Все живые клетки отвечают на повышение температуры и некоторые другие стрессовые воздействия синтезом специфического набора белков, называемых белками теплового шока (БТШ). К БТШ относят белки, синтезируемые клетками в ответ на тепловой шок, когда подавлена экспрессия основного пула белков, участвующих в нормальном метаболизме. Семейство 70 кДа БТШ (БТШ-70 эукариот и DnaK прокариот) объединяет белки теплового шока, играющие существенную роль как в обеспечении выживания клетки в стрессовых условиях, так и в нормальном метаболизме. Уровень гомологии между белками прокариот и эукариот превышает 50% при полной идентичности отдельных доменов. 70 кДа БТШ являются одной из самых консервативных групп белков в природе (Lindquist Craig, 1988 ; Yura et al., 1993), что связано, вероятно, с шаперонными функциями, которые эти БТШ выполняют в клетках
Индукция генов белков теплового шока (HSP) у эукариот происходит под воздействием фактора теплового шока HSF. В клетках, не подвергшихся стрессу, HSF присутствует и в цитоплазме и в ядре в виде мономерной формы, связанной с Hsp70 , и не имеет ДНК- связывающей активности. В ответ на тепловой шок или другой стресс, Hsp70 отсоединяется от HSF и начинает укладывать денатурированные белки. HSF собирается в тримеры, у него появляется ДНК связывающая активность, он аккумулируется в ядре и связывается с промотором. При этом транскрипция шаперонов в клетке возрастает во много раз. После того, как стресс прошел, освободившийся Hsp70 опять присоединяется к HSF, который при этом теряет ДНК-связывающую активность и все возвращается в нормальное состояние [ Morimoto ea 1993 ].Белки теплового шока появляются на поверхности клеток синовиальной оболочки при бактериальных инфекциях.
Большинство этих белков теплового шока образуются и в ответ на другие повреждающие воздействия. Возможно именно они помогают клетке пережить стрессовые ситуации. Существует три основных семейства белков теплового шока: с мол. массой 25, 70 и 90 кДа (hsp25 , hsp70 и hsp90 . В нормальных клетках было обнаружено множество очень похожих между собой белков из каждого семейства.Белки теплового шока помогают переводить в раствор и вновь сворачивать денатурированные или неправильно свернутые белки. Есть у них и другие функции.
Лучше всего изучены белки семейства hsp70 . Эти белки связываются с некоторыми другими белками, а также аномальными белковыми комплексами и агрегатами, от которых потом освобождаются, присоединяя AТР. Они помогают переводить в раствор и заново сворачивать агрегированные или неправильно свернутые белки путем нескольких циклов присоединения и гидролиза AТР. Аномальные белки имеются в любой клетке, но при некоторых воздействиях, например при тепловом шоке, их количество в клетке резко возрастает, и соответственно возникает необходимость в большом количестве белков теплового шока. Оно обеспечивается активацией транскрипции определенных генов теплового шока.
Белки теплового шока (Hsp - heat shock protein), образуя комплекс с растущей полипептидной цепью, предотвращают их неспецифическую агрегацию и деградацию под действием внутриклеточных протеиназ, способствуя их правильному фолдингу, происходящему с участием других шаперонов. Hsp70 принимает участие в ATP-зависимом разворачивании полипептидных цепей, делая неполярные участки полипептидных цепей доступными действию протеолитических ферментов.
см. также ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ: КЛАСС: ТФ 3.4 факторы теплового шока - http://humbio.ru/humbio/transcription/0002df25.htm
Александр Сапожников не согласен с таким теоретическим обоснованием механизма действия лекарства. По его словам, HSP70 может работать по другой схеме, которую только предстоит изучить, однако факт остается фактом - на клеточных культурах и ряде опухолей в двух линиях крыс, которым были привиты «человеческие» опухолевые клетки, белок действительно показывает активность.
По словам авторов работы, температура, при которой работают с HSP70 на культурах клеток, составляет 43°C, и она слишком высока для живых организмов, однако там, судя по всему, включаются иные механизмы, которые также только предстоит понять. Это касается и действия экзогенного неклеточного белка теплового шока внутри организма. «У каждого из нас в кровотоке присутствует достаточно высокий уровень HSP70 - до 900 нанограммов на миллилитр. Мы вводили его в животное и пытались смотреть, что с белком происходит дальше. В течение 40 минут мы видели следы HSP70 в крови, а потом он пропал. Есть мнение, что белок распадается, но мы так не думаем».
Впечатляющие результаты в ожидании проверки
Ирина Гужова рассказала и о дальнейших испытаниях препарата: «Мы испытывали этот механизм на мышиной меланоме B16, которая растет подкожно, и использовали в виде геля, наносимого на поверхность кожи. Результат получился впечатляющий: выживаемость мышей была гораздо выше, чем у контрольной группы, которую лечили гелем без действующего вещества или не лечили вообще. Разница была примерно в десять дней. Для мышей и данного типа опухоли это очень хорошая отсрочка. Подобные результаты были показаны и на крысиной глиоме C6 (это опухоль, которая растет непосредственно в мозге).
