, если они указывают на наличие иммунодефицита у обследуемого пациента.
Диагностическая иммуноферментная тест-система для определения антител к ВИЧ – включает вирусный АГ, адсорбированный на носителе, АТ против Ig человека. Используется для серодиагностики СПИДа.
Лечение: применение ингибиторов обратной транскриптазы, действующих в активированных клетках. Препараты являются производные тимидина - азидотимидин и фосфазид.
Профилактика. Специфическая - нет.
Влияние физических и химических факторов на микробы. Мутация и ее значение для практической медицины. Примеры. Значение экологии.
Действие химических и биологических факторов.
Действие химических веществ
Химические вещества могут тормозить или полностью подавлять рост микроорганизмов. Если химическое вещество подавляет рост бактерий, но после удаления их рост вновь возобновляется.
Противомикробные вещества с учетом химического строения и механизма их бактерицидного действия на бактерии можно подразделить на следующие группы: окислители, галогены, соединения металлов, кислоты и щелочи, поверхностно-активные вещества, спирты, красители, производные фенола и формальдегида.
Окислители. К этой группе относятся перекись водорода и калия перманганат.
Галогены. Хлор, йод и их препараты: хлорная известь, хлорамин Б, пантоцид, раствор йода спиртовый 5%-ный, йодинол, йодоформ.
Соединения тяжелых металлов (соли свинца, меди, цинка, серебра, ртути; металлорганические соединения серебра: протаргол, колларгол). Эти соединения способны оказывать как противомикробное, так и разнохарактерное местное действие на ткани макроорганизма.
Кислоты и щелочи. В основе бактерицидного действия кислот и щелочей лежат дегидратация микроорганизмов, изменение рН питательной среды, гидролиз коллоидных систем и образование кислотных или щелочных альбуминатов.
Красители обладают свойствами задерживать рост бактерий. Они действуют медленно, но более избирательно.
Формальдегид-бесцветный газ. В практике применяют 40%-ный водный раствор формальдегида (формалин). Газообразный и растворенный в воде формальдегид губительно влияет на вегетативные и споровые формы бактерий.
Действие биологических факторов
Действие биологических факторов проявляется прежде всего в антагонизме микробов, когда продукты жизнедеятельности одних микробов обусловливают гибель других.
Антибиотики (от греч. anti - против, bios - жизнь) - биологически активные вещества, образуемые в процессе жизнедеятельности грибов, бактерий, животных, растений и созданные синтетическим путем, способные избирательно подавлять и убивать микроорганизмы, грибы, риккетсии, крупные вирусы, простейшие и отдельные гельминты.
3. Реакция биологической активности бактериальных ферментов при ревматизме, диагностическое и практическое значение, защитная роль антител против ферментов в приобретенном иммунитете (определение антигиалуронидазы и анти О-стрептолизина).
Ревматизм - общее заболевание инфекционно-аллергического характера, при котором поражается соединительная ткань, главным образом сердечно-сосудистой системы, а также суставы, внутренние органы, центральная нервная система. Считается, что причиной развития ревматизма является активация патогенных микроорганизмов, главным образом бета-гемолитического стрептококка группы А. Именно ему отводится главная роль в этиологии и патогенезе ревматической болезни. Во-первых, заболевание развивается на фоне стрептококковой инфекции. Во-вторых, в крови больных обнаруживается большое количество антител к микроорганизмам этой группы. В-третьих, профилактика заболевания успешно проводится антибактериальными препаратами.
При ревматоидном артрите синовиальные мембраны, по невыясненным причинам, секретируют большое количество фермента глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы которая также разрушает дисульфидные связи в клеточной мембране. При этом наблюдается «утечка» протеолитических ферментов из клеточных лизосом, которые вызывают повреждения близлежащих костей и хрящей. Организм отвечает на это путём выработки цитокинов, среди которых также есть фактор некроза опухоли α TNF-α. Каскады реакций в клетках, которые запускаются цитокинами, ещё больше усугубляют симптомы болезни. Хроническое ревматоидное воспаление, ассоциированное с TNF-α, очень часто вызывает повреждения хрящей и суставов, ведущие к физической нетрудоспособности.
При данном методе используют явление люминесценции.
Сущность явления люминесценции заключается в том, что при поглощении различных видов энергии (световой, электрической и др.) молекулами некоторых веществ их атомы переходят в возбужденное состояние, а затем, возвращаясь в исходное состояние, выделяют поглощенную энергию в виде светового излучения.
В РИФ люминесценция проявляется в виде флуоресценции - это свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекращающееся сразу после его окончания.
Многие вещества и живые микроорганизмы обладают собственной флуоресценцией (так называемой первичной), однако интенсивность ее очень мала. Вещества, обладающие интенсивной первичной флуоресценцией и используемые для придания флуоресцирующих свойств нефлуоресцирующим веществам, получили название флуорохромы. Такая наведенная флуоресценция называется вторичной.
