Ταυτοποίηση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ιού DNA. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Σε ποιον ανατίθεται

Η διεξαγωγή της ανάλυσης PCR (PCR diagnostics) ξεκινά με τη συλλογή υλικού για εξέταση από γυναικολόγο, ουρολόγο ή δερματοφλεβολόγο. Η ποιότητα και η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων που ελήφθησαν στη συνέχεια διασφαλίζεται από τα υψηλότερα προσόντα και την τεράστια εμπειρία των γιατρών του ιατρικού κέντρου Euromedprestige, οι οποίοι τηρούν όλους τους απαραίτητους κανόνες για τη διεξαγωγή της ανάλυσης PCR: πλήρης στειρότητα, χρήση υλικών αποκλειστικά μιας χρήσης.

Το υλικό που συλλέγεται από το πινέλο τοποθετείται σε δοχείο με φυσιολογικό ορό. Μετά τη δειγματοληψία, τα δείγματα πρέπει να παραδοθούν στο εργαστήριο PCR το συντομότερο δυνατό.

Η ανάλυση PCR στο εργαστήριο πραγματοποιείται σε τρία στάδια:

1. Απομόνωση DNA
2. Ενίσχυση θραυσμάτων DNA
3. Ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης DNA

Η εξαγωγή DNA είναι το αρχικό στάδιο της διάγνωσης PCR, η ουσία της οποίας είναι η εξής: ο γιατρός παίρνει το υλικό για έρευνα από τον ασθενή και το υποβάλλει σε ειδική επεξεργασία. Κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας, η διπλή έλικα του DNA χωρίζεται σε ξεχωριστούς κλώνους. Στο υλικό του ασθενούς προστίθεται ειδικό υγρό, το οποίο διαλύει οργανικές ουσίες που παρεμβαίνουν στην «καθαρότητα» της αντίδρασης. Αυτό αφαιρεί λιπίδια, αμινοξέα, πεπτίδια, υδατάνθρακες, πρωτεΐνες και πολυσακχαρίτες. Το αποτέλεσμα είναι DNA ή RNA.

Η αρχή της μεθόδου PCR είναι να «χτίζει» νέες μολύνσεις DNA ή RNA. Αυτό δεν μπορεί να γίνει χωρίς αφαίρεση κυτταρικού υλικού.

Ο χρόνος που δαπανάται για την εξαγωγή DNA εξαρτάται από τον αιτιολογικό παράγοντα της μόλυνσης και από τον τύπο του υλικού που χρησιμοποιείται για την εξέταση PCR. Για παράδειγμα, χρειάζονται 1,5-2 ώρες για να προετοιμαστεί το αίμα για το επόμενο βήμα.

0Πίνακας ( => Αναλύει) Πίνακας ( => 2) Πίνακας ( =>.html) 2

Ενίσχυση DNA

Για να πραγματοποιήσουν το επόμενο στάδιο της διάγνωσης του DNA - την ενίσχυση του DNA - οι γιατροί χρησιμοποιούν τις λεγόμενες μήτρες DNA - μόρια DNA λοιμώξεων, στις οποίες θα πραγματοποιηθεί στη συνέχεια η "κλωνοποίηση" του DNA. Έχει ήδη αναφερθεί ότι η παρουσία του πλήρους DNA της μόλυνσης δεν είναι απαραίτητη· για αυτό το στάδιο, αρκεί ένα μικρό κομμάτι του μορίου DNA, το οποίο είναι μοναδικό σε αυτό το μικρόβιο (μόλυνση).

Στο επίκεντρο της ενίσχυσης του DNA και, κατά συνέπεια, στην καρδιά της όλης αρχής της αντίδρασης PCR βρίσκεται η φυσική διαδικασία ολοκλήρωσης του DNA για όλα τα έμβια όντα - η αντιγραφή του DNA, η οποία πραγματοποιείται με διπλασιασμό μιας μοναδικής αλυσίδας DNA.

Ξεκινώντας με ένα μόνο θραύσμα DNA, ο εργαστηριακός γιατρός το αντιγράφει και αυξάνει τον αριθμό των αντιγράφων σε μια αλυσιδωτή αντίδραση: μετά τον πρώτο κύκλο έχετε ήδη 2 θραύσματα, μετά τον δεύτερο κύκλο - 4, μετά τον τρίτο - 8, μετά τον τέταρτο - 16, μετά 32 , 64, 128, 256... Με κάθε κύκλο, ο αριθμός των αντιγράφων διπλασιάζεται και μετά από είκοσι κύκλους, η καταμέτρηση πηγαίνει σε εκατομμύρια και μετά από τριάντα σε δισεκατομμύρια. Ο κύκλος διαρκεί λίγα λεπτά και μειώνεται σε μια ορισμένη αλλαγή στο καθεστώς θερμοκρασίας σε έναν πολύ μικρό χημικό αντιδραστήρα. Εδώ στο διάλυμα σε επαρκείς ποσότητες υπάρχουν όλα τα απαραίτητα συστατικά της σύνθεσης, πρώτα απ 'όλα, τα νουκλεοτίδια A, G, T και C, και επίσης πραγματοποιήθηκαν λεπτές προπαρασκευαστικές χημικές εργασίες έτσι ώστε να δημιουργηθεί αμέσως ακριβές αντίγραφο από κάθε τελικό DNA τμήμα, μετά από αυτό το αντίγραφο - πάλι ένα αντίγραφο, αυτή είναι η διακλαδισμένη αλυσιδωτή αντίδραση.

Με την προσάρτηση εκκινητών στην αλυσίδα DNA - τεχνητά συντιθέμενα "κομμάτια" DNA (ζεύγη νουκλεοτιδίων) παρόμοια με το DNA των μικροβίων (μόλυνση) - δύο κοντές, που αποτελούνται από δύο αλυσίδες τμημάτων DNA, σχηματίζονται έλικες, οι οποίες είναι απαραίτητες για τη σύνθεση του μελλοντικού DNA.

Η σύνθεση μιας νέας αλυσίδας λαμβάνει χώρα με την ολοκλήρωση καθενός από τους δύο κλώνους του DNA. Η διαδικασία ενίσχυσης συμβαίνει με τη βοήθεια μιας συγκεκριμένης θέσης - DNA πολυμεράσης, η οποία έδωσε το όνομα στην εργαστηριακή μέθοδο. Η πολυμεράση δρα ως καταλύτης για την αντίδραση και παρακολουθεί τη διαδοχική σύνδεση των βάσεων νουκλεοτιδίου στον αναπτυσσόμενο νέο κλώνο DNA.

Έτσι, η ενίσχυση του DNA είναι μια πολλαπλή αύξηση στον αριθμό των αντιγράφων του DNA που είναι ειδικά, δηλ. εγγενή μόνο σε έναν συγκεκριμένο οργανισμό. Δεν χρειάζεται να συμπληρώσετε ολόκληρη την αλυσίδα του DNA για να δείτε τον αιτιολογικό παράγοντα της μόλυνσης. Χρειάζεται μόνο η περιοχή που είναι χαρακτηριστική αυτού του βακτηρίου ως άτομο.

5360 τρίψτε. Το κόστος ενός ολοκληρωμένου προγράμματος με γαστρεντερολόγο

ΕΚΠΤΩΣΗ 25%. ΣΤΗΝ ΥΠΟΔΟΧΗ ΚΑΡΔΙΟΛΟΓΟΥ

- 25%πρωταρχικός
Επίσκεψη γιατρού
θεραπευτής του Σαββατοκύριακου

5 160 τρίψτε. αντί για 5.420 ρούβλια. Εξέταση ανδρών για ουρολογικές λοιμώξεις

ΑΛΛΕΡΓΟΛΟΓΙΑ 5 120 τρίψτε. αντί για 5.590 ρούβλια.

Όλα τα πολυάριθμα επαναλαμβανόμενα βήματα ενίσχυσης συμβαίνουν σε διαφορετικές θερμοκρασίες. Για ανάλυση PCR, χρησιμοποιείται ειδικά προγραμματιζόμενος εξοπλισμός - PCR - ένας θερμοστάτης ή ένας ενισχυτής, ο οποίος αλλάζει αυτόματα τις θερμοκρασίες. Η ενίσχυση πραγματοποιείται σύμφωνα με ένα προκαθορισμένο πρόγραμμα που αντιστοιχεί στον τύπο της μόλυνσης που ανιχνεύεται. Ανάλογα με το πρόγραμμα και τον τύπο της μόλυνσης που ανιχνεύεται, η διαδικασία της αυτοματοποιημένης PCR διαρκεί από 2 έως 3 ώρες.

Στη διάγνωση PCR, τα προσόντα του βοηθού εργαστηρίου που εκτελεί την ανάλυση παίζει σημαντικό ρόλο· η σωστή ρύθμιση του εξοπλισμού PCR και η ερμηνεία των αποτελεσμάτων εξαρτώνται από αυτό. Οι γιατροί του Ιατρικού Κέντρου Euromedprestige έχουν μεγάλη εμπειρία στη διεξαγωγή διαγνωστικών DNA, γεγονός που διασφαλίζει την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων της μελέτης και εγγυάται θετική επιτυχία στη θεραπεία μολυσματικών ασθενειών. Για να περάσετε εξετάσεις PCR και να πραγματοποιήσετε πλήρη διάγνωση και θεραπεία μολυσματικών ασθενειών στο ιατρικό μας κέντρο "Euromedprestige".

Κατά την ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης, το προκύπτον μείγμα προϊόντων ενίσχυσης διαχωρίζεται. Στο μείγμα προστίθενται ειδικά διαλύματα, τα οποία προσδίδουν σε θραύσματα DNA την ικανότητα να φθορίζουν - να αντανακλούν πορτοκαλοκόκκινες φωτεινές λωρίδες. Η λάμψη που προκύπτει υποδηλώνει την παρουσία DNA ιών, μικροβίων ή βακτηρίων στο υλικό που λαμβάνεται από τον ασθενή για ανάλυση PCR.

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)- πειραματική μέθοδος μοριακής βιολογίας, η οποία είναι μια ειδική ενίσχυση νουκλεϊκών οξέων που προκαλείται από συνθετικούς ολιγονουκλεοτιδικούς εκκινητές in vitro.

Η ιδέα της ανάπτυξης της μεθόδου PCR ανήκει στον Αμερικανό ερευνητή Kary Mullis, ο οποίος το 1983 δημιούργησε μια μέθοδο που κατέστησε δυνατή την ενίσχυση του DNA κατά τους κυκλικούς διπλασιασμούς χρησιμοποιώντας το ένζυμο DNA πολυμεράση σε τεχνητές συνθήκες. Λίγα χρόνια μετά τη δημοσίευση αυτής της ιδέας, το 1993, ο K. Mullis έλαβε το Νόμπελ γι' αυτήν.

Στην αρχή της χρήσης της μεθόδου, μετά από κάθε κύκλο θέρμανσης-ψύξης, ήταν απαραίτητο να προστεθεί DNA πολυμεράση στο μείγμα της αντίδρασης, καθώς απενεργοποιήθηκε γρήγορα σε υψηλή θερμοκρασία. Η διαδικασία ήταν πολύ αναποτελεσματική, απαιτούσε πολύ χρόνο και ένζυμα. Το 1986, τροποποιήθηκε σημαντικά με τη χρήση πολυμεράσης DNA από θερμόφιλα βακτήρια. Αυτά τα ένζυμα είναι σε θέση να αντέξουν πολλούς κύκλους αντίδρασης, γεγονός που σας επιτρέπει να αυτοματοποιήσετε την PCR. Μία από τις πιο συχνά χρησιμοποιούμενες θερμοσταθερές πολυμεράσες DNA έχει απομονωθεί από βακτήρια. Thermus aquaticusκαι ονομάστηκε Taq-DNA πολυμεράση.

Η ουσία της μεθόδου.Η μέθοδος βασίζεται σε πολλαπλή επιλεκτική αντιγραφή μιας συγκεκριμένης περιοχής DNA χρησιμοποιώντας το ένζυμο Taq-DNA πολυμεράση. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης καθιστά δυνατή τη λήψη ενισχυτών μήκους έως και αρκετών χιλιάδων ζευγών βάσεων. Για να αυξηθεί το μήκος του προϊόντος PCR σε 20-40 χιλιάδες ζεύγη βάσεων, χρησιμοποιείται ένα μείγμα διαφόρων πολυμερασών, αλλά εξακολουθεί να είναι πολύ μικρότερο από το μήκος του χρωμοσωμικού DNA ενός ευκαρυωτικού κυττάρου.

Η αντίδραση πραγματοποιείται σε έναν προγραμματιζόμενο θερμοστάτη (ενισχυτή) - μια συσκευή που μπορεί να εκτελέσει αρκετά γρήγορα

ψύξη και θέρμανση δοκιμαστικών σωλήνων (συνήθως με ακρίβεια τουλάχιστον 0,1 °C). Οι ενισχυτές σάς επιτρέπουν να ορίσετε πολύπλοκα προγράμματα, συμπεριλαμβανομένων εκείνων με τη δυνατότητα "hot start" και επακόλουθης αποθήκευσης. Για PCR σε πραγματικό χρόνο, παράγονται συσκευές εξοπλισμένες με ανιχνευτή φθορισμού. Τα όργανα είναι επίσης διαθέσιμα με αυτόματο καπάκι και διαμέρισμα μικροπλάκας, επιτρέποντάς τους να ενσωματωθούν σε αυτοματοποιημένα συστήματα.

Συνήθως, κατά τη διάρκεια της PCR, εκτελούνται 20-45 κύκλοι, καθένας από τους οποίους αποτελείται από τρία στάδια: μετουσίωση, ανόπτηση εκκινητών, επιμήκυνση (Εικ. 6.1 και 6.2). Στο σχ. Το 6.1 δείχνει τη δυναμική των αλλαγών θερμοκρασίας στον δοκιμαστικό σωλήνα κατά τη διάρκεια του κύκλου PCR.

Ρύζι. 6.1.Γράφημα της μεταβολής της θερμοκρασίας στον δοκιμαστικό σωλήνα κατά τη διάρκεια ενός κύκλου της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

μετουσίωση προτύπου DNAπραγματοποιείται με θέρμανση του μίγματος της αντίδρασης στους 94-96 ° C για 5-90 δευτερόλεπτα έτσι ώστε οι αλυσίδες DNA να διασπαρούν. Πρέπει να σημειωθεί ότι πριν από τον πρώτο κύκλο, το μείγμα αντίδρασης προθερμαίνεται για 2-5 λεπτά για να μετουσιωθεί πλήρως η αρχική μήτρα, γεγονός που καθιστά δυνατή τη μείωση της ποσότητας των μη ειδικών προϊόντων αντίδρασης.

Ρύζι. 6.2.Σχήμα του πρώτου κύκλου της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

Στάδιο ανόπτησης ασταριού.Με σταδιακή μείωση της θερμοκρασίας, τα αστάρια συνδέονται συμπληρωματικά με το εκμαγείο. Η θερμοκρασία ανόπτησης εξαρτάται από τη σύνθεση των ασταριών και είναι συνήθως 4-5°C χαμηλότερη από την υπολογιζόμενη θερμοκρασία τήξης. Η διάρκεια της σκηνής είναι 5-60 δευτερόλεπτα.

Στο επόμενο στάδιο - επιμήκυνση- υπάρχει μια σύνθεση του θυγατρικού κλώνου του DNA στη μητρική μήτρα. Η θερμοκρασία επιμήκυνσης εξαρτάται από την πολυμεράση. Οι κοινώς χρησιμοποιούμενες πολυμεράσες Taq και Pfu DNA είναι πιο δραστικές στους 72°C. Ο χρόνος επιμήκυνσης, που εξαρτάται κυρίως από το μήκος του προϊόντος PCR, είναι τυπικά 1 λεπτό ανά 1000 ζεύγη βάσεων.

Στο τέλος του άρθρου, βλ
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR, PCR)εφευρέθηκε το 1983 από τον Carey Mullis (αμερικανό επιστήμονα). Στη συνέχεια, έλαβε το βραβείο Νόμπελ για αυτήν την εφεύρεση. Επί του παρόντος, η διάγνωση PCR είναι μια από τις πιο ακριβείς και ευαίσθητες μεθόδους για τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών.
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)- μια πειραματική μέθοδος μοριακής βιολογίας, μια μέθοδος σημαντικής αύξησης μικρών συγκεντρώσεων ορισμένων θραυσμάτων νουκλεϊκού οξέος (DNA) σε βιολογικό υλικό (δείγμα).
Η μέθοδος PCR βασίζεται στον επαναλαμβανόμενο διπλασιασμό ενός συγκεκριμένου τμήματος του DNA με τη βοήθεια ενζύμων υπό τεχνητές συνθήκες (in vitro). Ως αποτέλεσμα, παράγονται επαρκείς ποσότητες DNA για οπτική ανίχνευση. Στην περίπτωση αυτή, αντιγράφεται μόνο η περιοχή που πληροί τις καθορισμένες προϋποθέσεις και μόνο εάν υπάρχει στο υπό μελέτη δείγμα.
Εκτός από την απλή αύξηση του αριθμού των αντιγράφων DNA (αυτή η διαδικασία ονομάζεται ενίσχυση), η PCR επιτρέπει πολλούς άλλους χειρισμούς με γενετικό υλικό (εισαγωγή μεταλλάξεων, μάτισμα θραυσμάτων DNA) και χρησιμοποιείται ευρέως στη βιολογική και ιατρική πρακτική, για παράδειγμα, για τη διάγνωση ασθενειών (κληρονομικές, μολυσματικές), για τη διαπίστωση της πατρότητας, για την κλωνοποίηση γονιδίων, την εισαγωγή μεταλλάξεων, την απομόνωση νέων γονιδίων.