Животные, которых лечили однократной инъекцией в мозг, получали дополнительно десять дней жизни, а животные, которым вводили белок постоянно в течение трех дней с помощью помпы, эта продолжительность увеличивалась еще на десять дней, так как опухоль росла медленнее. Мы показали, что если обеднить популяцию Т-лимфоцитов от мыши, которая имела опухоль, и убрать уже «наученные» NK-клетки или CD8-положительные лимфоциты, то они не будут узнавать опухоль так хорошо. Можно сделать вывод, что основная функция HSP70 в этом процессе - активация специфического иммунитета».
Эти данные побудили ученых провести ограниченное исследование в рамках клиники имени Поленова (НИИ Нейрохирургии в Санкт-Петербурге). «В это время в нашем коллективе был нейрохирург Максим Шевцов, который одновременно с аспирантурой Бориса Александровича (Маргулиса, - прим. сайт) проходил ординатуру в этом НИИ. Он убедил своего руководителя, профессора Хачатуряна, испытать этот препарат. По тогдашнему законодательству достаточно было решения ученого совета и информированного согласия пациентов, и нам было выделено 25 больных. У них у всех были различные опухоли мозга, и они все получали то, что им полагалось по страховке, но плюс после хирургического удаления опухоли Максим вводил в операционное ложе раствор HSP70.
Проблема в том, что опухоли мозга удалить полностью сложно. Всегда остаются маленькие кусочки, которые опасно удалять, потому что вместе с ними можно удалить личность, и эти кусочки дают рецидивы. Но результаты оказались совершенно потрясающими: после операции у больных увеличивалось количество клеток специфического иммунитета, понижалось количество проопухолевых («перешедших на сторону опухоли») Т-лимфоцитов и уменьшалось количество интерлейкина-10 (информационной молекулы иммунной системы).
Исследование было только пилотное, не рандомизированное, группы контроля тоже не было, и проводилось оно в 2011 году. В том же году был принят закон, согласно которому такие испытания запрещены, и их пришлось прекратить, едва начав. У нас осталось 12 прооперированных пациентов. Кто знаком с клинической частью исследований, тот имеет представление о том, насколько сложно отследить судьбы пациентов после того, как каждый из них покидает клинику. Поэтому мы знаем только о восьми, которые остались доступны для контакта, и все они живы до сих пор. На начало осени прошлого года они были вполне здоровы, и те, кто продолжал учиться, осенью пошли в школу, хотя средний прогноз продолжительности жизни с обнаруженной глиомой - 14 месяцев».
Сейчас, по словам докладчиков, доклинические испытания подходят к концу, и препарату необходима многоступенчатая проверка на пациентах, которая займет несколько лет (вот почему в статье «Известий» фигурировал такой неправдоподобно короткий срок до выхода препарата на рынок - 3-4 года).
Александр Сапожников также подчеркнул важность клинических испытаний: «Привитая мышам опухоль и человеческая - это небо и земля. Препарат может работать на этой опухоли, но быть неэффективным ни на обычной опухоли мыши, ни на человеческой. Успокойте своих коллег, лекарства от всех болезней сразу не бывает».
Так считают и сами исследователи. «На данных стадиях все работает (и очень хорошо), но, конечно же, это не то лекарство, которое поднимает Лазаря, - заявляет Ирина Гужова, - однако оно достаточно эффективно и достойно того, чтобы пройти клинические испытания. И мы надеемся, что это случится».
Просто космос
У читателя может возникнуть резонный вопрос: откуда вообще взялся космос? Ирина Гужова поясняет: «Дело в том, что испытания проходили на базе Института особо чистых препаратов, у сотрудников которого хороший опыт в регистрации патентов и написании бумаг, поэтому мы это дело отдали им. Одновременно они начали производство этого белка, а мы делали опыты на животных. Но в процессе к ним обратился представитель Роскосмоса и спросил, а нет ли у нас какого-то незакристаллизованного белка, чтобы закристаллизовать в космосе, на орбите. И им отдали HSP70, кристаллы пытались вырастить на орбите, но ничего не получилось».
Проблема оказалась в строении белка. Очень подвижная часть в структуре белка мешала кристаллизации, поэтому его стали пытаться закристаллизовать по кусочкам, связывать подвижную часть специальной молекулой, чтобы она его «держала». Пытаются до сих пор. «Отсюда выросла эта история про клетки, которые растут в космосе и лечат всех от рака», - комментирует Ирина Гужова.
Она также сообщила, что для испытаний в космосе и на мышах белок подвергли очень высокой степени очистки - около 99%. Что касается сомнений, что активирует иммунитет не шаперон, а липополисахарид (ЛПС) - компонент клеточной стенки бактерий, в которых нарабатывают этот белок, - такая вероятность невелика. Хотя ЛПС «прилипает» к HSP очень сильно, и очистить от самых мизерных его примесей белок довольно трудно. Ученые ставят дополнительные контроли, чтобы показать, что не он, а именно шаперон - причина эффекта препарата. Например, препарат могут кипятить, что не влияет на ЛПС, но разрушает структуру белка. Тогда его свойства HSP теряются, и препарат перестает работать, чего бы не произошло, если бы в нем действовал в основном бактериальный ЛПС.
Кроме того, исследователи сравнивали эффект введения компонентов клеточной стенки бактерий с эффектом от HSP70, и эти сравнения явно были в пользу последнего.
«Не говорили глупостей. И чего? – Ноль эмоций!»
