61. Imunofluorescences reakcija. Mehānisms, sastāvdaļas, pielietojums. Tiešās un netiešās iestatīšanas metodes.
Ir trīs galvenie metodes veidi: tiešā, netiešā (13.10. att.), ar komplementu. Kūnsa reakcija ir ātra diagnostikas metode mikrobu antigēnu identificēšanai vai antivielu noteikšanai.
Tiešā RIF metode ir balstīts uz faktu, ka audu antigēni vai mikrobi, kas apstrādāti ar imūnserumu ar antivielām, kas iezīmētas ar fluorohromiem, spēj mirdzēt fluorescējošā mikroskopa UV staros. zaļās apmales forma.
Netiešā RIF metode sastāv no antigēna-antivielu kompleksa identificēšanas, izmantojot antiglobulīna (anti-antivielu) serumu, kas marķēts ar fluorohromu. Lai to izdarītu, uztriepes no mikrobu suspensijas apstrādā ar antivielām no pretmikrobu trušu diagnostikas seruma. Pēc tam tiek mazgātas antivielas, kuras nesaista mikrobu antigēni, un, apstrādājot uztriepi ar antiglobulīna (anti-truša) serumu, kas marķēts ar fluorohromiem, nosaka uz mikrobiem palikušās antivielas. Rezultātā veidojas mikrobu + pretmikrobu trušu antivielu + prettrušu antivielu komplekss, kas marķēts ar fluorohromu. Šis komplekss tiek novērots fluorescējošā mikroskopā, tāpat kā tiešajā metodē.
Kā etiķetes tiek izmantotas gaismas fluorohroma krāsvielas (fluoresceīna izotiocianāts utt.).
Ir dažādas RIF modifikācijas. Infekcijas slimību ekspresdiagnostikai Koons RIF izmanto mikrobu vai to antigēnu identificēšanai testa materiālā.
Saskaņā ar Kūnsu ir divas RIF metodes: tiešā un netiešā.
Tiešie RIF komponenti:
1) izmeklējamais materiāls (izkārnījumi, kas izvadīti no nazofarneksa utt.);
2) iezīmēts specifisks imūnserums, kas satur AT-la vēlamajam antigēnam;
3) izotonisks nātrija hlorīda šķīdums.
Testējamā materiāla uztriepi apstrādā ar marķētu antiserumu.
Notiek AG-AT reakcija. Luminiscences mikroskopiskās izmeklēšanas laikā fluorescence tiek noteikta apgabalā, kurā atrodas AG-AT kompleksi.
Netiešā RIF sastāvdaļas:
1) pētāmais materiāls;
2) specifisks antiserums;
3) antiglobulīna serums (AT-la pret imūnglobulīnu), marķēts ar fluorihromu;
4) Izotoniskais nātrija hlorīda šķīdums.
Testējamā materiāla uztriepi vispirms apstrādā ar imūnserumu līdz vajadzīgajam antigēnam un pēc tam ar marķētu antiglobulīna serumu.
Luminiscējošie AG-AT kompleksi - iezīmētie AT tiek noteikti, izmantojot fluorescējošu mikroskopu.
Netiešās metodes priekšrocība ir tāda, ka nav nepieciešams sagatavot plašu fluorescējošu specifisku serumu klāstu, bet tiek izmantots tikai viens fluorescējošs antiglobulīna serums.
Ir arī 4 komponentu netiešais RIF veids, kad papildus tiek ievadīts komplements (jūrascūciņas serums). Pozitīvā reakcijā veidojas AG-AT – marķētā – AT-komplementa komplekss.
Pašlaik plaši tiek izmantotas seroloģiskās reakcijas (SR), kurās tiek iesaistīti marķēti antigēni vai antivielas. Tie ietver imunofluorescences reakciju, radioimūnās un enzīmu imūnanalīzes metodes, imūnblotēšanas reakciju, plūsmas citometriju un elektronu mikroskopiju.
Tie attiecas:
1) infekcijas slimību serodiagnostikai, t.i., lai noteiktu antivielas, izmantojot zināmu konjugētu (ķīmiski kombinētu) antigēnu komplektu ar dažādām iezīmēm (fermentiem, fluorohroma krāsvielām);
2) noteikt mikroorganismu vai tā serovaru, izmantojot standarta iezīmētās diagnostiskās antivielas (ātrā diagnostika).
Diagnostikas serumus sagatavo, imunizējot dzīvniekus ar atbilstošu antigēnu, pēc tam imūnglobulīnus izolē un konjugē ar gaismas krāsvielām (fluorohromiem), fermentiem un radioizotopiem.