Ιδιαιτερότητα και εφαρμογή

Διεξαγωγή PCR

Για την PCR, στην απλούστερη περίπτωση, απαιτούνται τα ακόλουθα στοιχεία:

• Πρότυπο DNA που περιέχει το τμήμα του DNA που πρόκειται να ενισχυθεί.
• δύο εκκινητές συμπληρωματικοί προς τα άκρα του επιθυμητού θραύσματος.
• θερμοσταθερή πολυμεράση DNA;
• τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (Α, G, C, Τ);
• Ιόντα Mg2+ απαραίτητα για τη λειτουργία της πολυμεράσης.
• ρυθμιστικό διάλυμα.

Η PCR πραγματοποιείται σε έναν ενισχυτή - μια συσκευή που παρέχει περιοδική ψύξη και θέρμανση δοκιμαστικών σωλήνων, συνήθως με ακρίβεια τουλάχιστον 0,1 ° C. Για να αποφευχθεί η εξάτμιση του μίγματος της αντίδρασης, ένα έλαιο υψηλής βρασμού, όπως η βαζελίνη, προστίθεται στον δοκιμαστικό σωλήνα. Η προσθήκη ειδικών ενζύμων μπορεί να αυξήσει την απόδοση της αντίδρασης PCR.
Πρόοδος αντίδρασης

Συνήθως, κατά τη διεξαγωγή PCR, εκτελούνται 20 - 35 κύκλοι, καθένας από τους οποίους αποτελείται από τρία στάδια. Το εκμαγείο δίκλωνου DNA θερμαίνεται στους 94 - 96°C (ή στους 98°C εάν χρησιμοποιείται μια ιδιαίτερα θερμοσταθερή πολυμεράση) για 0,5 - 2 λεπτά για να επιτραπεί ο διαχωρισμός των κλώνων DNA. Αυτό το στάδιο ονομάζεται μετουσίωση - οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των δύο αλυσίδων καταστρέφονται. Μερικές φορές, πριν από τον πρώτο κύκλο, το μείγμα αντίδρασης προθερμαίνεται για 2-5 λεπτά για να μετουσιωθεί πλήρως το εκμαγείο και τα αστάρια.
Όταν οι κλώνοι διαχωρίζονται, η θερμοκρασία μειώνεται για να επιτραπεί στους εκκινητές να συνδεθούν με το μονόκλωνο πρότυπο. Αυτό το στάδιο ονομάζεται ανόπτηση. Η θερμοκρασία ανόπτησης εξαρτάται από τα αστάρια και συνήθως επιλέγεται 4 - 5°C κάτω από το σημείο τήξης τους. Χρόνος σκηνής - 0,5 - 2 λεπτά.

Η DNA πολυμεράση αντιγράφει τον κλώνο του εκμαγείου χρησιμοποιώντας τον εκκινητή ως εκκινητή. Αυτό είναι το στάδιο επιμήκυνσης. Η θερμοκρασία επιμήκυνσης εξαρτάται από την πολυμεράση. Οι πολυμεράσες που χρησιμοποιούνται συχνά είναι πιο δραστικές στους 72°C. Ο χρόνος επιμήκυνσης εξαρτάται τόσο από τον τύπο της DNA πολυμεράσης όσο και από το μήκος του θραύσματος που θα ενισχυθεί. Τυπικά, ο χρόνος επιμήκυνσης θεωρείται ένα λεπτό για κάθε χίλια ζεύγη βάσεων. Μετά το τέλος όλων των κύκλων, συχνά πραγματοποιείται ένα πρόσθετο στάδιο τελικής επιμήκυνσης προκειμένου να ολοκληρωθούν όλα τα μονόκλωνα θραύσματα. Αυτό το στάδιο διαρκεί 10 - 15 λεπτά.
Προετοιμασία υλικού για έρευνα και μεταφορά του στο εργαστήριο

Για μια επιτυχημένη ανάλυση, είναι σημαντικό να συλλέξετε σωστά το υλικό από τον ασθενή και να το προετοιμάσετε σωστά. Είναι γνωστό ότι στην εργαστηριακή διάγνωση η πλειοψηφία των λαθών (έως και 70%) γίνονται στο στάδιο της προετοιμασίας του δείγματος. Για τη λήψη αίματος στο εργαστήριο INVITRO, χρησιμοποιούνται σήμερα συστήματα κενού, τα οποία αφενός τραυματίζουν ελάχιστα τον ασθενή και, αφετέρου, επιτρέπουν τη λήψη του υλικού με τέτοιο τρόπο ώστε να μην έρχεται σε επαφή. είτε με το προσωπικό είτε με το περιβάλλον. Έτσι αποφεύγεται η μόλυνση (μόλυνση) του υλικού και διασφαλίζεται η αντικειμενικότητα της ανάλυσης PCR.

DNA - δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ - ένα βιολογικό πολυμερές, ένας από τους δύο τύπους νουκλεϊκών οξέων που παρέχουν αποθήκευση, μετάδοση από γενιά σε γενιά και εφαρμογή του γενετικού προγράμματος για την ανάπτυξη και τη λειτουργία ζωντανών οργανισμών. Ο κύριος ρόλος του DNA στα κύτταρα είναι η μακροπρόθεσμη αποθήκευση πληροφοριών σχετικά με τη δομή του RNA και των πρωτεϊνών.

Το RNA - το ριβονουκλεϊκό οξύ είναι ένα βιολογικό πολυμερές, παρόμοιο στη χημική του δομή με το DNA. Το μόριο RNA είναι κατασκευασμένο από τις ίδιες μονομερείς μονάδες - νουκλεοτίδια με το DNA. Στη φύση, το RNA υπάρχει συνήθως ως μονή αλυσίδα. Σε ορισμένους ιούς, το RNA είναι ο φορέας της γενετικής πληροφορίας. Στο κύτταρο, παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταφορά πληροφοριών από το DNA στην πρωτεΐνη. Το RNA συντίθεται σε ένα πρότυπο DNA. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται μεταγραφή. Υπάρχουν τμήματα στο DNA που περιέχουν πληροφορίες που είναι υπεύθυνες για τη σύνθεση τριών τύπων RNA, που διαφέρουν ως προς τις λειτουργίες τους: αγγελιαφόρο ή αγγελιοφόρο RNA (mRNA), ριβοσωμικό (rRNA) και μεταφορά (tRNA). Και οι τρεις τύποι RNA εμπλέκονται στην πρωτεϊνοσύνθεση με τον ένα ή τον άλλο τρόπο. Ωστόσο, πληροφορίες για τη σύνθεση πρωτεϊνών περιέχονται μόνο στο mRNA.

Τα νουκλεοτίδια είναι η βασική επαναλαμβανόμενη μονάδα στα μόρια νουκλεϊκού οξέος, το προϊόν μιας χημικής ένωσης μιας αζωτούχου βάσης, ενός σακχάρου πέντε άνθρακα (πεντόζη) και μιας ή περισσότερων φωσφορικών ομάδων. Τα νουκλεοτίδια που υπάρχουν στα νουκλεϊκά οξέα περιέχουν μία φωσφορική ομάδα. Ονομάζονται ανάλογα με την αζωτούχα βάση που περιέχουν - αδενίνη (Α) που περιέχει αδενίνη, γουανίνη (G) - γουανίνη, κυτοσίνη (C) - κυτοσίνη, θυμίνη (Τ) - θυμίνη, ουρακίλη (U) - ουρακίλη. Το DNA αποτελείται από 4 τύπους νουκλεοτιδίων - A, T, G, C, το RNA έχει επίσης 4 τύπους - A, U, G, C. Το σάκχαρο στη σύνθεση όλων των νουκλεοτιδίων του DNA είναι δεοξυριβόζη, το RNA είναι ριβόζη. Κατά τον σχηματισμό των νουκλεϊκών οξέων, τα νουκλεοτίδια, δεσμεύοντας, σχηματίζουν μια σακχαροφωσφορική ραχοκοκαλιά του μορίου, στη μία πλευρά του οποίου υπάρχουν βάσεις.

Ένας εκκινητής είναι ένα σύντομο DNA που χρησιμοποιείται για την αντιγραφή του κλώνου προτύπου. Καθένας από τους εκκινητές είναι συμπληρωματικός με μία από τις αλυσίδες του δίκλωνου προτύπου, που πλαισιώνει την αρχή και το τέλος της ενισχυμένης περιοχής.

Βιβλιογραφία

1. Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Αρχές και εφαρμογή. Ανά. από τα Αγγλικά. - Μ.: Μιρ, 2002. - 589 σ., εικονογράφηση. ISBN 5-03-003328-9
2. Shchelkunov S.N. Γενετική μηχανική - Novosibirsk: Sib. παν. εκδοτικός οίκος, 2004. - 496 σ.; Εγώ θα. ISBN 5-94087-098-8
3. Patrushev L.I. Τεχνητά γενετικά συστήματα - M .: Nauka, 2005 - Σε 2 τόμους - ISBN 5-02-033278-X

ΣΠΟΥΔΑΙΟΣ!

Οι πληροφορίες αυτής της ενότητας δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται για αυτοδιάγνωση ή αυτοθεραπεία. Σε περίπτωση πόνου ή άλλης έξαρσης της νόσου, μόνο ο θεράπων ιατρός πρέπει να συνταγογραφήσει διαγνωστικές εξετάσεις. Για διάγνωση και σωστή θεραπεία, θα πρέπει να επικοινωνήσετε με το γιατρό σας.

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)- είναι μια μέθοδος βιοχημικής τεχνολογίας στη μοριακή βιολογία, που πραγματοποιείται με στόχο την αύξηση ενός ή περισσότερων αντιγράφων θραυσμάτων DNA κατά πολλούς βαθμούς, η οποία σας επιτρέπει να δημιουργήσετε από πολλές χιλιάδες έως εκατομμύρια αντίγραφα μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA.

Αναπτύχθηκε το 1983 από τον Cary Mullis, η μέθοδος PCR είναι πλέον μια κοινή και συχνά απαραίτητη μέθοδος που χρησιμοποιείται σε εργαστήρια ιατρικής και βιολογικής έρευνας για πολλές διαφορετικές εφαρμογές. Αυτά περιλαμβάνουν κλωνοποίηση DNA για αλληλούχιση, φυλογένεση με βάση το DNA ή λειτουργική ανάλυση γονιδίων. διάγνωση κληρονομικών ασθενειών · ταυτοποίηση γενετικών δακτυλικών αποτυπωμάτων (που χρησιμοποιούνται στους κλάδους της εγκληματολογικής επιστήμης και στον έλεγχο πατρότητας), καθώς και στην ανίχνευση και διάγνωση μολυσματικών ασθενειών. Το 1993, ο Mullis τιμήθηκε με το Νόμπελ Χημείας μαζί με τον Michael Smith για την εργασία τους στην PCR.

Η μέθοδος βασίζεται στον θερμικό κύκλο, που αποτελείται από επαναλαμβανόμενους κύκλους αντιδράσεων θέρμανσης και ψύξης για τη μετουσίωση και την αντιγραφή του DNA από ένζυμα. Οι εκκινητές, (μικρά κομμάτια DNA) που περιέχουν αλληλουχίες που είναι συμπληρωματικές στη θέση στόχο μαζί με την πολυμεράση DNA (από την οποία ονομάστηκε η μέθοδος), είναι βασικά συστατικά για την επιλεκτική και εκ νέου ενίσχυση. Στη διαδικασία PCR, το ίδιο το συντιθέμενο DNA χρησιμοποιείται ως εκμαγείο για αντιγραφή, θέτοντας σε κίνηση μια αλυσιδωτή αντίδραση στην οποία το πρότυπο DNA ενισχύεται εκθετικά. Η PCR μπορεί να τροποποιηθεί σημαντικά για να πραγματοποιήσει ένα ευρύ φάσμα γενετικών χειρισμών.

Σχεδόν όλες οι εφαρμογές PCR χρησιμοποιούν μια θερμοσταθερή πολυμεράση DNA όπως η πολυμεράση Taq, ένα ένζυμο που αρχικά απομονώθηκε από βακτήρια. Thermusaquaticus. Αυτή η πολυμεράση DNA συναρμολογεί ενζυματικά μια νέα αλυσίδα DNA από τα δομικά στοιχεία του DNA - νουκλεοτίδια, χρησιμοποιώντας μονόκλωνο DNA ως πρότυπο και ολιγονουκλεοτίδια DNA (ονομάζονται επίσης εκκινητές DNA) που απαιτούνται για την έναρξη της σύνθεσης DNA. Η συντριπτική πλειονότητα των μεθόδων PCR χρησιμοποιεί θερμικό κύκλο, δηλ., εναλλασσόμενη θέρμανση και ψύξη του δείγματος PCR σε μια συγκεκριμένη σειρά βημάτων θερμοκρασίας. Αυτά τα βήματα θερμικού κύκλου απαιτούνται πρώτα για να διαχωριστούν φυσικά οι δύο κλώνοι της διπλής έλικας του DNA σε υψηλή θερμοκρασία σε μια διαδικασία που ονομάζεται μετουσίωση DNA. Σε χαμηλότερη θερμοκρασία, κάθε κλώνος θα χρησιμοποιηθεί ως εκμαγείο στη σύνθεση DNA από την DNA πολυμεράση προκειμένου να ενισχυθεί επιλεκτικά η περιοχή DNA στόχος. Η επιλεκτικότητα της PCR προκύπτει χρησιμοποιώντας εκκινητές που είναι συμπληρωματικοί στην περιοχή στόχου DNA για ενίσχυση υπό ορισμένες συνθήκες θερμικού κύκλου.

Αρχές διάγνωσης PCR

Η PCR χρησιμοποιείται για την ενίσχυση ενός συγκεκριμένου τμήματος μιας αλυσίδας DNA (DNA στόχος). Οι περισσότερες μέθοδοι PCR συνήθως ενισχύουν θραύσματα DNA έως και ~10.000 ζεύγη βάσεων (kb), αν και ορισμένες μέθοδοι επιτρέπουν στα θραύσματα να κλιμακωθούν έως και 40 kb σε μέγεθος. Η αντίδραση παράγει μια περιορισμένη ποσότητα του τελικού ενισχυμένου προϊόντος, η οποία ελέγχεται από τα διαθέσιμα αντιδραστήρια στην αντίδραση και την αναστολή ανατροφοδότησης των προϊόντων αντίδρασης.

Το βασικό κιτ PCR απαιτεί πολλά εξαρτήματα και αντιδραστήρια. Αυτά περιλαμβάνουν:

• Πρότυπο DNA, το οποίο περιέχει την προς ενίσχυση περιοχή DNA στόχο.
• δύο αστάρια,συμπληρωματικά προς τα 3' άκρα καθενός από τους νοηματικούς και αντιπληροφοριακούς κλώνους του DNA στόχου.
• Taq πολυμεράσηή άλλη πολυμεράση DNA που λειτουργεί σε βέλτιστη θερμοκρασία περίπου 70°C.
• Τριφωσφορικοί δεοξυνουκλεοζίτες(dNTPs, τριφωσφορικές ομάδες που περιέχουν νουκλεοτίδια), τα δομικά στοιχεία από τα οποία η DNA πολυμεράση συνθέτει μια νέα αλυσίδα DNA.
• ρυθμιστικό διάλυμα, παρέχοντας κατάλληλες χημικές συνθήκες για βέλτιστη δραστηριότητα και σταθερότητα της DNA πολυμεράσης.
• δισθενή κατιόντα,ιόντα μαγνησίου ή μαγγανίου. Το Mg2+ χρησιμοποιείται συνήθως, αλλά το Mn2+ μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για μεταλλαξιογένεση DNA που προκαλείται από PCR, καθώς υψηλότερες συγκεντρώσεις Mn2+ αυξάνουν το ποσοστό σφάλματος κατά τη σύνθεση του DNA.
• Μονοσθενή κατιόνταιόντα καλίου.

Η PCR πραγματοποιείται συνήθως σε όγκο αντίδρασης 10-200 μl σε μικρούς σωλήνες αντίδρασης (όγκος 0,2-0,5 ml) σε θερμικό κυκλοποιητή-ενισχυτή. Ο κυκλοποιητής θερμαίνει και ψύχει τους σωλήνες αντίδρασης για να επιτύχει τις θερμοκρασίες που απαιτούνται για κάθε στάδιο της αντίδρασης. Πολλοί σύγχρονοι ποδηλάτες χρησιμοποιούν το φαινόμενο Peltier, το οποίο επιτρέπει τη θέρμανση και την ψύξη του συγκροτήματος του σωλήνα PCR απλώς αντιστρέφοντας την κατεύθυνση του ηλεκτρικού ρεύματος. Οι σωλήνες αντίδρασης με λεπτό τοίχωμα προάγουν την ευνοϊκή θερμική αγωγιμότητα για να εξασφαλίσουν ταχεία θερμική ισορροπία. Οι παλαιότεροι ανακυκλωτές που δεν έχουν θερμαινόμενο καπάκι απαιτούν ένα στρώμα λαδιού στην επιφάνεια του μείγματος αντίδρασης ή ένα σφαιρίδιο κεριού σε ένα φιαλίδιο.