Ирина сообщает, что побочных реакций в ходе испытаний ученые пока не обнаружили, но они могут быть отсроченными. «Я считаю, что исследователь в первую очередь должен на себе все попробовать сам, и прошла два курса шаперонотерапии. Никаких побочных эффектов не было, наоборот, казалось, что проходят мелкие болячки и крылья вырастают за спиной».
«С другой стороны, все, что было в СМИ, - настоящее безобразие, - отмечает исследователь. - Но, как говорится, не было бы счастья, да несчастье помогло: уже сейчас в Институт особо чистых препаратов поступают звонки с предложениями помочь с клиническими испытаниями. Мы выступали на конференциях и в разных более скромных СМИ, говорили о том же самом, но выверяли слова, не говорили глупостей. И чего? - Ноль эмоций! А тут пронеслась такая вот муть по экранам, и пожалуйста! Такое интересное общество, такая интересная страна».
Впрочем, согласно источникам сайт, интервью, с которого все началось, Симбирцев дал вынужденно. предложили дать интервью, чтобы стимулировать интерес к проблемам Института и привлечь дополнительное финансирование на клинические испытания. Кроме того, ходят слухи о возможной утрате институтом юридического лица вследствие происходящих по всей стране слияний научных организаций. Видимо, ученый оказался не готов подробно и популярно рассказать газете о происходящем. «В этот раз все, что могло быть понято неправильно, было понято неправильно», - замечает источник.
В результате ситуация все больше становится похожа на небезызвестную басню, когда Роскосмос и госструктуры, раздающие гранты, рвутся в облака, ожидая немедленных результатов от фундаментальной науки, рак пятится назад, журналисты разливают структурированную воду… А российская наука в очередной раз оказывается в незавидном положении, вынужденная оправдываться за преступления, которых не совершала.
07 Июня 2010Как выглядит молекулярный термометр? Этот вопрос намного сложнее, чем может показаться на первый взгляд. Судя по всему, используемый клеткой «термометр», играющий одну из важнейших ролей в поддержании стабильности протеома клетки, представляет собой систему факторов транскрипции и специализированных белков – шаперонов, в т.ч. белков теплового шока, реагирующих не только на повышение температуры (это всего лишь первая из открытых функций этого класса белков), но и на другие повреждающие клетку физиологические воздействия.
Шапероны (chaperones) – класс белков, основная функция которых – восстановление правильной третичной структуры повреждённых белков, а также образование и диссоциация белковых комплексов.
Система шаперонов реагирует на возникающие в процессе жизнедеятельности клетки повреждения и обеспечивает правильное прохождение фолдинга – сворачивания аминокислотных цепочек, сходящих с рибосомальной «линии сборки», в трехмерные структуры. Несмотря на очевидность исключительной важности этой системы, долгое время никто из занимающихся ее изучением специалистов даже не предполагал, что этот молекулярный термометр одновременно является и своего рода «источником молодости» клетки, а его изучение предоставляет возможность взглянуть на ряд заболеваний с новой, неизвестной ранее стороны.
Белки, являющиеся основным продуктом функционирования генома, не только формируют структуру, но и обеспечивают работу всех клеток, тканей и органов. Отсутствие сбоев в процессах синтеза аминокислотных последовательностей; формирования, сборки и транспортировки белковых молекул, а также выведения поврежденных белков является важнейшим аспектом поддержания здоровья как отдельных клеток, так и всего организма. Белки также являются материалом, необходимым для формирования и эффективного функционирования «молекулярных машин», обеспечивающих процессы биосинтеза, – процесса, критичного для обеспечения долголетия организма. Причиной многих проблем являются нарушения фундаментального процесса фолдинга белков. Нарушения работы «ОТК», представленного белками теплового шока и шаперонами, приводят к появлению и накоплению ошибок. Эти ошибки нарушают работу молекулярных механизмов, что может приводить к развитию различных заболеваний. Возникновение таких ошибок в нейронах чревато поистине ужасными последствиями, проявляющимися развитием таких нейродегенеративных заболеваний, как рассеянный склероз, а также болезней Гентингтона, Паркинсона и Альцгеймера.
Открытая в 1962 году Феруччио Ритосса (Ferruccio Ritossa) реакция теплового шока описана как индуцированное повышением температуры изменение организации плотно упакованных хромосом в клетках слюнных желез мух-дрозофил, ведущее к образованию так называемых «вздутий». Такие вздутия, выглядящие под микроскопом как хлопковые шарики, зажатые между плотно упакованными участками хромосом, появляются также при воздействии динитрофенола, этанола и солей салициловой кислоты.
Оказалось, что вздутия хромосом являются новыми регионами транскрипции, начинающими синтез новых информационных РНК в течение нескольких минут после своего возникновения. Белковые продукты этого процесса в настоящее время широко известны как белки теплового шока, наиболее изученными из которых являются Hsp90 и Hsp70. Белки этого семейства регулируют сворачивание аминокислотных цепочек и предотвращают появление неправильно сформированных белковых молекул в клетках всех живых организмов.