Diagnostiskās monoklonālās antivielas tiek ražotas, izmantojot hibrīda šūnas, kas veidojas, sapludinot imūno B limfocītu ar mielomas šūnu. Hibridomas spēj ātri vairoties in vitro šūnu kultūrā un ražot uzņemtajam B-limfocītam raksturīgu imūnglobulīnu.
Marķētie SR pēc specifikas nav zemāki par citiem SR, un to jutīguma ziņā tie ir pārāki par visiem SR.
Imunofluorescences reakcija (RIF)
Kā etiķetes tiek izmantotas gaismas fluorohroma krāsvielas (fluoresceīna izotiocianāts utt.).
Ir dažādas RIF modifikācijas. Infekcijas slimību ekspresdiagnostikai Koons RIF izmanto mikrobu vai to antigēnu identificēšanai pētāmajā materiālā.
Saskaņā ar Kūnsu ir divas RIF metodes: tiešā un netiešā.
Tiešie RIF komponenti:
1) testa materiāls (izkārnījumi, izdalījumi no nazofaringijas u.c.);
2) iezīmēts specifisks imūnserums, kas satur antivielas pret vēlamo antigēnu;
3) izotonisks nātrija hlorīda šķīdums.
Testējamā materiāla uztriepi apstrādā ar marķētu antiserumu.
Notiek AG-AT reakcija. Luminiscences mikroskopiskās izmeklēšanas laikā tiek konstatēta marķējuma fluorescence zonā, kur lokalizēti AG-AT kompleksi (34. att.).
Sastāvdaļas netiešais RIF, kas paredzēts ātrai A gripas diagnostikai:
1) pacientam ar aizdomām par gripu no nazofarneksa tiek izskalots testa materiāls;
2) specifisks antiserums ar antivielām pret A gripas vīrusu;
3) antiglobulīna serums (AT pret imūnglobulīnu), marķēts ar fluorohromu;
4) izotonisks nātrija hlorīda šķīdums.
Testējamā materiāla uztriepi vispirms apstrādā ar imūnserumu līdz vajadzīgajam antigēnam un pēc tam ar marķētu antiglobulīna serumu.
Ar fluorescējošu mikroskopu nosaka imūnkompleksus AG-AT – iezīmētos AT.
Netiešās metodes priekšrocība ir tāda, ka nav nepieciešams sagatavot plašu fluorescējošu specifisku serumu klāstu, bet tiek izmantots tikai viens fluorescējošs antiglobulīna serums.
Priekš A gripas seroloģiskā diagnoze, tas ir, lai noteiktu antivielas pret A gripas vīrusu asins serumā, izmantojot netiešais RIF lietot gripas diagnostikas līdzekli (A gripas vīrusa antigēnu). Vīrusu infekciju serodiagnozei galvenokārt ir retrospektīvs raksturs, un to izmanto, lai apstiprinātu diagnozi un epidemioloģisko analīzi.
Ar enzīmu saistītais imūnsorbcijas tests (ELISA): konkurējošā metode (B hepatīta vīrusa HBs-AG noteikšana) un netiešā metode (HIV infekcijas seroloģiskā diagnostika)
Ar enzīmu saistīts imūnsorbcijas tests (ELISA)
Kā etiķetes tiek izmantoti enzīmi: peroksidāze, sārmaina fosfatāze utt.
Reakcijas indikators ir enzīmu spēja izraisīt krāsu reakcijas, iedarbojoties uz atbilstošo substrātu. Piemēram, peroksidāzes substrāts ir ortofenildiamīna (OPD) vai tetrametilbenzidīna (TMB) šķīdums.
Visplašāk izmantotās ir cietfāzes ELISA (35. att.), netiešās un konkurējošās metodes (36. att.).
ELISA rezultātus var novērtēt vizuāli un mērot optisko blīvumu ar spektrofotometru (ELISA analizatoru).
ELISA priekšrocības ietver:
Reakcijas novērtēšanas metožu vienkāršība;
Konjugātu stabilitāte;
Viegli pielāgojams automatizācijai.
Kā piemēri ir sniegti šādi ELISA veidi:
A) konkurētspējīgs veids
Paredzēts B hepatīta vīrusa virsmas antigēna (HBs Ag) noteikšanai serumā un asins plazmā vīrushepatīta B diagnostikai un HBs Ag pārnēsāšanas noteikšanai.
Sastāvdaļas:
1) testa materiāls – serums vai asins plazma;
2) antivielas pret HBs Ag, adsorbētas uz polistirola mikroplates iedobes virsmas;
3) konjugāts – peles monoklonālās antivielas pret HBs Ag, marķētas ar peroksidāzi;
4) ortofenilēndiamīns (OPD) – substrāts;
5) fosfāta-fizioloģiskā šķīduma buferšķīdums;
6) kontroles serumi:
Pozitīvs (serums ar HBs Ag);
Negatīvs (serums bez HBs Ag).