Σειρά διαδικασίας

Τυπικά, η PCR αποτελείται από μια σειρά 20-40 επαναλαμβανόμενων αλλαγών θερμοκρασίας που ονομάζονται κύκλοι, με κάθε κύκλο να αποτελείται συνήθως από 2-3 διακριτά βήματα θερμοκρασίας, συνήθως τρία. Η ποδηλασία συχνά αρχίζει και τελειώνει με ένα μόνο βήμα θερμοκρασίας (το λεγόμενο προσμονή) σε υψηλή θερμοκρασία (> 90 ° C) για την τελική επέκταση του προϊόντος ή για σύντομη αποθήκευση. Οι θερμοκρασίες που χρησιμοποιούνται και η διάρκεια εφαρμογής τους σε κάθε κύκλο εξαρτάται από πολλές παραμέτρους. Αυτά περιλαμβάνουν το ένζυμο που χρησιμοποιείται για τη σύνθεση DNA, τη συγκέντρωση δισθενών ιόντων και dNTP στην αντίδραση και το σημείο τήξης (Tm) των εκκινητών.

• Στάδιο αρχικοποίησης:Αυτό το στάδιο συνίσταται στη θέρμανση της αντίδρασης σε θερμοκρασία 94-96°C (ή 98°C εάν χρησιμοποιούνται πολυμεράσες υψηλής σταθερότητας στη θερμότητα), η οποία διεξάγεται για 1-9 λεπτά. Το βήμα απαιτείται μόνο για πολυμεράσες DNA που απαιτούν θερμική ενεργοποίηση, τη λεγόμενη PCR θερμής εκκίνησης.
• Βήμα μετουσίωσης:Είναι το πρώτο τακτικό γεγονός θερμικού κύκλου και συνίσταται στη θέρμανση της αντίδρασης στους 94-98°C για 20-30 δευτερόλεπτα. Αυτό προκαλεί διάσπαση του εκμαγείου DNA με καταστροφή δεσμών υδρογόνου μεταξύ συμπληρωματικών βάσεων και σχηματισμό μονόκλωνων μορίων DNA.
• Βήμα ανόπτησης:Η θερμοκρασία της αντίδρασης μειώνεται στους 50-65°C για 20-40 δευτερόλεπτα, γεγονός που επιτρέπει στους εκκινητές να συνδεθούν με το μονόκλωνο εκμαγείο DNA. Τυπικά η θερμοκρασία ανόπτησης είναι περίπου 3-5 βαθμούς Κελσίου κάτω από την Tm των χρησιμοποιούμενων εκκινητών. Οι σταθεροί δεσμοί υδρογόνου DNA-DNA σχηματίζονται μόνο όταν η αλληλουχία εκκινητών ταιριάζει περισσότερο με το πρότυπο αλληλουχίας. Η πολυμεράση συνδέεται με το υβρίδιο εκκινητή-πρότυπο και ξεκινά τη σύνθεση DNA.
• Στάδιο διαστολής / επιμήκυνσης:Η θερμοκρασία κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου εξαρτάται από τη χρησιμοποιούμενη πολυμεράση DNA. Η πολυμεράση Taq έχει τη βέλτιστη θερμοκρασία δραστηριότητας στους 75-80°C. μια θερμοκρασία 72°C χρησιμοποιείται συνήθως για αυτό το ένζυμο. Σε αυτό το στάδιο, η DNA πολυμεράση συνθέτει έναν νέο κλώνο DNA συμπληρωματικό στον κλώνο μήτρας DNA προσθέτοντας dNTPs που είναι συμπληρωματικά του εκμαγείου στην κατεύθυνση 5" προς 3", συνδέοντας την ομάδα 5"-φωσφορικών του dNTP με την 3"- υδροξυλική ομάδα στο τέλος του προκύπτοντος (διαστελλόμενου) DNA. Ο χρόνος επέκτασης εξαρτάται τόσο από τη χρησιμοποιούμενη πολυμεράση DNA όσο και από το μήκος του θραύσματος DNA που πρόκειται να ενισχυθεί. Τυπικά, στη βέλτιστη θερμοκρασία της, η DNA πολυμεράση πολυμερίζει χίλιες βάσεις ανά λεπτό. Υπό βέλτιστες συνθήκες, δηλ. Ελλείψει περιορισμών λόγω περιοριστικών υποστρωμάτων ή αντιδραστηρίων, σε κάθε στάδιο επέκτασης, η ποσότητα του DNA στόχου διπλασιάζεται, με αποτέλεσμα μια εκθετική (γεωμετρική) ενίσχυση ενός θραύσματος DNA.
• Τελική επέκταση:Αυτό είναι το μόνο βήμα, που μερικές φορές εκτελείται στους 70-74°C για 5-15 λεπτά μετά τον τελευταίο κύκλο PCR, για να διασφαλιστεί ότι τυχόν εναπομείναν μονόκλωνο DNA έχει επεκταθεί πλήρως.
• Τελική προσδοκία:Αυτό το βήμα στους 4-15 °C επ' αόριστον μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να διατηρηθεί η αντίδραση σύντομη. Για να ελεγχθεί εάν η PCR έχει συνθέσει το αναμενόμενο θραύσμα DNA (επίσης μερικές φορές αναφέρεται ως "ενισχυτής" ή "ενισχυτής"), χρησιμοποιείται ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης για τον διαχωρισμό των προϊόντων PCR κατά μέγεθος. Το μέγεθος των προϊόντων PCR προσδιορίζεται με σύγκριση με μια κλίμακα DNA (δείκτης μοριακού βάρους) που περιέχει θραύσματα DNA γνωστού μεγέθους, που εκτελούνται σε ένα πήκτωμα μαζί με τα προϊόντα PCR.

Στάδια της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

Η διαδικασία PCR μπορεί να χωριστεί σε τρία στάδια:

1. Εκθετική Ενίσχυση: Κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου, η ποσότητα του προϊόντος διπλασιάζεται (υποθέτοντας 100% αποτελεσματικότητα αντίδρασης). Η αντίδραση είναι πολύ ευαίσθητη: χρειάζεται μόνο μια μικρή ποσότητα DNA.
2. Στάδιο ισοπέδωσης: η αντίδραση επιβραδύνεται καθώς η DNA πολυμεράση χάνει τη δραστικότητα και η κατανάλωση αντιδραστηρίων όπως dNTP και εκκινητές τα κάνει να γίνουν περιοριστικά .
3. Οροπέδιο: Το προϊόν δεν συσσωρεύεται πλέον λόγω της εξάντλησης των αντιδραστηρίων και των ενζύμων.

Βελτιστοποίηση PCR

Στην πράξη, η PCR μπορεί να αποτύχει για διάφορους λόγους, ιδίως λόγω της ευαισθησίας της στη μόλυνση, η οποία προκαλεί ενίσχυση των παραπροϊόντων DNA. Από αυτή την άποψη, έχει αναπτυχθεί ένας αριθμός τεχνικών και διαδικασιών για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών PCR. Η μόλυνση από ξένο DNA αντιμετωπίζεται με εργαστηριακά πρωτόκολλα και διαδικασίες που καθαρίζουν μείγματα προ-PCR πιθανών μολυντών DNA. Αυτό συνήθως περιλαμβάνει τον διαχωρισμό των κιτ PCR από τις περιοχές ανάλυσης ή καθαρισμού των προϊόντων PCR, τη χρήση πλαστικών σκευών μιας χρήσης και τον σχολαστικό καθαρισμό της επιφάνειας εργασίας μεταξύ των σταδίων αντίδρασης. Οι τεχνικές σχεδιασμού εκκινητών παίζουν σημαντικό ρόλο στη βελτίωση της απομόνωσης των προϊόντων PCR και στην αποφυγή σχηματισμού παραπροϊόντων, και η χρήση εναλλακτικών ρυθμιστικών συστατικών ή ενζύμων πολυμεράσης μπορεί να βοηθήσει στην ενίσχυση μακρών ή άλλως προβληματικών περιοχών DNA. Η προσθήκη αντιδραστηρίων όπως το φορμαμίδιο σε ρυθμιστικά συστήματα μπορεί να αυξήσει την ειδικότητα και την ανάκτηση της PCR. Μπορεί να πραγματοποιηθεί προσομοίωση θεωρητικών αποτελεσμάτων PCR (ηλεκτρονική PCR) σε υπολογιστή για να βοηθήσει στο σχεδιασμό του εκκινητή.

Εφαρμογή PCR

Επιλεκτική απομόνωση DNA

Η PCR επιτρέπει την απομόνωση θραυσμάτων DNA από γονιδιωματικό DNA με επιλεκτική ενίσχυση μιας συγκεκριμένης περιοχής DNA. Αυτή η εφαρμογή της PCR συμπληρώνει πολλές μεθόδους, όπως η δημιουργία ανιχνευτών υβριδισμού για κηλίδωση Southern ή Northern και μεθόδους κλωνοποίησης DNA, οι οποίες απαιτούν μεγάλες ποσότητες DNA που αντιπροσωπεύουν μια συγκεκριμένη περιοχή του DNA. Η PCR παρέχει αυτές τις μεθόδους με υψηλή περιεκτικότητα σε καθαρό DNA, που επιτρέπει την ανάλυση δειγμάτων DNA, ακόμη και με μικρή ποσότητα πρώτης ύλης.

Άλλες εφαρμογές της PCR περιλαμβάνουν τον προσδιορισμό αλληλουχίας DNA για την αναγνώριση άγνωστων ενισχυμένων με PCR αλληλουχιών, στις οποίες ένας από τους εκκινητές ενίσχυσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην αλληλουχία Sanger, απομόνωση αλληλουχίας DNA για την επιτάχυνση τεχνολογιών ανασυνδυασμένου DNA που περιλαμβάνουν την εισαγωγή μιας αλληλουχίας DNA σε ένα πλασμίδιο ή γενετικό υλικό ενός άλλου οργανισμού. Αποικίες βακτηρίων (E. coli) μπορούν να υποβληθούν σε ταχεία διαλογή με PCR για να διορθωθεί ο σχεδιασμός του DNA του φορέα. Η PCR μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για γενετικά δακτυλικά αποτυπώματα. μια τεχνική που χρησιμοποιείται στην ιατροδικαστική για την αναγνώριση ενός ατόμου ή ενός οργανισμού συγκρίνοντας το πειραματικό DNA χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους PCR.

Ορισμένες μέθοδοι PCR «δακτυλικών αποτυπωμάτων» έχουν υψηλή διακριτική δύναμη και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό γενετικών σχέσεων μεταξύ ατόμων, όπως γονέα-παιδιού ή μεταξύ αδελφών, και χρησιμοποιούνται σε τεστ πατρότητας. Αυτή η τεχνική μπορεί επίσης να εφαρμοστεί για τον προσδιορισμό των εξελικτικών σχέσεων μεταξύ των οργανισμών.

Ενίσχυση και ποσοτικοποίηση DNA

Εφόσον η PCR αυξάνει τον αριθμό αντιγράφων των περιοχών DNA-στόχων, η PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση πολύ μικρών ποσοτήτων δείγματος. Αυτό είναι συχνά κρίσιμο για ιατροδικαστικές έρευνες όπου μόνο ίχνη DNA είναι διαθέσιμα ως αποδεικτικά στοιχεία. Η PCR μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση αρχαίου DNA που είναι δεκάδων χιλιάδων ετών. Αυτές οι μέθοδοι PCR έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε ζώα όπως το μαμούθ ηλικίας 40.000 ετών, καθώς και σε ανθρώπινο DNA, σε εφαρμογές που κυμαίνονται από την ανάλυση αιγυπτιακών μούμιων μέχρι την αναγνώριση ενός Ρώσου τσάρου.

Οι ποσοτικές μέθοδοι PCR εκτιμούν την ποσότητα μιας δεδομένης αλληλουχίας που υπάρχει σε ένα δείγμα, μια μέθοδος που χρησιμοποιείται συχνά για τον ποσοτικό προσδιορισμό του επιπέδου έκφρασης γονιδίου. Η PCR πραγματικού χρόνου είναι ένα καθιερωμένο εργαλείο ποσοτικοποίησης DNA που μετρά τη συσσώρευση DNA προϊόντος μετά από κάθε κύκλο ενίσχυσης PCR.

PCR στη διάγνωση ασθενειών

Η PCR επιτρέπει την έγκαιρη διάγνωση κακοήθων ασθενειών όπως η λευχαιμία και το λέμφωμα, η οποία είναι σήμερα ιδιαίτερα ανεπτυγμένη στην έρευνα για τον καρκίνο και χρησιμοποιείται ήδη συστηματικά. Η PCR μπορεί να πραγματοποιηθεί απευθείας σε δείγματα γονιδιωματικού DNA για την ανίχνευση κακοήθων κυττάρων ειδικά για τη μετατόπιση με ευαισθησία που είναι τουλάχιστον 10.000 φορές υψηλότερη από άλλες μεθόδους.

Η PCR επιτρέπει επίσης την ανίχνευση ακαλλιέργητων ή βραδέως αναπτυσσόμενων οργανισμών όπως μυκοβακτήρια, αναερόβια βακτήρια και ιούς από ιστοκαλλιέργεια και ζωικά μοντέλα. Η βάση για διαγνωστικές εφαρμογές PCR στον τομέα της μικροβιολογίας είναι η αναγνώριση μολυσματικών παραγόντων και η διαφοροποίηση μη παθογόνων στελεχών από παθογόνα λόγω συγκεκριμένων γονιδίων.

Το DNA του ιού μπορεί επίσης να ανιχνευθεί με PCR. Οι εκκινητές πρέπει να είναι ειδικοί για τις αλληλουχίες DNA-στόχους του ιού και η PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διαγνωστικές δοκιμές DNA ή προσδιορισμό της αλληλουχίας του ιικού γονιδιώματος. Η υψηλή ευαισθησία της PCR καθιστά δυνατή την ανίχνευση ιών αμέσως μετά τη μόλυνση και ακόμη και πριν από την εμφάνιση της νόσου. Αυτή η έγκαιρη ανίχνευση του ιού θα μπορούσε να δώσει στους γιατρούς σημαντικές θεραπευτικές επιλογές. Η ποσότητα του ιού ("ιικό φορτίο") σε έναν ασθενή μπορεί επίσης να προσδιοριστεί με ποσοτική ανάλυση DNA που βασίζεται σε PCR.

Παραλλαγές στις βασικές μεθόδους αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