В конце 1970-х и в начале 1980-х годов с помощью оригинального приема клеточной биохимии, позволяющего увеличить количество информационных РНК, кодирующих последовательности соответствующих белков, ученым удалось клонировать первые гены теплового шока мухи-дрозофилы. На тот момент специалисты придерживались мнения, что реакция теплового шока характерна исключительно для организма дрозофил. На этом этапе Ричард Моримото и сделал своей первый вклад в изучение белков теплового шока. Он собрал обширную коллекцию ДНК многоклеточных организмов и с помощью метода саузерн-блоттинга продемонстрировал, что все они содержат практически идентичные по структуре аналоги гена Hsp70. Примерно в то же время Джим Бардуэлл (Jim Bardwell) и Бетти Крейг (Betty Craig) из университета Висконсина в Мэдисоне идентифицировали в геноме кишечной палочки (Escherichia coli) ген dnaK, также являющийся аналогом Hsp70. Результатом дальнейшего детального изучения этого вопроса стало понимание того, что гены теплового шока в практически неизменившимся в ходе эволюции виде представлены в геномах представителей всех пяти царств живого мира.
Следующим достижением в цепи последовавших за этим событий стала идентификация семейства факторов транскрипции, управляющих запуском первого этапа реакции теплового шока. В этой работе приняло участие несколько исследовательских групп из разных университетов, в том числе и группа Моримото. Ученые продемонстрировали, что повышение температуры клетки вызывает изменение формы этих факторов транскрипции, что способствует их связыванию с промоторами генов теплового шока, инициирующими синтез белков теплового шока. Более того, оказалось, что в отличие от дрожжей, мух-дрозофил и нематод Caenorhabditis elegans, имеющих только один фактор транскрипции генов теплового шока, в клетках человека имеется целых три таких фактора. Такая сложная схема регуляции экспрессии исследуемых генов навела ученых на мысль об их многофункциональности, требующей дополнительного изучения.
Дальнейшие исследования показали, что белки теплового шока сами регулируют функционирование фактора транскрипции, инициирующего их продукцию в ядрах клеток. Очевидным стало также то, что белки теплового шока выполняют функции молекулярных шаперонов – управляют сворачиванием аминокислотных цепочек, обеспечивая формирование правильных пространственных конформаций белковых молекул, а также выявляют и устраняют сбои в этом процессе. Таким образом, оказалось, что клеточный термометр не только измеряет температуру, но и осуществляет мониторинг появления в клетке неправильно сформированных и поврежденных белков. Тепловой шок и другие стрессорные воздействия наполняют клетку аномальными белками, на что шапероны реагируют связыванием этих белков и высвобождением фактора транскрипции теплового шока-1 (Hsf1). Молекулы этого фактора самопроизвольно формируют тримеры (комплексы из трех молекул), связывающиеся с соответствующими регионами генома, в свою очередь запускающими синтез белков теплового шока. Следующее за этим повышение концентрации белков теплового шока до необходимого уровня по принципу обратной связи подавляет транскрипционную активность фактора транскрипции Hsf1.
Изучение функционирования белков теплового шока на линиях клеток сильно ограничивало возможности исследователей, так как не обеспечивало получения информации о сопровождающих его изменениях, происходящих во всем организме. Поэтому примерно в 1999 году Моримото и его коллеги решили перейти на новую модель – круглых червей C.elegans. Их особенно вдохновила опубликованная в 1994 году работа Макса Перутца (Max Perutz), установившего, что причиной серьезного нейродегенеративного заболевания – болезни Гентингтона – является особая мутация гена, получившего название гентингтин. Эта мутация приводит к синтезу варианта белка, содержащего дополнительный фрагмент из длинной цепочки аминокислоты глутамина, по всей видимости, нарушающий нормальный процесс фолдинга. Агрегация таких аномальных белковых молекул в нейронах и приводит к развитию болезни Гентингтона. Исследователи предположили, что изучение белков, формирование молекул которых нарушено из-за экспрессии полиглутамина или сходных причин, поможет разобраться в работе молекулярного термометра.
В процессе работы над созданием животных моделей экспрессии в нейронах и мышечных клетках белков, содержащих избыточные полиглутаминовые последовательности, исследователи установили, что степень агрегации и ассоциированной с ней токсичности таких белков пропорциональна их длине и возрасту организма. Это навело их на мысль, что подавление опосредуемого инсулином сигнального механизма, регулирующего продолжительность жизни организма, может повлиять на процесс агрегации полиглутаминсодержащих белков. Результаты дальнейших исследований подтвердили существование предполагаемой взаимосвязи, а также продемонстрировали, что влияние функционирования фактора транскрипции Hsf1 на продолжительность жизни организма опосредовано инсулинзависимым сигнальным механизмом. Эти наблюдения сделали очевидным тот факт, что реакция теплового шока одинаково важна как для выживания организма в условиях острого стресса, так и для постоянной нейтрализации токсичного действия белков, отрицательно сказывающегося на функционировании и продолжительности жизни клеток.
Использование живых организмов в качестве экспериментальной модели позволило ученым перевести исследования на качественно новый уровень. Они стали обращать внимание на механизмы, посредством которых организм воспринимает и интегрирует поступающую извне информацию на молекулярном уровне. Если стресс влияет на процесс старения, логично предположить, что белки теплового шока, регистрирующие появление и предотвращающие накопление в клетке поврежденных белков, вполне способны замедлять развитие эффектов старения.