Progress:
2. Inkubācija 1 stundu 37°C.
3. Caurumu mazgāšana.
4. Konjugāta pievienošana.
5. Inkubācija 1 stundu 37°C temperatūrā.
6. Caurumu mazgāšana.
7. Ievadīšana OFD. HBs Ag klātbūtnē šķīdums iedobēs kļūst dzeltens.
8. ELISA skaitīšanu veic pēc optiskā blīvuma, izmantojot fotometru. Optiskā blīvuma pakāpe būs apgriezti proporcionāla pētāmo Ag HB koncentrācijai.
Reakcija notiek trīs fāzēs:
1. Testējamā seruma (plazmas) HBs Ag saistās ar homologām antivielām, kas adsorbētas uz iedobes virsmas. Izveidojas IR AG-AT. (HBs Ag – anti HBs AT).
2. Antivielas pret HBs Ag, kas iezīmētas ar peroksidāzi, saistās ar atlikušajiem brīvajiem HBs Ag determinantiem AG-AT kompleksā. Veidojas komplekss ar AT-AG iezīmētu AT (anti HBs AT - HBs Ag - anti HBs AT iezīmēts ar peroksidāzi).
3. OPD mijiedarbojas ar AT-AG-AT kompleksa peroksidāzi un rodas dzeltena krāsa.
B) netiešais veids
Tā ir galvenā testa reakcija HIV infekcijas diagnosticēšanai.
Mērķis: HIV infekcijas seroloģiskā diagnostika – antivielu noteikšana pret HIV antigēniem.
Sastāvdaļas:
1) testa materiāls – asins serums (AT līdz HIV Ags);
2) sintētiskie peptīdi, kas imitē 2 HIV antigēnus: gp 120 un gp 41, adsorbēti uz polistirola iedobes virsmas;
3) ar peroksidāzi marķēts antiglobulīna serums, kas iegūts, imunizējot trušus ar cilvēka globulīniem (AT uz AT);
5) fosfātu buferšķīdums;
6) kontroles serumi:
Pozitīvs;
Negatīvs.
Progress:
1. Kontroles un testa seruma pievienošana.
2. Inkubācija 30 minūtes 37°C temperatūrā.
3. Atmazgāšana.
4. Ar fermentu marķēta antiglobulīna seruma pievienošana.
5. Inkubācija 30 minūtes 37°C temperatūrā.
6. Atmazgāšana.
7. Ievadīšana OFD.
Reakcija notiek 3 fāzēs:
1. Testa seruma antivielas pret HIV saistās ar homologiem antigēniem (gp 120 un gp 41), un uz sorbenta virsmas veidojas IR AG-AT (HIV Ag - AT pret HIV).
2. IR AG-AT-AT veidošanās, marķēta ar peroksidāzi, jo Testa seruma antivielas ir antigēni antiglobulīna serumam.
3. OPD mijiedarbojas ar AG-AT-AT kompleksa peroksidāzi, un iedobes šķīdums iekrāsojas dzeltenā krāsā. Fermentatīvās aktivitātes pakāpe ir tieši proporcionāla pārbaudīto antivielu koncentrācijai.
Imunofluorescences metode (RIF, imunofluorescences reakcija, Kūna reakcija) ir metode specifisku Ag noteikšanai, izmantojot ar fluorohromu konjugētu Abs. Tam ir augsta jutība un specifiskums.
To izmanto infekcijas slimību ekspresdiagnostikai (patogēna identifikācijai testa materiālā), kā arī Ab un virsmas receptoru un leikocītu marķieru noteikšanai (imūnfenotipēšanai) un citām šūnām.
Diagnostikas praksē plaši tiek izmantota baktēriju un vīrusu antigēnu noteikšana infekcijas materiālos, dzīvnieku audos un šūnu kultūrās, izmantojot fluorescējošas antivielas (serumus). Fluorescējošo serumu sagatavošana balstās uz noteiktu fluorohromu (piemēram, fluoresceīna izotiocianāta) spēju izveidot ķīmisku saiti ar seruma proteīniem, nepārkāpjot to imunoloģisko specifiku.
Ir trīs veidu metodes: tieša, netieša, ar komplementu. Tiešā RIF metode ir balstīta uz to, ka audu antigēni vai mikrobi, kas apstrādāti ar imūnserumu ar antivielām, kas iezīmētas ar fluorohromiem, spēj mirdzēt fluorescējošā mikroskopa UV staros. Baktērijas uztriepē, kas apstrādātas ar šādu luminiscējošu serumu, mirdz gar šūnas perifēriju zaļas apmales veidā.