• Ειδική για αλληλόμορφη PCR: διαγνωστική μέθοδος ή μέθοδος κλωνοποίησης που βασίζεται σε μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς (SNPs) (διαφορές μιας βάσης στο DNA). Απαιτεί προηγούμενη γνώση της αλληλουχίας DNA, συμπεριλαμβανομένων των διαφορών μεταξύ των αλληλόμορφων, και χρησιμοποιεί εκκινητές των οποίων τα 3' άκρα εκτείνονται στα SNP. Η αυστηρή ενίσχυση PCR είναι πολύ λιγότερο αποτελεσματική παρουσία αναντιστοιχίας μεταξύ προτύπου και εκκινητή, επομένως επιτυχής ενίσχυση με ειδικό για SNP σήματα εκκινητών σχετικά με την παρουσία συγκεκριμένων SNPs στην αλληλουχία.
• Συγκρότημα PCR ή συγκρότημα κύκλου πολυμεράσης (PCP):τεχνητή σύνθεση μακρών αλληλουχιών DNA με PCR σε δεξαμενή μακρών ολιγονουκλεοτιδίων με μικρά επικαλυπτόμενα τμήματα. Τα ολιγονουκλεοτίδια εναλλάσσονται μεταξύ των κατευθύνσεων της λογικής και της αντιπληροφοριακής αλυσίδας και τα επικαλυπτόμενα τμήματα καθορίζουν τη σειρά των θραυσμάτων PCR, δημιουργώντας έτσι επιλεκτικά το τελικό προϊόν μακράς μήκους DNA.
• Ασύμμετρη PCR: ενισχύει κατά προτίμηση έναν κλώνο DNA σε ένα δίκλωνο πρότυπο DNA. Χρησιμοποιείται στην ανίχνευση αλληλουχίας και υβριδισμού όπου απαιτείται ενίσχυση μόνο ενός από τους δύο συμπληρωματικούς κλώνους. Η PCR πραγματοποιείται ως συνήθως, αλλά με μεγάλη περίσσεια εκκινητών για την αλυσίδα που προορίζεται για ενίσχυση. Λόγω της αργής (αριθμητικής προόδου) ενίσχυσης στο τέλος της αντίδρασης μετά τη χρήση ενός περιοριστικού εκκινητή, απαιτούνται επιπλέον κύκλοι PCR. Η τελευταία τροποποίηση αυτής της διαδικασίας, γνωστή ως "LATE-PCR" (γραμμικότητα μετά την εκθετική φάση - PCR) χρησιμοποιεί έναν περιοριστικό εκκινητή με υψηλότερο σημείο τήξης (Tm) από την περίσσεια του εκκινητή για να διατηρήσει την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης, καθώς η συγκέντρωση του περιοριστικού εκκινητή μειώνεται στη μέση της αντίδρασης.
• Dial-out PCR: μια εξαιρετικά παράλληλη μέθοδος για τη λήψη ακριβών μορίων DNA για τη σύνθεση γονιδίων. Η σύνθετη δεξαμενή μορίων DNA τροποποιείται από μοναδικές πλευρικές ετικέτες σε μαζική παράλληλη αλληλουχία. Οι εκκινητές που κατευθύνονται σε ετικέτα παρέχουν στη συνέχεια μόρια αλληλουχίας με PCR.
• Ενίσχυση εξαρτώμενη από ελικάση:παρόμοιο με την παραδοσιακή PCR, αλλά απαιτεί σταθερή θερμοκρασία από την ανακύκλωση μέσω των κύκλων μετουσίωσης και ανόπτησης/διαστολής. Η ελικάση DNA, ένα ένζυμο που ξετυλίγει το DNA, χρησιμοποιείται αντί για θερμική μετουσίωση.
• Hot start PCR: Μια τεχνική που μειώνει τη μη ειδική ενίσχυση κατά την αρχική ρύθμιση των βημάτων PCR. Μπορεί να γίνει με το χέρι με θέρμανση των συστατικών της αντίδρασης σε θερμοκρασία μετουσίωσης (π.χ. 95 °C) πριν από την προσθήκη της πολυμεράσης. Έχουν αναπτυχθεί εξειδικευμένα συστήματα ενζύμων που αναστέλλουν τη δράση πολυμεράσης σε θερμοκρασία δωματίου, είτε με δέσμευση αντισώματος είτε παρουσία ομοιοπολικά δεσμευμένων αναστολέων που διασπώνται μόνο μετά από ένα στάδιο ενεργοποίησης σε υψηλή θερμοκρασία. Η θερμή εκκίνηση/ψυχρό φινίρισμα PCR επιτυγχάνεται με νέες υβριδικές πολυμεράσες που είναι ανενεργές σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και ενεργοποιούνται άμεσα σε θερμοκρασία επιμήκυνσης.
• Ειδική PCR για διαμικροδορυφορική αλληλουχία (ISSR):Μέθοδος δακτυλικών αποτυπωμάτων PCR DNA που αυξάνει τον αριθμό αντιγράφων των περιοχών μεταξύ απλών επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών για να ληφθεί ένα μοναδικό δακτυλικό αποτύπωμα από το ενισχυμένο μήκος θραύσματος.
• Αντεστραμμένο PCRχρησιμοποιείται ευρέως για τον καθορισμό περιοχών αλληλουχίας γύρω από γονιδιωματικά ένθετα. Περιλαμβάνει μια σειρά από διασπάσεις DNA και αυτο-σύνδεση, με αποτέλεσμα γνωστές αλληλουχίες σε κάθε άκρο της άγνωστης αλληλουχίας.
• PCR με μεσολάβηση απολίνωσης:Χρησιμοποιεί μικρούς συνδέτες DNA που συνδέονται με το DNA που μας ενδιαφέρει και μερικούς εκκινητές συνδεδεμένους με τους συνδέτες DNA. χρησιμοποιείται για την αλληλουχία DNA, το περπάτημα του γονιδιώματος και το αποτύπωμα DNA.
• Ειδική για μεθυλίωση PCR(MSP): Αναπτύχθηκε από τους Stephen Bailin και Jim Herman στο Johns Hopkins School of Medicine, και χρησιμοποιείται για την ανίχνευση μεθυλίωσης των νησίδων CpG στο γονιδιωματικό DNA. Το DNA κατεργάζεται αρχικά με όξινο θειώδες νάτριο, το οποίο μετατρέπει τις μη μεθυλιωμένες βάσεις κυτοσίνης σε ουρακίλη, η οποία αναγνωρίζεται από τους εκκινητές PCR ως θυμίνη. Στη συνέχεια εκτελούνται δύο PCR στο τροποποιημένο DNA χρησιμοποιώντας σετ πανομοιότυπων εκκινητών εκτός από οποιαδήποτε νησίδα CpG εντός της αλληλουχίας εκκινητών. Σε αυτά τα σημεία, ένα σύνολο εκκινητών αναγνωρίζει το DNA με κυτοσίνες για να αυξήσει τον αριθμό αντιγράφων του μεθυλιωμένου DNA και ένα σύνολο αναγνωρίζει το DNA με ουρακίλη ή θυμίνη για να ενισχύσει το μη μεθυλιωμένο DNA. Το MSP χρησιμοποιώντας qPCR μπορεί επίσης να πραγματοποιηθεί για να ληφθούν ποσοτικές και όχι ποιοτικές πληροφορίες σχετικά με τη μεθυλίωση.
• Miniprimer - PCR:Χρησιμοποιούνται θερμοσταθερές πολυμεράσες (S-Tbr), οι οποίες μπορούν να εκτείνονται από βραχείς εκκινητές ("smalligo"), με αριθμό 9 ή 10 νουκλεοτιδίων. Αυτή η τεχνική επιτρέπει στην PCR να στοχεύει περιοχές που σχετίζονται με μικρότερους εκκινητές και χρησιμοποιείται για να ενισχύσει διατηρημένες αλληλουχίες DNA όπως το γονίδιο rRNA 16S (ή ευκαρυωτικό 18S).
• Ενίσχυση ανιχνευτή εξαρτώμενη από πολλαπλή απολίνωση (MLPA): επιτρέπει την ενίσχυση πολλαπλών στόχων με ένα μόνο ζεύγος εκκινητών, αποφεύγοντας έτσι τους περιορισμούς ανάλυσης της multiplex PCR.
• Multiplex PCRαποτελείται από πολλά σετ εκκινητών σε ένα μείγμα PCR προκειμένου να ληφθούν αμπλικόνια διαφορετικών μεγεθών που είναι ειδικά για διαφορετικές αλληλουχίες DNA. Με την εστίαση σε πολλά γονίδια ταυτόχρονα, είναι δυνατό να ληφθούν πρόσθετες πληροφορίες κατά τη διάρκεια μιας μόνο δοκιμής, η οποία διαφορετικά θα απαιτούσε πολλές φορές περισσότερα αντιδραστήρια και περισσότερο χρόνο για να πραγματοποιηθεί. Οι θερμοκρασίες ανόπτησης για κάθε σετ εκκινητών πρέπει να βελτιστοποιηθούν για να λειτουργούν σωστά σε μία μόνο αντίδραση και με μεγέθη αμπλικονίου. Δηλαδή, το μήκος του ζεύγους βάσεων τους πρέπει να είναι αρκετά διαφορετικό ώστε να σχηματίζονται διακριτές ζώνες όταν οραματίζονται με ηλεκτροφόρηση γέλης.
• Ένθετη PCR: αυξάνει την ειδικότητα της ενίσχυσης του DNA, μειώνοντας το φόντο λόγω μη ειδικής ενίσχυσης DNA. Δύο σετ εκκινητών χρησιμοποιούνται σε δύο διαδοχικές PCR. Στην πρώτη αντίδραση, χρησιμοποιείται ένα ζεύγος εκκινητών για τη σύνθεση προϊόντων DNA, τα οποία, εκτός από τον επιδιωκόμενο σκοπό, μπορεί να εξακολουθούν να αποτελούνται από μη ειδικά ενισχυμένα θραύσματα DNA. Τα προϊόντα στη συνέχεια χρησιμοποιούνται σε μια δεύτερη PCR με ένα σετ εκκινητών του οποίου οι θέσεις δέσμευσης είναι πλήρως ή εν μέρει διαφορετικές από τα 3' άκρα καθενός από τους εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην πρώτη αντίδραση. Η Nested PCR είναι συχνά πιο επιτυχημένη στην ειδική ενίσχυση μακρών θραυσμάτων DNA από παραδοσιακή PCR, αλλά απαιτεί πιο λεπτομερή γνώση των αλληλουχιών στόχων.
• PCR με επικαλυπτόμενες επεκτάσειςή μάτισμα με επικαλυπτόμενες προεκτάσεις(SOE): Μια τεχνική γενετικής μηχανικής που χρησιμοποιείται για τη σύνδεση δύο ή περισσότερων τεμαχίων DNA που περιέχουν συμπληρωματικές αλληλουχίες. Χρησιμοποιείται για τη σύνδεση τεμαχίων DNA που περιέχουν γονίδια που ρυθμίζουν αλληλουχίες ή μεταλλάξεις. η τεχνική επιτρέπει τη δημιουργία συγκεκριμένων και μακρών κατασκευών DNA.
• Ποσοτική PCR (QPCR):χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της ποσότητας του προϊόντος PCR (συνήθως σε πραγματικό χρόνο). Προσδιορίζει ποσοτικά τις αρχικές ποσότητες DNA, cDNA ή RNA. Η qPCR χρησιμοποιείται ευρέως για τον προσδιορισμό της παρουσίας μιας αλληλουχίας DNA σε ένα δείγμα και του αριθμού αντιγράφου της στο δείγμα. Η ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο έχει πολύ υψηλό βαθμό ακρίβειας. Οι μέθοδοι QRT-PCR (ή QF-PCR) χρησιμοποιούν φθορίζουσες βαφές όπως τα Sybr Green, EvaGreen ή ανιχνευτές DNA που περιέχουν φθοροφόρο όπως το TaqMan για τη μέτρηση της ποσότητας του ενισχυμένου προϊόντος σε πραγματικό χρόνο. Μερικές φορές αναφέρεται ως RT-PCR (PCR σε πραγματικό χρόνο) ή RQ-PCR. Η QRT-PCR ή η RTQ-PCR είναι πιο κατάλληλες συντομογραφίες καθώς η RT-PCR συνήθως αναφέρεται σε PCR αντίστροφης μεταγραφής που χρησιμοποιείται συχνά σε συνδυασμό με qPCR.
• PCR αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR):για να αυξηθεί ο αριθμός αντιγράφων του DNA από το RNA. Η αντίστροφη μεταγραφάση μεταγράφει το RNA σε cDNA, το οποίο στη συνέχεια ενισχύεται με PCR. Η RT-PCR χρησιμοποιείται ευρέως στο προφίλ έκφρασης για την ανίχνευση γονιδιακής έκφρασης ή για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας ενός μεταγράφου RNA, συμπεριλαμβανομένων των θέσεων έναρξης και διακοπής της μεταγραφής. Εάν η γονιδιωματική αλληλουχία DNA ενός γονιδίου είναι γνωστή, η RT-PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να χαρτογραφήσει τη θέση των εξονίων και των ιντρονίων στο γονίδιο. Το 5' άκρο ενός γονιδίου (που αντιστοιχεί στη θέση έναρξης της μεταγραφής) προσδιορίζεται συνήθως με RACE-PCR (ταχεία ενίσχυση των άκρων cDNA).
• PCR στερεάς φάσης: καλύπτει διάφορες έννοιες, συμπεριλαμβανομένης της "Ενίσχυσης Polonia" (όπου η PCR των αποικιών γίνεται σε μια μήτρα γέλης, για παράδειγμα), "Bridge PCR" (οι εκκινητές συνδέονται ομοιοπολικά σε μια στερεή επιφάνεια στήριξης), η παραδοσιακή PCR στερεάς φάσης (όπου "ασύμμετρη Η PCR" χρησιμοποιείται παρουσία εκκινητών που φέρουν στερεό υπόστρωμα με αλληλουχία που αντιστοιχεί σε έναν από τους υδατικούς εκκινητές) και ενισχυμένη PCR στερεάς φάσης (όπου η συμβατική PCR στερεάς φάσης μπορεί να βελτιωθεί χρησιμοποιώντας υψηλού Tm και ένθετους εκκινητές στερεού υποστήριξης με η επιλογή εφαρμογής θερμικού «βήματος» για την προώθηση του σχηματισμού ασταριών με σταθερή στήριξη).
• Thermal Asymmetric Interleaved PCR (TAIL-PCR):χρησιμοποιείται για την απομόνωση μιας άγνωστης ακολουθίας που ακολουθεί μια γνωστή αλληλουχία. Σε μια γνωστή αλληλουχία, το TAIL-PCR χρησιμοποιεί ένα ένθετο ζεύγος εκκινητών με διαφορετικές θερμοκρασίες ανόπτησης. Το εκφυλισμένο εκκινητή χρησιμοποιείται για ενίσχυση σε διαφορετική κατεύθυνση από την άγνωστη αλληλουχία.
• Touchdown PCR (Step PCR):μια παραλλαγή PCR που στοχεύει στη μείωση του μη ειδικού υποβάθρου με σταδιακή μείωση της θερμοκρασίας ανόπτησης καθώς προχωρούν οι κύκλοι PCR. Η θερμοκρασία ανόπτησης στους αρχικούς κύκλους είναι τυπικά μερικούς βαθμούς (3-5°C) πάνω από το Tm των εκκινητών που χρησιμοποιούνται, ενώ στους επόμενους κύκλους, η θερμοκρασία είναι μερικούς βαθμούς (3-5°C) κάτω από το Tm του αστάρια. Οι υψηλότερες θερμοκρασίες δίνουν μεγαλύτερη εξειδίκευση για τη δέσμευση του εκκινητή και οι χαμηλότερες θερμοκρασίες επιτρέπουν πιο αποτελεσματική ενίσχυση από συγκεκριμένα προϊόντα που παράγονται κατά τη διάρκεια των αρχικών κύκλων.
• PAN-AC: Χρησιμοποιεί ισοθερμικές συνθήκες για ενίσχυση και μπορεί να εφαρμοστεί σε ζωντανά κύτταρα.
• Καθολική γρήγορη βόλτα στο γονιδίωμα: για το περπάτημα του γονιδιώματος και τη γενετική δακτυλική αποτύπωση με τη χρήση πιο ειδικής "διπλής" PCR από τις παραδοσιακές "μονόπλευρες" προσεγγίσεις (χρησιμοποιώντας μόνο έναν ειδικό για το γονίδιο εκκινητή και έναν κοινό εκκινητή - που μπορεί να οδηγήσει σε τεχνητό "θόρυβο") λόγω του μηχανισμού , συμπεριλαμβανομένου του σχηματισμού μιας δομής λάσο. Απλοποιημένα παράγωγα του UFW είναι το "Lane RAGE" (lasso nested PCR για ταχεία ενίσχυση των άκρων του γονιδιωματικού DNA), το "5" RACE Lane" και το "3" RACE Lane.
• ΣεπυρίτιοPCR(ψηφιακή PCR, εικονική PCR, e-PCR, e-PCR) αναφέρεται σε υπολογιστικά εργαλεία που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό των αποτελεσμάτων μιας θεωρητικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης χρησιμοποιώντας ένα δεδομένο σύνολο εκκινητών (ανιχνευτών) για την ενίσχυση αλληλουχιών DNA από ένα γονιδίωμα ή μεταγραφικό στοιχείο αλληλουχίας.

Ιστορικό PCR

Σε ένα άρθρο του Journal of Molecular Biology το 1971, οι Kleppe et al., περιέγραψαν για πρώτη φορά μια μέθοδο που χρησιμοποιεί ενζυματικό προσδιορισμό για την αντιγραφή ενός σύντομου προτύπου DNA με εκκινητές υπό συνθήκες in vitro. Ωστόσο, αυτή η πρώιμη εκδήλωση της βασικής αρχής της PCR δεν έλαβε ιδιαίτερη προσοχή και η εφεύρεση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης το 1983 γενικά πιστώνεται στον Carey Mullis.

Όταν ο Mullis ανέπτυξε την PCR το 1983, εργαζόταν στο Emeryville της Καλιφόρνια για την Cetus Corporation, μια πρώιμη εταιρεία βιοτεχνολογίας. Εκεί ήταν υπεύθυνος για τη σύνθεση μικρών αλυσίδων DNA. Ο Mullis έγραψε ότι συνέλαβε την PCR ενώ οδηγούσε στον αυτοκινητόδρομο της ακτής του Ειρηνικού ένα βράδυ με το αυτοκίνητό του. Έπαιξε στο μυαλό του έναν νέο τρόπο ανάλυσης των αλλαγών (μεταλλαγών) στο DNA όταν συνειδητοποίησε ότι αντίθετα είχε εφεύρει μια μέθοδο για την αύξηση του αριθμού αντιγράφων οποιουδήποτε τμήματος του DNA μέσω επαναλαμβανόμενων κύκλων διπλασιασμού που προκαλούνται από την πολυμεράση DNA. Στο Scientific American, ο Mullis συνόψισε τη διαδικασία: «Ξεκινώντας με ένα μόνο μόριο γενετικού υλικού DNA, η PCR μπορεί να δημιουργήσει 100 δισεκατομμύρια τέτοια μόρια σε μια μέρα. Αυτή η αντίδραση εκτελείται εύκολα. Δεν απαιτεί τίποτα περισσότερο από έναν δοκιμαστικό σωλήνα, μερικά απλά αντιδραστήρια και μια πηγή θερμότητας». Του απονεμήθηκε το Νόμπελ Χημείας το 1993 για την εφεύρεσή του, επτά χρόνια αργότερα όταν ο ίδιος και οι συνάδελφοί του στο Cetus έκαναν πράξη την πρότασή του για πρώτη φορά. Ωστόσο, εξακολουθεί να υπάρχει κάποια διαμάχη σχετικά με την πνευματική και πρακτική συνεισφορά άλλων επιστημόνων στο έργο του Mullis, και το εάν ήταν ο μοναδικός εφευρέτης της αρχής της PCR.

Η μέθοδος PCR βασίζεται στη χρήση κατάλληλης πολυμεράσης DNA ικανής να αντέχει τις υψηλές θερμοκρασίες >90°C (194°F) που απαιτούνται για τη διάσπαση των δύο κλώνων του DNA στη διπλή έλικα του DNA μετά από κάθε κύκλο αντιγραφής. Οι πολυμεράσες DNA, που αρχικά χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα in vitro, που προαναγγέλλονταν από την PCR, δεν ήταν σε θέση να αντέξουν τόσο υψηλές θερμοκρασίες. Επομένως, οι πρώιμες διαδικασίες αντιγραφής του DNA ήταν πολύ αναποτελεσματικές και χρονοβόρες και απαιτούσαν μεγάλες ποσότητες DNA πολυμεράσης και συνεχή επεξεργασία σε όλη τη διαδικασία.