То, что для многих заболеваний, ассоциированных с накоплением склонных к агрегации белков, характерны симптомы старения, а все болезни, в основе которых лежат нарушения формирования белковых молекул, ассоциированы со старением, наводит на мысль, что чувствительные к температуре метастабильные белки теряют свою функциональность по мере старения организма. И действительно, эксперименты на C.elegans показали, что функционирование механизма, запускаемого фактором транскрипции Hsf1, также как и других защитных систем клетки, начинает угасать практически сразу после достижения организмом зрелости. Однако оказалось, что активация фактора транскрипции Hsf1 на ранних этапах развития может препятствовать нарушению стабильности белковых молекул (протеостаза).
Возможно, это наблюдение, предполагающее весьма интригующие возможности, не распространяется на более сложные многоклеточные организмы, однако все живое состоит из белков, поэтому полученные в экспериментах на круглых червях результаты с большой степенью вероятности могут помочь ученым разобраться в механизмах старения человека.
Однако это еще не конец истории. Результаты работы, недавно проведенной под руководством профессора Моримото, указывают на существование механизмов корректировки протеостаза, не требующих непосредственного вмешательства в функционирование фактора транскрипции Hsf1. Исследователи решили провести классический генетический скрининг мутантов C.elegans, демонстрирующих нарушения процесса формирования белковых молекул в мышечных клетках. В результате они установили, что влияющая на этот процесс мутация находится в гене фактора транскрипции, контролирующего продукцию нейротрансмиттера гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК). ГАМК управляет функционированием нейротрансмиттеров возбуждения и регулирует мышечный тонус. Интересен тот факт, что любое нарушение стабильности работы опосредуемых ГАМК механизмов ведет к гиперстимуляции, заставляющей постсинаптические мышечные клетки реагировать на несуществующий стресс, что приводит к нарушению процессов формирования белковых молекул. Другими словами, оказалось, что активность нейронов может влиять на функционирование молекулярных термометров других клеток организма, что еще более усложнило вырисовывающуюся картину.
Если этот механизм распространяется и на человека, то, возможно, ученым удастся разработать метод воздействия на нейроны, приводящий к активации белков теплового шока в клетках скелетных мышц и способствующий устранению симптомов мышечной дистрофии и других заболеваний двигательных нейронов. Возможно, манипуляции над этим механизмов позволят контролировать и процесс накопления поврежденных белков, ассоциированный со старением. Однако, к сожалению, не все так просто, как хотелось бы. В организме C.elegans развитием реакции теплового шока во всех взрослых соматических клетках управляет одна пара нейронов. Судя по всему, активность этих нейронов и механизм обратной связи позволяют клеткам и тканям активировать белки теплового шока согласно их конкретным нуждам. Дело в том, что для различных тканей характерна разная активность биосинтеза белков, а также отличающиеся выраженность и характер внешних воздействий. Поэтому универсальный подход к управлению реакцией теплового шока в принципе невозможен.
Вооружившись результатами своей работы и многообещающими идеями, Моримото и несколько из его коллег основали компанию Proteostasis Therapeutics, целью работы которой является идентификация терапевтических малых молекул, способных корректировать патологические эффекты накопления неправильно сформированных белковых молекул. Этот подход связан с достаточно большой долей риска, так как уровень белков теплового шока повышается при многих злокачественных заболеваниях. Однако Моримото и его соратники считают, что разрабатываемое ими направление обладает слишком большим потенциалом, чтобы его игнорировать.
Об авторе
Профессор Ричард Моримото (Richard Morimoto), после защиты докторской диссертации полностью посвятил свою работу изучению функционирования белков теплового шока и их роли в старении организма. Первые шаги в выбранном им направлении Моримото сделал в Гарвардском университете под руководством доктора Мэтта Месельсона (Matt Meselson). В настоящее время Ричард Моримото является директором института биомедицинских исследований имени Райса, входящего в структуру Северо-Западного университета в Эванстоне, штат Иллинойс, а также одним из основателей компании Proteostasis Therapeutics (Кембридж, штат Массачусетс).
Евгения Рябцева
Портал «Вечная молодость» по материалам The Scientist: Richard Morimoto,
Структурно-функциональные изменения под действием высоких температур.
Высокотемпературное воздействие сказывается прежде всего на текучести мембран, в результате чего происходит увеличение их проницаемости и выделение из клетки водорастворимых веществ. Вследствие этого наблюдается дезорганизация многих функций клеток, в частности их деления. Так, если при температуре 20 °C все клетки проходят процесс митотического деления, при 38 °C - каждая седьмая, а при 42 °C - лишь каждая пятисотая клетка.
Повышенная текучесть мембранных липидов, обусловленная изменением состава и структуры мембраны при перегреве, приводит к потере активности мембранно-связанных ферментов и нарушению деятельности ЭТЦ. Из основных энергопродуцирующих процессов - фотосинтеза и дыхания, наиболее чувствительна ЭТЦ фотосинтеза, особенно фотосистема II (ФС II). Что касается ферментов фотосинтеза, то основной фермент С3-цикла фотосинтеза - РБФ-карбоксилаза - достаточно устойчив к перегреву.
Перегрев оказывает заметный эффект на водный режим растения, быстро и значительно повышая интенсивность транспирации. В результате у растения возникает водный дефицит. Сочетание засухи с жарой и высокой солнечной инсоляцией оказывает максимальное отрицательное влияние на посевы, нарушая, наряду с фотосинтезом, дыханием и водным режимом, поглощение элементов минерального питания.