Netiešā RIF metode ietver antigēna-antivielu kompleksa noteikšanu, izmantojot antiglobulīna (anti-antivielu) serumu, kas marķēts ar fluorohromu. Lai to izdarītu, uztriepes no mikrobu suspensijas apstrādā ar antivielām no pretmikrobu trušu diagnostikas seruma. Pēc tam tiek mazgātas antivielas, kuras nesaista mikrobu antigēni, un, apstrādājot uztriepi ar antiglobulīna (anti-truša) serumu, kas marķēts ar fluorohromiem, nosaka uz mikrobiem palikušās antivielas. Rezultātā veidojas mikrobu + pretmikrobu trušu antivielu + anti-trušu antivielu komplekss, kas marķēts ar fluorohromu. Šis komplekss tiek novērots fluorescējošā mikroskopā, tāpat kā tiešajā metodē.
Mehānisms. Testējamā materiāla uztriepi sagatavo uz stikla priekšmetstikliņa, fiksē uz liesmas un apstrādā ar imūno truša serumu, kas satur antivielas pret patogēnu antigēniem. Lai izveidotu antigēna-antivielu kompleksu, preparātu ievieto mitrā kamerā un 15 minūtes inkubē 37 °C temperatūrā, pēc tam to rūpīgi nomazgā ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu, lai atdalītu antivielas, kas nav saistījušās ar antigēnu. Pēc tam preparātam tiek uzklāts fluorescējošs antiglobulīna serums pret trušu globulīniem, inkubēts 15 minūtes 37 °C temperatūrā un pēc tam preparātu rūpīgi nomazgā ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu. Fluorescējošā antiglobulīna seruma saistīšanās rezultātā ar specifiskām antivielām, kas fiksētas uz antigēna, veidojas gaismas antigēna-antivielu kompleksi, kurus nosaka ar fluorescējošu mikroskopiju.
4. Bērnistabas bērnu guļamistabā gaisā konstatēti 75 mt/m3 streptokoku, 12 mt/m3 stafilokoku un 1 mt/m3 tuberkulozes baktēriju. Sniedziet gaisa sanitāro un bakterioloģisko novērtējumu un izklāstiet tā sanitārijas plānu.
PĀRBAUDE BIĻETE Nr._54
Retrovīrusi. HIV infekcija (AIDS) un tās patogēni.
Cilvēka imūndeficīta vīruss izraisa HIV infekciju, kā rezultātā attīstās iegūtais imūndeficīta sindroms.
HIV infekcijas izraisītājs ir limfotrops vīruss, kas pieder Retroviridae dzimtai, Lentivirus ģints.
Morfoloģiskās īpašības: RNS saturošs vīruss. Vīrusa daļiņai ir sfēriska forma. Apvalks sastāv no dubultā lipīdu slāņa, kurā iekļūst glikoproteīni. Lipīdu apvalks rodas no saimniekšūnas plazmas membrānas, kurā vīruss vairojas. Glikoproteīna molekula sastāv no 2 apakšvienībām, kas atrodas uz viriona virsmas un iekļūst tā lipīdu apvalkā.
Vīrusa kodols ir konusa formas un sastāv no kapsīdu proteīniem, vairākiem matricas proteīniem un proteāzes proteīniem. Genoms veido divas RNS virknes, lai veiktu reprodukcijas procesu, HIV ir reversā transkriptāze vai reversetāze.
Vīrusa genoms sastāv no 3 galvenajiem strukturālajiem gēniem un 7 regulējošiem un funkcionāliem gēniem. Funkcionālie gēni veic regulējošās funkcijas un nodrošina reprodukcijas procesu īstenošanu un vīrusa līdzdalību infekcijas procesā.
Vīruss galvenokārt skar T- un B-limfocītus, dažas monocītu šūnas (makrofāgus, leikocītus) un nervu sistēmas šūnas.
Kultūras īpašības: uz cilvēka T-limfocītu un monocītu kultūru (IL-2 klātbūtnē).
Antigēna struktūra: 2 vīrusa tipi - HIV-1 un HIV-2 HIV-1 ir vairāk nekā 10 genotipi (apakštipi): A, B, C, D, E, F..., atšķiras ar olbaltumvielu aminoskābju sastāvu. .
HIV-1 iedala 3 grupās: M, N, O. Lielākā daļa izolātu pieder M grupai, kurā izšķir 10 apakštipus: A, B, C, D, F-l, F-2, G, H, I, K. Izturība: jutīga pret fizikāliem un ķīmiskiem faktoriem, karsējot mirst. Vīruss var izdzīvot ilgu laiku izžuvušajā stāvoklī, izžuvušajās asinīs.