Ανακάλυψη το 1976 της πολυμεράσης Taq, μιας πολυμεράσης DNA που απομονώθηκε από ένα θερμόφιλο βακτήριο, Thermusaquaticus, που φυσικά ζει σε ζεστά (50 έως 80°C (122 έως 176°F)) περιβάλλοντα όπως θερμές πηγές, άνοιξε το δρόμο για μια δραματική βελτίωση στη μέθοδο PCR. DNA πολυμεράση που απομονώθηκε από Τ.Aquaticus, είναι σταθερό σε υψηλές θερμοκρασίες και παραμένει ενεργό ακόμα και μετά τη μετουσίωση του DNA, εξαλείφοντας έτσι την ανάγκη προσθήκης νέων πολυμερασών DNA μετά από κάθε κύκλο. Αυτό κατέστησε δυνατή την αυτοματοποίηση της διαδικασίας ενίσχυσης του DNA με βάση έναν θερμικό κυκλωτή.

Πόλεμοι διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας

Η προτεινόμενη μέθοδος PCR κατοχυρώθηκε με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας από τον Carey Mullis και πιστώνεται στην Cetus Corporation όπου εργαζόταν ο Mullis όταν εφηύρε την τεχνική το 1983. Το ένζυμο πολυμεράσης Taq έχει επίσης προστατευθεί με διπλώματα ευρεσιτεχνίας. Υπήρξαν αρκετές αγωγές υψηλού προφίλ που σχετίζονται με τη μεθοδολογία, συμπεριλαμβανομένης μιας ανεπιτυχούς αγωγής που κατατέθηκε από την DuPont. Η φαρμακευτική εταιρεία Hoffmann-La Roche απέκτησε τα δικαιώματα των διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας το 1992 και σήμερα κατέχει εκείνα που εξακολουθούν να προστατεύονται.

Μια παρόμοια μάχη για τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας για το ένζυμο πολυμεράση Taq συνεχίζεται ακόμη σε ορισμένες δικαιοδοσίες σε όλο τον κόσμο μεταξύ της Roche και της Promega. Τα νομικά επιχειρήματα ξεπέρασαν τους όρους των αρχικών διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας PCR και Taq πολυμεράσης, τα οποία έληξαν στις 28 Μαρτίου 2005.

SEI HPE "Κρατική Ιατρική Ακαδημία Krasnoyarsk

πήρε το όνομά του από την Ομοσπονδιακή Υπηρεσία Υγείας και Κοινωνικής Ανάπτυξης Yasenetsky »

Τμήμα Ιατρικής Γενετικής και Κλινικής Νευροφυσιολογίας, IPO

ΚΥΡΙΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

ΑΛΥΣΙΔΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ

Μεθοδικό εγχειρίδιο για μαθητές 3-4 μαθημάτων

στις ειδικότητες γενικής ιατρικής (060101) και

Krasnoyarsk - 2007

Shnaider, N. A., Butyanov, R. A. Βασικές αρχές της μεθόδου αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Μεθοδολογικό εγχειρίδιο εξωσχολικής εργασίας σπουδαστών 3-4 μαθημάτων των ειδικοτήτων γενικής ιατρικής (060101) και παιδιατρικής (060103). - Krasnoyarsk: Εκδοτικός οίκος GOU VPO KrasGMA, 2007. - 42σ.

Το μεθοδολογικό εγχειρίδιο συμμορφώνεται πλήρως με τις απαιτήσεις του κρατικού προτύπου (2000) και αντικατοπτρίζει τις κύριες πτυχές της σύγχρονης μεθόδου για τη διάγνωση κληρονομικών ανθρώπινων ασθενειών - τη μέθοδο αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, το εκπαιδευτικό υλικό είναι προσαρμοσμένο στις εκπαιδευτικές τεχνολογίες, λαμβάνοντας υπόψη τις ιδιαιτερότητες εκπαίδευσης σε 3-4 μαθήματα ιατρικών και παιδιατρικών σχολών.

Αξιολογητές:Προϊστάμενος του Τμήματος Ιατρικής Γενετικής, Κρατικό Εκπαιδευτικό Ίδρυμα Ανώτατης Επαγγελματικής Εκπαίδευσης

"Κρατικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο του Νοβοσιμπίρσκ της Ομοσπονδιακής Υπηρεσίας Υγείας και Κοινωνικής Ανάπτυξης", Διδάκτωρ Ιατρικών Επιστημών, Καθηγητής.

Αντιγραφή DNA

Αντικείμενο μελέτης αυτής της μεθόδου είναι το Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA). Το DNA είναι ένας παγκόσμιος φορέας γενετικής πληροφορίας σε όλους τους οργανισμούς που υπάρχουν στη Γη (με εξαίρεση τους μικροοργανισμούς που περιέχουν RNA). Το DNA είναι ένας διπλός κλώνος στριμμένος σε έλικα. Κάθε κλώνος αποτελείται από νουκλεοτίδια συνδεδεμένα σε σειρά. Οι κλώνοι DNA έχουν την αντίθετη κατεύθυνση: το 5'-άκρο ενός κλώνου αντιστοιχεί στο 3'-άκρο του δεύτερου κλώνου. Η μοναδική ιδιότητα του DNA είναι η ικανότητά του να διπλασιάζεται. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται αντιγραφή. Η αντιγραφή του μορίου του DNA λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της συνθετικής περιόδου της ενδιάμεσης φάσης. Κάθε μία από τις δύο αλυσίδες του «γονικού» μορίου χρησιμεύει ως πρότυπο για την «κόρη». Μετά την αντιγραφή, το νεοσυντιθέμενο μόριο DNA περιέχει έναν "μητρικό" κλώνο και το δεύτερο - μια "κόρη", που έχει πρόσφατα συντεθεί (ημι-συντηρητική μέθοδος). Για τη σύνθεση εκμαγείου ενός νέου μορίου DNA, είναι απαραίτητο το παλιό μόριο να απελευθερωθεί και να τεντωθεί. Ο αναδιπλασιασμός ξεκινά σε διάφορες θέσεις στο μόριο του DNA. Η τομή ενός μορίου DNA από την αρχή μιας αντιγραφής έως την έναρξη μιας άλλης ονομάζεται αντίγραφο.

Η έναρξη της αναπαραγωγής είναι ενεργοποιημένη αστάρια(σπόροι), που αποτελούνται από 100-200 ζεύγη βάσεων. Το ένζυμο ελικάση DNA ξετυλίγει και διαχωρίζει τη μητρική έλικα DNA σε δύο κλώνους, πάνω στους οποίους, σύμφωνα με την αρχή της συμπληρωματικότητας, με τη συμμετοχή του ενζύμου DNA πολυμεράσης, συναρμολογούνται «θυγατρικές» κλώνοι DNA. Προκειμένου το ένζυμο να ξεκινήσει τη δουλειά του, απαιτείται η παρουσία ενός μπλοκ εκκίνησης - ένα μικρό αρχικό δίκλωνο θραύσμα. Το αρχικό μπλοκ σχηματίζεται όταν ο εκκινητής αλληλεπιδρά με τη συμπληρωματική περιοχή του αντίστοιχου κλώνου του μητρικού DNA. Σε κάθε ρεπλικόνιο, η DNA πολυμεράση μπορεί να κινηθεί κατά μήκος του «μητρικού» κλώνου προς μία μόνο κατεύθυνση (5`=>3`).

Στο κύριο σκέλος, καθώς το ρεπλικόνιο ξετυλίγεται, ένας κλώνος "κόρη" σταδιακά μεγαλώνει συνεχώς. Στο υστερούμενο σκέλος, το θυγατρικό σκέλος συντίθεται επίσης προς την κατεύθυνση (5`=>3`), αλλά σε ξεχωριστά θραύσματα καθώς το ρεπλικόνιο ξετυλίγεται.

Έτσι, η προσκόλληση των συμπληρωματικών νουκλεοτιδίων των «θυγατρικών» κλώνων πηγαίνει σε αντίθετες κατευθύνσεις (αντιπαράλληλη). Η αναπαραγωγή σε όλα τα αντίγραφα πραγματοποιείται ταυτόχρονα. Θραύσματα και μέρη "θυγατρικών" κλώνων που συντίθενται σε διαφορετικά αντίγραφα συνδέονται σε έναν μόνο κλώνο από μια ενζυμική λιγάση. Η αντιγραφή χαρακτηρίζεται από ημι-συντήρηση, αντιπαραλληλισμό και ασυνέχεια. Ολόκληρο το γονιδίωμα ενός κυττάρου αντιγράφεται μία φορά ανά χρονική περίοδο που αντιστοιχεί σε έναν μιτωτικό κύκλο. Ως αποτέλεσμα της διαδικασίας αντιγραφής, δύο μόρια DNA σχηματίζονται από ένα μόριο DNA, στο οποίο ο ένας κλώνος είναι από το μητρικό μόριο DNA και ο δεύτερος, το θυγατρικό, συντίθεται πρόσφατα (Εικ. 1).

Ρύζι. 1. Διάγραμμα αντιγραφής μορίου DNA.

Έτσι, ο κύκλος αντιγραφής του DNA περιλαμβάνει τρία βασικά στάδια:

1. ξετύλιγμα της έλικας του DNA και απόκλιση κλώνων (μετουσίωσης).

2. προσάρτηση ασταριών.

3. συμπλήρωση της αλυσίδας του παιδικού νήματος.

Αρχή της μεθόδου PCR

Ήταν η αντιγραφή του DNA που αποτέλεσε τη βάση της PCR. Στην PCR, οι διαδικασίες που αναφέρονται παραπάνω πραγματοποιούνται σε δοκιμαστικό σωλήνα σε κυκλικό τρόπο. Η μετάβαση από το ένα στάδιο της αντίδρασης στο άλλο επιτυγχάνεται με αλλαγή της θερμοκρασίας του μίγματος επώασης. Όταν το διάλυμα θερμαίνεται στους 93-95°C, λαμβάνει χώρα μετουσίωση του DNA. Για να προχωρήσετε στο επόμενο βήμα - την προσθήκη ή "ανόπτηση" των εκκινητών - το μίγμα επώασης ψύχεται στους 50-65°C. Στη συνέχεια, το μείγμα θερμαίνεται στους 70-72°C - η βέλτιστη λειτουργία της πολυμεράσης taq-DNA - σε αυτό το στάδιο, ολοκληρώνεται ένας νέος κλώνος DNA. Στη συνέχεια ο κύκλος επαναλαμβάνεται ξανά. Με άλλα λόγια Η μέθοδος PCR είναι μια πολλαπλή αύξηση του αριθμού των αντιγράφων (ενίσχυση) ένα συγκεκριμένο τμήμα DNA που καταλύεται από το ένζυμο DNA πολυμεράση.

Η επέκταση των θυγατρικών κλώνων DNA πρέπει να συμβεί ταυτόχρονα και στους δύο κλώνους του μητρικού DNA, επομένως η αντιγραφή του δεύτερου κλώνου απαιτεί επίσης το δικό του εκκινητή. Έτσι, δύο εκκινητές εισάγονται στο μίγμα αντίδρασης: ένας για την "+"-αλυσίδα, ο δεύτερος για την "-"-αλυσίδα. Έχοντας ενώσει τους αντίθετους κλώνους του μορίου DNA, οι εκκινητές περιορίζονται σε αυτό το τμήμα του, το οποίο στη συνέχεια θα διπλασιαστεί ή θα ενισχυθεί επανειλημμένα. Το μήκος ενός τέτοιου θραύσματος, το οποίο ονομάζεται αμπλικόνιο, είναι συνήθως αρκετές εκατοντάδες νουκλεοτίδια.

Βήματα PCR

Κάθε κύκλος ενίσχυσης περιλαμβάνει 3 στάδια που συμβαίνουν σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας (Εικ. 2).

· Στάδιο 1:Μετουσίωσης DNA . Ρέει στις 93-95° για 30-40 δευτερόλεπτα.

· Στάδιο 2:ανόπτηση ασταριού . Η προσκόλληση εκκινητή λαμβάνει χώρα συμπληρωματικά προς τις αντίστοιχες αλληλουχίες σε αντίθετους κλώνους DNA στα όρια μιας συγκεκριμένης περιοχής. Κάθε ζεύγος ασταριών έχει τη δική του θερμοκρασία ανόπτησης, οι τιμές της οποίας είναι στην περιοχή 50-65°C. Χρόνος ανόπτησης 20-60 sec.

· Στάδιο 3:επέκταση των αλυσίδων DNA Συμπληρωματική επέκταση των αλυσίδων DNA εμφανίζεται από το άκρο 5" έως το άκρο 3" της αλυσίδας σε αντίθετες κατευθύνσεις, ξεκινώντας από τις θέσεις προσάρτησης του εκκινητή. Το υλικό για τη σύνθεση νέων αλυσίδων DNA είναι τριφωσφορικοί δεοξυριβονουκλεοζίτες που προστίθενται στο διάλυμα. Η διαδικασία σύνθεσης καταλύεται από το ένζυμο taq-πολυμεράση και λαμβάνει χώρα σε θερμοκρασία 70-72°C. Χρόνος σύνθεσης - 20-40 sec.

Οι νέοι κλώνοι DNA που σχηματίστηκαν στον πρώτο κύκλο ενίσχυσης χρησιμεύουν ως μήτρες για τον δεύτερο κύκλο ενίσχυσης, στον οποίο σχηματίζεται ένα συγκεκριμένο θραύσμα DNA αμπλικονίου (Εικ. 3). Σε επόμενους κύκλους ενίσχυσης, τα αμπλικόνια χρησιμεύουν ως πρότυπο για τη σύνθεση νέων αλυσίδων.

Έτσι, τα αμπλικόνια συσσωρεύονται στο διάλυμα σύμφωνα με τον τύπο 2", όπου n είναι ο αριθμός των κύκλων ενίσχυσης. Επομένως, ακόμη κι αν μόνο ένα μόριο δίκλωνου DNA ήταν αρχικά στο αρχικό διάλυμα, περίπου 108 μόρια αμπλικονίου συσσωρεύονται στο διάλυμα στο 30-40 κύκλοι Αυτή η ποσότητα είναι επαρκής για αξιόπιστη οπτική ανίχνευση αυτού του θραύσματος με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.

Η διαδικασία ενίσχυσης πραγματοποιείται σε ειδικό προγραμματιζόμενο θερμοστάτη ( ποδηλάτης), το οποίο, σύμφωνα με ένα δεδομένο πρόγραμμα, αλλάζει αυτόματα τις θερμοκρασίες ανάλογα με τον αριθμό των κύκλων ενίσχυσης.

Τα ακόλουθα στοιχεία απαιτούνται για την ενίσχυση:

· Πρότυπο DNA(DNA ή μέρος αυτού που περιέχει το επιθυμητό ειδικό θραύσμα).

· Primers(συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια (20-30 ζεύγη νουκλεοτιδίων) συμπληρωματικά σε αλληλουχίες DNA στα όρια του συγκεκριμένου θραύσματος που προσδιορίζεται). Η επιλογή ενός συγκεκριμένου θραύσματος και η επιλογή εκκινητών παίζουν σημαντικό ρόλο στην ειδικότητα της ενίσχυσης, η οποία επηρεάζει την ποιότητα της ανάλυσης.

· Ένα μείγμα τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων (dNTPs)(ένα μείγμα τεσσάρων dNTP, τα οποία αποτελούν το υλικό για τη σύνθεση νέων συμπληρωματικών κλώνων DNA σε ισοδύναμες συγκεντρώσεις 200-500 microns)

· ΕνζυμοTaq- πολυμεράση(θερμοσταθερή πολυμεράση DNA, που καταλύει την επιμήκυνση των αλυσίδων εκκινητών με διαδοχική προσθήκη νουκλεοτιδικών βάσεων στην αναπτυσσόμενη αλυσίδα του συντιθέμενου DNA, 2-3 mm).

· ρυθμιστικό διάλυμα(μέσο αντίδρασης που περιέχει ιόντα Mg2+ απαραίτητα για τη διατήρηση της ενζυμικής δραστηριότητας, PH 6,8-7,8).

Για να προσδιοριστούν συγκεκριμένες περιοχές του γονιδιώματος των ιών RNA, ένα αντίγραφο DNA λαμβάνεται πρώτα από ένα πρότυπο RNA χρησιμοποιώντας μια αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής (RT) που καταλύεται από το ένζυμο ανάστροφη μεταγραφάση (αντίστροφη μεταγραφάση).

Ρύζι. 2. Ενίσχυση (1ος κύκλος).

Ρύζι. 3. Ενίσχυση (2ος κύκλος).

Κύριες εφαρμογές της PCR

κλινικό φάρμακο:

o διάγνωση λοιμώξεων,

o εντοπισμός μεταλλάξεων, συμπεριλαμβανομένης της διάγνωσης κληρονομικών ασθενειών,

o προσδιορισμός γονότυπου, συμπεριλαμβανομένου του γονότυπου HLA,

o κυψελοειδείς τεχνολογίες

οικολογία (ως τρόπος παρακολούθησης της κατάστασης και της ποιότητας των περιβαλλοντικών αντικειμένων και των τροφίμων)

ορισμός των διαγονιδιακών οργανισμών (ΓΤΟ)

Ταυτοποίηση, πατρότητα, ιατροδικαστική

γενική και ειδική βιολογία,

Βασικές αρχές

οργάνωση διαγνωστικών εργαστηρίων

Οι εργασίες στο εργαστήριο PCR πραγματοποιούνται σύμφωνα με τους "Κανόνες για το σχεδιασμό, την ασφάλεια, τη βιομηχανική υγιεινή, το αντιεπιδημικό καθεστώς και την προσωπική υγιεινή κατά την εργασία σε εργαστήρια (τμήματα, τμήματα) υγειονομικών και επιδημιολογικών ιδρυμάτων του συστήματος υγειονομικής περίθαλψης.