Молекулярные аспекты повреждений при тепловом шоке. Жара повреждает в клетке прежде всего белки, особенно ферменты, нарушая процесс биосинтеза белков de novo, ингибируя активность ферментов, индуцируя деградацию существующих белков. В результате могут исчезать пулы ферментов, значимых для функционирования клеток как в период стресса, так и последующей репарации. Большинство ключевых ферментов растений термолабильны, включая РБФК, каталазу и СОД. Ингибирование РБФК представляет собой главную причину снижения ИФ при высокой температуре. Жара подавляет также способность превращать сахарозу в крахмал у ячменя, пшеницы и картофеля, указывая на то, что один или несколько ферментов в цепи превращения сильно ингибируются жарой. Непосредственное влияние жары на активность растворимой крахмалсинтазы в эндосперме пшеницы, как in vitro, так и in vivo вызывает подавление накопления крахмала.
Высокие температуры ингибировали активность каталазы у нескольких видов растений, в то время как активность других антиоксидантных ферментов не подавлялась. У ржи изменения активности каталазы были обратимыми и не оставляли видимых повреждений после прекращения жары, в то время как у огурца восстановление активности каталазы замедлялось (тормозилось) и сопровождалось обесцвечиванием хлорофилла, указывающим на более существенное окислительное повреждение. В проростках кукурузы, выращиваемой при повышенных температурах (35 °C), активность СОД была ниже, чем при относительно низких температурах (10 °C).
Жара нарушала целостность мембран, что приводило к повышенной их проницаемости для ионов и растворов. Одновременно нарушалась деятельность ассоциированных с мембранами ферментов фотосинтеза, дыхания и транспорта ассимилятов. Жара повышала степень насыщения жирных кислот мембранных фосфолипидов ЭПР. В условиях сильной жары его мембраны избирательно повреждались, вызывая деградацию мРНК (3-амилазы. Одновременно индуцированная жарой утечка веществ через мембраны влияет на редокс-потенциал основных клеточных компартментов, что, в свою очередь, нарушает ход метаболических процессов вплоть до гибели клеток.
Окислительный стресс был недавно признан одним из самых главных отрицательных факторов действия жары на растения. Жара вызывает дисбаланс между количеством поглощенной пигментами солнечной радиации и транспортом электронов через цитохромы - процесс, названный фотоингибированием. Избыточная энергия может перейти на кислород, что приводит к образованию АФК. Основными зонами окислительного повреждения в клетках являются митохондрии и хлоропласты, где происходит нарушение транспорта электронов. В хлоропластах высокотемпературный стресс вызывает фотоингибирование фотосинтеза и инактивацию каталазы, что приводит к накоплению АФК и обесцвечиванию хлорофилла. Фотосистема II признана самой чувствительной к действию жары, приводящей к дезинтеграции функциональных компонентов комплекса ФС II и, соответственно, нарушению транспорта электронов между ФС I и ФС II, увеличению потока электронов на молекулярный кислород и образованию АФК. В результате снижается ИФ, что представляет собой основную причину потери урожая при действии жары.
Белки теплового шока. Синтез белков теплового шока (БТШ) в ответ на увеличение температуры был обнаружен в 1974 г. Он характерен для всех типов живых организмов, включая высшие и низшие растения. БТШ у всех организмов представлен большим набором полипептидов, которые принято именовать в соответствии с молекулярной массой, выраженной в килодальтонах (кДа). Например, БТШ с молекулярной массой 70 кДа называют БТШ 70. О существенной роли БТШ в жизни клеток говорит высокая консервативность их эволюции. Так, отдельные участки в эволюции БТШ 70 сохраняют свыше 90% гомологии у бактерий и человека. БТШ растений представлены группой высокомолекулярных (110-60 кДа) и низкомолекулярных (35-15 кДа) белков. Отличительными чертами растений являются множественность низкомолекулярных БТШ и высокая интенсивность их синтеза при тепловом шоке (ТШ).
Синтез БТШ - стрессовая программа, включаемая тепловым шоком, происходит при подъеме температуры на 8-10 °C выше нормальной. Так, в листьях ячменя максимум синтеза БТШ достигается при 40 °C, а в листьях риса - при 45 °C. Переключение нормальной жизни клетки на стрессовую программу включает в себя репрограммирование генома, связанное с торможением экспрессии генов, активность которых характерна для жизни в нормальных условиях, и активацией генов ТШ. В клетках растений мРНК, кодирующие БТШ, обнаруживаются через 5 мин после начала стресса. Кроме того, происходит распад полисом, синтезирующих белки, типичные для нормальных условий, и формирование полисом, синтезирующих БТШ. Быстрое включение синтеза БТШ на уровне не только транскрипции (синтез РНК на ДНК), но и трансляции (синтез белка на мРНК) достигается в результате координации многих событий. Тепловой шок вызывает изменения в мРНК, синтезированных в клетке до шока, связанные с модификацией белковых факторов трансляции и рибосомных белков. Кроме того, мРНК БТШ имеют отличия от мРНК обычных белков. В результате ТШ происходит ослабление, а затем и прекращение синтеза обычных белков и переключение аппарата белкового синтеза на синтез БТШ, которые обнаруживаются в клетке уже через 15 мин после начала ТШ. Максимум синтеза наблюдается через 2-4 ч, затем идет его снижение.