Patogenitātes faktori, patoģenēze: vīruss pievienojas limfocītam, iekļūst šūnā un vairojas limfocītā. HIV vairošanās rezultātā limfocītos pēdējie tiek iznīcināti vai zaudē funkcionālās īpašības. Vīrusam, vairojoties dažādās šūnās, tas uzkrājas orgānos un audos, un tas ir atrodams asinīs, limfā, siekalās, urīnā, sviedros un izkārnījumos.
Ar HIV infekciju samazinās T-4 limfocītu skaits, tiek traucēta B limfocītu funkcija, tiek nomākta dabisko killer šūnu darbība un samazināta reakcija uz antigēniem, kā arī komplementa, limfokīnu un citu imūnfunkcijas regulējošu faktoru ražošana. (IL) tiek traucēta, kā rezultātā rodas imūnsistēmas disfunkcijas.
Klīnika: tiek ietekmēta elpošanas sistēma (pneimonija, bronhīts); Centrālā nervu sistēma (abscesi, meningīts); Notiek kuņģa-zarnu trakta (caureja), ļaundabīgi audzēji (iekšējo orgānu audzēji).
HIV infekcija notiek vairākos posmos: 1) inkubācijas periods, kas vidēji ir 2-4 nedēļas; 2) primāro izpausmju stadija, ko sākotnēji raksturo akūts drudzis un caureja; stadija beidzas ar asimptomātisku fāzi un vīrusa noturību, pašsajūtas atjaunošanos, bet HIV antivielas tiek konstatētas asinīs, 3) sekundāro slimību stadija, kas izpaužas ar elpošanas un nervu sistēmas bojājumiem. HIV infekcija beidzas ar pēdējo, 4. terminālo stadiju – AIDS.
Mikrobioloģiskā diagnostika.
Virusoloģiskie un seroloģiskie pētījumi ietver HIV antigēnu un antivielu noteikšanas metodes. Šim nolūkam izmanto ELISA, IB un PCR. Serumi no pacientiem ar HIV-1 un HIV-2 satur antivielas pret visiem vīrusu proteīniem. Taču, lai apstiprinātu diagnozi, HIV-1 tiek noteiktas antivielas pret proteīniem gp41, gpl20, gpl60, p24 un HIV-2 antivielas pret proteīniem gp36, gpl05, gpl40. HIV antivielas parādās 2-4 nedēļas pēc inficēšanās un tiek konstatētas visos HIV posmos.
Metode vīrusa noteikšanai asinīs un limfocītos. Tomēr ar jebkuru pozitīvu testu, lai apstiprinātu rezultātus, tiek veikta IB reakcija. Tiek izmantota arī PCR, kas var noteikt HIV infekciju inkubācijas periodā un agrīnā klīniskajā periodā, taču tā jutība ir nedaudz zemāka nekā ELISA.
Klīniskās un seroloģiskās diagnozes apstiprina imunoloģiskie pētījumi, ja tie liecina par imūndeficīta klātbūtni izmeklējamajā pacientā.
Diagnostiskā ar enzīmu saistītā imūnsorbcijas testa sistēma HIV antivielu noteikšanai – ietver vīrusa antigēnu, kas adsorbēts uz nesēja, anti-cilvēka Ig antivielas. Lieto AIDS serodiagnostikai.
Ārstēšana: reversās transkriptāzes inhibitoru lietošana, kas darbojas aktivētās šūnās. Zāles ir timidīna atvasinājumi - azidotimidīns un fosfazīds.
Profilakse. Konkrēts - nē.
Fizikālo un ķīmisko faktoru ietekme uz mikrobiem. Mutācija un to nozīme praktiskajā medicīnā. Piemēri. Ekoloģijas nozīme.
Ķīmisko un bioloģisko faktoru darbība.
Ķīmisko vielu darbība
Ķīmiskās vielas var kavēt vai pilnībā nomākt mikroorganismu augšanu. Ja ķīmiska viela kavē baktēriju augšanu, bet pēc izņemšanas to augšana atsāk.
Pretmikrobu vielas, ņemot vērā to ķīmisko struktūru un baktericīdās iedarbības mehānismu pret baktērijām, var iedalīt šādās grupās: oksidētāji, halogēni, metālu savienojumi, skābes un sārmi, virsmaktīvās vielas, spirti, krāsvielas, fenola un formaldehīda atvasinājumi.
Oksidētāji. Šajā grupā ietilpst ūdeņraža peroksīds un kālija permanganāts.
Halogēni. Hlors, jods un to preparāti: balinātājs, hloramīns B, pantocīds, joda 5% spirta šķīdums, jodinols, jodoforms.