Μόλυνση δειγμάτων DNA

Η διεξαγωγή διαγνωστικών PCR σχετίζεται με πρόβλημα που προκαλείται από την υψηλή ευαισθησία της μεθόδου - η δυνατότητα μόλυνση. Εάν εισέλθουν ίχνη θετικού DNA στο σωλήνα αντίδρασης (ειδικά προϊόντα ενίσχυσης DNA - αμπλικόνια, πρότυπο DNA που χρησιμοποιείται ως θετικός μάρτυρας, θετικό DNA ενός κλινικού δείγματος) οδηγεί σε ενίσχυση ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA κατά τη διάρκεια της PCR και, ως αποτέλεσμα, σε την εμφάνιση ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων.

Κατά τη διάρκεια της εργασίας, μπορεί να συναντήσετε δύο είδη μόλυνσης:

1. διασταυρούμενη μόλυνσηαπό δείγμα σε δείγμα (κατά την επεξεργασία κλινικών δειγμάτων ή κατά την εκσκαφή του μείγματος αντίδρασης), που οδηγεί στην εμφάνιση σποραδικών ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων.

2. επιμόλυνση προϊόντος ενίσχυσης(amplicons), το οποίο είναι ύψιστης σημασίας, γιατί κατά τη διαδικασία PCR, τα amplicons συσσωρεύονται σε τεράστιες ποσότητες και είναι ιδανικά προϊόντα για επανενίσχυση.

Η ίχνη μόλυνσης πιάτων, αυτόματων πιπέτων και εργαστηριακού εξοπλισμού με αμπλικόνη, η επιφάνεια των εργαστηριακών τραπεζιών ή ακόμα και η επιφάνεια του δέρματος των εργαζομένων στο εργαστήριο οδηγεί στην εμφάνιση συστηματικών ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων. Ο προσδιορισμός της πηγής μόλυνσης μπορεί να είναι πολύ δύσκολος και απαιτεί σημαντική επένδυση χρόνου και χρήματος. Η εμπειρία που έχει συσσωρευτεί μέχρι σήμερα στις εργασίες των εργαστηρίων με τη χρήση της μεθόδου PCR για τη διάγνωση μας επιτρέπει να διαμορφώσουμε τις βασικές απαιτήσεις για την οργάνωση τέτοιων εργαστηρίων και τη διεξαγωγή των ίδιων των αναλύσεων. Η συμμόρφωση με αυτές τις απαιτήσεις εξαλείφει την πιθανότητα μόλυνσης και λήψης ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων.

Στάδια ανάλυσης PCR

Γεωγραφικά διαχωρισμένα, τοποθετώντας τα σε ξεχωριστά δωμάτια (Εικ. 4.5):

· Αίθουσα Pre-PCR,όπου πραγματοποιείται επεξεργασία κλινικών δειγμάτων, εκχύλιση DNA, προετοιμασία του μείγματος αντίδρασης για PCR και PCR (εάν υπάρχουν διαθέσιμες συνθήκες, τα δύο τελευταία βήματα συνιστάται επίσης να πραγματοποιηθούν σε επιπλέον ξεχωριστό δωμάτιο). Σε αυτούς τους χώρους απαγορεύεται η διεξαγωγή όλων των άλλων τύπων εργασιών με τους μελετηθέντες παράγοντες, η διάγνωση PCR των οποίων διενεργείται σε αυτό το εργαστήριο.

· Αίθουσα μετά την PCR,όπου πραγματοποιείται η ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης. Σε αυτό το δωμάτιο μπορούν να χρησιμοποιηθούν άλλες μέθοδοι ανίχνευσης. Είναι επιθυμητό να εντοπιστεί ο χώρος για την ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης όσο το δυνατόν πιο μακριά από τα δωμάτια προ-PCR.

Οι αίθουσες εργασίας είναι εξοπλισμένες με λαμπτήρες υπεριώδους με μέγιστη ακτινοβολία στην περιοχή των 260 nm (τύπου DB-60) με ρυθμό 2,5 W ανά 1 m3. Οι λαμπτήρες τοποθετούνται έτσι ώστε οι επιφάνειες των τραπεζιών εργασίας, ο εξοπλισμός και τα υλικά με τα οποία έρχεται σε επαφή ο χειριστής κατά την ανάλυση PCR να εκτίθενται σε άμεση ακτινοβολία. Η ακτινοβόληση πραγματοποιείται εντός 1 ώρας πριν από την έναρξη της εργασίας και εντός 1 ώρας μετά το τέλος της εργασίας.

Οι εργαστηριακοί γιατροί εργάζονται με ειδικά εργαστηριακά ρούχα, τα οποία αλλάζουν όταν μετακινούνται από το ένα δωμάτιο στο άλλο, και με γάντια μιας χρήσης. Η επεξεργασία ρούχων από διαφορετικά δωμάτια πραγματοποιείται χωριστά. Διαφορετικοί υπάλληλοι εργάζονται σε διαφορετικά στάδια της ανάλυσης PCR.

Για εργασία, χρησιμοποιούνται ξεχωριστά σετ διανομέων, πλαστικών και γυαλικών, εργαστηριακού εξοπλισμού, ρόμπες και γάντια, σχεδιασμένα για διάφορα στάδια ανάλυσης και μη φορητά από το ένα δωμάτιο στο άλλο. Ο εξοπλισμός, τα υλικά και το απόθεμα σε κάθε δωμάτιο επισημαίνονται ανάλογα.

Όλα τα στάδια της εργασίας εκτελούνται μόνο με τη χρήση αναλώσιμων μιας χρήσης: άκρες για αυτόματες πιπέτες, δοκιμαστικούς σωλήνες, γάντια κ.λπ. Φροντίστε να αλλάζετε τις άκρες όταν μετακινείστε από δείγμα σε δείγμα. Είναι απαραίτητο να χρησιμοποιήσετε άκρες με φίλτρο φραγμού αερολύματος για να αποτρέψετε την είσοδο μικροσταγονιδίων του διαλύματος στην πιπέτα. Οι χρησιμοποιημένοι δοκιμαστικοί σωλήνες και τα άκρα απορρίπτονται σε ειδικά δοχεία ή δοχεία που περιέχουν απολυμαντικό διάλυμα. Τα κλινικά δείγματα αποθηκεύονται χωριστά από τα αντιδραστήρια.

Για την επεξεργασία και τον καθαρισμό του χώρου εργασίας, κάθε δωμάτιο διαθέτει μπατονέτες-γάζας (πετσέτες), τσιμπιδάκια, απολυμαντικά και διαλύματα αδρανοποίησης.

Στο διαγνωστικό εργαστήριο PCR, οι εργασίες που σχετίζονται με την παραγωγή (κλωνοποίηση) και την απομόνωση ανασυνδυασμένων πλασμιδίων που περιέχουν αλληλουχίες DNA ή θραύσματα γονιδίων παθογόνων που διαγιγνώσκονται σε αυτό το εργαστήριο αποκλείονται.

Συλλογή κλινικού υλικού

Το υλικό που μελετήθηκε για την PCR μπορεί να είναι αποξέσεις επιθηλιακών κυττάρων, αίματος, πλάσματος, ορού, υπεζωκοτικού και εγκεφαλονωτιαίου υγρού, ούρων, πτυέλων, βλέννας και άλλων βιολογικών εκκρίσεων, δείγματα βιοψίας.

Η δειγματοληψία του υλικού πραγματοποιείται στις συνθήκες του θαλάμου θεραπείας του αντίστοιχου προφίλ. Μετά τη δειγματοληψία, τα δείγματα θα πρέπει να μεταφερθούν στο διαγνωστικό εργαστήριο PCR το συντομότερο δυνατό.

Η δειγματοληψία πρέπει να πραγματοποιείται με αποστειρωμένα όργανα, κατά προτίμηση μιας χρήσης, μόνο σε αποστειρωμένους πλαστικούς σωλήνες μιας χρήσης ή γυάλινους σωλήνες, προεπεξεργασμένους για μία ώρα με μείγμα χρωμίου, πλυμένο καλά με απεσταγμένο νερό και φρύξη σε φούρνο σε θερμοκρασία 150 ° C για 1 ώρα.

Ζώνη ανίχνευσης (άλλος όροφος ή άλλο κτίριο).

Ρύζι. 4. Εργαστηριακή συσκευή PCR με ανίχνευση με ηλεκτροφόρηση.

Ζώνη ανίχνευσης (διαφορετικός όροφος ή κτίριο)

Ρύζι. 5. Εργαστηριακή συσκευή PCR με ανίχνευση φθορισμού (ποσοτική ανάλυση).

Ρύζι. 6. Αίθουσα εξαγωγής DNA.Εμφανίζεται ένα επιτραπέζιο κουτί με βακτηριοκτόνο λαμπτήρα.

Ρύζι. 7. αίθουσα ενίσχυσης.

Ρύζι. 8. Αίθουσα ανίχνευσης.

Ρύζι. 9. Δείγματα αίματος για διάγνωση DNA κληρονομικών ασθενειών.

Αποθήκευση και μεταφορά δειγμάτων

Για τη διάγνωση των κληρονομικών ασθενειών, τα δείγματα αίματος αποθηκεύονται σε ειδικές χάρτινες φόρμες ή σε epindorf (πλαστικοί δοκιμαστικοί σωλήνες) σε παγωμένη κατάσταση για μεγάλο χρονικό διάστημα (Εικ. 9).

Για τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών, τα δείγματα διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου για όχι περισσότερο από 2 ώρες. Εάν απαιτείται μεγαλύτερη αποθήκευση, τα δείγματα μπορούν να τοποθετηθούν σε ψυγείο σε θερμοκρασία 2-8°C για περίοδο που δεν υπερβαίνει τις 24 ώρες. Η μεγαλύτερη αποθήκευση (έως 2 εβδομάδες) είναι αποδεκτή όταν καταψύχεται σε κατάψυξη σε θερμοκρασία μείον 20°C. Δεν επιτρέπεται η επαναλαμβανόμενη κατάψυξη-απόψυξη των δειγμάτων.

Εάν το διαγνωστικό εργαστήριο PCR και η αίθουσα διαδικασιών για τη δειγματοληψία είναι χωρισμένα εδαφικά, τότε τα δείγματα θα πρέπει να μεταφέρονται σε θερμοδοχεία ή θερμικά δοχεία σύμφωνα με τους κανόνες αποθήκευσης δειγμάτων και τους κανόνες μεταφοράς μολυσματικών υλικών.

Εξαγωγή DNA από δείγματα

Η μέθοδος προσρόφησης στερεάς φάσης, η οποία συνίσταται στην προσθήκη ενός παράγοντα λύσης που περιέχει διάλυμα γουανιδίνης, ρόφηση DNA σε ροφητή, επαναλαμβανόμενη πλύση και επαναρρόφηση του DNA με ρυθμιστικό διάλυμα, έχει γίνει ευρέως διαδεδομένη. Στην περίπτωση επεξεργασίας ορού, πλάσματος ή πλήρους αίματος, συνήθως χρησιμοποιείται η μέθοδος της εκχύλισης με φαινόλη. Η μέθοδος περιλαμβάνει αποπρωτεϊνοποίηση με φαινόλη/χλωροφόρμιο ακολουθούμενη από καθίζηση DNA (ή RNA) με αιθανόλη ή ισοπροπανόλη. Η επεξεργασία πραγματοποιείται σε δοκιμαστικούς σωλήνες μικροφυγοκέντρησης τύπου Eppendor P με όγκο 1,5 ml. Ο χρόνος επεξεργασίας είναι 1,5-2 ώρες (Εικ. 10).

Ρύζι. 10. Απομόνωση DNA.

Διεξαγωγή PCR

Ορισμένη ποσότητα δείγματος από το επεξεργασμένο κλινικό δείγμα μεταφέρεται σε ειδικό σωλήνα μικροφυγόκεντρου τύπου Eppendorf με όγκο 0,2 ή 0,5 ml. Ένα μείγμα ενίσχυσης που αποτελείται από νερό, ρυθμιστικό PCR, διάλυμα dNTP, διάλυμα εκκινητή και διάλυμα προστίθεται στο Το ίδιο σωληνάριο Taq-πολυμεράση (προστέθηκε τελευταία στο μείγμα) Τυπικά, ο όγκος του μείγματος αντίδρασης είναι 25 μl Στη συνέχεια προστίθεται μία σταγόνα ορυκτέλαιο σε κάθε σωλήνα για να αποτραπεί η εξάτμιση του μίγματος της αντίδρασης κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης. Οι σωλήνες μεταφέρονται σε έναν προγραμματιζόμενο θερμοστάτη (ενισχυτή), όπου η ενίσχυση πραγματοποιείται σε αυτόματη λειτουργία σύμφωνα με ένα δεδομένο πρόγραμμα (Εικ. 11).

Ρύζι. έντεκα. Ενισχυτής " Θερμοκυκλωτής ».

Ο χρόνος αντίδρασης, ανάλογα με το δεδομένο πρόγραμμα, είναι 2-3 ώρες. Παράλληλα με τα πειραματικά δείγματα τοποθετούνται δείγματα ελέγχου: ο θετικός μάρτυρας περιλαμβάνει όλα τα συστατικά της αντίδρασης, αλλά αντί για το υλικό του κλινικού δείγματος εισάγεται ένα παρασκεύασμα DNA ελέγχου του υπό μελέτη γονιδίου. Ο αρνητικός έλεγχος περιλαμβάνει όλα τα συστατικά της αντίδρασης, αλλά αντί για το κλινικό υλικό ή το παρασκεύασμα DNA, προστίθεται κατάλληλη ποσότητα απιονισμένου νερού ή εκχυλίσματος που δεν περιέχει το μελετημένο DNA. Απαιτείται αρνητικός έλεγχος για τον έλεγχο των συστατικών της αντίδρασης για απουσία DNA σε αυτά λόγω μόλυνσης και για τον αποκλεισμό ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων.

Καταχώρηση αποτελεσμάτων

Το ενισχυμένο ειδικό θραύσμα DNA ανιχνεύεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης παρουσία βρωμιούχου αιθιδίου. Το βρωμιούχο αιθίδιο σχηματίζει μια σταθερή ενδιάμεση ένωση με θραύσματα DNA, η οποία εμφανίζεται ως φωτεινές ζώνες όταν το πήκτωμα ακτινοβολείται με ακτινοβολία UV με μήκος κύματος 290-330 nm. Ανάλογα με το μέγεθος των αμπλικονίων PCR που προκύπτουν, χρησιμοποιείται ένα πήκτωμα που περιέχει 1,5% έως 2,5% αγαρόζη. Για να παρασκευαστεί ένα πήκτωμα αγαρόζης, ένα μείγμα αγαρόζης, ρυθμιστικού διαλύματος και νερού τήκεται σε φούρνο μικροκυμάτων ή σε λουτρό νερού και προστίθεται ένα διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου. Ψύχεται στους 50-60°C, το μείγμα χύνεται στο καλούπι με ένα στρώμα πάχους 4-6 mm και χρησιμοποιώντας ειδικές χτένες, φτιάχνονται τσέπες στο πήκτωμα για την εφαρμογή του δείγματος. Οι χτένες τοποθετούνται με τέτοιο τρόπο ώστε να παραμένει ένα στρώμα αγαρόζης 0,5-1 mm μεταξύ του πυθμένα των φρεατίων και της βάσης της γέλης. Αφού στερεοποιηθεί η γέλη, εφαρμόζεται ενίσχυση στους θύλακες σε ποσότητα 5-15 μl. Συνιστάται η διεξαγωγή ηλεκτροφόρησης ενός μείγματος δεικτών μήκους θραυσμάτων DNA παράλληλα με δείγματα ελέγχου και πειραματικά. Τυπικά, ένα τέτοιο μίγμα περιέχει δέκα θραύσματα DNA 100, 200, 300, κ.λπ. μακρών ζευγών βάσεων.

Η ρύθμιση ενός τέτοιου δείγματος σάς επιτρέπει να επαληθεύσετε το μήκος των αμπλικονίων στα δείγματα ελέγχου και στα πειραματικά δείγματα. Το πήκτωμα με το εφαρμοσμένο δείγμα μεταφέρεται σε θάλαμο ηλεκτροφόρησης γεμάτο με ρυθμιστικό διάλυμα, ο θάλαμος συνδέεται με πηγή ισχύος και ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των προϊόντων ενίσχυσης πραγματοποιείται για 30-45 λεπτά σε ένταση ηλεκτρικού πεδίου 10-15 V/cm. Σε αυτή την περίπτωση, το μπροστινό μέρος της βαφής, που αποτελεί μέρος του μείγματος αντίδρασης, πρέπει να περάσει τουλάχιστον 3 cm.

Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, το πήκτωμα μεταφέρεται στο γυαλί του transilluminator και παρατηρείται στο υπεριώδες φως. Για τεκμηρίωση, η γέλη φωτογραφίζεται σε φιλμ Mikrat 300 ή εγγράφεται χρησιμοποιώντας ένα σύστημα βίντεο συνδεδεμένο σε υπολογιστή.