Синтез различных БТШ происходит при разной температуре. В хлоропластах синтез высокомолекулярных БТШ активировался в диапазоне 34-42 °C, ослабевал при 44 °C и резко снижался при 46 °C. Индукция синтеза низкомолекулярных БТШ была особенно заметной при 40-42 °C. Существенное угнетение синтеза РБФК происходило только при температуре выше 44 °C. Почти все из обнаруженных БТШ хлоропластов кодируются в ядре, синтезируются в цитоплазме, а затем транспортируются в хлоропласт, где и выполняют защитную функцию во время ТШ. После окончания теплового шока синтез БТШ прекращается и возобновляется синтез белков, характерных для клетки в нормальных температурных условиях. При этом мРНК БТШ быстро разрушаются в клетках при нормальной температуре, тогда как сами белки могут сохраняться существенно дольше, обеспечивая, по-видимому, повышение устойчивости клеток к нагреванию. Длительное пребывание клеток в условиях ТШ обычно также приводит к ослаблению и прекращению синтеза БТШ. В этом случае включаются механизмы регуляции экспрессии генов БТШ по принципу обратной связи. Накопление в клетках БТШ снижает активность их генов. Возможно, таким путем клетка поддерживает количество БТШ на необходимом уровне, препятствуя их сверхпродукции.
Как правило, в ответ на повышение температуры синтезируются соответствующие белки, что способствует повышению термоустойчивости организма. Защитная роль БТШ описывается моделью молекулярного шаперона (в пер. с англ. - провожатый, наставник при молодой особе). В экстремальных условиях БТШ «опекают» функционирование конкретных макромолекул, клеточных структур, освобождают клетки от поврежденных компонентов, что позволяет поддерживать клеточный гомеостаз. Взаимодействие БТШ 70 с другими белками зависит от соотношения АТФ/АДФ. Считается, что БТШ 70 в комплексе с АДФ удерживает на себе расплетенный белок, а замена АДФ на АТФ приводит к освобождению этого белка из комплекса с БТШ 70.
В соответствии с этой моделью БТШ повышают термоустойчивость клеток, обеспечивая следующие процессы: энергозависимую стабилизацию нативной структуры белков; правильную сборку олигомерных структур в условиях гипертермии; транспорт веществ через мембраны органелл; дезагрегацию неправильно собранных макромолекулярных комплексов; освобождение клетки от денатурированных макромолекул и реутилизацию входивших в них мономеров с помощью убиквитинов. Убиквитины - низкомолекулярные белки теплового шока, присоединение которых к полипептиду делает его мишенью протеаз. Это своего рода «метка смерти» для белков. При их помощи происходит выбраковка и удаление поврежденных и недостроенных в результате действия ТШ белков.
В пользу защитной функции БТШ при ТШ свидетельствует целый ряд фактов. В частности, показано, что выключение синтеза белка специфическими ингибиторами во время ТШ, когда происходит синтез БТШ, приводит к гибели клеток. Клетки можно закаливать, повышая их термоустойчивость путем предварительного кратковременного воздействия повышенных температур. Условия такой закалки совпадают с условиями индукции синтеза БТШ. Интересно, что синтез БТШ у растений индуцирует не только ТШ, но и, например, соли кадмия и арсенит, обработка которыми повышает устойчивость клеток к нагреву. Важно также подчеркнуть, что изменения в структуре гена (мутации), нарушающие синтез БТШ, приводят к потере устойчивости клеток к нагреву. Дальнейшие исследования конкретной функции каждого БТШ при стрессе позволят выяснить молекулярные механизмы формирования и функционирования защитных свойств при ТШ.
Большинство белков ТШ имеют в клетках родственные белки, которые синтезируются при нормальной температуре постоянно или в определенные фазы онтогенеза. Оказывается, эти белки, в частности БТШ 70, присоединяются к другим белкам, вызывая их разворачивание и препятствуя их агрегации. Последнее может помешать белку приобрести нативную конформацию, необходимую для его функциональной активности. Разворачивание белков с помощью БТШ необходимо для их проникновения через мембрану хлоропластов, митохондрий и ЭПР. Поскольку агрегация белков при повышении температуры резко усиливается, активация синтеза БТШ 70 в этих условиях должна защищать белки от необратимого повреждения. БТШ присутствуют во всех компартмен-тах клетки, в частности ядре и ядрышках, где они накапливаются при ТШ. БТШ 70 способствует прохождению синтезируемых в цитоплазме предшественников хлоропластных и митохондриальных белков через мембрану, играя роль в биогенезе этих органелл. БТШ 60, тоже относящиеся к шаперонам, называют также шаперонинами. Эти белки обеспечивают правильную сборку четвертичной структуры клеточных белков, например ключевого фермента фотосинтеза РБФК, состоящего из восьми больших и восьми малых субъединиц. К группе шаперонов относят также БТШ 90, играющий важную роль в образовании комплекса стероидных гормонов с их рецепторами. Кроме того, БТШ 90 образует комплексы с некоторыми протеинкиназами, контролируя их активность. Как известно, протеинкиназы фосфорилируют самые разные клеточные белки, регулируя их активность.