Smago metālu savienojumi (svina, vara, cinka, sudraba, dzīvsudraba sāļi; sudraba metālorganiskie savienojumi: protargols, kolargols). Šie savienojumi spēj radīt gan pretmikrobu, gan dažādu lokālu iedarbību uz makroorganisma audiem.
Skābes un sārmi. Skābju un sārmu baktericīda darbība balstās uz mikroorganismu dehidratāciju, barības vides pH izmaiņām, koloidālo sistēmu hidrolīzi un skābu vai sārmainu albuminātu veidošanos.
Krāsvielām piemīt īpašības, kas kavē baktēriju augšanu. Viņi darbojas lēni, bet selektīvāk.
Formaldehīds ir bezkrāsaina gāze. Praksē tiek izmantots 40% formaldehīda (formalīna) ūdens šķīdums. Gāzveida un ūdenī izšķīdušais formaldehīds kaitīgi ietekmē baktēriju veģetatīvās un sporu formas.
Bioloģisko faktoru darbība
Bioloģisko faktoru darbība izpaužas galvenokārt mikrobu antagonismā, kad dažu mikrobu atkritumi izraisa citu nāvi.
Antibiotikas (no grieķu valodas anti - pret, bios - dzīvība) ir bioloģiski aktīvas vielas, kas veidojas sēnīšu, baktēriju, dzīvnieku, augu dzīvībai svarīgās aktivitātes laikā un radušās sintētiski, spēj selektīvi nomākt un nogalināt mikroorganismus, sēnītes, riketsijas, lielos vīrusus, vienšūņus. un atsevišķi helminti.
3. Baktēriju enzīmu bioloģiskās aktivitātes reakcija reimatisma gadījumā, diagnostiskā un praktiskā nozīme, antivielu pret enzīmiem aizsargājošā loma iegūtajā imunitātē (antihialuronidāzes un anti-O-streptolizīna noteikšana).
Reimatisms ir vispārēja infekciozi alerģiska rakstura slimība, kas skar saistaudus, galvenokārt sirds un asinsvadu sistēmu, kā arī locītavas, iekšējos orgānus, centrālo nervu sistēmu. Tiek uzskatīts, ka reimatisma attīstības cēlonis ir patogēno mikroorganismu, galvenokārt beta-hemolītiskā streptokoka A grupas, aktivizēšanās. Tam ir liela nozīme reimatisko slimību etioloģijā un patoģenēzē. Pirmkārt, slimība attīstās uz streptokoku infekcijas fona. Otrkārt, pacientu asinīs tiek konstatēts liels skaits antivielu pret šīs grupas mikroorganismiem. Treškārt, slimību profilakse tiek veiksmīgi veikta ar antibakteriālām zālēm.
Reimatoīdā artrīta gadījumā sinoviālās membrānas nezināmu iemeslu dēļ izdala lielu daudzumu enzīma glikozes-6-fosfāta dehidrogenāzes, kas arī sadala disulfīda saites šūnu membrānā. Šajā gadījumā notiek proteolītisko enzīmu “noplūde” no šūnu lizosomām, kas izraisa blakus esošo kaulu un skrimšļu bojājumus. Ķermenis reaģē uz to, ražojot citokīnus, kas ietver arī audzēja nekrozes faktoru α TNF-α. Reakciju kaskādes šūnās, ko izraisa citokīni, vēl vairāk pasliktina slimības simptomus. Hronisks reimatoīdais iekaisums, kas saistīts ar TNF-α, ļoti bieži izraisa skrimšļa un locītavu bojājumus, izraisot fizisku invaliditāti.
Šī metode izmanto luminiscences fenomenu.
Luminiscences fenomena būtība ir tāda, ka tad, kad noteiktu vielu molekulas absorbē dažāda veida enerģiju (gaismu, elektrisko utt.), to atomi nonāk ierosinātā stāvoklī un pēc tam, atgriežoties sākotnējā stāvoklī, atbrīvo absorbētā enerģija gaismas starojuma veidā.
RIF luminiscence parādās fluorescences formā - tas ir mirdzums, kas rodas apstarošanas brīdī ar aizraujošu gaismu un apstājas tūlīt pēc tā pabeigšanas.
Daudzām vielām un dzīviem mikroorganismiem ir sava fluorescence (tā sauktā primārā), taču tās intensitāte ir ļoti zema. Vielas, kurām ir intensīva primārā fluorescence un ko izmanto, lai piešķirtu fluorescējošas īpašības nefluorescējošām vielām, sauc par fluorohromiem. Šo inducēto fluorescenci sauc par sekundāro.