Τα δείγματα ελέγχου αξιολογούνται πρώτα. Στην ηλεκτροφορητική λωρίδα που αντιστοιχεί στον θετικό μάρτυρα, θα πρέπει να υπάρχει μια πορτοκαλί φωτεινή ταινία. Η ηλεκτροφορητική του κινητικότητα θα πρέπει να αντιστοιχεί στο μήκος του ενισχυτικού που καθορίζεται στις οδηγίες.

Στην ηλεκτροφορητική τροχιά που αντιστοιχεί στον αρνητικό έλεγχο, μια τέτοια ζώνη θα πρέπει να απουσιάζει. Η παρουσία μιας τέτοιας ζώνης στον αρνητικό έλεγχο υποδηλώνει μόλυνση - μόλυνση των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται με το μελετημένο DNA ή το αμπλικόνιο. Τα δείγματα δοκιμής αξιολογούνται από την παρουσία στην αντίστοιχη λωρίδα μιας ζώνης που βρίσκεται στο ίδιο επίπεδο με τη ζώνη στο δείγμα θετικού ελέγχου. Η ένταση της λάμψης της ζώνης αντιστοιχεί στην ποσότητα του υπό μελέτη DNA στο δείγμα, γεγονός που επιτρέπει μια ημιποσοτική αξιολόγηση της PCR. Συνήθως τα θετικά αποτελέσματα αξιολογούνται σε μια κλίμακα τεσσάρων βαθμών. Εάν η λάμψη της ζώνης στο πειραματικό δείγμα είναι πολύ ασθενής, τότε ένα τέτοιο δείγμα θα πρέπει να αναδιαταχθεί (Εικ. 12).

Ρύζι. 12. Ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης.

Εφαρμογές PCR γιαδιάγνωση σημειακών μεταλλάξεων και γονιδιακών πολυμορφισμών

Ένας από τους κορυφαίους τομείς εφαρμογής της PCR στην πρακτική υγειονομική περίθαλψη είναι η διάγνωση σημειακών μεταλλάξεων και γονιδιακών πολυμορφισμών. . Υπάρχουν άμεσες και έμμεσες μέθοδοι διάγνωσης DNA. Σε εκείνες τις περιπτώσεις όπου είναι γνωστό ένα γονίδιο, η βλάβη του οποίου οδηγεί στην ανάπτυξη μιας κληρονομικής ασθένειας, αυτή η βλάβη μπορεί να ανιχνευθεί με μοριακές γενετικές μεθόδους. Τέτοιες μέθοδοι ονομάζονται άμεσες. Χρησιμοποιώντας άμεσες μεθόδους, ανιχνεύονται διαταραχές στην πρωτογενή νουκλεοτιδική αλληλουχία του DNA (μεταλλάξεις και οι τύποι τους). Οι άμεσες μέθοδοι χαρακτηρίζονται από ακρίβεια που φτάνει σχεδόν το 100%.

Ωστόσο, στην πράξη, αυτές οι μέθοδοι μπορούν να εφαρμοστούν υπό ορισμένες προϋποθέσεις.:

με γνωστό κυτταρογενετικό εντοπισμό του γονιδίου που είναι υπεύθυνο για την ανάπτυξη μιας κληρονομικής νόσου.

Το γονίδιο της νόσου πρέπει να κλωνοποιηθεί και να είναι γνωστή η νουκλεοτιδική του αλληλουχία.

Ο στόχος της άμεσης διάγνωσης DNA είναι ο εντοπισμός μεταλλαγμένων αλληλόμορφων.

Έτσι, σε εκείνες τις περιπτώσεις όπου είναι γνωστό τι είδους βλάβη του DNA οδηγεί σε μια κληρονομική ασθένεια, το θραύσμα DNA που περιέχει τη βλάβη εξετάζεται απευθείας, δηλαδή χρησιμοποιείται η άμεση μέθοδος διάγνωσης του DNA.

Ωστόσο, μέχρι σήμερα, τα γονίδια πολλών ασθενειών δεν έχουν χαρτογραφηθεί, η οργάνωση εξωνίου-ιντρονίου τους είναι άγνωστη και πολλές κληρονομικές ασθένειες χαρακτηρίζονται από έντονη γενετική ετερογένεια, η οποία δεν επιτρέπει την πλήρη χρήση άμεσων διαγνωστικών μεθόδων DNA. Επομένως, σε περιπτώσεις όπου ο εντοπισμός της βλάβης δεν είναι γνωστός, χρησιμοποιείται μια διαφορετική προσέγγιση, που σχετίζεται με τη μελέτη της γειτνίασης του γονιδίου που ευθύνεται για τη γονιδιακή νόσο, σε συνδυασμό με οικογενειακή ανάλυση, δηλαδή έμμεσες μεθόδους μοριακής γενετικής διάγνωσης. κληρονομικών ασθενειών χρησιμοποιούνται.

Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορες μέθοδοι για την ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων και μικρών διαγραφών, αλλά όλες βασίζονται στη χρήση της μεθόδου PCR. Αυτή η αντίδραση σάς επιτρέπει να πολλαπλασιάσετε επανειλημμένα την αλληλουχία νουκλεοτιδίων του DNA και στη συνέχεια να αναζητήσετε μεταλλάξεις. Οι μέθοδοι αναζήτησης για θραύσματα DNA που φέρουν μεταλλάξεις βασίζονται σε μια συγκριτική ανάλυση μεταλλαγμένων και φυσιολογικών αλληλουχιών νουκλεοτιδίων DNA.

Ανάλυση προϊόντων PCR

στη διαδικασία της άμεσης διάγνωσης του DNA

Περιλαμβάνει τη μελέτη συγκεκριμένων χαρακτηριστικών της ενισχυμένης περιοχής του γονιδίου. Έτσι, σε ασθένειες που προκαλούνται από την επέκταση των επαναλήψεων τρινουκλεοτιδίων, τα προϊόντα ενίσχυσης διαφέρουν ως προς το μήκος τους (αντανακλώντας διαφορετικό αριθμό τριδύμων στην περιοχή του γονιδίου που μελετήθηκε) και, ως αποτέλεσμα, στην ταχύτητα κίνησής τους στο πήκτωμα. Λόγω αυτού, επιτυγχάνεται σαφής ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός φυσιολογικών και μεταλλαγμένων αλληλόμορφων και ακριβής προσδιορισμός του παθολογικά επιμηκυμένου θραύσματος, δηλαδή διάγνωση DNA της νόσου (Εικ. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Ρύζι. 14. Διάγνωση διαγραφής ΦΙΜΩΤΡΟ στο γονίδιο DYT 1 σε ασθενείς με δυστονία ανεξάρτητη από τη ντόπα (ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου). Κομμάτια 2,3,6 - άρρωστος. λωρίδες 1,4,5 - έλεγχος. Το λεπτό βέλος υποδεικνύει το κανονικό αλληλόμορφο, το έντονο βέλος δείχνει το μεταλλαγμένο βραχύτερο αλληλόμορφο (διαγραφή τριών νουκλεοτιδίων).

Εάν η υπό μελέτη περιοχή DNA περιλαμβάνεται εξ ολοκλήρου σε μια εκτεταμένη διαγραφή, τότε η ενίσχυση PCR του DNA από αυτό το διαγραμμένο αλληλόμορφο δεν θα πραγματοποιηθεί λόγω της έλλειψης θέσεων για υβριδισμό εκκινητών. Σε αυτή την περίπτωση, θα διαγνωστεί μια ομόζυγη διαγραφή με βάση την πλήρη απουσία του προϊόντος PCR της αντίδρασης (η σύνθεση DNA είναι αδύνατη και από τα δύο αντίγραφα του γονιδίου). Με μια ετερόζυγη διαγραφή, είναι δυνατό να ανιχνευθεί ένα προϊόν PCR που συντίθεται από ένα φυσιολογικό (ασφαλές) αλληλόμορφο, ωστόσο, για αξιόπιστη διάγνωση μιας τέτοιας μετάλλαξης, είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθούν πιο εξελιγμένες μέθοδοι οπτικοποίησης DNA που επιτρέπουν την εκτίμηση της δόσης του τελικού Προϊόν PCR.

Για την ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων (τις περισσότερες φορές υποκαταστάσεις νουκλεοτιδίων) σε ορισμένες θέσεις, η μέθοδος PCR χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλες μεθόδους μοριακής γενετικής ανάλυσης. Εάν η θέση και η φύση της προτεινόμενης σημειακής μετάλλαξης είναι επακριβώς γνωστά, τότε για τη σκόπιμη ανίχνευση μιας τέτοιας μετάλλαξης, περιοριστικές ενδονουκλεάσες (περιορισμούς) είναι ειδικά κυτταρικά ένζυμα που απομονώνονται από διάφορα στελέχη βακτηρίων.

Αυτά τα ένζυμα αναγνωρίζουν συγκεκριμένες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων που κυμαίνονται από τέσσερα έως δέκα νουκλεοτίδια σε μήκος. Στη συνέχεια πραγματοποιούν περιορισμό (λατ. (κοπή) αυτών των αλληλουχιών ως μέρος ενός μορίου δίκλωνου DNA. Κάθε περιοριστικό ένζυμο αναγνωρίζει και κόβει σε ένα σταθερό μέρος μια αυστηρά καθορισμένη, ειδική αλληλουχία νουκλεοτιδίων - τοποθεσία περιορισμού (τόπος αναγνώρισης).

Σε περιπτώσεις όπου μια σημειακή μετάλλαξη αλλάζει τη φυσική θέση αναγνώρισης για ένα συγκεκριμένο ένζυμο περιορισμού, αυτό το ένζυμο δεν θα μπορεί να διασπάσει το μεταλλαγμένο ενισχυμένο με PCR θραύσμα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η μετάλλαξη οδηγεί στην εμφάνιση μιας νέας θέσης αναγνώρισης για ένα συγκεκριμένο ένζυμο περιορισμού, το οποίο απουσιάζει στον κανόνα.

Και στις δύο περιπτώσεις, τα μεταλλαγμένα και κανονικά προϊόντα PCR που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το επιλεγμένο ένζυμο περιορισμού θα δώσουν περιοριστικά θραύσματα διαφορετικού μήκους, τα οποία μπορούν εύκολα να ανιχνευθούν με ηλεκτροφόρηση (Εικ. 15).

Έτσι, εάν είναι απαραίτητο να ανιχνευθεί γρήγορα οποιαδήποτε συγκεκριμένη σημειακή μετάλλαξη, η εργασία περιορίζεται στην αναζήτηση του αντίστοιχου ενζύμου περιορισμού, η θέση αναγνώρισης του οποίου εντοπίζεται στη θέση της διαταραγμένης αλληλουχίας νουκλεοτιδίων. Η θεραπεία προϊόντων PCR με αυτό το ένζυμο περιορισμού θα επιτρέψει την εύκολη διαφοροποίηση των φυσιολογικών και μεταλλαγμένων αλληλόμορφων. Η ανάλυση περιορισμού απλοποιεί σημαντικά την ανίχνευση γνωστών σημειακών μεταλλάξεων και σήμερα χρησιμοποιείται ευρέως για την άμεση διάγνωση DNA κληρονομικών ασθενειών.

τελικό στάδιο μοριακή γενετική ανάλυση μεταλλάξεωνείναι ο προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του θραύσματος DNA που μελετήθηκε (sequencing), η οποία συγκρίνεται με τον κανόνα και διατυπώνεται η τελική γενετική διάγνωση. Χάρη στην πρόοδο της μοριακής γενετικής, έχουν αναπτυχθεί πλέον διαγνωστικές μέθοδοι DNA για περισσότερες από 400 κληρονομικές ασθένειες.

Ρύζι. 15. Ανίχνευση σημειακής μετάλλαξης χρησιμοποιώντας ανάλυση περιορισμού:Α - ενισχυτή περιοχή του γονιδίου που περιέχει μια θέση περιορισμούAGCTγια περιοριστική ενδονουκλεάσηAlu Εγώ. Μετάλλαξησολ→ ΕΝΑαλλάζει αυτή την αλληλουχία νουκλεοτιδίων, με αποτέλεσμα το ένζυμο περιορισμούAluiμπλοκαρισμένο? Β - ηλεκτροφερόγραμμα προϊόντων περιορισμού: λωρίδα 1 - ομοζυγωτία για το κανονικό αλληλόμορφο. λωρίδα 2, ομοζυγωτία για τη μετάλλαξη. λωρίδα 3 - ετερόζυγη κατάσταση (φυσιολογικό αλληλόμορφο + μετάλλαξη).

Η διάγνωση κληρονομικών ασθενειών με βάση την άμεση εξέταση μεταλλαγμένων αλληλόμορφων σε ασθενείς, μέλη της οικογένειάς τους ή εικαζόμενους ετερόζυγους φορείς παθολογικών μεταλλάξεων είναι κατάλληλη για προσυμπτωματική και προγεννητική διάγνωση, η οποία μπορεί να εφαρμοστεί στα πρώτα στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, πριν την εμφάνιση τυχόν κλινικά ή βιοχημικά συμπτώματα.ασθένεια.

Ανεξάρτητα από τη μέθοδο ανίχνευσης μεταλλάξεων, ο ακριβής μοριακός χαρακτηρισμός κάθε μετάλλαξης μπορεί να επιτευχθεί μόνο με άμεση αλληλούχιση. Για την αυτοματοποίηση αυτής της διαδικασίας, τα τελευταία χρόνια, χρησιμοποιούνται ευρέως ειδικές συσκευές - sequencer, που καθιστούν δυνατή τη σημαντική επιτάχυνση της διαδικασίας ανάγνωσης πληροφοριών DNA.

Ο δρόμος για μια ευρύτερη εφαρμογή της μοριακής βιολογικής έρευνας σε κλινικά διαγνωστικά εργαστήρια ανοίγει επιταχύνοντας την αναλυτική διαδικασία εκτελώντας όλες τις διαδικασίες σε ένα συνεχές, χωρίς μεταφορά δείγματος, δημιουργώντας συνθήκες για την αποφυγή μόλυνσης κατά την παράλληλη δοκιμή ορισμένων αναλυτών και με αντικειμενική καταχώριση των αποτελεσμάτων σε κάθε κύκλο.

Κύριες τροποποιήσεις της μεθόδου PCR

Χρησιμοποιείται για γρήγορη σάρωση και αναζήτηση γνωστών γονιδιακών μεταλλάξεων.

Multiplex (multiprimer) PCR

Αυτή η μέθοδος βασίζεται στην ταυτόχρονη ενίσχυση πολλών εξονίων του μελετημένου γονιδίου σε μία αντίδραση. Αυτό επιτρέπει την οικονομική ταχεία διαλογή των πιο κοινών μεταλλάξεων. Για παράδειγμα, για τη γρήγορη διάγνωση της μεταφοράς διαγραφών στο γονίδιο της δυστροφίνης σε ασθενείς με προοδευτική μυϊκή δυστροφία Duchenne/Becker, πραγματοποιείται ταυτόχρονη ενίσχυση του συνόλου των πιο συχνά μεταλλαγμένων εξονίων αυτού του γονιδίου. Δεδομένου ότι αυτές οι ασθένειες κληρονομούνται σε έναν υπολειπόμενο τύπο που συνδέεται με Χ και σχετίζονται με βλάβη στο μόνο χρωμόσωμα Χ στα αγόρια, σε περίπτωση εκτεταμένης διαγραφής, η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της αντίδρασης θα αποκαλύψει την απουσία ενός ή περισσότερων θραυσμάτων DNA (εξόνια ), το οποίο μπορεί να χρησιμεύσει ως μοριακή επιβεβαίωση της διάγνωσης. Επιπλέον, με την επιλογή συγκεκριμένων περιοχών γονιδίου για ενίσχυση PCR, είναι δυνατή μια αρκετά ακριβής εκτίμηση του συνολικού μήκους των σημείων διαγραφής και γονιδιακής θραύσης (μέχρι το εξόνιο).

Η συνδυασμένη χρήση πολλών πολυπλεξικών αντιδράσεων καθιστά δυνατή τη διάγνωση έως και 98% όλων των διαγραφών που συμβαίνουν σε ασθενείς με προοδευτική μυϊκή δυστροφία Duchenne/Becker. Αυτό είναι περίπου το 60% του συνολικού αριθμού των γνωστών μεταλλάξεων στο γονίδιο της δυστροφίνης και υποδηλώνει μια πολύ υψηλή αποτελεσματικότητα αυτής της μεθόδου διαλογής για τη διάγνωση DNA της δυστροφινοπάθειας (Εικ. 16).

Ρύζι. 16. Άμεση διάγνωση DNA της μυϊκής δυστροφίας Duchenne με χρήση multiplex PCR (ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης). Σε καθένα από τα άτομα που εξετάστηκαν, τέσσερα εξόνια του γονιδίου της δυστροφίνης ενισχύθηκαν ταυτόχρονα (εξόνια 17, 19, 44 και 45· τα βέλη δείχνουν τα αντίστοιχα προϊόντα ενίσχυσης). Λωρίδα 1 - έλεγχος, λωρίδες 2-5 - ασθενείς με μυϊκή δυστροφία Duchenne με διάφορες διαγραφές του γονιδίου δυστροφίνης (λωρίδες 2 και 5 - διαγραφή εξονίου 45, λωρίδα 3 - διαγραφή εξονίου 44, λωρίδα 4 - διαγραφή εξονίου 17 και 19 ).