У растений найдено более 30 низкомолекулярных (15-35 кДа) БТШ, локализованных главным образом в цитоплазматических гранулах теплового шока, появляющихся во время ТШ и исчезающих после него. Их основная функция - защищать «дошоковые» мРНК, что позволяет использовать последние для синтеза белка после окончания шока. Низкомолекулярные БТШ обнаруживаются и в других компартментах, в частности в хлоропластах. Считается, что они защищают от ТШ тилакоидные мембраны, где локализованы процессы световой фазы фотосинтеза.
У некоторых растений обнаружен конститутивный (неиндуцированный) синтез БТШ при формировании, в частности, пыльцы. Возможно, что дошоковые БТШ обеспечивают ее термостабильность при ТШ. Кроме БТШ, жара индуцирует экспрессию белков других классов, в частности кальмодулина.
Метаболизм в условиях теплового шока. Целенаправленных исследований метаболизма растений при действии ТШ крайне мало, причем в этих опытах зачастую одновременно действовали как ТШ, так и засуха. Это очень важный момент, поскольку реакция растений на сочетание засухи и ТШ иная, чем реакция на отдельные стрессоры. Так, при сочетании стрессов растения накапливали несколько растворимых сахаров, в том числе сахарозу, мальтозу, трекаллозу, фруктозу и глюкозу. При действии засухи накапливается пролин, а при действии ТШ, а также сочетания ТШ и засухи пролин в растениях не накапливался. В условиях ТШ пролин или его интермедиат (пирролин-5-карбоксилат) токсичны, поэтому пролин не подходит в качестве совместимого осмолита. При одновременном действии ТШ и засухи резко возрастает содержание глутамина. Видимо, при ингибировании биосинтеза пролина, глутамат трансформируется в глутамин. Одновременно активируются гены, кодирующие расщепление крахмала и биосинтез липидов, а также повышается экспрессия генов, кодирующих гексокиназу, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу, фруктокиназу и сахарозо-УДФ-глюкозилтрансферазу. Именно изменения в экспрессии генов на уровне транскрипции представляют главный фактор перепрограммирования углеводного метаболизма.
При действии ТШ на проростки арабидопсиса установлено синхронное повышение размера пулов целого ряда аминокислот и амидов (аспарагина, лейцина, изолейцина, треонина, аланина и валина), получаемых из ЩУК и ПВК. Кроме того, увеличилось содержание углеводов: мальтозы, сахарозы, галактинола, миоинозитола, раффинозы и моносахаридов, предшественников клеточной стенки. Уже через 6 ч увеличивались концентрации b-аланина, глицерина, мальтозы, сахарозы, трекаллозы.
Фотосинтез, транспирация и дыхание. Показателем, тесно связанным с регуляцией CO2- и Н2O-обмена растений, является устьичная проводимость. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что высокие температуры индуцируют закрывание устьиц, которое можно рассматривать как косвенную реакцию на температурную зависимость дефицита давления водяных паров и дыхания листьев. Так, частичное закрывание устьиц является следствием повышения внутриклеточной концентрации CO2. Однако искомое закрывание устьиц не приводит к снижению фотосинтеза, поскольку температурные зависимости устьичной проводимости и ИФ не совпадают. Так, устьичная проводимость повышается при таких температурах, когда фотосинтез необратимо ингибируется.
Хотя устьичная проводимость, видимо, прямо не влияет на ИФ, она помогает регулировать транспирацию, которая благодаря контролю за температурой листа воздействует на жароустойчивость процесса фотосинтеза. В посевах некоторых культур при достаточном влагообеспечении температура воздуха благодаря терморегуляции может быть почти на 8 °C ниже температуры воздуха над посевом. Вместе с тем при дефиците влаги в почве может наблюдаться обратная картина - температура листьев в посеве превышает температуру окружающего воздуха почти на 15 °C, что усиливает негативное воздействие водного дефицита на ИФ.
Интенсивность нетто-фотосинтеза пшеницы и большинства С3-культур достаточно стабильна в диапазоне 15-30 °C. Ниже и выше данного температурного диапазона ИФ снижается на 5-10% на каждый градус (рис. 3.1). Относительно незначительное изменение нетто-фотосинтеза в диапазоне 15-30 °C не должно скрывать тот факт, что гросс-фотосинтез с повышением температуры в действительности повышается. Однако из-за одновременного повышения ИД всего растения и особенно фотодыхания интенсивность нетто-фотосинтеза изменяется мало.
Между C3- и С4-культурами в этом отношении существуют заметные различия, причем оптимальная интенсивность нетто-фотосинтеза у С4-видов наблюдается при более высоких температурах (30-40 °C). Фотодыхание у них незначительное, в результате чего повышение фиксации CO2 с увеличением температуры не маскируется фотодыхательными затратами. Действительно, более высокий температурный оптимум нетто-фотосинтеза у С4-видов в сравнении с С3-видами объясняется меньшими дыхательными затратами при повышенных температурах у первых. Необратимые изменения фотосинтетического аппарата у них отмечаются лишь при превышении температуры 40 °C главным образом из-за повреждения ФС II, наступающего в течение нескольких минут после начала действия ТШ, что оказывает решающее влияние на урожайность.