Для возбуждения флуоресценции при люминесцентной микроскопии чаще всего используют ультрафиолетовую или сине-фиолетовую часть спектра (длина волны 300-460 нм). Для этих целей в лабораториях имеются люминесцентные микроскопы различных моделей - МЛ-1-МЛ-4, «Люмам».
В вирусологической практике применяют два основных метода люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител (или РИФ).
Флуорохромирование - это обработка препаратов флуорохромом с целью увеличения силы и контрастности свечения их. Наибольший интерес представляет флуорохром акридиновый оранжевый, который вызывает полихроматическую флуоресценцию нуклеиновых кислот. Так, при обработке препаратов этим флуорохромом дезоксирибонуклеиновая кислота ярко флуоресцирует зеленым цветом, а рибонуклеиновая - рубиново-красным.
Метод РИФ заключается в том, что антитела, соединенные с флуорохромом, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело в связи с присутствием в нем флуорохрома обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению.
Для получения антител используют высокоактивные гипериммунные сыворотки, из которых выделяют антитела и метят их флуорохромом. В качестве флуорохрома наиболее часто используют ФИТЦ-флуоресцеин изотиоционат (зеленое свечение) и РСХ-родамин сульфохлорид (красное свечение). Антитела, меченные флуорохромом, называют конъюгатом.
Методика приготовления и окрашивания препаратов заключается в следующем:
- готовят на предметных стеклах мазки, отпечатки из органов или на покровных стеклах - инфицированную культуру клеток; можно использовать и гистосрезы;
- препараты подсушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном ацетоне при комнатной температуре или при минус 15 °С (от 15 мин до 4-16 ч);
- окрашивают по прямому или непрямому методу; ведут учет под люминесцентным микроскопом по интенсивности свечения, оцениваемому в крестах.
Параллельно готовят и окрашивают препараты от здорового животного - контроль.
Различают два основных метода применения флуоресцирующих антител: прямой и непрямой.
Прямой метод (одноступенчатый) . На фиксированный препарат наносят конъюгат (флуоресцирующую сыворотку к предполагаемому вирусу), выдерживают 30 мин при температуре 37 °С во влажной камере. Затем препарат отмывают от несвязанного конъюгата физиологическим раствором (pH 7,2 - 7,5), подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под микроскопом.
Прямой метод позволяет обнаружить и идентифицировать антиген. Для этого нужно иметь на каждый вирус флуоресцирующую сыворотку.
Непрямой метод (двухступенчатый) . На фиксированный препарат наносят немеченую сыворотку, содержащую антитела к предполагаемому вирусу, выдерживают 30 мин при 37 °С, отмывают несвязанные антитела. На препарат наносят флуоресцирующую антивидовую сыворотку, соответствующую виду животного - продуцента гомологичных противовирусных антител, выдерживают 30 мин при 37 °С. Затем препарат отмывают от несвязанных меченых антител, подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под люминесцентным микроскопом.
Антивидовые сыворотки получают, иммунизируя глобулинами животных тех видов, которые служат продуцентами антивирусных антител. Так, если антивирусные антитела получали на кроликах, то используют флуоресцирующую антикроличью сыворотку.
Непрямой метод позволяет не только обнаружить и идентифицировать антиген, но и выявить и определить титр антител. Кроме того, этим методом можно обнаруживать одной меченой сывороткой антигены различных вирусов, так как он основан на использовании антивидовых сывороток. Чаще применяют антикроличьи, антибычьи, антилошадиные сыворотки и сыворотки против глобулинов морской свинки.
Разработаны несколько модификаций непрямого метода. Наибольшего внимания заслуживает метод с использованием комплемента. Метод заключается в том, что на фиксированный препарат наносят инактивированную нефлуоресцирующую специфическую сыворотку и комплемент морской свинки, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, и для выявления комплекса антиген + антитело + комплемент наносят флуоресцирующую антикомплементарную сыворотку, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, подсушивают на воздухе и исследуют под люминесцентным микроскопом.
Достоинства РИФ: высокая специфичность и чувствительность; простота техники постановки; требуется минимальное количество компонентов. Это экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ. К недостаткам можно отнести субъективизм в оценке интенсивности свечения и, к сожалению, иногда флуоресцирующие сыворотки бывают плохого качества. В настоящее время РИФ широко применяют в диагностике вирусных болезней животных.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .
№ 35 Реакция иммунофлюоресценции. Механизм, компоненты, применение.
Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических АГ с помощью АТ, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.
Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.
Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками,
не нарушая их иммунологической специфичности.
Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ
основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
Непрямой метод РИФ
заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.
Механизм
. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген - антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С
в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген - антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.