Lai ierosinātu fluorescenci luminiscences mikroskopijas laikā, visbiežāk tiek izmantota ultravioletā vai zili violetā spektra daļa (viļņa garums 300-460 nm). Šiem nolūkiem laboratorijās ir dažādu modeļu fluorescējošie mikroskopi - ML-1-ML-4, "Lumam".
Viroloģiskajā praksē tiek izmantotas divas galvenās fluorescējošās mikroskopijas metodes: fluorohromizācija un fluorescējošās antivielas (vai FIF).
Fluorohroma pārklājums- Tā ir zāļu apstrāde ar fluorohromu, lai palielinātu to spīduma stiprumu un kontrastu. Vislielāko interesi rada fluorohromakridīna oranžs, kas izraisa nukleīnskābju polihromatisku fluorescenci. Tādējādi, apstrādājot zāles ar šo fluorohromu, dezoksiribonukleīnskābe fluorescē spilgti zaļā krāsā, bet ribonukleīnskābe fluorescē rubīnsarkanā krāsā.
RIF metode ir balstīta uz faktu, ka antivielas, kas apvienotas ar fluorohromu, saglabā spēju izveidot specifisku saiti ar homologu antigēnu. Iegūtais antigēna + antivielu komplekss, jo tajā ir fluorohroms, tiek noteikts fluorescējošā mikroskopā ar tā raksturīgo mirdzumu.
Antivielu iegūšanai izmanto augsti aktīvus hiperimūnos serumus, no kuriem izdala antivielas un marķē ar fluorohromu. Visbiežāk izmantotie fluorohromi ir FITC-fluoresceīna izotiocianāts (zaļā gaisma) un PCX-rodamīna sulfohlorīds (sarkanā gaisma). Ar fluorohromu iezīmētās antivielas sauc par konjugātiem.
Preparātu sagatavošanas un krāsošanas procedūra ir šāda:
- sagatavot uztriepes, orgānu izdrukas uz priekšmetstikliņiem vai inficētu šūnu kultūru uz vāka plāksnītēm; Var izmantot arī histosekciju;
- preparātus žāvē gaisā un fiksē atdzesētā acetonā istabas temperatūrā vai mīnus 15 ° C (no 15 minūtēm līdz 4-16 stundām);
- iekrāso ar tiešu vai netiešu metodi; veikt ierakstus fluorescējošā mikroskopā, pamatojoties uz mirdzuma intensitāti, kas aprēķināta krustiņos.
Tajā pašā laikā tiek sagatavoti un iekrāsoti preparāti no vesela dzīvnieka - kontrole.
Ir divas galvenās fluorescējošu antivielu izmantošanas metodes: tiešās un netiešās.
Tiešā metode (viens solis). Fiksētajam preparātam uzklāj konjugātu (iespējamā vīrusa fluorescējošu serumu) un 30 minūtes tur 37 °C temperatūrā mitrā kamerā. Pēc tam preparātu mazgā no nesaistītā konjugāta ar fizioloģisko šķīdumu (pH 7,2 - 7,5), žāvē gaisā, uzklāj nefluorescējošu eļļu un izmeklē mikroskopā.
Tiešā metode ļauj noteikt un identificēt antigēnu. Lai to izdarītu, katram vīrusam ir jābūt fluorescējošam serumam.
Netiešā metode (divpakāpju). Fiksētajam preparātam uzklāj nemarķētu serumu, kas satur iespējamās vīrusa antivielas, inkubē 30 minūtes 37 °C temperatūrā, un nesaistītās antivielas nomazgā. Preparātam uzklāj fluorescējošu pretsugu serumu, kas atbilst tādam dzīvniekam, kurš ražo homologas pretvīrusu antivielas, un inkubē 30 minūtes 37 °C temperatūrā. Pēc tam preparātu nomazgā no nesaistītajām iezīmētajām antivielām, žāvē gaisā, uzklāj nefluorescējošu eļļu un izmeklē fluorescējošā mikroskopā.
Pretsugu serumus iegūst, imunizējot ar globulīniem to sugu dzīvniekus, kas kalpo kā pretvīrusu antivielu ražotāji. Tātad, ja pretvīrusu antivielas tika iegūtas trušiem, tad tiek izmantots fluorescējošs prettrušu serums.
Netiešā metode ļauj ne tikai noteikt un identificēt antigēnu, bet arī atklāt un noteikt antivielu titru. Turklāt šī metode var noteikt dažādu vīrusu antigēnus ar vienu marķētu serumu, jo tā ir balstīta uz pretsugu serumu izmantošanu. Visbiežāk tiek izmantoti prettrušu, pret liellopu, pret zirgu serumi un pret jūrascūciņu globulīna serumi.