Ειδική για αλληλόμορφη ενίσχυση

Η μέθοδος βασίζεται στη χρήση δύο ανεξάρτητων ζευγών εκκινητών για μια συγκεκριμένη περιοχή του γονιδίου: ένας εκκινητής και στα δύο ζεύγη είναι κοινός και ο δεύτερος εκκινητής σε κάθε ζεύγος έχει διαφορετική δομή και είναι συμπληρωματικός είτε με φυσιολογικές είτε με μεταλλαγμένες αλληλουχίες DNA . Ως αποτέλεσμα μιας τέτοιας αντίδρασης σε διάλυμα, μπορούν να συντεθούν ταυτόχρονα δύο τύποι προϊόντων PCR - φυσιολογικό και μεταλλαγμένο. Επιπλέον, ο σχεδιασμός των εκκινητών που χρησιμοποιούνται καθιστά δυνατή τη σαφή διαφοροποίηση των κανονικών και μεταλλαγμένων προϊόντων ενίσχυσης με βάση το μοριακό τους μέγεθος. Αυτή η μέθοδος είναι πολύ σαφής και σας επιτρέπει να επαληθεύσετε τόσο την ομο- όσο και την ετερόζυγη μεταφορά του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου.

Μέθοδος για τοποκατευθυνόμενη τροποποίηση του ενισχυμένου DNA

Η μέθοδος βασίζεται στη χρήση στην PCR του λεγόμενου εκκινητή ασυμφωνίας (όχι πλήρως συμπληρωματικό του εκμαγείου), ο οποίος διαφέρει από την αλληλουχία DNA του εκμαγείου κατά ένα νουκλεοτίδιο. Ως αποτέλεσμα της συμπερίληψης του καθορισμένου εκκινητή στη σύνθεση του μεταλλαγμένου προϊόντος PCR, σχηματίζεται σε αυτό μια τεχνητά δημιουργημένη θέση περιορισμού για μια από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες, η οποία επιτρέπει την άμεση διάγνωση DNA μιας συγκεκριμένης γνωστής μετάλλαξης χρησιμοποιώντας περιοριστική ανάλυση. Η δημιουργία μιας τέτοιας τεχνητής θέσης περιορισμού μπορεί να είναι απαραίτητη εάν η έρευνα δεν αποκάλυψε την ύπαρξη ενός γνωστού και προσβάσιμου ενζύμου, η «φυσική» θέση περιορισμού του οποίου επηρεάζεται ως αποτέλεσμα της εμφάνισης της μελετημένης μετάλλαξης στο μόριο DNA .

Μέθοδος PCR αντίστροφης μεταγραφάσης (RT- PCR)

Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται σε περιπτώσεις όπου είναι πιο βολικό να χρησιμοποιηθεί όχι γονιδιωματικό DNA ως αντικείμενο μελέτης, αλλά ένα πιο συμπαγές και πλούσιο σε πληροφορίες cDNA που λαμβάνεται μετά από κατάλληλη επεξεργασία δειγμάτων ιστού, όπως υλικό βιοψίας ή κυτταρικές σειρές λεμφοκυττάρων, ινοβλάστες , κλπ. Σημαντική προϋπόθεση εδώ είναι η έκφραση (τουλάχιστον ελάχιστη) του επιθυμητού γονιδίου στον υπό μελέτη ιστό.

Στο πρώτο στάδιο, πραγματοποιείται αντίστροφη μεταγραφή του mRNA και τα προκύπτοντα μόρια cDNA χρησιμεύουν ως πρότυπο για PCR. Στη συνέχεια, η κρίσιμη περιοχή cDNA που ενισχύεται σε επαρκή ποσότητα υποβάλλεται σε προσδιορισμό αλληλουχίας και άλλες μεθόδους διαλογής μεταλλάξεων, άμεση ηλεκτροφορητική μελέτη (ανίχνευση διαγραφών, εισαγωγές κ.λπ.) ή ενσωμάτωση σε ένα σύστημα έκφρασης προκειμένου να ληφθεί ένα πρωτεϊνικό προϊόν και η άμεση ανάλυσή του .

Αυτή η μέθοδος είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική για την ανίχνευση μεταλλάξεων που οδηγούν στη σύνθεση μιας «κολοβωμένης» πρωτεΐνης (ανόητες μεταλλάξεις, μεταλλάξεις ματίσματος, μεγάλες διαγραφές) - η λεγόμενη ανάλυση PTT (Protein Truncation Test). Η ανάλυση PTT χρησιμοποιείται συνήθως κατά την εξέταση εκτεταμένων γονιδίων πολλαπλών εξονίων, όπως το γονίδιο για μυϊκή δυστροφία Duchenne/Becker, αταξία-τελαγγειεκτασία ή νευροϊνωμάτωση τύπου 1.

PCR σε πραγματικό χρόνο(PCR σε πραγματικό χρόνο)

Κάθε χρόνο, στην πρακτική υγειονομική περίθαλψη, η PCR σε πραγματικό χρόνο γίνεται μια ολοένα και πιο δημοφιλής διαγνωστική μέθοδος. Το θεμελιώδες χαρακτηριστικό του είναι η παρακολούθηση και η ποσοτική ανάλυση της συσσώρευσης προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και η αυτόματη καταχώρηση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Αυτή η μέθοδος δεν απαιτεί ένα βήμα ηλεκτροφόρησης, το οποίο μειώνει τις απαιτήσεις για ένα εργαστήριο PCR. Χάρη στην εξοικονόμηση χώρου παραγωγής, τη μείωση του αριθμού προσωπικού και τη ζήτηση για ποσοτικοποίηση DNA/RNA, αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται με επιτυχία τα τελευταία χρόνια στα μεγαλύτερα υγειονομικά επιδημικά, διαγνωστικά και ερευνητικά κέντρα στις αναπτυγμένες χώρες του κόσμου. αντικατάσταση της PCR στην τρέχουσα ("κλασική") μορφή της.

Η PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιεί φθορίζοντα επισημασμένους ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές για την ανίχνευση του DNA κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης. Η PCR σε πραγματικό χρόνο επιτρέπει την πλήρη ανάλυση ενός δείγματος εντός 20-60 λεπτών και είναι θεωρητικά ικανή να ανιχνεύσει ακόμη και ένα μόριο DNA ή RNA σε ένα δείγμα.

Ρύζι. 17. PCR σε πραγματικό χρόνο.

Η PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιεί το σύστημα TaqMan για τον έλεγχο της κινητικής της PCR απευθείας κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης χρησιμοποιώντας σβέση συντονισμού φθορισμού. Για ανίχνευση, χρησιμοποιείται ένας ανιχνευτής που φέρει ένα φθοροφόρο και έναν αποσβεστήρα συμπληρωματικό στο μεσαίο τμήμα του ενισχυμένου θραύσματος. Όταν το φθοροφόρο και ο αποσβεστήρας συνδέονται με τον ολιγονουκλεοτιδικό ανιχνευτή, παρατηρείται μόνο μια μικρή ποσότητα φθορίζουσας εκπομπής. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ενίσχυσης, λόγω της δραστικότητας 5'-εξωνουκλεάσης της πολυμεράσης Taq, η φθορίζουσα ετικέτα περνά στο διάλυμα, απελευθερώνεται από την περιοχή του αποσβεστήρα και δημιουργεί ένα φθορίζον σήμα που αυξάνεται σε πραγματικό χρόνο ανάλογα με τη συσσώρευση του ενίσχυση (Εικ. 17).

Κύρια πλεονεκτήματα της PCR-Real-Time έναντι της PCR με ηλεκτροφόρηση γέλης:

Η όλη μέθοδος λαμβάνει χώρα σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα.

· Η μέθοδος διαρκεί 1 ώρα.

Αρκετές 1-2 αίθουσες εργασίας.

Μαζί με μια ποιοτική αξιολόγηση του αποτελέσματος, καθίσταται δυνατή η ποσοτικοποίησή του (για παράδειγμα, όταν συνταγογραφείται αντιική θεραπεία για AIDS ή ιογενή ηπατίτιδα, είναι απαραίτητο να γνωρίζουμε το ιικό φορτίο, δηλαδή την ποσότητα του ιού ανά 1 μονάδα, η οποία παρέχει πραγματική -time PCR);

· Μειώνει δραματικά τον κίνδυνο μόλυνσης.

συμπέρασμα

Η μέθοδος PCR είναι μια από τις πιο κοινές μεθόδους μοριακής βιολογικής έρευνας. Αυτή η μέθοδος θα πρέπει να χρησιμοποιείται με νόημα από τους κλινικούς γιατρούς και ένας γιατρός που αποφασίζει να χρησιμοποιήσει PCR στην εργασία του πρέπει να έχει ορισμένες γνώσεις σχετικά με τα χαρακτηριστικά και τις δυνατότητες αυτής της μεθόδου. Δεύτερον, πρέπει να υπάρχει στενή ανατροφοδότηση μεταξύ του κλινικού ιατρού και του εργαστηρίου PCR, η οποία είναι απαραίτητη για την ανάλυση πολύπλοκων περιπτώσεων και την ανάπτυξη της σωστής διαγνωστικής στρατηγικής. Τρίτον, η ανάλυση PCR δεν αποτελεί πανάκεια στη διάγνωση (κυρίως μολυσματικών ασθενειών) και δεν αντικαθιστά τις υπάρχουσες ερευνητικές μεθόδους, αλλά απλώς τις συμπληρώνει. Και το πιο σημαντικό, η PCR δεν μπορεί να αντικαταστήσει τη διαίσθηση και την αναλυτική σκέψη που πρέπει να έχει ένας γιατρός που προσδοκά επιτυχία.

Π . μικρό . Μοριακές-βιολογικές έρευνες - αλλαγή σημείων αναφοράς διάγνωσης και θεραπείας. Η χρήση μοριακών βιολογικών μεθόδων συνδέεται με την προοπτική μιας ριζικής αλλαγής στην έμφαση στην εργαστηριακή διάγνωση. Μπορούμε να μιλήσουμε όχι μόνο για έγκαιρη ενημέρωση, αλλά για την εκ των προτέρων παραλαβή της. Εάν τώρα οι εργαστηριακές μελέτες στις περισσότερες περιπτώσεις πραγματοποιούνται ήδη με προχωρημένη νόσο και έχει ξεκινήσει θεραπεία, τότε οι μοριακές βιολογικές εργαστηριακές πληροφορίες αναμένεται να καταστήσουν δυνατό τον εντοπισμό της κλίσης ενός ατόμου σε ορισμένους τύπους παθολογίας και του βαθμού ευαισθησίας σε ορισμένα φάρμακα, τα οποία θα επιτρέψει την τεκμηρίωση του προγνωστικού, προληπτικού και εξατομικευμένου χαρακτήρα της ιατρικής του μέλλοντος.

ΑΛΛΑΓΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΩΝ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ

ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΕΣ ΠΑΘΗΣΕΙΣ

Σήμερα Στο μέλλον

Διάγνωση Γενετικό διαβατήριο

8. Πόσες αίθουσες εργασίας απαιτούνται για ένα εργαστήριο PCR με ανίχνευση φθορισμού (ποσοτική ανάλυση, Real-Time PCR);

9. Τι είναι η ανίχνευση;

10. Ποιες μέθοδοι διάγνωσης DNA διακρίνονται;

11. Ποιο ένζυμο λειτουργεί με βάση την PCR;

12. Γιατί η ζώνη ανίχνευσης πρέπει να διαχωριστεί από άλλες ζώνες εργασίας;

13. Τι είναι η τοποθεσία περιορισμού;

14. Ποια είναι η διαφορά μεταξύ της άμεσης μεθόδου διάγνωσης DNA και της έμμεσης;

15. Τι είναι η αλληλουχία;

16. Τι είναι η multiplex PCR;

17. Ποιοι τύποι μεταλλάξεων προσδιορίζονται με PCR;

18. Τι είναι η μόλυνση;

19. Ποια είναι η ουσία της ειδικής για αλληλόμορφη μεθόδου ενίσχυσης;

20. Συνθήκες αποθήκευσης υλικού PCR;

21. Ποια συσκευή χρησιμοποιείται για την ενίσχυση;

22. Ποια είναι η μέθοδος της ανάστροφης μεταγραφάσης PCR (RT-PCR);

23. Ποιο είναι το υλικό για τη διάγνωση PCR;

24. Αναφέρετε τους τύπους μόλυνσης;

Τεστ για αυτοδιδασκαλία

1. Περιοριστικές ενδονουκλεάσες:

α) ένζυμα που «σπάνε» το DNA σε αυστηρά συγκεκριμένα σημεία.

β) ένζυμα που ράβουν θραύσματα στο μόριο DNA.

γ) ένζυμα που παρέχουν ενώσεις που πραγματοποιούν την επιδιόρθωση του DNA.

2. Γονιδιακή ενίσχυση:

3. Ποια από τις μεθόδους της μοριακής γενετικής χρησιμοποιείται για τη διάγνωση ασθενειών που προκαλούνται από ένα μεταλλαγμένο γονίδιο γνωστής αλληλουχίας;

α) τη χρήση συγκεκριμένου περιορισμού·

β) άμεση ανίχνευση με χρήση ειδικών μοριακών ανιχνευτών.

γ) ανάλυση οικογένειας της κατανομής του πολυμορφισμού μήκους φυσιολογικού περιοριστικού θραύσματος.

4. Αλληλουχία DNA:

α) ταυτοποίηση της αλληλουχίας βάσεων DNA.

β) επαναλαμβανόμενη επανάληψη οποιουδήποτε τμήματος DNA.

γ) απομόνωση θραύσματος DNA που περιέχει το γονίδιο που μελετήθηκε.

5. Δείγματα DNA μπορούν να ληφθούν χρησιμοποιώντας :

β) χοριακές λάχνες.

γ) αμνιακό υγρό.

δ) κύτταρα αμνιακού υγρού.

ε) βιοψίες δέρματος, μυών, ήπατος,

ε) όλα είναι σωστά, εκτός από το σημείο "γ",

ζ) όλα είναι σωστά, εκτός από το σημείο "δ",

η) Όλα τα παραπάνω είναι σωστά.

6. Ποιες μεταλλάξεις διαγιγνώσκονται με PCR;

α) γονιδιωματικό·

β) χρωμοσωμική;

γ) γονίδιο (σημείο).

7. Το Primer είναι:

α) ένα συμπληρωματικό τμήμα DNA·

β) ένα συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο επισημασμένη (ραδιενεργά ή φθορίζουσα) αλληλουχία συμπληρωματική προς ένα μεταλλαγμένο ή φυσιολογικό γονίδιο.

γ) ένα ολιγονουκλεοτίδιο που δρα ως "σπόρος" και ξεκινά τη σύνθεση μιας πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας σε ένα πρότυπο DNA ή RNA.

8. Ποιος ανέπτυξε την αρχή της μεθόδου PCR;

β) Κ. Μούλλης

9. Χρησιμοποιείται η μέθοδος PCR για τη διάγνωση της επέκτασης των τρινουκλεοτιδικών επαναλήψεων (δυναμικός τύπος μεταλλάξεων);

10. Σε ποιες περιοχές χρησιμοποιείται η PCR;

α) κλινική ιατρική·

β) ορισμός των διαγονιδιακών οργανισμών (ΓΤΟ)

γ) ταυτοποίηση του προσώπου, διαπίστωση πατρότητας, εγκληματολογία

δ) όλα τα παραπάνω

δ) κανένα από τα παραπάνω.

Δείγματα απαντήσεων: 1 - α; 2 - β; 3 - β; 4 - α; 5 - e; 6 - σε; 7 - σε; 8 - β; 9 – α, 10 – ημ.

Κύριος

1. Γενετική Bochkov. Μόσχα. ΓΕΩΤΑΡ, 2002.

Πρόσθετος

1., Bakharev και η θεραπεία συγγενών και κληρονομικών ασθενειών στα παιδιά. - Μόσχα, 2004.

2. Διαγνωστική DNA και ιατρική γενετική συμβουλευτική. - Μόσχα, 2004.

3. Γενετική Ginter. - Μόσχα, 2003.

4. Gorbunov βασικές αρχές ιατρικής γενετικής. - Αγία Πετρούπολη: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Μοριακή κλινική διάγνωση. – Κόσμος, 1999.

6. Menshikov - βιολογική έρευνα στην κλινική εργαστηριακή διάγνωση: οι δυνατότητες του προβλήματος (διαλέξεις). Κλινική εργαστηριακή διαγνωστική, Νο 3, 2006.

7. Kornienko της εργασίας του εργαστηρίου PCR κατά την εν σειρά ανάλυση βιολογικού υλικού. Κλινική εργαστηριακή διαγνωστική, Νο 10, 2006.

8. Οργάνωση των εργασιών του εργαστηρίου PCR. Μεθοδικές οδηγίες. MU 1.3.1794-03. Επικεφαλής Υγειονομικός Ιατρός της Ρωσικής Ομοσπονδίας, 2003.

9. Τεχνολογία Erlich H. A. PCR. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Genome Res. - Νο. 6, 1996.

ΚΥΡΙΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

ΑΛΥΣΙΔΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ

Μεθοδολογικό εγχειρίδιο εξωσχολικής εργασίας σπουδαστών 3-4 μαθημάτων των ειδικοτήτων γενικής ιατρικής (060101) και παιδιατρικής (060103).

SEI HPE "Krasnoyarsk State Medical Academy of the Federal Agency for Health and Social Development"

Ρωσία, Κρασνογιάρσκ,