Ir izstrādātas vairākas netiešās metodes modifikācijas. Vislielāko uzmanību ir pelnījusi metode, kurā izmanto komplementu. Metode sastāv no inaktivēta nefluorescējoša specifiska seruma un jūrascūciņas komplementa uzklāšanas fiksētam preparātam, inkubācijas 30 minūtes 37 °C temperatūrā, mazgāšanas un antigēna + antivielas + komplementa kompleksa identificēšanas, fluorescējoša antikomplementāra seruma uzklāšanas un inkubācijas. 30 minūtes 37 °C temperatūrā, mazgā, žāvē gaisā un pārbauda fluorescējošā mikroskopā.
RIF priekšrocības: augsta specifika un jutīgums; iestudējuma tehnikas vienkāršība; Nepieciešams minimālais sastāvdaļu skaits. Šī ir ātrā diagnostikas metode, jo atbildi varat saņemt dažu stundu laikā. Trūkumi ir subjektivitāte mirdzuma intensitātes novērtēšanā, un diemžēl dažkārt fluorescējošie serumi ir sliktas kvalitātes. Pašlaik RIF plaši izmanto vīrusu dzīvnieku slimību diagnostikā.
Ja atrodat kļūdu, lūdzu, iezīmējiet teksta daļu un noklikšķiniet uz Ctrl+Enter.
Nr.35 Imunofluorescences reakcija. Mehānisms, sastāvdaļas, pielietojums.
Imunofluorescences metode (RIF, imunofluorescences reakcija, Kūna reakcija) ir metode specifisku antigēnu noteikšanai, izmantojot antivielas, kas konjugētas ar fluorohromu. Tam ir augsta jutība un specifiskums.
To izmanto infekcijas slimību ekspresdiagnostikai (patogēna identifikācijai pētāmajā materiālā), kā arī AT un virsmas receptoru un leikocītu marķieru noteikšanai (imūnfenotipēšanai) un citām šūnām.
Diagnostikas praksē plaši tiek izmantota baktēriju un vīrusu antigēnu noteikšana infekcijas materiālos, dzīvnieku audos un šūnu kultūrās, izmantojot fluorescējošas antivielas (serumus). Fluorescējošo serumu sagatavošana balstās uz noteiktu fluorohromu (piemēram, fluoresceīna izotiocianāta) spēju izveidot ķīmisku saiti ar seruma proteīniem, nepārkāpjot to imunoloģisko specifiku.
Ir trīs veidu metodes: tieša, netieša, ar komplementu. Tiešā RIF metode ir balstīts uz faktu, ka audu antigēni vai mikrobi, kas apstrādāti ar imūnserumu ar antivielām, kas iezīmētas ar fluorohromiem, spēj mirdzēt fluorescējošā mikroskopa UV staros. Baktērijas uztriepē, kas apstrādātas ar šādu luminiscējošu serumu, mirdz gar šūnas perifēriju zaļas apmales veidā.
Netiešā RIF metode sastāv no antigēna-antivielu kompleksa identificēšanas, izmantojot antiglobulīna (anti-antivielu) serumu, kas marķēts ar fluorohromu. Lai to izdarītu, uztriepes no mikrobu suspensijas apstrādā ar antivielām no pretmikrobu trušu diagnostikas seruma. Pēc tam tiek mazgātas antivielas, kuras nesaista mikrobu antigēni, un, apstrādājot uztriepi ar antiglobulīna (anti-truša) serumu, kas marķēts ar fluorohromiem, nosaka uz mikrobiem palikušās antivielas. Rezultātā veidojas mikrobu + pretmikrobu trušu antivielu + anti-trušu antivielu komplekss, kas marķēts ar fluorohromu. Šis komplekss tiek novērots fluorescējošā mikroskopā, tāpat kā tiešajā metodē.
Mehānisms . Testējamā materiāla uztriepi sagatavo uz stikla priekšmetstikliņa, fiksē uz liesmas un apstrādā ar imūno truša serumu, kas satur antivielas pret patogēnu antigēniem. Lai izveidotu antigēna-antivielu kompleksu, zāles ievieto mitrā kamerā un inkubē 37 °C temperatūrā. 15 minūtes, pēc tam tās rūpīgi nomazgā ar izotonisko nātrija hlorīda šķīdumu, lai noņemtu antivielas, kas nav saistījušās ar antigēnu. Pēc tam preparātam tiek uzklāts fluorescējošs antiglobulīna serums pret trušu globulīniem, inkubēts 15 minūtes 37 °C temperatūrā un pēc tam preparātu rūpīgi nomazgā ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu. Fluorescējošā antiglobulīna seruma saistīšanās rezultātā ar specifiskām antivielām, kas fiksētas uz antigēna, veidojas gaismas antigēna-antivielu kompleksi, kurus nosaka ar fluorescējošu mikroskopiju.